Bu protokol, tümör anjiyogenezinin nicel proteomik analizi için lazer-yakama mikrodiseksiyonu kullanarak glioma örneklerinden yeterli yüksek kaliteli neovasküler doku hazırlamış, geleneksel olarak anjiyojenik faktörlere odaklanan çalışmaların sınırlamalarını aşmış ve glioma anjiyogenezinin geniş ölçekli proteomik profilini sağlamıştır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsan Glioma Dokularından Neovasküler Dokuların Tümör Anjiyogenezinin Nicel Proteomik Analizi İçin Hazırlanması
Bu makalede
Özet
Özet
Glioma, merkezi sinir sisteminin birincil kötü huylu tümörlerini temsil eder ve önemli sıklık ve ölüm oranı içerir. Tümör anjiyogenezi, glioma patofizyolojisinin ayırt edici özelliğidir ve tümör ortamında önemli bir olaydır. Tümör neovaskülarizasiyasının anormal yapısı çift rol oynar: besin kaynağı ve tümör hücresinin kan dolaşımına girmesini sağlayan metastatik bir portal. Anti-anjiyogenez tedavisi, kanser alanında sıcak bir konudur. Önceki çalışmaların çoğu, tümör anjiyogenezinin aktive edici ve inhibitör faktörlerine odaklanmıştır; ancak bu sadece tümör anjiyogenezini çok sınırlı bir aralıkta netleştirir. Anormal protein ekspresyonu veya translasyon sonrası değişiklikler, gliomada kan damarlarının anormal morfolojisine katkıda bulunur. Bu protokol, glioma dokularından yeterli miktarda neovasküler doku izole etmek ve saflaştırmak için lazer-yakalama mikrodiseksiyon (LCM) kullandı; bu yöntem, glioma neovasküler dokularında kontrollere kıyasla farklı şekilde ekspresyona sahip proteinleri belirlemek için izotop etiketli nicel proteomik analizinde kullanıldı. Bu veriler, tümör anjiyogenezinin patolojik mekanizmalarını aydınlatmak, anti-anjiyojenik terapötik hedeflerin keşfedilmesi ve tümör anjiyogenezi temelli biyobelirteçlerin oluşturulması için kritik bilimsel bir temel sağlar.
Giriş
Gliomalar, glial hücrelerden kaynaklanan venöron 1'e yapısal ve metabolik destek sağlayan yüksek derecede heterojen merkezi sinir sistemi (MSS) tümörleridir ve histolojik olarak alt tiplere ayrılırlar: astrositomalar, oligodendrogliomalar ve ependimomalar2. WHO derecelendirme sistemine göre, glioma dereceleri I ve II, düşük dereceli gliomlardır (LGG) ve genellikle yavaş büyüme hızları ve potansiyel uzun vadeli stabiliteyle karakterize edilir ve genellikle anatomik konuma göre cerrahi rezeksiyona uygundur. Buna karşılık, derece III ve IV yüksek dereceli gliomalardır (HGG), ağırlıklı olarak farklılaşmamış ve kötü niyetli, yüksek invaziv davranışa ve kötüprognoza sahip 3. Mevcut tedaviler sınırlı ve büyük ölçüde etkisiz hale gelmektedir; Ameliyat sonrası radyoterapi/kemoterapi ile birlikte maksimum güvenli rezeksiyon, prognozu orta derecede iyileştirirken, tümörlerin yayılan infiltratif büyümesi ve belirsiz sınırları nedeniyle radikal rezeksiyonu önleyen belirsiz sınırlar nedeniyle önemli sınırlamalar ve toksisiteler devam etmektedir 4,5. İnsan gliomaları, özellikle yüksek derecelerde glioma, yüksek damarlı kötü huylu tümörlerdir ve büyüme, çoğalma ve invazasyonları anormal neovaskülerleşmelerine büyük ölçüde bağlıdır; bu da gliomamalignitesinin kritik bir özelliğidir 6,7. Hedefleme tümörü anjiyogenez çalışması, terapötik atılımlar açısından önemli bilimsel avantajlara sahiptir.
Anjiyogenez, temel olarak endotel hücre çoğalması, göçü ve belirli uyaranlar altında farklılaşmayı içerir; araştırmalar şu düzenleyicilere odaklanır: (i) indüktörler, damar endotel büyüme faktörü (VEGF)8, vasorin (VASN)9, hipoksi indükleyici faktör 1 (HIF1)10, dönüşüm büyüme faktörü β (TGF-β)11, endokan12, trombositten teşrelenen büyüme faktörü (PDGF)13 ve epidermal büyüme faktörü (EGF)14 dahil olmak üzere indüktörler; ve (ii) inhibitörler; bunlar arasında anjiyostatin15, endostatin16, trombosit aktive edici faktör reseptörü-1 (TSP-1)17 ve metalloproteinazların doku inhibitörleri (TIMP'ler)18 bulunur. Faz I/II/III beyin tümörü klinik denemelerinde, çoğu anti-anjiojenik ilac, anjiyogenezdeki merkezi rolü nedeniyle VEGF sinyalini hedef alır; örneğin, VEGF blokajı 19,20,21 ile neovaskülarizasasyonu engelleyen monoklonal bir antikor olan bevacizumab örneğidir. Ancak, son faz II/III çalışmalar, bevacizumab ve lomustine ile lomustin alan ileri glioblastoma hastalarında yalnızca lomustine kıyasla anlamlı genel sağlıkta anlamlı bir faydagöstermedi 19,20,21,22. Kritik olarak, anti-VEGF tedavi damar anormalliklerini iyileştirir ancak doğrudan tümör sitotoksisitesi olmadan sadece anjiyogenezi bastırır ve tedavi direnci artırabilir. Sonuç olarak, tek bir veya birkaç anjiyojenik düzenleyiciyi hedef almak radikal bir tedavi sağlamaz; Etkili stratejiler, anjiyogenezin eşzamanlı baskılanmasını ve tümör istilası ile metastazı vasküler yollarla bloke edilmesini gerektirir. Gliomlardaki proteinlerin tanısal ve prognostik değeri iyi bilinmektedir, ancak malign glioma tedavisinde on yıllar içinde sınırlı ilerleme kaydedilmiştir.
Proteomik, biyolojik örneklerdeki tüm proteinleri, ifade profilleri, translasyon sonrası modifikasyonlar (PTM) ve etkileşimler dahil olmak üzere, kütle spektrometrisi (MS) tabanlı tekniklerle, üstten aşağı (TDP) ve aşağıdan yukarıya (BUP) yaklaşımlar dahil olmak üzere küresel olarak analiz edebilir. Yüksek verimli MS, her koşuda on binlerce proteinin tanımlanmasını sağlar; bu da tümör mekanizmalarının incelenmesi ve terapötik hedef tanımlaması için vazgeçilmezdir. Protein bolluğu ve PTM'leri, glioma dokularında ve kan ve türevleri 23,24,25, beyin omurilik sıvısı 26 ve idrar 27 gibi sıvı biyopsilerde tanımlanabilir. Tümör damar sisteminde anormal protein ekspresyonları ve PTM'ler patolojik damar değişikliklerini tetikler. Glioma neovaskülerizasyonundaki protein değişiklikleri, glioma neovaskülerizasyonunun güvenilir proteomik profillenmesi için protokol geliştirilmesini sağlayan proteomik ile tanımlanabilir.
Ancak, neovasküler dokular tüm glioma dokularındaki bileşenlerden sadece biridir. Tüm glioma dokularından neovasküler dokuların izolasyonu ve saflaştırılması, glioma anjiyogenezisinin doğru nicel proteomik analizi için kilit adımdır. Lazerle yakalanan mikrodiseksiyon (LCM)28,29,30,31, tüm glioma dokularından neovasküler dokuları izole etmek ve saflaştırmak için etkili bir yaklaşımdır. Nicel proteomik için yeterli miktarda neovasküler doku proteini elde etmek çok zordur. 2007 yılında bir araştırma ekibi, proteomik analizi için neovasküler dokuları derece IV gliomadan ayırmak amacıyla LCM kullanmaya çalıştı ve sadece dört MS32 proteini tespit edildi. Daha sonra, 2012'de, LCM'yi sürekli olarak IV. derece glioma neovasküler dokularını nicel proteomik analizi için zenginleştirmek için kullandılar; bu da MS33 ile yalnızca 29 proteini tespit etti. Bu iki glioma anjiyogenezi proteomik çalışması, glioma anjiyogenezinde çok düşük proteomik verimlilik göstermektedir; bu da glioma anjiyogenezinin karmaşık proteomik manzarasını temsil edemez.
Bu protokol, glioma anjiyogenezinin nicel proteomik analizi için yeterli miktarda neovasküler protein edinmesini sağlayan bir prosedür geliştirmiş ve böylece tümör anjiyogenezi için büyük ölçekli bir proteomik manzara oluşturulmuştur. Bu, etkili anjiyojenez tabanlı biyobelirteçler ve anti-anjiyogenez tedavi hedefleri/ilaçlarının keşfi açısından önemli bilimsel bir değere sahiptir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
İnsan dokusu örneklerini içeren bu protokol, Shandong Birinci Tıp Üniversitesi Tıbbi Etik İnceleme Komitesi tarafından onaylanmış (Onay no. R202211090133) ve hastalardan ve hasta ailesinden bilgilendirilmiş onay alınmıştır. Bu çalışmada kullanılan glioma örneklerinin tamamı, Central South Üniversitesi Xiangya Hastanesi beyinşirürji bölümünden yapılan nörocerrahi rezeksiyon örneklerinden alınmıştır; bunlar arasında 7 astrositoma grade III doku vakası bulunmaktadır. Normal kontrol damarları (n = 3), beyin travması nedeniyle çıkarılan hasarlı beyin dokusundaki mikrodamarlardan alındı. Tüm hastalar, ameliyattan önce önce radyoterapi veya kemoterapi almadan ilk kez başvurmuştu ve hepsi Central South Üniversitesi Xiangya Hastanesi patoloji bölümü tarafından teşhis edildi. Xiangya Hastanesi'nde, glioma olmadan (dış kuvvetle hasar görmüş) normal beyinden çok küçük kan damarlarının beyin cerrahisi rezeksiyonu yoluyla üç normal kontrol damar dokusu elde edilmiştir. Reaktifler ve kullanılan ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.
1. İnsan glioma dokularından neovasküler dokuları izole etmek için LCM kullanımı
- LCM slaytı hazırlayın: Polietilen naftalat (PEN) membranını yeniden kullanılabilir metal kaydırmalara elle kaplamak ve kaplamalı slaytları -80 °C'de saklayın.
NOT: Donmuş doku kesitlerini doğrudan yapıştırmak için önceden kaplanmış metal slaytlar kullanılacaktır. - Toluidin mavisi boyama çözeltisi (%0,5) hazırlayın: 0,25 g toluidin mavisini 40 mL ddH₂O içinde çözürün. Bir proteaz inhibitörü tableti ekleyin ve tamamen çözünene kadar karıştırın. DdH₂O ile sesi 50 mL'ye ayarlayın, filtreleyin ve buzda saklayın.
- Doku işleme: Kriyostatı çalışma sıcaklığında (-25 °C oda/örnek başı) tutun. -80 °C depolamadan glioma dokusu alın, buz üzerinde aktarın, kanı filtre kağıdıyla alın ve gömülmek için uygun doku bloklarını seçin.
- Gömülü doku protokolü: Numune diskini önceden soğutma. Gömülü ortamı uygulayın ve doku bloğunu hızla yerleştirin. Tüm bloğu -25 °C'de 10 dakika boyunca dondurarak sertleşme için.
- Doku ve ekran damarlarını kesin: 8 μm kalınlıkta dokuları kesin. Doku kesitlerini standart slaytlara monte edin, dokuyu toluidin mavisi boyama çözeltisiyle boyantın ve neovasküler damarları optik mikroskopi altında ekranlayın.
NOT: Eğer damar tespit edilmezse, 3–5 doku kesitini atın ve boyama döngüsünü tekrarlayın, ta ki neovasküler damar bölgeleri ortaya çıkana kadar. - Hazırlanan LCM slaytına damar pozitif doku kesitini monte edin: Damar pozitif bölümleri PEN kaplı LCM slaytlarına aktarın, sızdırdırın, etiketleyin ve -80 °C'de saklayın.
- LCM kaydırma üzerine monte edilen doku kesitlerini önceden soğutulmuş %70 etanol (4 °C, 1–2 dakika) ile sabitleyin; %0,5 toluidin mavisi (4 °C, 30 s) ile boşaltma ve boyama; Lekesi boşaltın, ddH₂O'da (4 °C; iki ayrı yıkama banyosu) iki kez durulayın, süzürün, proteaz inhibitörü çözeltisinde (30 s) kuluçka yapın ve -80 °C'de saklayın.
- LCM cihazını önceden çalıştırın, 30 dakika önceden ısıtın, katı hal kızılötesi lazeri kullanarak 30 dakika daha ön ısıtın ve ardından 500 μL mikrosantrifüj tüp toplama cihazı takın.
- Doku örneğine monte edilen LCM dilimlerini (-80 °C'de depolanan) hazırlanmış LCM cihazına yükleyin ve uyumlu yazılımın yardımıyla glioma dokularındaki neovasküler damarlara odaklanmayı ayarlayın.
- Neovasküler damarın dış kenarı boyunca lazer işaretleme çizgisini tam olarak çizin (damar duvarından kaçının), lazerle neovasküler damarları yakıp ayırın, ardından bunları EP tüp kapağına toplayın.
NOT: Neovasküler damarların tamamen ayrıldığından emin olmak için ikinci lazer yanımını kullanın. - Toplanan neovasküler gemi örnek tüpünü ters çevirip kapatın ve -80 °C dondurucuda saklayın.
2. LCM izole edilmiş glioma neovasküler dokularından proteinlerin ekstraksiyonu ve protein içeriğinin nicelendirilmesi
- %4 sodyum dodesil sülfat (SDS), 1 mM ditiothreitol (DTT) ve 150 mM Tris-HCl (pH 8.0) içeren protein ekstraksiyon tamponu hazırlanın.
NOT: SDS, gözleri, cildi ve solunum yollarını ciddi şekilde tahriş eden tehlikeli bir tozdur ve bu tozlar bir duman başlığında tartılmalıdır; ve DTT bir tahriş edicidir, bu da bir buhar davlumbazında tartılması gerekir. - LCM tarafından toplanan glioma neovasküler damar dokularını ekstraksiyon tamponunda yeniden askıya alın. Tam liz için buzlu su banyosu üzerinde 1 dakika sonikasyon yapın.
- 16.000 x g ile 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı yeni mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
- Aliquot protein niceliği için minimum üst-üstlük. Kalan üst yüzeye DTT ekleyin (son konsantrasyon: 1 mM DTT), kabarcıkları önlemek için pipetle nazikçe karıştırın. Aliquot ve -80 °C'de depolayın.
- Aşağıdaki adımları izleyerek bicinchoninic acid (BCA) protein testi yapın:
- Çalışma çözümünü hazırlayın (Reaktif A:B = 50:1).
- Sığır serum albümini (BSA) standardı (0.5 mg/mL) hazırlayın.
- Karşılık gelen çözümleri Tablo 1'e göre ekleyin.
- Örnekleri/standartları çalışan çözeltiyle karıştırın ve 96 kuyruklu bir plakaya aktarın.
- 37 °C'de 30 dakika kuluçka yapın.
- 562 nm'de soğurma noktasını ölç.
- Konsantrasyonları standart eğriye karşı hesaplayın.
3. Hazırlanan neovasküler proteinleri analiz etmek için nicel proteomiklerin kullanılması
- Çıkarılan neovasküler proteinlerin triptik peptid örneklerini hazırlamak.
- Her ekstraksiyon edilen protein örneğine buz gibi aseton ekleyin (tümör; kontrol) (örnek: aseton = 1:5, v/v), iyice karıştırın ve -20 °C'de 1 saat kuluçka yapın. 12.000 x g (4 °C) sıcaklıkta 15 dakika boyunca santrifüj yapın. Protein ekstraksiyon reaktiflerini (SDS, DTT ve Tris-HCL) çıkarmak için üst örtü atın ve pelleti 20 μL çözünme tamponunda 1 μL %1 SDS ile yeniden süzülerek kullanın.
NOT: Güvenlik gözlüğü takarak yeterli havalandırmalı aseton kullanın, ateşleme kaynaklarından uzak durun ve atıkları özel ve kıvılcım geçirmez bir kapta atın. - Her numuneye 2 μL indirgentici reaktif (DTT) ekleyin, iyice karıştırın ve 60 °C'de 1 saat kuluçka yapın. 1 μL sistein bloklayıcı reaktif (iyodoasetamide) ekleyin, ardından oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın.
- Her örteneğe tripsin (protein: tripsin = 20:1, v/v) ekleyin. Vortex karışımı yapın ve gece boyunca 37 °C'de kuluçka yapın.
- Her ekstraksiyon edilen protein örneğine buz gibi aseton ekleyin (tümör; kontrol) (örnek: aseton = 1:5, v/v), iyice karıştırın ve -20 °C'de 1 saat kuluçka yapın. 12.000 x g (4 °C) sıcaklıkta 15 dakika boyunca santrifüj yapın. Protein ekstraksiyon reaktiflerini (SDS, DTT ve Tris-HCL) çıkarmak için üst örtü atın ve pelleti 20 μL çözünme tamponunda 1 μL %1 SDS ile yeniden süzülerek kullanın.
- Hazırlanan triptik peptiptleri etiketlemek için göreceli ve mutlak nicelik (iTRAQ) reaktifleri için İzobarik targlar kullanın.
NOT: Bu protokolde, triptik peptit örneklerini (tümör; kontrol) etiketlemek için altı pleksli iTRAQ reaktifleri (plex etiketleri 113, 114, 115, 116, 117 ve 118) kullanılır; her örnek türü üç kez etiketlenir (Tablo 2).- Her iTRAQ reaktif tüpünü 50 μL izopropanol ile yeniden yapılandırın.
- Triptik peptid örneklerini ilgili reaktif tüplerine ekleyin, oda sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın.
- Reaksiyonları 3× hacim ultra saf su ekleyerek sonlandırın, ardından oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka yapın.
- Etiketlenmiş altı örneği eşit şekilde birleştirin, iyice karıştırın ve liyofilizasyon yapın.
- iTRAQ etiketli triptik peptid örneğini fraksiyonlamak için güçlü katyon değişimi (SCX) kullanın.
- 2 mL A çözeltisinde liyofilize peptitler yeniden oluşturulur (10 mM KH₂PO₄, %25 ACN, pH 2.7). Bir Sülfoetil fonksiyonel katyon değişim kolonuna yük (4.6 × 100 mm, 5 μm, 200 Å).
- B çözeltisi (500 mM KCl, 10 mM KH₂PO₄, %25 ACN, pH 2.7) kullanılarak 1 mL/dakika sabit akış hızıyla elyut yapın: 0 %→10 % (2 dakika) → %10→20 % (25 dakika) → %20→45 % (5 dakika) → %50→100 % (5 dakika). Süreç boyunca 214 nm'de izleyin, her tüp başına her dakika topla, toplamda 30 fraksiyon elde edin.
- Her fraksiyonu vakum santrifüjle konsantre edin ve ardından %0,1 (v/v) triffloroasetik asit (TFA) ile 40 μL ile yeniden yapılandırılın. Tüm 30 fraksiyon -80 °C sıcaklığında dondurucuda saklanır.
NOT: TFA son derece aşındırıcı ve toksiktir, ciddi cilt ve göz hasarına yol açar ve solunum sistemini tahriş eder; uygun PPE ile birlikte bir duman davlumonunda ele alınmalı, asîde dirençli eldivenler, gözlükler ve laboratuvar önlüğü bulunmalı, atık ise asidik atık olarak toplanmalıdır.
- Her fraksiyonlu peptid örneğini analiz etmek için LC-MS/MS kullanın.
- Tuzu detuzlamak için C18 ters fazlı katı faz ekstraksiyon kartuşu (standart yoğunluk, yatak numarası 7 mm, hacim 3 mL) kullanın.
- Her fraksiyondan 10 μL ile birlikte C çözeltisi (%0,1 Formik asit) ve D çözeltisi (%80 asetonitril ve %0,1 Formik asit) gradyanı ile 140 dakika boyunca 250 nL/dakika hızında bir C18 ters faz sıvı kromatografi (LC) sütunu (10 cm uzunluk, 75 μm identifikasyon, 3 μm reçine) kullanılabilmektedir.
- LC-ayrılmış peptitleri MS/MS analizi için yüksek çözünürlüklü bir kütle spektrometresine çevrimiçi girer.
- Q Exactive tarafından oluşturulan ham spektrum dosyalarını (.raw, Proteome Discoverer 1.4 ile .mgf formatına dönüştürün ve ardından bu .mgf dosyalarını, yazılımın yerleşik modülü olan MASCOT 2.2 sunucusuna veritabanı arama için gönderin.
NOT: Uniprot insan veritabanı (toplam 146.704 dizi; 20 Temmuz 2025'te http://www.uniprot.org'den indirildi) ayrıntılı arama parametreleriyle birlikte kullanılmıştır (Tablo 3). - MASCOT sunucusundan çıkan arama dosyalarını (.dat) tekrar Proteome Discoverer 1.4'e geri alın. Yüksek güvenlikli tanımlamalar elde etmek için yanlış keşif oranı (FDR) eşiği <0.01 filtreleme için veriler.
- MS/MS verileriyle protein amino asit dizisini belirleyin, protein bolluğunu iTRAQ raporlayıcı iyon yoğunluklarıyla nicelikle ölçün.
- Deneysel tekrarlanabilirliği hesaplayarak diferansiyel olarak ifade edilen proteinlerin (DEP'ler) kesme değeri ile anlamlılık p<0,05 ile belirlenir.
NOT: Bu çalışmada kesme değeri 1.4 > katlama değişimi (FC) olarak belirlenmiştir ve bu da sistematik hataları etkili bir şekilde ortadan kaldırabilir.
- Glioma neovasküler DEP'lerin fonksiyonel özelliklerini analiz edin.
- DAVID (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, sürüm 6.7; https://david.ncifcrf.gov/) ana sayfasına erişin ve analiz başlatmak için menü çubuğundan Analiz Başlat'ı seçin.
- Sol paneli seçin, yükleme arayüzü olarak hizmet verir; Protein veya gen kimliklerini Step 1 giriş kutusuna (kopyala-yapıştır işlevi kullanılarak) girin.
- Adım 2 için, yüklenen proteinlerle eşleşen tanımlayıcı tipini seçin; bu çalışmada UniProt Accession kullanıldı.
- Adım 3 için, gen listesi veya arka plan ayarlarını seçin: Gen zenginleştirme analizi, arka plan gen seti seçmeyi gerektirir. Sistem varsayılan olarak türün tüm genomunu kullanır veya kullanıcılar arka plan olarak özel bir protein/gen listesi yükleyebilir.
- Gönderme Listesi'ne tıklayarak başvuruları gönderin ve analizi başlatın.
NOT: Analiz sonuçları "Annotasyon Özet Sonuçları" panelinin sağ tarafında gösterilmektedir. Kullanıcılar, analitik ihtiyaçlara göre çıktı seçebilirler; bu çalışma, özellikle DEP'leri içeren biyolojik süreçleri analiz etmek için GOTERM_BP_FAT listesini kullanmıştır. - Glioma neovasküler DEP'ler için biyolojik süreçler (BP'ler), hücresel bileşenler (CC'ler), moleküler fonksiyonlar (MF'ler) ve KEGG yollarını elde edinin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Nicel proteomik için yeterli miktarda LCM izole protein örneği alındı
Glioma neovasküler dokularında farklı olarak ifade edilen proteinlerin güvenilir proteomik profilleri elde etmek için, bu çalışma en yaygın glioma alt tipi olan astrositoma Grade III seçildi ve zengin neovasküler damarların bulunabilirliği nedeniyle LCM kullanılarak izole edilmiş neovasküler dokuları seçti. Ayrıca, nicel proteomik için örnek başına ≥400 μg protein gereklidir...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
LCM, izotop etiketlemeli nicel proteomiklerle birleştiğinde, glioma anjiyogenezinin ilk büyük ölçekli proteomik profilini tespit etti
Tümör anjiyogenezi, gliomların kritik patolojik bir özelliğidir ve yüksek invazivlik ve terapötik dirençleriyleyakından ilişkilidir 6,7. Geleneksel anti-anjiojenik tedaviler (örneğin VEGF inhibitörleri) hedef monotonluğu ve telafi direnç nedeniyle sınırl...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir.
Teşekkürler
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimsel Fonları (81272798-dan X.Z.'ye ve 82203592 N.L.'ye), Shandong Eyalet Doğa Bilimleri Vakfı (ZR2022QH112-N.L.), Shandong Eyaleti Taishan Akademisyen Mühendislik Projesi Özel Fonları (NO.tstp20221143'ten X.Z.'ye), Çin Ulusal Yüksek Düzey Yabancı Uzman Yetenek Programı (H20240743; Yabancı Uzman: X.Z.), ve Shandong İlk Tıp Üniversitesi Gelişen Stratejik Alanlarda Bilimsel Araştırma Yetiştirme Projesi (202403) ile birlikte yer aldı.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 96-Well Plakası | Thermo Fisher Scientific (ABD) | 468667 | Tüketim Malzemeleri |
| Aseton | NanJing Reaktifi (Çin) | C0720114023 | Reaktif |
| Asetonitril | Merck (Çin) | CN34892 | Reaktif |
| BCA Protein Test Kiti | Abcam (Birleşik Krallık) | ab102536 | Reaktif |
| Sığır serum albümini (BSA) standardı | Solarbio (Çin) | PC0001-1 | Reaktif |
| Santrifüj tüpü (50ML) | Kirgen (Çin) | KG2811 | Tüketim Malzemeleri |
| Kriyostat Mikrotomu | Leica (Almanya) | 1900 yılları | Ekipman |
| Sistein | Aladdin (Çin) | C108238 | Reaktif |
| DL-Ditiothreitol(DTT) | Amresco (ABD) | D8220 | Reaktif |
| EASY-Spray C18 Ters Faz HPLC Kolonu | Thermo Scientific (ABD) | ES800A | Tüketim Malzemeleri |
| Elektronik Denge | Sartorius (ABD) | BSA224S | Ekipman |
| Gömülü ortam | Leica (Almanya) | 39475237 | Tüketim Malzemeleri |
| Empore SPE kartuşları C18 | Sigma-Aldrich (ABD) | 66872-U | Tüketim Malzemeleri |
| Eppendorf Tüpü | Kirgen (Çin) | KG2211 | Tüketim Malzemeleri |
| Filtre Kağıdı | Cytiva (ABD) | 42. sınıf | Tüketim Malzemeleri |
| Formik asit | Aladdin (Çin) | F112032 | Reaktif |
| Cam Şişere | SHUBO (Çin) | 1015479 | Tüketim Malzemeleri |
| Cam Gradasyonlu Silindir | SHUBO (Çin) | 1601 | Tüketim Malzemeleri |
| Yüksek Çözünürlüklü Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometrisi | Thermo Scientific (ABD) | Q-Exactive | Ekipman |
| Yalıtılmış Konteyner | Fhefon (Çin) | LCZYX-12 | Tüketim Malzemeleri |
| Ters Mikroskop | Leica (Almanya) | XDS-1 | Ekipman |
| İyodoasetamid | Solarbio (Çin) | I8010 | Reaktif |
| İzopropanol | Aladdin (Çin) | I112018 | Reaktif |
| iTRAQ reaktifleri | Sigma-Aldrich (ABD) | 4381663 | Reaktif |
| KCl | Beyotime (Çin) | ST1596 | Reaktif |
| KH2PO4 | ShangHai YuanYe (Çin) | S24278 | Reaktif |
| Lazerle yakalama mikrodiseksiyonu | Leica (Almanya) | LMD 6000 | Ekipman |
| Lazerle yakalama mikrodiseksiyon slaytı | Leica (Almanya) | 3800040 | Tüketim Malzemeleri |
| Leica Yüksek Profilli Tek Kullanımlık Bıçaklar | Leica (Almanya) | 14035838926 | Tüketim Malzemeleri |
| Sıvı Azot Kabı | KEYICRYO (Çin) | YDS-3 | Ekipman |
| Manyetik Sıcak Plaka Karıştırıcı | ShanghaiSILE (Çin) | LAB-0002-0068-SHSL | Ekipman |
| Microplate Reader | TECAN (İsviçre) | INFNITE F200 | Ekipman |
| PEN Zar | Leica (Almanya) | 11505189 | Tüketim Malzemeleri |
| PH ölçer | Sartorius (ABD) | PB-10 | Ekipman |
| Pipet | Eppendorf (Almanya) | 3123000268 | Ekipman |
| Pipet | Eppendorf (Almanya) | 3123000241 | Ekipman |
| Pipet | Eppendorf (Almanya) | 3123000225 | Ekipman |
| PoliSÜLFOETIL A | PolyLC Inc (ABD) | 104SE0303 | Tüketim Malzemeleri |
| Proteaz inhibitörü | Roche (İsviçre) | 05892791001 | Reaktif |
| Soğutmalı santrifüj | Beckman (ABD) | AllegraTM X-22R | Ekipman |
| Buzdolabı | MEILING (Çin) | BCD-180KCT | Ekipman |
| Sodyum dodesil sülfat (SDS) | Amresco (ABD) | 1027P033 | Reaktif |
| Boyama Kavanozu | Beyotime (Çin) | FG005 | Tüketim Malzemeleri |
| Paslanmaz çelik kepçe | Muzixing (Çin) | XYS-101 | Tüketim Malzemeleri |
| İpuçları | Kirgen (Çin) | KG1313 | Tüketim Malzemeleri |
| Toluidin mavisi boyama çözeltisi | Sigma-Aldrich (ABD) | 198161-5G/198161-25G | Reaktif |
| Trifluoroasetik asit | Aladdin (Çin) | T103293 | Reaktif |
| Tris-HÇL | Amresco (ABD) | T8230 | Reaktif |
| Tripsin-EDTA çözümü | Solarbio (Çin) | T1300 | Reaktif |
| Ultra Düşük Sıcaklık Dondurucu | Sanyo (Japonya) | MDF-382E | Ekipman |
| Ultra-saf su temizleyici | ELGA (Birleşik Krallık) | PureLAB flex | Ekipman |
| Ultrasonik Hücre Bozucu | QSONICA (ABD) | Q500 | Ekipman |
| Vakumlu dondurucu kurutucu | Thermo (ABD) | SNL 315SV | Ekipman |
| Vortex mikser | Kristal Teknolojisi & Endüstriler (ABD) | HYQ-3110 | Ekipman |
| Su banyosu kuluçka makinesi | Shanghai Yiheng Teknoloji Enstrümanı (Çin) | HWS-26 | Ekipman |
| Tartı Kağıdı | Cole-parmer (ABD) | 133802 | Tüketim Malzemeleri |
Kaynaklar
- Lapointe, S., Perry, A., Butowski, N. A. Primary brain tumours in adults. Lancet. 392 (10145), 432-446 (2018).
- Pienkowski, T., et al. Proteomic profiling reveals dynamic regulation of vesicle trafficking across glioma grades. J Neurooncol. 175 (2), 585-598 (2025).
- Louis, D. N., et al. The 2021 WHO classification of tumors of the central nervous system: A summary. Neuro Oncol. 23 (8), 1231-1251 (2021).
- Kan, L. K., et al. Potential biomarkers and challenges in glioma diagnosis, therapy and prognosis. BMJ Neurol Open. 2 (2), e000069(2020).
- Bertolini, G., et al. Prognostic impact of second surgical resection in IDH wildtype recurrent glioblastoma following chemo-radiation therapy: a propensity score analysis cohort study. J Neurooncol. 174 (3), 789-798 (2025).
- Ma, X., et al. Long non-coding RNA HOTAIR enhances angiogenesis by induction of VEGFA expression in glioma cells and transmission to endothelial cells via glioma cell derived-extracellular vesicles. Am J Transl Res. 9 (11), 5012-5021 (2017).
- Wang, R., et al. MCPIP1 promotes cell proliferation, migration and angiogenesis of glioma via VEGFA-mediated ERK pathway. Exp Cell Res. 418 (1), 113267(2022).
- Seyedmirzaei, H., Shobeiri, P., Turgut, M., Hanaei, S., Rezaei, N. VEGF levels in patients with glioma: a systematic review and meta-analysis. Rev Neurosci. 32 (2), 191-202 (2021).
- Zhong, Y., et al. Vasorin exocytosed from glioma cells facilitates angiogenesis via VEGFR2/AKT signaling pathway. Mol Cancer Res. 22 (7), 668-681 (2024).
- Domènech, M., Hernández, A., Plaja, A., Martínez-Balibrea, E., Balañà, C. Hypoxia: The cornerstone of glioblastoma. Int J Mol Sci. 22 (22), 12608(2021).
- Chen, Z., et al. Prrx1 promotes stemness and angiogenesis via activating TGF-β/smad pathway and upregulating proangiogenic factors in glioma. Cell Death Dis. 12 (6), 615(2021).
- Bastola, S., et al. Endothelial-secreted Endocan activates PDGFRA and regulates vascularity and spatial phenotype in glioblastoma. Nat Commun. 16 (1), 471(2025).
- Krenzlin, H., et al. Cytomegalovirus promotes murine glioblastoma growth via pericyte recruitment and angiogenesis. J Clin Invest. 129 (4), 1671-1683 (2019).
- Hong, G., et al. EGFL7: Master regulator of cancer pathogenesis, angiogenesis and an emerging mediator of bone homeostasis. J Cell Physiol. 233 (11), 8526-8537 (2018).
- Feldo, M., et al. Effect of diosmin administration in patients with chronic venous disorders on selected factors affecting angiogenesis. Molecules. 24 (18), 3316(2019).
- Anakha, J., Dobariya, P., Sharma, S. S., Pande, A. H. Recombinant human endostatin as a potential anti-angiogenic agent: therapeutic perspective and current status. Med Oncol. 41 (1), 24(2023).
- Kaur, S., et al. Functions of thrombospondin-1 in the tumor microenvironment. Int J Mol Sci. 22 (9), 4570(2021).
- Qi, J. H., Anand-Apte, B. Deglycosylation increases the aggregation and angiogenic properties of mutant tissue inhibitor of metalloproteinase 3 protein: Implications for sorsby fundus dystrophy. Int J Mol Sci. 23 (22), 14231(2022).
- Sandmann, T., et al. Patients with proneural glioblastoma may derive overall survival benefit from the addition of bevacizumab to first-line radiotherapy and temozolomide: Retrospective analysis of the AVAglio trial. J Clin Oncol. 33 (25), 2735-2744 (2015).
- Funakoshi, Y., et al. Update on chemotherapeutic approaches and management of bevacizumab usage for glioblastoma. Pharmaceuticals (Basel). 13 (12), 470(2020).
- Sferruzza, G., Malcangi, M., Bosco, L., Finocchiaro, G. Reassessing the efficacy of bevacizumab in newly diagnosed glioblastoma: A systematic review and external pseudodata-based analysis. Neurooncol Adv. 6 (1), vdad174.31(2024).
- Ahir, B. K., Engelhard, H. H., Lakka, S. S. Tumor development and angiogenesis in adult brain tumor: glioblastoma. Mol Neurobiol. 57 (5), 2461-2478 (2020).
- Hallal, S., et al. A comprehensive proteomic SWATH-MS workflow for profiling blood extracellular vesicles: A new avenue for glioma tumour surveillance. Int J Mol Sci. 21 (13), 4754(2020).
- Westphal, M., Lamszus, K. Circulating biomarkers for gliomas. Nat Rev Neurol. 11 (10), 556-566 (2015).
- Santangelo, A., Tamanini, A., Cabrini, G., Dechecchi, M. C. Circulating microRNAs as emerging non-invasive biomarkers for gliomas. Ann Transl Med. 5 (13), 277(2017).
- Gahoi, N., et al. Multi-pronged proteomic analysis to study the glioma pathobiology using cerebrospinal fluid samples. Proteomics Clin Appl. 12 (2), 201870013(2018).
- Hao, X., et al. Urinary protein biomarkers for pediatric medulloblastoma. J Proteomics. 225, 103832(2020).
- Mustafa, D., Kros, J. M., Luider, T. Combining laser capture microdissection and proteomics techniques. Methods Mol Biol. 428, 159-178 (2008).
- Zheng, P. P., et al. Differential expression of splicing variants of the human caldesmon gene (CALD1) in glioma neovascularization versus normal brain microvasculature. Am J Pathol. 164 (6), 2217-2228 (2004).
- Miyai, M., Iwama, T., Hara, A., Tomita, H. Exploring the vital link between glioma, neuron, and neural activity in the context of invasion. Am J Pathol. 193 (6), 669-679 (2023).
- Komiyama, K., et al. Glioma facilitates the epileptic and tumor-suppressive gene expressions in the surrounding region. Sci Rep. 12 (1), 6805(2022).
- Mustafa, D. A. N., et al. Identification of glioma neovascularization-related proteins by using MALDI-FTMS and nano-LC fractionation to microdissected tumor vessels. Mol Cell Proteomics. 6, 1147-1157 (2007).
- Mustafa, D. A. N., et al. A proteome comparison between physiological angiogenesis and angiogenesis in glioblastoma. Mol Cell Proteomics. 11 (6), M111.008466(2012).
- Li, C., et al. Accurate qualitative and quantitative proteomic analysis of clinical hepatocellular carcinoma using laser capture microdissection coupled with isotope-coded affinity tag and two-dimensional liquid chromatography mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 3 (4), 399-409 (2004).
- Woo, J., Schoenfeld, M., Sun, X., Iraguha, T., Zhou, Z., Zhang, Q. Mouse paneth cell-enriched proteome enabled by laser capture microdissection. Proteome Res. 21 (10), 2435-2442 (2022).
- Zhang, Y., et al. Quantitative phosphoproteomics reveals molecular pathway network alterations in human early-stage primary hepatic carcinomas: potential for 3P medical approach. EPMA J. 14 (3), 477-502 (2023).
- Yang, H., et al. Ubiquitinomics revealed disease- and stage-specific patterns relevant for the 3PM approach in human sigmoid colon cancers. EPMA J. 14 (3), 503-525 (2023).
- Wen, S., et al. Quantitative acetylomics revealed acetylation-mediated molecular pathway network changes in human nonfunctional pituitary neuroendocrine tumors. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 753606(2021).
- Su, J., Yang, L., Sun, Z., Zhan, X. Personalized drug therapy: Innovative concept guided with proteoformics. Mol Cell Proteomics. 23 (3), 100737(2024).
- Yang, L., et al. What does one-dimensional gel electrophoresis-based western blotting data really mean in the reality of proteoforms. Talanta. 295, 128266(2025).
- Fang, Z., et al. Proteoformics: Current status and future perspectives. J Proteomics. 321, 105524(2025).
- Lu, M., Zhan, X. The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes. EPMA J. 9 (1), 77-102 (2018).
- Jia, W., Gong, X., Ye, Z., Li, N., Zhan, X. Nitroproteomics is instrumental for stratification and targeted treatments of astrocytoma patients: Expert recommendations for advanced 3PM approach with improved individual outcomes. EPMA J. 14 (4), 673-696 (2023).
- Gong, X., et al. Glioma angiogenesis phosphoproteome landscape and biomarker sets identified with phenome-centered multiomics toward 3P medical approaches. EPMA J. 16 (4), 831-856 (2025).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
