HIF-1α/BNIP3 Yolunun İnhibisyonu Yoluyla Otofajinin Modülasyonu Yoluyla Diz Osteoartritinde Hidroksil Aspir Sarı A'nın Moleküler Mekanizması

Yaygın bir kronik ortopedik durum olan diz osteoartriti (KOA), orta yaşlı ve yaşlı bireyleri etkileyerek yaşam kalitelerini önemli ölçüde etkiler ^1,2. Yaygın olarak görülmesine rağmen, KOA'nın altında yatan kesin etiyoloji ve patofizyolojik mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Ayrıca, hem önleme hem de iyileştirici tedavi açısından, bu durumun karmaşık patolojik temellerini çözmenin aciliyetinin altını çizmektedir. Ortaya çıkan ilgi alanlarından biri, kıkırdak homeostazında otofajinin rolüdür ve kıkırdak dokusunda azalmış otofajinin KOA ^3,4'teki dejenerasyonuna katkıda bulunduğunu gösteren biriken kanıtlar vardır.

Hücresel homeostazın korunması için hayati önem taşıyan bir hücresel bozunma süreci olan otofaji, kıkırdağın bakım ve onarımında büyük önem taşır. Eklem kıkırdağında yaygın olan hipoksik mikro ortamda, hipoksi ile indüklenebilir faktör 1α (HIF-1α)/adenovirüs E1B 19 kDa etkileşimli protein 3 (BNIP3) sinyal yolu, otofajinin önemli bir düzenleyicisi olarak ortaya çıkar. KOA hastalarında yüksek HIF-1α ekspresyonu gözlenmiştir, bu da bu yolun düzensizliğinin bozulmuş otofajiye ve ardından kıkırdak dejenerasyonuna katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir ^5,6,7.

Akupunktur, yakı, şifalı bitkiler ve masaj, diz artritini tedavi etmek için geleneksel Çin tıbbının dört klasik yöntemidir. Steroid olmayan antienflamatuar ilaçlar, hyaluronik asit enjeksiyonları ve artroplasti gibi mevcut tedavilerin yararlı olduğu kanıtlanmıştır, ancak aynı zamanda bazı yan etkilerle de ilişkilidir⁸. Ayrıca, diz osteoartriti için önerilen rutin bir tedavi yoktur. Zamanla, KOA için yaygın bir tamamlayıcı tedavi olarak, Geleneksel Çin Tıbbı (TCM), KOA⁹ tedavisinde umut vaat eden çok sayıda bitkisel ilaç geliştirmiştir. Bunlar arasında, Hidroksil aspir sarısı A, anti-inflamatuar ve otofaji modüle edici özellikleri nedeniyle büyük ilgi görmüştür^10,11. Bununla birlikte, HSYA'nın diz osteoartriti (KOA) üzerinde, özellikle HIF-1α/BNIP3 yolu yoluyla otofajiyi düzenleme açısından terapötik etkisini uyguladığı kesin mekanizmalar belirsizliğini korumaktadır. Bu nedenle, HSYA'nın kondrosit otofajisi üzerindeki etkisine ve HIF-1α/BNIP3 yolu ile etkileşimine odaklanarak HSYA'nın KOA'daki terapötik etkilerinin mekanizmasını araştırıyoruz. HSYA'nın, HIF-1α/BNIP3 yolu inhibisyonu yoluyla apoptozu ve inflamasyonu baskılarken, kondrosit otofajisini ve proliferasyonunu artırarak diz osteoartritini hafiflettiğini varsayıyoruz.

İnsan örneklerini içeren tüm prosedürler, Zhanjiang Merkez Halk Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylandı (Onay No. KY-YS-2021-09). Numune alınmadan önce tüm katılımcılardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. Kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Hastalar ve çalışma tasarımı

Diz osteoartriti (KOA) tanısı alan ve total diz artroplastisi uygulanan otuz hasta çalışmaya alındı. Kohort, tümü Amerikan Romatoloji Koleji KOA kriterlerini 12 karşılayan 52-75 yaşları arasındaki (ortalama ± SD: 64.3 ± 12.6 yıl)^{14 erkek ve 16} kadından oluşuyordu. Ameliyattan önceki 2 hafta içinde steroid olmayan antiinflamatuar ilaçlar veya steroidler veya 1 ay içinde eklem içi enjeksiyonlar alan hastalar çalışma dışı bırakıldı.

2. Birincil kondrosit kültürü

Eklem kıkırdağı ameliyattan hemen sonra steril koşullarda toplandı ve soğuk PBS'ye yerleştirildi. Steril neşterler kullanılarak, kıkırdak buz gibi soğuk bir cam plaka üzerinde ~1 mm³ parçalar halinde kesildi ve 10 mL %0.25 tripsin-EDTA içeren 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarıldı. Tüp, 37 °C'lik çalkalama suyu banyosunda 80 rpm'de 30 dakika inkübe edildi ve sindirimi kolaylaştırmak için her 5 dakikada bir hafifçe ters çevrildi. Süpernatan aspire edildi ve doku peleti bir kez PBS ile yıkandı ve 200 × g'da 5 dakika santrifüjlendi. Pelet daha sonra 10 mL %0.02 tip II kollajenaz içinde yeniden süspanse edildi ve çalkalanarak 4 saat boyunca 37 °C'de sindirildi. Süspansiyon, ayrışmayı teşvik etmek için her 30 dakikada bir yukarı ve aşağı pipetlendi, 70 μm'lik bir süzgeçten geçirildi ve 5 dakika boyunca 200 × g'da tekrar santrifüjlendi. Elde edilen pelet, %10 FBS, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile desteklenmiş DMEM içinde yeniden süspanse edildi ve T25 şişelerine ekildi. Hücreler 37 °C'de %5_CO2 ile inkübe edildi, ortam her 2-3 günde bir değiştirildi ve deneyler için 1-2 pasajlarındaki hücreler kullanıldı. Deney grupları normal kontrol, boş model, HSYA (100 μmol/L), HIF-1α inhibitörü YC-1 (10 μmol/L), rapamisin (10 nmol/L), HSYA + YC-1 ve HSYA + rapamisin idi.

3. siRNA Aracılı HIF-lα, BNIP3 Yıkımı

Birincil kondrositler, 2-5 × 10⁵ hücre/kuyuda 6 oyuklu plakalara ekildi ve %30-%50 birleşmeye ulaşana kadar 37 °C'de kültürlendi. Her kuyucuk için 5 μL 20 μM siRNA, 250 μL Opti-MEM içinde seyreltildi ve 5 μL lipid bazlı transfeksiyon reaktifi, 250 μL Opti-MEM içinde ayrı ayrı seyreltildi. İki çözelti hafifçe karıştırıldı ve kompleksler oluşturmak için oda sıcaklığında 15-20 dakika inkübe edildi. Kültür ortamı, %10 FBS içeren 1.5 mL taze DMEM ile değiştirildi ve siRNA-lipid kompleksi (500 μL), hafif bir girdap ile kuyu duvarı boyunca damla damla ilave edildi. Hücreler 6 saat inkübe edildi, besiyeri tam besiyeri ile değiştirildi ve kültüre 48-72 saat devam edildi. Yıkım etkinliği, daha ileri tedavilerden önce qRT-PCR ve Western blot ile doğrulandı.

4. ELİSA

Hücre kültürü süpernatanları toplandı, 200 × g'da 5 dakika santrifüjlendi ve gerektiğinde tahlil tamponunda 1:2 oranında seyreltildi. IL-1β, TNF-α ve IL-6 için ELISA kitleri üreticinin protokolüne göre kullanıldı. Standartlar, boşluklar ve numuneler üç kopya halinde çalıştırıldı. Substrat reaksiyonunu takiben, absorbans 15 dakika içinde bir mikroplaka okuyucu kullanılarak 450 nm'de ölçüldü.

5. MTT testi

Kondrositler, 100 μL tam ortamda 5.000 hücre/kuyuda 96 oyuklu plakalara ekildi ve 0 saat, 24 saat, 48 saat veya 72 saat inkübe edildi. Her zaman noktasında, her bir kuyucuğa doğrudan 20 μL MTT çözeltisi (PBS'de 5 mg/mL) ilave edildi ve plakalar, kuyucukların dibinde mor formazan kristalleri görünene kadar 37 °C'de 30 dakika inkübe edildi. Süpernatant, kristalleri bozmadan dikkatlice aspire edildi, her bir oyuğa 150 μL DMSO ilave edildi ve kristallerin tamamen çözülmesi için plakalar 10 dakika boyunca 100 rpm'de bir çalkalayıcıya yerleştirildi. Absorbans, bir mikroplaka okuyucu kullanılarak 490 nm'de ölçüldü. Kısa inkübasyon süresi, metabolik olarak yüksek oranda aktif hücrelerde sinyal doygunluğunu önlemek için seçildi.

6. Akış sitometrisi

Hücreler tripsinizasyon ile toplandı, 200 × g'da 5 dakika santrifüjlendi ve soğuk PBS ile iki kez yıkandı. ~1 × 10⁶ hücre/mL'de 500 μL bağlanma tamponu içinde yeniden süspanse edildiler ve 5 μL Ek V-FITC ve 5 μL PI ilave edildi. Hafifçe karıştırıldıktan sonra hücreler karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edildi. Numuneler, numune başına en az 10.000 olay toplanmış bir akış sitometresinde analiz edildi (uyarma 488 nm, emisyon FITC 530/30 nm, PI > 600 nm). Apoptotik hücreler standart yazılım kullanılarak ölçüldü.

7. Batı lekeleme

Hücreler iki kez soğuk PBS ile durulandı ve proteaz inhibitörleri içeren 200 μL RIPA tamponunda buz üzerinde 30 dakika parçalandı. Hücreler plastik bir kazıyıcı ile kazındı, viskoziteyi azaltmak için yukarı ve aşağı pipetlendi ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 12.000 × g'da santrifüjlendi. Süpernatanlar toplandı ve protein konsantrasyonları BCA testi kullanılarak ölçüldü. Eşit miktarda protein (30 μg) ×5 yükleme tamponu ile karıştırıldı, 95 °C'de 5 dakika ısıtıldı ve %10-%12 SDS-PAGE jelleri üzerinde ayrıldı. Elektroforez, istifleme için 80 V'ta ve ayırma için 120 V'ta çalıştırıldı ve proteinler, 90 dakika boyunca 300 mA'da PVDF membranlarına aktarıldı. Membranlar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca %5 yağsız sütte bloke edildi ve gece boyunca 4 °C'de birincil antikorlarla (1:1.000) inkübe edildi. TBST ile üç yıkamadan sonra, membranlar oda sıcaklığında 1 saat boyunca HRP konjuge ikincil antikorlarla (1:5.000) inkübe edildi. Protein bantları ECL substratı ile görselleştirildi ve 30-120 saniye maruz kalma ile bir kemilüminesans algılama sistemi kullanılarak görüntülendi. Bant yoğunlukları ImageJ kullanılarak ölçüldü ve yükleme kontrolü olarak GAPDH kullanıldı.

8. Monodansilkadaverin (MDC) boyama

Kullanımdan hemen önce stok solüsyondan 50 μM MDC çalışma solüsyonu hazırlandı. Hücreler, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1 mL %4 paraformaldehit ile sabitlendi, PBS ile iki kez yıkandı ve karanlıkta 37 °C'de 30 dakika boyunca 500 μL MDC çalışma solüsyonu ile inkübe edildi. PBS ile iki yıkamadan sonra, lameller antifade montaj ortamı ile monte edildi ve bir floresan mikroskobu altında gözlemlendi (uyarma 355 nm, emisyon 512 nm).

9. Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM)

Hücreler toplandı ve 5 dakika boyunca 200 × g'da santrifüjleme ile peletlendi, daha sonra gece boyunca 4 °C'de %2 glutaraldehit içinde sabitlendi. Numuneler, her biri 5 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkandı ve bir çeker ocakta 4 °C'de 1 saat boyunca %1 osmiyum tetroksit içinde sonradan sabitlendi. Dehidrasyon, her biri 10 dakika boyunca %30, %50, %70, %90 ve %100'lük kademeli bir aseton serisi ile gerçekleştirildi. Numunelere 1 saat boyunca 1:1 aseton/epoksi reçine ve ardından gece boyunca saf reçine ile sızıldı. Gömme, taze reçine içinde gerçekleştirildi ve 48 saat boyunca 60 °C'de polimerize edildi. 50-70 nm'lik ultra ince kesitler bir ultramikrotom ile kesildi, 200 gözenekli bakır ızgaralara monte edildi, 30 dakika boyunca %2 uranil asetat ile boyandı, ardından 15 dakika boyunca kurşun sitrat uygulandı, damıtılmış su ile yıkandı, havayla kurutuldu ve 80 kV'da transmisyon elektron mikroskobu altında incelendi. Bir güvenlik notu olarak, glutaraldehit ve osmiyum tetroksit toksik ve uçucudur ve yalnızca eldiven ve koruyucu gözlükle çeker ocakta kullanılmalıdır. Atıklar, kurumsal güvenlik protokollerine göre belirlenmiş tehlikeli kaplara atılmalıdır.

10. İstatistiksel analiz

Tüm deneyler üç kopya halinde gerçekleştirildi. Veriler ortalama ± SD olarak ifade edilir. İstatistiksel anlamlılık, tek yönlü ANOVA ve ardından LSD post-hoc testi kullanılarak değerlendirildi ve P < 0.05 anlamlı kabul edildi.

HSYA'nın kondrosit proinflamatuar sitokinleri (IL-1β, TNF-α, IL-6) ekspresyonu üzerindeki etkisi
Normal kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, diğer tüm gruplarda önemli ölçüde yüksek proinflamatuar sitokin seviyeleri (IL-1β, TNF-α ve IL-6) görüldü (P < 0.05, Tablo 1, Şekil 1A-G). HSYA, HIF-1α inhibitörü, otofaji indükleyicisi, HSYA + HIF-1α inhibitörü veya HSYA + otofaji indükleyicisi ile tedavi, boş model grubuna göre sitokin düzeylerini önemli ölçüde azalttı (P < 0.05). Bunlar arasında, kombine tedaviler (HSYA + HIF-1α inhibitörü veya HSYA + otofaji indükleyicisi), model grubuna kıyasla yaklaşık %35-%40'lık düşüşlerle sitokin ekspresyonunu daha da azalttı (P < 0.05). Gen girişim deneylerinde (Şekil 1H-J), HIF-1α veya BNIP3'ün siRNA yıkımı, model + boş gruba kıyasla sitokin seviyelerinde ~%25-%30'luk azalmalara yol açtı. HSYA tedavisi bu etkileri daha da artırdı. Spesifik olarak, siHIF-1α + HSYA grubundaki sitokin seviyeleri, siHIF-1α + boş grubuna göre ~%20 daha düşüktü ve siBNIP3 + HSYA grubundaki seviyeler, siBNIP3 + boş gruba göre ~%22 daha düşüktü (P < 0.05).

HSYA'nın kondrosit proliferasyonu üzerindeki etkisi
Normal kontrol grubu başlangıçta proliferasyon aktivitesi sergilerken, boş model grubu anlamlı bir azalma gösterdi (P < 0.05, Şekil 2A). HSYA, HIF-1α inhibitörü veya otofaji indükleyicisi ile tedaviyi takiben proliferasyon kısmen düzeldi ve kombine HSYA + HIF-1α inhibitörü veya HSYA + otofaji indükleyici tedavileri ile belirgin şekilde arttı (P < 0.05). siRNA deneylerinde (Şekil 2B), HIF-1α veya BNIP3'ün yıkılması, model kontrol grubuna kıyasla proliferasyonu ~%25 oranında destekledi. HSYA tedavisi proliferasyonu daha da arttırdı ve model grubuna kıyasla ~%40 daha yüksek proliferasyonla sonuçlandı (P < 0.05).

HSYA'nın kondrositlerde apoptoz ve otofaji ile ilişkili protein ekspresyonu üzerine etkisi
Western blot analizi, gruplar arasında protein ekspresyonunda önemli farklılıklar olduğunu ortaya koydu (Tablo 2). Boş model grubu, kontrollere kıyasla HIF-1a'nın belirgin yukarı regülasyonunu ve LC3, P62, Beclin1 ve BNIP3 ekspresyonunun azaldığını gösterdi (P < 0.05). HSYA, HIF-1α inhibitörü veya otofaji indükleyicisi ile tedavi, LC3, P62, Beclin1 ve BNIP3 ekspresyonunu arttırdı ve HIF-1α düzeylerini azalttı (P < 0.05). HSYA + HIF-1α inhibitörü veya HSYA + otofaji indükleyicisi ile kombine tedaviler, boş model grubuna kıyasla LC3 ve Beclin1 seviyeleri ile neredeyse iki katına çıkarak en büyük değişiklikleri üretti. P62 tipik olarak otofaji aktive edildiğinde azalsa da, burada HSYA tedavisini takiben seviyeleri artmıştır. Bu, kondrosit otofajisi ile ilgili önceki çalışmalarda da bildirilen bir fenomen olan artmış otofagozom birikimini veya eksik akıyı gösterebilir.

HSYA'nın kondrositlerde apoptoz oranlarına etkisi
Akış sitometrisi analizi, boş model grubunun normal kontrol grubuna göre önemli ölçüde daha yüksek bir apoptoz oranı sergilediğini gösterdi (P < 0.05, Şekil 3A,B). HSYA, HIF-1α inhibitörü ve otofaji indükleyicisinin her biri apoptozu azaltırken, kombine tedaviler (HSYA + HIF-1α inhibitörü veya HSYA + otofaji indükleyicisi), boş model grubuna kıyasla ~%45-%50'lik azalmalarla en düşük apoptoz oranlarını üretti (P < 0.05). siRNA deneylerinde, apoptoz ayrıca HIF-1α veya BNIP3'ün yıkılmasıyla azaltıldı ve HSYA tedavisi ile daha da azaltıldı.

HSYA'nın kondrositlerde apoptoz oranları ve otofajik vezikül oluşumu üzerine etkisi
MDC boyama ve TEM görüntüleme, gruplar arasında otofajik vezikül oluşumunda belirgin farklılıklar olduğunu ortaya koydu (Şekil 4A-D). Boş model grubu, veziküllerin seyrek bir dağılımını sergilerken, HSYA, HIF-1α inhibitörü veya otofaji indükleyici tedavileri vezikül sayılarını artırdı. Kombine tedaviler (HSYA + HIF-1α inhibitörü veya HSYA + otofaji indükleyicisi), model grubuna kıyasla TEM tarafından gözlemlenen yaklaşık iki kat daha fazla vezikül ile en belirgin gelişmeyi üretti. Bu bulgularla tutarlı olarak, akış sitometrisi ile ölçülen apoptoz oranları (Şekil 5A-E) kombine tedavi gruplarında en düşüktü.

VERİ KULLANILABİLİRLİĞİ:
Bu çalışmada üretilen tüm veriler Ek Dosya 1'de verilmiştir.

Şekil 1: Her grupta kondrosit proinflamatuar sitokinlerin (IL-1β, TNF-α, IL-6) ekspresyonu (n = 3). (A-G) IL-1β, TNF-α ve IL-6'nın protein ekspresyon seviyeleri Western blotlama (WB) ile tespit edildi. (H-J) IL-1β, TNF-α ve IL-6 içerikleri, enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile ölçüldü (P < 0.05). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Her grupta kondrosit proliferasyon aktivitesinin karşılaştırılması (n = 3). (A) Tedavi edilen gruplar ve (B) HIF-1α ve BNIP3 yıkım grupları, P< 0.05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Her grubun apoptoz oranının karşılaştırılması (n = 3). (A) 1, Normal grup; 2, Model grubu; 3, HSYA grubu; 4, HIF-1α inhibitör grubu; 5, Otofaji grubu; 6, HSYA + HIF-1α inhibitör grubu; 7, HSYA + Otofaji indükleyici grubu. (B) HIF-1α ve BNIP3 gen yıkım grupları. Normal kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, *P 0,05<. Boş model grubuyla karşılaştırıldığında, #P< 0,05. HSYA + HIF-1α inhibitör grubu ile karşılaştırıldığında, & P< 0.05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Mitokondride otofajik vezikül oluşumunun TEM görüntülemesi. (A) Boş model. (B) HSYA grubu. (C) HIF-1α inhibitör grubu. (D) Otofaji indükleyici grubu. Ölçek çubuğu = 1 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: HSYA'nın her grupta hücre apoptoz oranları üzerindeki etkisi (n = 3). (A) Boş model. (B) HSYA grubu. (C) HIF-1α inhibitör grubu. (D) Otofaji indükleyici grubu. (E) Normal kontrol grubuna kıyasla her grubun toplam analizi, **P< 0.01. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Her gruptaki pro-İnflamatuar sitokin düzeylerinin karşılaştırılması. Normal kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, *P 0,05<. Boş model grubuyla karşılaştırıldığında, #P< 0,05. HASY, HIF-1α inhibitörü ve otofaji indükleyicisi ile tedavi edilen gruplarla karşılaştırıldığında, & P< 0.05.

Tablo 2: Farklı gruplardaki proteinlerin karşılaştırılması. Normal kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, *P< 0.05. HSYA, HIF-1α inhibitörü ve otofaji indükleyicisi ile tedavi edilen gruplarla karşılaştırıldığında, #P< 0.05.

Ek Dosya 1: Çalışma sırasında üretilen ham veriler. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.