Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Ganzhirong Granül, tip 2 diyabette SIRT3-MPC1-PC/PDH ekseniyle karaciğer glukoneogenezini inhibe eder

419 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/69500

⸱

12 Aralık 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine, 2Department of Gastroenterology, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 3Research Center of Chinese Traditional Medicine, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 4Preventive Treatment Center, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, Ganzhirong Granül'ünün, SIRT3-MPC1-PC/PDH ekseni üzerinden karaciğer glukoneogenezini inhibe ederek tip 2 diyabette hiperglisemiyi hafifledip iyileştirmediğini araştırmıştır.

Özet

Tip 2 diyabet (T2DM), karaciğer insülin direnci ve aşırı glukoneogenez ile karakterize edilen küresel bir metabolik bozukluktur. Ganzhirong Granül, geleneksel Çin tıbbı formülü, T2DM'nin yönetiminde potansiyel göstermiştir, ancak özellikle karaciğer glukoneogenezi gibi temel mekanizmaları belirsizdir. Bu çalışma, GZRG'nin SIRT3 aracılı sinyal yolunu modüle ederek hiperglisemiyi hafifledip iyileştirmediğini araştırdı. GZRG'nin anti-diyabetik etkileri, yüksek yağlı diyet (HFD) kaynaklı T2DM farelerinde ve serbest yağ asidi (FFA) kaynaklı insüline dirençli HepG2 hücrelerinde değerlendirildi. Metabolik parametreler, glikoz ve piruvat toleransı, insülin hassasiyeti ve lipid profilleri değerlendirildi. SIRT3'ün aşırı ifade edilmesi ve etkisi yoluyla moleküler mekanizmalar incelendi; glukoneojenik yolda anahtar proteinlerin (SIRT3, MPC1, PC, PDH-E2, PCK1 ve G6Pase) ekspresyonu incelendi. GZRG tedavisi, hem T2DM farelerde hem de insülin dirençli (IR) HepG2 hücrelerinde hiperglisemiyi önemli ölçüde iyileştirdi, insülin hassasiyetini artırdı ve lipid metabolizmasını iyileştirdi. Karaciğer steatozunu zayıflattı ve glukoneogenezi baskıladı. Mekanik olarak, GZRG SIRT3 ekspresyonunu aşağı regule etti; bu da MPC1 ve PC seviyelerinde eşzamanlı düşüşlere ve PDH-E2'de artışa yol açtı. Bu protein ifadesindeki bu değişim, piruvat metabolizmasını glukoneogenezden uzaklaştırdı. SIRT3 aşırı ekspresyonu, GZRG'nin glukoneogenez üzerindeki baskılayıcı etkilerini tersine çevirirken, SIRT3'ün etkisi GZRG ile sinerjik oldu. GZRG, SIRT3-MPC1-PC/PDH ekseni üzerinden karaciğer glukoneogenezini inhibe ederek T2DM'yi hafiflettir. Bu bulgular, GZRG'nin yeni bir moleküler mekanizmasını aydınlatmakta ve SIRT3'ü T2DM yönetimi için potansiyel bir terapötik hedef olarak öne çıkarmaktadır.

Giriş

Tip 2 diyabet hastalığı (T2DM), dünya genelinde en yaygın ve engelleyici kronik metabolik bozukluklardan biri olarak ortaya çıkmış olup, önemli bir halk sağlığı ve ekonomik yükoluşturmaktadır 1,2. İnsülin direnci (IR) ve ilerleyici pankreas β hücre disfonksiyonu ile karakterize edilen T2DM, öncelikle glikoz ve lipidhomeostazı 3,4 ile yönlendirilir. Glukoz düzenlemesinde rol alan çoklu organlar arasında, karaciğer glikogenoliz ve glukoneogenez yoluyla endogen glikoz üretimini kontrol ederek merkezi bir roloynar 5. Aşırı hepatik glukoneogenez, T2DM patofizyolojisinin ayırt edici özelliği olan açlık hiperglisemisine önemli bir katkı kaynağıdır ve glikoz dengesinin geri kazanılması için kritik bir terapötikhedefi temsil eder 6.

Mevcut hipoglisemik ajanlar —metformin 7, tiazolidinedionlar8, GLP-1 reseptöragonistleri 9 ve SGLT2inhibitörleri 10 — farklı mekanizmalarla glisemik kontrol sağlar, ancak uzun vadeli kullanımları genellikle yan etkiler, azalan etkinlik veya tedavi intoleransı nedeniyle sınırlıdır. Sonuç olarak, birden fazla metabolik yolu güvenli ve etkili şekilde hedefleyebilen tamamlayıcı veya alternatif terapötik yaklaşımlara olan ilgi artmaktadır. Çok bileşenli ve çok hedefli farmakolojik özellikleriyle karakterize edilen geleneksel Çin tıbbı (TCM), T2DM 11,12,13,14,15 gibi karmaşık metabolik hastalıkların yönetimi için umut vaat eden fırsatlar sunar. Birkaç klasik TCM formülasyonunun, insülin direncini iyileştirdiği, lipid metabolizmasını iyileştirdiği ve entegre düzenleyici mekanizmalarla karaciğer glukoneogenezini baskıladığıbildirilmiştir 16,17.

Ganzhirong granülü (GZRG), metabolik bozuklukların yönetiminde klinik kullanım geçmişine sahip standartlaştırılmış bir TCM formülüdür. GZRG, sekiz şifalı bitkiden oluşan bir bitkisel formülasyondur. Önceki fitokimyasal ve farmakolojik araştırmalarımıza dayanarak, GZRG'de Salvianolik asit B, D-stachyose, Proantosiyanidinler, Violet oksalik asit, Salvianollik asit A, Salvianollik asit C, Calycosin 7 glukozid, 3′-metoksipuerarin, 3′-hidroksi puerarin, Apigenin-7-beta-d-pyrano, Emodin-8-O-β-D-glikoz, Krizofanol-1-O-glukozid, Krizofanol-8-O-glukozid, Puerarin, Rosmarinik asit, Kriptotanshinon, Katekin, Ft-nyflavin, Calycosin, Rhein, Guanosin, Oleik asit, Aloe emodin, Formononetin, Palmitik asit, Krizofanol, D-triptofan, Danshensu, Ferulic asit, Mannitol, Gallik asit ve L-fenilalanin. Geleneksel Çin tıbbının (TCM) tip 2 diyabeti yönetmedeki temel avantajlarından biri, çok bileşenli ve çok hedefli sinerjik etkileridir. GZRG'de bulunan onlarca aktif bileşen, insülin sinyal yolları, glikojen metabolizması ve inflamatuar yanıtlar gibi birden fazla biyolojik işlemle etkileşime girmesi muhtemeldir; böylece tek bir saflaştırılmışbileşik 18 tarafından yeterince çoğaltılamayan entegre bir ağ etkisi oluşturur. Önceki araştırmalar, GZRG'nin diyabet modellerinde glikoz ve lipid metabolizması üzerinde faydalı etkiler yarattığınıgöstermiştir 19; ancak bu etkilerin altında yatan kesin moleküler mekanizmalar henüz belirsizdir. Özellikle, GZRG'nin karaciğer glukoneojenik sinyalini modüle ederek antidiyabetik etkilerini yapıp yapmadığı henüz açıklanmamıştır.

Sirtuin 3 (SIRT3), mitokondriyal NAD⁺-bağımlı deasetilaz olup, hücresel enerji homeostazı20'nin kritik bir düzenleyicisidir. SIRT3, temel metabolik enzimleri deasetilasyon ve aktive ederek mitokondriyal oksidatif fosforilasyonu, yağ asidi oksidasyonunu ve glukoneogenez21'i etkiler. Sapkın SIRT3 ekspresyonu, insülin direnci, yağlı karaciğer ve T2DM22,23 patogenezinde rol oynamıştır. Kanıtlar, hepatik SIRT3 aşırı ekspresyonunun, mitokondriyal piruvat taşıyıcı 1 (MPC1)24, piruvat karboksilaza (PC)25, piruvat dehidrojenaz (PDH)26, fosfoenolpiravat karboksikinaz (PCK1)27 ve glukoz-6-fosfataz (G6Pase)28 gibi enzimleri modüle ederek glukonojenik akını artırdığını göstermektedir. Dolayısıyla, SIRT3 aracılı piruvat metabolizması kontrolü, mitokondriyal fonksiyon ile hepatik glukoz çıkışını birbirine bağlayan kritik bir bağlantı noktasıdır ve SIRT3'ü T2DM'de terapötik müdahale için cazip bir hedef haline getirir.

GZRG'deki biyoaktif bileşenlerin metabolik etkileri ve SIRT3'ün hepatik glukoz homeostazındaki merkezi rolü göz önüne alındığında, GZRG'nin SIRT3 aracılı glukoneojenik yolun modülasyonu yoluyla T2DM'de hiperglisemiyi iyileştirdiği varsayımlandı. Bu hipotezi değerlendirmek için, GZRG'nin glikoz ve lipid metabolizması üzerindeki etkileri, yüksek yağlı diyet (HFD) kaynaklı T2DM farelerinde ve serbest yağ asidi (FFA) kaynaklı insüline dirençli HepG2 hücrelerinde değerlendirildi. Daha ileri araştırmalar, SIRT3-MPC1-PC/PDH sinyal ekseninin GZRG'nin karaciğer glukoneogenezi üzerindeki baskılayıcı etkisini aracılıkla ilişkilendirmedeki rolüne baktı. Bu çalışma, GZRG'nin metabolik faydalarının temelini oluşturan moleküler mekanizmaları aydınlatmayı ve T2DM yönetimi için çok hedefli bir modülatör olarak terapötik potansiyelini destekleyen deneysel kanıtlar sunmayı amaçlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvan çalışması protokolü, Changchun Çin Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı (onay no. 2024396). Tüm hayvan deneyleri, ulusal yönergeler ve hayvanların korunmasına ilişkin ilgili ulusal yasalara uygun olarak gerçekleştirildi.

Deneysel ilaçlar
GZRG (parti numarası 26210483), Çin Changchun Çin Tıbbı Üniversitesi Bağlı Hastanesi (Jilin, Çin) tarafından sağlanmıştır. GZRG'nin ana biyoaktif bileşenleri ve kalite kontrol parametreleri önceki birçalışmada karakterize edilmiştir 18.

Reaktifler ve antikorlar
Ticari test kitleri, glikoz, esterleşmemiş yağ asitleri (NEFA), trigliseridler (TG), toplam kolesterol (TC), yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) kolesterol ve düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) kolesterolünün niceliklerini belirlemek için kullanıldı. Glikozillenmiş hemoglobin ve insülin için enzimle bağlantılı immünosorbent test (ELISA) kitleri de ticari olarak elde edilmiştir. Piruvat dehidrojenaz (PDH) ve piruvat karboksilaza (PC) için ELISA kitleri de ticari olarak elde edilmiştir. RNA ve cDNA çalışmaları için RNA Doku/Hücre Kiti, qPCR PreMix ve gDNA RT SuperMix ticari olarak satın alındı. Transfeksiyon, bir transfeksiyon reaktifi kullanılarak gerçekleştirildi. SIRT3 (RRID: AB_2837621), fosfoenolpiruvat karboksikinaz 1 (PCK1; RRID: AB_2838732), PDH-E2, glikoz-6-fosfataz (G6Pase; RRID: AB_2845572), mitokondriyal piruvat taşıyıcı 1 (MPC1; RRID: AB_2836209), PC (RRID: AB_2836732) ve gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH; RRID: AB_2833041) ticari bir satıcıdan temin edildi.

Fare ve tedaviler
Erkek C57BL/6J fareleri (5-6 haftalık) Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd.'den alınmış ve standart koşullarda (22 ± 2 °C, %50-60 nem, 12 saat ışık/karanlık döngü) ücretsiz yiyecek ve suya erişimle beslenmiştir. 1 haftalık bir alışma döneminin ardından, altı fare rastgele kontrol (Con) grubu olarak belirlendi ve standart bir yemek diyetiyle beslendi. Kalan fareler, obezite ve insülin direncini tetiklemek için 12 hafta boyunca yüksek yağlı diyet (HFD) aldı.

13. haftada, açlık kan şekeri (FBG) seviyesi 11,1 mmol/L ≥ fareler başarılı tip 2 diyabet (T2DM) modelleri olarak sınıflandırıldı. Bu diyabetli fareler rastgele beş deneysel gruba (n = 6 grup başına ayrıldı): HFD model grubu, düşük dozlu GZRG (L-GZRG, 3,2 g/kg/gün), orta dozlu GZRG (M-GZRG, 6,4 g/kg/gün), yüksek dozlu GZRG (H-GZRG, 12,8 g/kg/gün) ve metformin (Met, 0,2 g/kg/gün). GZRG ve Met, 8 hafta boyunca günlük oral gavajla uygulandı. Con ve HFD model grupları eşdeğer miktarda damıtılmış su aldı. Tedavi süresi tamamlandıktan sonra, tüm farelerden kan ve karaciğer dokusu örnekleri toplanarak sonraki analizler yapıldı.

İntraperitoneal glikoz tolerans testi (IPGTT), piruvat tolerans testi (PTT) ve insülin tolerans testi (ITT)
Metabolik tolerans testleri, ilaç tedavisinin başlamasından 6 ila 8 hafta arasında yapıldı. IPGTT ve PTT için fareler gece boyunca (yaklaşık 16 saat) aç tutuldu. ITT için daha kısa 4 saatlik oruç dönemi uygulandı. Oruç sonrası farelere intraperitoneal enjeksiyon olarak ya glikoz (IPGTT için 2 g/kg), sodyum piruvat (PTT için 2 g/kg) veya insan normal insülini (ITT için 1 U/kg) verildi. Kan şekeri seviyeleri, enjeksiyondan sonraki 0 dakika, 30 dakika, 60 dakika, 90 dakika ve 120 dakika içinde kalibre edilmiş bir glukometre kullanılarak kuyruk ven kan örneklerinden ölçüldü.

Biyokimyasal analiz ve enzim aktivite testleri
Açlık kan şekeri (FBG), hemoglobin A1c (HbA1c) ve insülin (INS) seviyeleri, üreticinin talimatlarına göre ticari test kitleri kullanılarak belirlendi. İnsülin Direncinin Homeostatik Model Değerlendirmesi (HOMA-IR) şu formülle hesaplandı:

HOMA-IR = [FBG (mmol/L) x INS (μU/mL)] / 22.5

NEFA, TG, TC, LDL-C, HDL-C dolaşımdaki seviyeleri ve karaciğer dokularındaki PDH ile PC'nin enzimatik aktiviteleri ilgili ticari kitler kullanılarak nicelendirildi.

Karaciğer dokularının histopatolojik analizi
Taze karaciğer dokuları %10 nötr tamponlu formalinde 24 saat sabitlendi, ardından parafin gömülmesi için standart işlem yapıldı. 5 μm kalınlığında kesimler kesilip Hematoksilin ve Eosin (H&E) ile boyanarak genel morfolojik değerlendirme yapıldı. Lipid görselleştirme için, seçilmiş karaciğer örnekleri Optimal Kesme Sıcaklığı (OCT) bileşiğine gömüldü, snap-donduruldu, kriyokesiye alındı ve Yağ Kırmızı O ile boyandı.

Hücre kültürü ve tedavisi
İnsan hepatoma hücre hattı HepG2, Çin Bilimler Akademisi'nin Tip Kültürü Koleksiyonu'ndan elde edilmiştir. Hücreler, 25 mM glikoz, %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisillin-streptomisin ile takviye edilmiş Minimum Temel Ortamda (MEM) kültürlendi. Kültürler, %5CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde 37 °C'de tutuldu.

İnsülin direncinin (IR) in vitro modelini oluşturmak için, %70-80 birleşimdeki hücreler, daha önce bildirilen veküçük değişikliklerle 29 molar oranda oleik asit ve palmitik asit içeren serbest yağ asidi (FFA) karışımıyla 24 saat boyunca tedavi edildi. FFA indüksiyonunun ardından, kültür ortamı, aynı FFA karışımını içeren taze MEM ile ve çeşitli GZRG konsantrasyonları ile değiştirilerek ek 24 saatlik kuluçka yapıldı.

Hücre canlılık testi (CCK-8)
Logaritmik büyüme fazındaki HepG2 hücreleri hasat edilip kuyu başına 1 x 104 hücre yoğunluğunda 96 kuyu tabaklarına tohumlanmıştır. Çevresel kuyular buharlaşmayı en aza indirmek için 100 μL steril fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) ile dolduruldu. Yapışmayı sağlamak için gece kuluçkasından sonra, hücreler deneysel tasarıma göre işlendi. İşlemden sonra, her kuyuya 10 μL CCK-8 çözeltisi eklendi ve plakalar 37 °C'de 2 saat kuluçka altına alındı. 450 nm'de absorbans mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçüldü. Hücre canlılığı şu şekilde hesaplandı:

[(As - Ab) / (Ac - Ab)] x %100

burada As numunenin emilimidir, Ac kontrol (işlememiş hücreler) emilimidir ve Ab boşluğun (hücresiz kuyular) emiridir.

HepG2 hücrelerinde plazmid transfeksiyonu
SIRT3 aşırı ekspresyon plazmidi (OV-SIRT3) ve üç ayrı SIRT3 hedefleyen küçük interferensif RNA plazmidi (si-SIRT3-1#, si-SIRT3-2#, si-SIRT3-3#) ile birlikte negatif kontrol siRNA'sı (si-NC) bir satıcı tarafından üretildi. Transfeksiyonlar, hücreler %50-60 birleşmeye ulaştığında transfeksiyon reaktifi kullanılarak gerçekleştirildi. Transfeksiyon kompleksi steril koşullarda şu şekilde hazırlandı: Çözelti A, 250 μL indirgenmiş serum ortamında 1 μg plazmid DNA'nın nazik karıştırma ile seyreltilmesiyle üretildi. Çözelti B, 250 μL indirgenmiş serum ortamında 2-3 μL transfeksiyon reaktifiyle seyreltilerek hazırlandı, ardından girdap yapmadan 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkubasyon yapıldı. İki çözelti birleştirildi, pipetle nazikçe karıştırıldı ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka yoluyla DNA-lipid kompleksleri oluşturuldu. Transfeksiyon için, işlemden 1 saat önce hücre kültür ortamı aspire edildi, hücreler PBS ile yıkandı ve 1 mL azaltılmış serum ortamı (serumsuz ve antibiyotiksiz) eklendi. Sonra, her kuyuya damla olarak 500 μL transfeksiyon kompleksi eklendi ve kültür plakası homojenliği sağlamak için nazikçe döndü. Hücreler 37 °C'de 4-6 saat kuluçka altına alındı, ardından ortam sitotoksisiteyi azaltmak için tam ortamla değiştirildi. Daha sonra, hücreler ek 24-48 saat kültürlendikten sonra daha fazla analiz yapıldı. Transfeksiyon verimliliği nicel PCR (qPCR) ile değerlendirildi. Toplam RNA çıkarıldı, cDNA'ya ters transkribe edildi ve 18S rRNA ile iç kontrol olarak kullanılan SIRT3 spesifik primerlerle amplifikasyon yapıldı. Göreli ifade seviyeleri ΔΔCt yöntemiyle belirlendi ve bu sonuçlara dayanarak sonraki deneyler için en etkili siRNA yapısı seçildi.

Hücre içi lipid birikimi için yağ kırmızısı O boyama
Logaritmik büyüme fazındaki HepG2 hücreleri, 24 kuyu tabakalarında 2 x 105 hücre yoğunluğunda tohumlanmış, 250 μM oleik asit ve 250 μM palmitik asit içeren yüksek lipidli ortamla 48 saat boyunca indüklenerek lipid birikim modeli oluşturulmuştur. Tedavilerden sonra hücreler PBS ile yıkanıp oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %10 formaldehit ile sabitlenmiştir. Damıtılmış suyla durulama ve %60 isopropanol'e kısa bir batırmadan sonra, hücreler taze hazırlanmış Yağ Kırmızı O çalışma çözeltisi ile (A1 ve A2 bileşenleri 3:2 oranında karıştırılarak elde edilen) 10-15 dakika boyunca boyandı. Fazla boya %60 izopropanol ile yıkanarak ve ardından damıtılmış su ile temizlendi. Çekirdekler 1-2 dakika boyunca Mayer'in hematoksiliniyle (1.0 g/L) karşı boyandı. Son yıkamadan sonra, hücreler gliserol jelatinle monte edildi ve lipid damlacıklarının niteliksel değerlendirmesi için ışık mikroskobu ile 200x büyütme ile görüntüler alındı.

HepG2 hücrelerinde insülin direncinin indüklenmesi ve glukoz niceliği
HepG2 hücreleri, insülin direncinin in vitro modelini oluşturmak için 24 delikli plakalarda 2 x 105 hücre tohumlama yoğunluğunda kültürlendi. 24 saatlik tedaviden sonra, kültür süpernatantı daha fazla analiz için toplanmıştır. Hücre içi glikoz ölçümü için, hücre süspansiyonları 1000 x g hassasiyetinde 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj edildi. Süpernatant atıldı ve hücre peleti bir veya iki kez izotonik tampon ile yıkandı, ardından aynı koşullarda santrifüj yapıldı. Pellet daha sonra 0,2 ila 0,3 mL homojenizasyon ortamında homojenize edildi ve 300 W prob kullanılarak buz suyu banyosunda ultrasonik bozulmaya maruz bırakıldı; 3-5 saniyelik darbeler ve ardından 30 saniyelik aralıklar tekrarlanarak 3x-5x tekrarlandı. Ortaya çıkan homojenat, daha fazla santrifüj yapılmadan doğrudan analiz edildi. Hem kültür süpernatantı hem de hücre homojenatındaki glukoz seviyeleri, üreticinin talimatlarına uygun olarak standart bir glukoz test seti kullanılarak ölçüldü ve metabolik yanıtların doğru ve tekrarlanabilir değerlendirilmesini sağladı.

Hücresel trigliserit içeriğinin ölçümü
HepG2 hücreleri, 1000 x g ölçüsünde 10 dakika boyunca santrifüjle toplandı ve üst sıvı atıldı. Hücre pelleti, izotonik fosfat tamponu (0.1 M, pH 7.0-7.4) ile 1 veya 2 kez yıkanmış, ardından aynı koşullar altında santrifüjleme yapılmıştır. Süpernatan çıkarıldıktan sonra pellet yeniden askıya alındı ve 0,2-0,3 mL mutlak etanol ile homojenize edildi. Homojenat buz üzerinde ultrasonik bozulmaya maruz kaldı (300 W, patlama başına 3-5 saniye, 30 saniye aralıklar, 3-5 kez tekrarlandı). Ortaya çıkan homojenat, daha fazla santrifüj yapmadan doğrudan sonraki analizler için kullanıldı. 96 kuyuyla boş, standart ve örnek kuyuları olan bir plaka kuruldu. Kapsamlı karıştırmadan sonra, plaka 37 °C'de 10 dakika kuluçka yapıldı ve mikroplaka okuyucu kullanılarak soğurma 500 nm olarak ölçüldü. Hücre örneklerindeki trigliserid içeriği, gliserol standartlarının seri seyreltilmelerinden elde edilen standart bir eğriye göre hesaplandı.

Toplam kolesterol içeriğinin ölçümü
HepG2 hücreleri (5 x 106), buz üzerinde ultrasonik bozulmayla 1 mL ekstraksiyon tamponunda lizize edildi. Homojenat, 4 °C'de 10 dakika boyunca 10.000 x g ile santrifüjlendi ve süpernatant derhal analiz için toplandı. Kolesterol standart stok çözeltisi (50 μmol/mL) hazırlanıp seri olarak seyreltilerek standart bir eğri (0,3125 ila 10 μmol/mL) oluşturuldu. Kolesterol test setinde bulunan bir, iki ve üç reaktiflerin karıştırılması ve 37 °C'ye kadar ısıtılması sonucu çalışan bir kromojenik çözelti hazırlandı. Örnekler veya standartlar çalışan çözeltiyle karıştırıldı, 37 °C'de 30 dakika kuluçka altına alındı ve soğukkanlık 500 nm olarak ölçüldü. Kolesterol içeriği standart eğriye göre hesaplandı.

İmmünofloresans boyama
Örtü örtülerinde yetiştirilen hücreler buz gibi PBS ile duruldu ve oda sıcaklığında %4 paraformaldehit ile 15 dakika sabitlendi. PBS yıkamalarından sonra, hücreler %0,1 Triton X-100 ile 10 dakika geçirimli hale getirildi ve gece boyunca %5 BSA ile 4 °C'de bloklandı. Hücreler daha sonra gece boyunca 4 °C'de primer anti-SIRT3 antikoru (1:500 seyreltme) ile kuluçka edildi. PBS yıkamalarının ardından, hücreler floresans ile konjuge edilmiş ikincil antikor (1:2000 seyreltme) ile oda sıcaklığında karanlıkta 1 saat kuluçka edildi. Çekirdekler 10 dakika boyunca DAPI (0,5 μg/mL) ile boyandı. Kapak kaymaları, anti-fade montaj ortamı kullanılarak cam slaytlara monte edildi ve floresans mikroskopu altında görselleştirildi.

RNA çıkarımı ve nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR)
Toplam RNA, RNA Doku/Hücre Kiti kullanılarak hücrelerden çıkarıldı. Genomik DNA çıkarıldı ve cDNA gDNA RT kiti kullanılarak sentezlendi. Nicel PCR, qPCR kiti kullanılarak gerçek zamanlı PCR tespit sisteminde gerçekleştirildi. Gene özgü primer dizileri Tablo 1'de verilmiştir.

Western Blot analizi
Karaciğer dokularından protein ekstraksiyonu için yaklaşık 50-200 mg doku tartıldı, bir petri kabında doğrandı ve homojenizatora aktarıldı. Protein bozulmasını önlemek için önceden soğutulan lizis tamponu (RIPA tamponu) eklenerek proteaz ve fosfataz inhibitörleriyle desteklenmiştir. Homojenizasyon doku üzerinde tam bozulma sağlamak için buz üzerinde kapsamlı şekilde gerçekleştirildi ve homojenat bir santrifüj tüpüne aktarılıp protein çözünürlüğünü kolaylaştırmak için 30 dakika boyunca buzda kuluçka edildi. Daha sonra, homojenat 4 °C'de 12.000 x g sıcaklıkta 10-30 dakika boyunca santrifüj edildi ve süpernatant özenle toplam protein ekstraktı olarak toplanarak peletten gelen kontaminasyondan kaçındı. Hücresel protein ekstraksiyonu için, hücrelere önceden soğutulmuş lizis tamponu (%1 Triton X-100 ve proteaz inhibitörleri içeren RIPA tamponu) eklendi, ardından tam lizis sağlanmak için 15-30 dakika buzda kuluçka yapıldı. Hücre bozulması, hücre kazıyıcıyla tekrar tekrar kazıma veya güçlü pipetleme ile sağlandı. Lizat, bir santrifüj tüpüne aktarıldı ve 4 °C'de 14.000 x g sıcaklıkta 30 dakika boyunca santrifüj edildi ve üst düzey protein ekstraktı olarak toplandı. Protein konsantrasyonu BCA protein test kiti kullanılarak nicelendirildi ve aliquotlar gelecekteki Western blot analizi için -80 °C'de saklandı veya doğrudan numune hazırlamak için kullanıldı. Protein örnekleri Laemmli tamponunda 100 °C'de 10 dakika boyunca denatüre edildi, SDS-PAGE ile ayrıldı ve PVDF membranlarına aktarıldı. Zarlar, oda sıcaklığında 2 saat boyunca %5 yağsız sütle tıkanmış ve ardından 4 °C'de gece boyunca spesifik primer antikorlarla kuluçka altına alınmıştır. Yıkamadan sonra, zarlar HRP ile konjuge ikincil antikorlarla oda sıcaklığında 1 saat kuluçka edildi. Protein bantları, geliştirilmiş kemilyüminsans (ECL) alt yüzeyi kullanılarak görselleştirildi. Kemilyünesan sinyaller yakalandı ve bant yoğunlukları ImageJ yazılımı kullanılarak densitometrik analizle nicelendirildi. Ham Western lekeleri Ek Dosya 1'de sağlanmıştır.

İstatistiksel analiz
Tüm veriler, ortalama ± ortalama standart hatası (SEM) olarak ifade edilir. İki grup arasında istatistiksel karşılaştırmalar, eşleşmemiş bir Öğrenci t-testi kullanılarak gerçekleştirildi. Üç veya daha fazla grup arasındaki karşılaştırmalar için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) uygulandı, ardından çoklu karşılaştırmalar için Tukey'nin sonradan yaptığı test uygulandı. Tüm istatistiksel analizler GraphPad Prism yazılımı (Sürüm 9.5.0) kullanılarak gerçekleştirildi. 0,05'in altında olan p-değeri istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

GZRG, HFD kaynaklı T2DM farelerinde insülin direncini ve glukoneogenezi iyileştirmiştir
HFD kaynaklı tip 2 diyabet hastalığı (T2DM) fare modeli, insülin direnci, hiperglisemi ve dislipidemi ile karakterize edilir ve hastalık patogenezini araştırmak ve terapötik müdahaleleri değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır30. Mevcut çalışmada, GZRG'nin etkinliği ve temel mekanizmalarını değerlendirmek için C57BL/6J farelerinde HFD kaynaklı bir T2DM modeli oluşturuldu.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışma, GZRG'nin hem in vivo hem de in vitro T2DM modellerinde, öncelikle SIRT3-MPC1-PC/PDH ekseninin modülasyonu yoluyla karaciğer glukoneogenezinin baskılanması yoluyla önemli antihiperglisemik ve insülin duyarlılaştırıcı etkiler gösterdiğini göstermektedir. Deneysel veriler, GZRG uygulamasının açlık hiperglisemisini azalttığını, glikoz ve insülin toleransını iyileştirdiğini, lipid homeostazını geri getirdiğini ve HFD kaynaklı diyabetik farelerde karaciğer steatoz...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Tüm yazarlar, bu makalede bildirilen çalışmayı etkileyebilecek herhangi bir rekabet eden finansal çıkarları veya kişisel ilişkileri olmadığını belirtir.

Teşekkürler

Bu araştırma, Jilin Eyaleti Bilim ve Teknoloji Kalkınma Planı, hibe numarası 20210101199JC, YDZJ202301ZYTS454 tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
FastKing gDNA RT SuperMix  Çözüm Dışı Bırakıyor;    Tiangen Biotech Co., Ltd. (Çin). KR118-02
Glukoz-6-fosfataz (G6Pase) AntikorWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Çin)LJS-D-12610
gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH) AntikorWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Çin)LJS-T-0004
Glikozillenmiş hemoglobin ELISA kitleri     Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd. (Çin).MM-0159M2
GZRGChangchun Çin Tıp Üniversitesi Bağlı Hastanesi (Jilin, Çin)26210483
Yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) kolesterol test kitleriNanjing Jiancheng Biyomühendislik Enstitüsü (Çin)A112-1-1
İnsülin ELISA kitleriJiangsu Meimian Industrial Co., Ltd. (Çin).MM-0579M2
Lipofectamine2000 Invitrogen, ABD11668-019
Düşük yoğunluklu lipoprotein (LDL) kolesterol test kitleriNanjing Jiancheng Biyomühendislik Enstitüsü (Çin)A113-1-1
Glikoz analiz kitlerini ölçmekNanjing Jiancheng Biyomühendislik Enstitüsü (Çin)F006-1-1
mitokondriyal piruvat taşıyıcı 1 (MPC1)AntikorWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Çin)LJS-D-3852
esterleşmemiş yağ asitleri (NEFA) test kitleriNanjing Jiancheng Biyomühendislik Enstitüsü (Çin)A042-2-1
PC AntibodyWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Çin)LJS-D-4364
PDH-E2 AntikorWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Çin)LJS-D-14046
fosfoenolpiruvat karboksikinaz 1 (PCK1)AntikorWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Çin)LJS-D-6770
piruvat karboksilaza (PC) ELISA kitleri Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Çin)LJS-160408H
Piruvat dehidrojenaz (PDH)ELISA kitleri   Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Çin)LJS-160300H
RNA Easy Fast Tissue/Cell Kit   Tiangen Biotech Co., Ltd. (Çin). DP451
SIRT3 AntikorWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Çin)LJS-A-5135
Yetenek SYBR Yeşil qPCR PreMix Tiangen Biotech Co., Ltd. (Çin). FP209-02
toplam kolesterol (TC) test kitleriNanjing Jiancheng Biyomühendislik Enstitüsü (Çin)A110-1-1
trigliserid (TG) test kitleriNanjing Jiancheng Biyomühendislik Enstitüsü (Çin)A111-1-1

Kaynaklar

  1. Ahmad, E., Lim, S., Lamptey, R., Webb, D. R., Davies, M. J. Type 2 diabetes. Lancet (London, England). 400, 1803-1820 (2022).
  2. Singh, A., Shadangi, S., Gupta, P. K., Rana, S. Type 2 Diabetes Mellitus: A Comprehensive Review of Pathophysiology, Comorbidities, and Emerging Therapies. Comp Physiol. 15, e70003(2025).
  3. Lu, X., et al. Type 2 diabetes mellitus in adults: pathogenesis, prevention and therapy. Signal Transduct Target Ther. 9, 262(2024).
  4. Yang, W., Jiang, W., Guo, S. Regulation of Macronutrients in Insulin Resistance and Glucose Homeostasis during Type 2 Diabetes Mellitus. Nutrients. 15 (21), 4671(2023).
  5. Petersen, M. C., Vatner, D. F., Shulman, G. I. Regulation of hepatic glucose metabolism in health and disease. Nat Rev Endocrinol. 13 (10), 572-587 (2017).
  6. Barroso, E., Jurado-Aguilar, J., Wahli, W., Palomer, X., Vázquez-Carrera, M. Increased hepatic gluconeogenesis and type 2 diabetes mellitus. Trends Endocrinol Metab. 35 (12), 1062-1077 (2024).
  7. Dutta, S., et al. Metformin: A Review of Potential Mechanism and Therapeutic Utility Beyond Diabetes. Drug Des Devel Ther. 17, 1907-1932 (2023).
  8. Lebovitz, H. E. Thiazolidinediones: the Forgotten Diabetes Medications. Curr Diab Rep. 19 (12), 151(2019).
  9. Yao, H., et al. Comparative effectiveness of GLP-1 receptor agonists on glycaemic control, body weight, and lipid profile for type 2 diabetes: systematic review and network meta-analysis. BMJ. 384, e076410(2024).
  10. Vallon, V., Verma, S. Effects of SGLT2 Inhibitors on Kidney and Cardiovascular Function. Annu Rev Physiol. 83, 503-528 (2021).
  11. Dou, Z., et al. Syndrome Differentiation and Treatment Regularity in Traditional Chinese Medicine for Type 2 Diabetes: A Text Mining Analysis. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 728032(2021).
  12. Ni, Y., et al. Evidence of traditional Chinese medicine for treating type 2 diabetes mellitus: from molecular mechanisms to clinical efficacy. Pharm Biol. 62 (1), 592-606 (2024).
  13. Wang, J., et al. Effects of three Huanglian-derived polysaccharides on the gut microbiome and fecal metabolome of high-fat diet/streptozocin-induced type 2 diabetes mice. Int J Biol Macromol. 273 (Pt 1), 133060(2024).
  14. Qi, L., et al. Structural characterization of red yeast rice-derived polysaccharide and its promotion of lipid metabolism and gut function in high-fat diet-induced mice. Int J Biol Macromol. 282 (Pt 1), 136744(2024).
  15. Liu, Y., et al. Flavonoid-Rich mulberry leaf extract modulate lipid metabolism, antioxidant capacity, and gut microbiota in high-fat diet-induced obesity: potential roles of FGF21 and SOCS2. Food Med Homol. 1, 9420016(2024).
  16. Wu, H., et al. Efficacy and safety assessment of traditional Chinese medicine for metabolic syndrome. BMJ Open Diabetes Res Care. 8 (1), e001181(2020).
  17. Jin, Z., Wang, X. Traditional Chinese medicine and plant-derived natural products in regulating triglyceride metabolism: Mechanisms and therapeutic potential. Pharmacol Res. 208, 107387(2024).
  18. Chen, S., et al. Screening and identification of active compounds of GanZhiRong granule based on liquid chromatography-mass spectrometry and biomolecular networks. Chinese J Anal Chem. 51, 100294(2023).
  19. Yu, Y., Liu, T., Yang, Y., Wang, H., Liu, Y. Effects of Liver Fat Soluble Granule Comnined and Metformin on Blood Glucose in Diabetic Rats. Jilin J Trad Chinese Med. 39, 654-656 (2019).
  20. Ji, Z., Liu, G. H., Qu, J. Mitochondrial sirtuins, metabolism, and aging. J Genet Genomics. 49 (4), 287-298 (2022).
  21. Zhang, J., et al. Mitochondrial Sirtuin 3: New emerging biological function and therapeutic target. Theranostics. 10 (18), 8315-8342 (2020).
  22. Chen, J., et al. The role of sirtuins in the regulatin of oxidative stress during the progress and therapy of type 2 diabetes mellitus. Life Sci. 333, 122187(2023).
  23. Weng, S., et al. Chaperonin counteracts diet-induced non-alcoholic fatty liver disease by aiding sirtuin 3 in the control of fatty acid oxidation. Diabetologia. 66 (5), 913-930 (2023).
  24. Liang, L., Li, Q., Huang, L., Li, D., Li, X. Sirt3 binds to and deacetylates mitochondrial pyruvate carrier 1 to enhance its activity. Biochem Biophys Res Commun. 468 (4), 807-812 (2015).
  25. Guo, X., et al. The Role of Palmitoleic Acid in Regulating Hepatic Gluconeogenesis through SIRT3 in Obese Mice. Nutrients. 14 (7), 1482(2022).
  26. Han, Y., et al. Bawei Chenxiang Wan ameliorates right ventricular hypertrophy in rats with high altitude heart disease by SIRT3-HIF1α-PDK/PDH signaling pathway improving fatty acid and glucose metabolism. BMC Complement Med Ther. 24 (1), 190(2024).
  27. Wei, X., et al. Both prolonged high-fat diet consumption and calorie restriction boost hepatic NAD+ metabolism in mice. J Nutr Biochem. 115, 109296(2023).
  28. Kavanaugh, J. W. Skeletal Muscle Acetylation in Response to an Acute and Chronic High-Fat Diet [Doctoral Dissertations]. , Virginia Tech. (2017).
  29. Lee, M. R., Yang, H. J., Park, K. I., Ma, J. Y. Lycopus lucidus Turcz. ex Benth. Attenuates free fatty acid-induced steatosis in HepG2 cells and non-alcoholic fatty liver disease in high-fat diet-induced obese mice. Phytomedicine. 55, 14-22 (2019).
  30. Qu, X., et al. Riligustilide alleviates hepatic insulin resistance and gluconeogenesis in T2DM mice through multitarget actions. Phytother Res. 36 (1), 462-474 (2022).
  31. Rui, L. Energy Metabolism in the Liver. Compr Physiol. 4, 177-197 (2014).
  32. Li, A., et al. Berberine Reduces Pyruvate-driven Hepatic Glucose Production by Limiting Mitochondrial Import of Pyruvate through Mitochondrial Pyruvate Carrier 1. EBioMedicine. 34, 243-255 (2018).
  33. Tavoulari, S., Sichrovsky, M., Kunji, E. R. S. Fifty years of the mitochondrial pyruvate carrier: New insights into its structure, function, and inhibition. Acta Physiol (Oxford, England). 238 (4), e14016(2023).
  34. Dutta, S., et al. Metformin: A Review of Potential Mechanism and Therapeutic Utility Beyond Diabetes. Drug Des Devel Ther. 17, 1907-1932 (2023).
  35. Xu, G., et al. Mitochondrial ACSS1-K635 acetylation knock-in mice exhibit altered metabolism, cell senescence, and nonalcoholic fatty liver disease. Sci Adv. 10 (20), eadj5942(2024).
  36. Jin, L., et al. FGF21-Sirtuin 3 Axis Confers the Protective Effects of Exercise Against Diabetic Cardiomyopathy by Governing Mitochondrial Integrity. Circulation. 146 (20), 1537-1557 (2022).
  37. Ning, Y., et al. SIRT3: A potential therapeutic target for liver fibrosis. Pharmacol Ther. 257, 108639(2024).
  38. Xian, Y., et al. Enhanced SIRT3 expression restores mitochondrial quality control mechanism to reverse osteogenic impairment in type 2 diabetes mellitus. Bone Res. 13 (1), 30(2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

SIRT3 Yoluİnsülin DirenciPirüvat MetabolizmasıHepG2 HücreleriProtein EkspresyonuLipid MetabolizmasıGlikoz Toleransı
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.