Bu makale, C. oleifera yapraklarının besin içeriği ve ilgili metabolik yolları hakkında üç büyüme ve gelişim aşamasında ilk raporu sunan ve yaprak yaşlanmasının moleküler mekanizmasını anlamak için bir temel sunan bir protokol sunmaktadır.
Araştırma makalesi
Bu makale, C. oleifera yapraklarının besin içeriği ve ilgili metabolik yolları hakkında üç büyüme ve gelişim aşamasında ilk raporu sunan ve yaprak yaşlanmasının moleküler mekanizmasını anlamak için bir temel sunan bir protokol sunmaktadır.
C . oleifera'da farklı büyüme dönemlerinde besin içeriği, azot metabolizmasıyla ilişkili gen ifadesi ve nişasta ile sakroz metabolizmasındaki değişiklikleri göstermek amacıyla, C. oleifera 'Dabieshan 1' çeşitinden yapraklar genç (2 yaşındaki C. oleifera), erken meyve evresinde (6 yaşındaki C. oleifera) ve zirve meyve aşamalarında (10 yaşındaki C. oleifera) toplandı), bu materyaller deneysel materyal olarak seçildi. Besin içeriğinin belirlenmesi ve transkriptom dizileme analizi, erken çiçeklenme aşamasında yaprak örnekleri üzerinde yapılmış, farklı büyüme dönemlerinde C. oleifera'nın besin içeriği ve ilgili metabolik yolları sistematik olarak incelenmiştir. Sonuçlar, hem genç hem de zirve meyve aşamasında toplanan C. oleifera yapraklarının KEGG veritabanında karşılaştırılmasının ardından sırasıyla azot metabolizmasına bağlı 9 homolog gen, nişasta ve sakaroz metabolizmasına ilişkin 24 geni ayırt etti. Ağaç yaşının artmasıyla birlikte, C. oleiferayapraklarındaki azot metabolizması ve nişasta ile sukroz metabolik yollarında değişiklikler yaşanır. C. oleifera, hem fenilalanin amonyak-liaz yolunu hem de sukroz biyosentezini güçlendirir. Bunlar sonunda C. oleifera yapraklarında çözünür protein ve çözünür şeker seviyelerinin artmasına yol açtı. Bu çalışma, C. oleifera'nın vejetatif büyümeden üreme büyümesine dönüşümü sırasında azot metabolizması, nişasta ve sukroz metabolizması ile besin içeriğindeki değişikliklerin mekanizmalarına yeni bakış açısı sunmaktadır. Meyve verme dönemini anlamak ve çiçek ile meyve vermeyi teşvik etmek için bitki yaprak gübreleri uygulamak için teorik referanslar sunar.
Gençlik evresinde C. oleifera, genellikle bölünmemiş ana sapa sahiptir ve esas olarak vejetatif büyüme geçirir; çiçek tomurcuklarının farklılaşması ve çiçeklenme gibi üreme süreçleri için yeteneksizdir. C. oleifera'nın fideleri aşılanırken, yetişkin evreye giren bahar sürgünleri çift olarak kullanılır; çünkü bunlar çiçekaçmayı tetikleme yeteneğine sahiptir 2,3,4. Ancak, erken ekim aşamasında, genç dönemdeki C. oleifera, güçlü vejetatif büyüme nedeniyle çiçek tomurcukları oluşturmakta zorlanabilir ve çiçek tomurcuklarının farklılaşmasına uğrayabilir; çünkü çevresel koşullar çiçek tomurcuklarının oluşumunu sınırlayabilir. Buna rağmen, C. oleifera, genç evresinden birincil meyve verme dönemine ilerledikçe ve sonunda meyve zirvesine ulaştıkça, normal çiçek tomurcukları oluşumu ve çiçeklenme yeteneğini yavaş yavaş geliştirir. C. Oleifera, karmaşık bir şekle sahiptir; aynı anda meyve ve çiçekiçerir 5. Başlangıç meyve aşamasında C. oleifera birkaç çiçek üretebilir, ancak en yüksek meyve aşamasına girdiğinde daha fazla çiçek üretir. C. oleifera'nın en yüksek meyve aşamasında, üreme büyümesi baskın hale gelir ve ışık, sıcaklık, su ve besin taleplerinin artmasıyla birlikte gelir. C. oleifera gibi odunsu meyve ağaçlarının çiçeklenmeden önce uzun bir vejetatif büyüme dönemine sahip olduğu, bu da yetiştirme döngüsünün kısaltılması ve erken yüksek verimlilik elde etme olasılığınısınırladığı açıktır 6.
Azot, bitkilerin nasıl büyüyüp gelişmesi için çok önemlidir. Farklı bitki türleri farklı miktarda azot içerir ve aynı türde bile farklı büyüme dönemlerinde azot içeriğinde önemli farklılıklar vardır. Bitkiler üreme büyüme aşamasına geçtikçe, azot çiçekler, meyveler ve tohumlar gibi organlarda yavaş yavaşbirikir. Azot, enzimler, proteinler, spesifik hormonlar, nüklein asitler ve diğer hayati maddeler için gereklidir; böylece metabolik aktiviteleri organizeeder 8. Çiçek tomurcuklarının farklılaşması süreci, bitkileri vejetatif evreden üreme aşamasına geçiş yapan ve karmaşık bir gelişim sürecini içerir. Besin birikimi, bitki çiçek tomurcuklarının farklılaşması için temel bir temeloluşturur 9. Mevcut görüş, başarılı çiçek tomurcuklarının farklılaşmasının karbonhidrat birikimine bağlıolduğunu savunmaktadır 10. Meyve ağacı çiçek tomurcuklarının farklılaşması boyunca, çözünür şeker içeriğindeki dalgalanmalar doğrudan veya dolaylı olarak sürecietkiler 10. Araştırmalar, Prunus salicina yapraklarındaki karbonhidrat seviyeleri ile çiçek tomurcuklarının farklılaşması arasında yakın bir ilişki olduğunu göstermiştir; çünkü çözünür şeker seviyeleri, fizyolojik çiçek tomurcuğu farklılaşma aşamasında çiçek tomurcuğu morfolojik farklılaşma dönemine göre daha yüksektir; çünkü P. salicina çiçek tomurcukları farklılaşması sırasında karbonhidratların hızla azalmasına maruzkalmıştır 11. Buna rağmen, çiçek tomurcuklarının farklılaşması sırasında Ficus carica'da çözünür nişasta içeriğinde anlamlı bir dalgalanmagözlemlenmediğine dair raporlar bulunmaktadır 12. Yaprak dökülen bitkiler, çiçek tomurcuklarının farklılaştığı bahar döneminde yumurtalıkta nişasta biriktirirken, yaprak dökülen bitkiler tomurcuklanma döneminde nişasta depolar. 13. Yukarıdaki bilgilere dayanarak, çiçek tomurcuklarının farklılaşması sırasında farklı türler arasında karbonhidrat içeriği değişikliklerinin yörüngelerinde farklılıklar olduğu sonucuna varabiliriz. Ying ve ark.14, Vernicia fordii'de çiçek tomurcuklarının farklılaşmasının iki farklı aşamasında azot metabolizması ve sukroz ile nişasta metabolizması gibi temel meteorolojik yol süreçlerinde rol alan anahtar enzim genlerinin ifade desenlerini analiz etti. Bu analiz, tung ağacı çiçek tomurcuklarının fizyolojik ve biyokimyasal göstergelerindeki dinamik değişikliklerle birleştirilerek, tung ağacı çiçek tomurcuklarının farklılaşması sırasında besin birikimi, kullanımı, taşınımı ve dağılımının ayrıntılı bir açıklamasınısağlamıştır 8,14. Lai Chengchun ve arkadaşlarının yaptığı araştırmalar, iki yaprağın çıkarılmasının ekspres edilen genleri olan sukroz fosfat sentazı (SPS), nötr invertaz (NI), hücre duvarı invertazı (CWI) ve α-amilazı (AMY) modüle ettiğini, böylece sakkaroz sentezini ve ardından nişasta birikimi teşvik ettiğini, meyve olgunlaşması, sürgünün filizlenmesi ve çiçeklenme için gerekli temel besin çerçevesinisağladığını bulmuştur 13,15.
Ancak, C. oleifera'da farklı evrelerde besin içeriği, azot metabolizması ve nişasta ile sukroz metabolizmasındaki değişiklikler üzerine yapılan araştırmalar nadiren bildirilmiştir. Çoğu çalışma, tek nükleotid polimorfizm (SNP) haritalarının oluşturulmasına, SSR belirteçlerinin geliştirilmesine ve C. oleifera'nın düşük veya yüksek sıcaklık koşullarında fizyolojik ve moleküler yanıtlarınınincelenmesine odaklanmıştır (16,17,18,19,20). Bu nedenle, bu çalışmada yaygın C. oleifera çeşidi "Dabieshan 1" seçildi ve farklı büyüme dönemlerinde (gençlik aşaması, ilk meyve verme evresi ve en yüksek meyve evresi) bulunan C. oleifera'nın yaprak örnekleri besin ve transkriptom dizileme analizi için toplandı. Amaç, C. oleifera yapraklarında gözlemlenen büyüme ve gelişim süreçleri boyunca çeşitli evrelerde besin içeriği, azot metabolizması ve sukroz ile nişasta gen ifadesinin metabolizmasındaki farklılıkları belirlemekti. Azot metabolizması, sakaroz ve nişasta metabolizması yollarının ve bunların ilgili besinlerle olan ilişkilerinin netleştirilmesi, C. oleifera çiçek tomurcuğunun farklılaşma mekanizmasının incelenmesine zemin atabilir ve C. oleifera çiçeklenmesinin moleküler mekanizmalarına ışık tutabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
1. Deneysel malzemeler
C. oleifera 'Dabieshan 1' yaprakları gelişimin üç önemli aşamasında toplanmıştır: gençlik aşaması, yaklaşık 2 yaşında; Konu yaklaşık 6 yaşında erken meyve verme aşamasına geçer ve yaklaşık 10 yaşında en yüksek meyve dönemine ulaşır. Yukarıdaki üç gelişim aşamasındaki tüm C. oleifera bitkileri, C. oleifera 'Dabieshan 1' ile aynı spesifikasyona sahip kapta yetiştirilen fidelerle dikilmiştir. C. oleifera ormanındaki toprağın fiziksel ve kimyasal özellikleri Tablo 1'de gösterilmiştir.
2. Koleksiyon alanı genel görünümü
Deneysel materyaller, Anhui Eyaleti'nin kalbinde bulunan Heping Kasabası'ndan toplanmıştır. Shucheng İlçesi, eyaletin merkezi bölgesinde yer alır ve Dabie Dağları'nın çevre bölgesine bağlıdır. Koordinatlar 31°11 ′K, 116°47 ′D, ortalama rakım 90 m'dir. Toprak sarı-kahverengi toprak olarak sınıflandırılır. Bölge, nemli subtropikal muson iklim düzenine sahiptir; yıllık ortalama sıcaklık 15,6 °C olarak kalır, genellikle yılda yaklaşık 1.100 mm yağış alır, yılda yaklaşık 1.969 saat güneş ışığı görür ve 224 gün süren donsuz bir döneme sahiptir.
3. Örnek toplama ve ön işlem
Örnekler çiçeklenme öncesi dönemde (Eylül sonu döneminde) seçildi. Her gelişim aşaması için benzer, tutarlı ve güçlü büyümeye sahip C. oleifera bitkileri seçildi. Her bitkiden üçüncü yaprak yukarıdan aşağıya çıkarılırdı; bu yaprak, C. oleifera tacının dış kısmının doğu, batı, güney ve kuzey yönlerinden orta derecede büyüyen bahar sürgünleri oluşturuyordu. Örnekler, genç dönemde C. oleifera yaprakları için seri harfler ve numaralarla işaretlendi; konu erken meyve evresine ve en yüksek meyve dönemine geçer. Bunlar toplanıp sıvı azotta depolandı. Her aşamadan beş rastgele örnek ağacı tek bir biyolojik kopya olarak seçildi ve tüm aşamalarda üç biyolojik replikasyon oluşturuldu. Seçilen örnekler aynı gün laboratuvara geri getirildi ve -80 °C'de korundu.
4. Fizyolojik indeks belirleme
Çözünür şeker içeriği, anthrone kolorimetrik yöntem21 ile belirlendi. Organik karbon içeriği, potasyum dikromat oksidasyonu - demir sülfat titrasyonyöntemi 22 ile belirlendi. Çözünür protein içeriği Coomassie parlak maviyöntemi 23 ile elde edilmiştir. Toplam azot konsantrasyonu Kjeldahlyöntemi 22 ile nicelendirilmiştir.
5. Tam RNA'nın izolasyonu yapıldı, ardından tamamlayıcı DNA (cDNA) kütüphanesi oluşturuldu ve ardından dizileme yapıldı
Toplam RNA, C. oleifera yapraklarından farklı aşamalarda bitki RNA çıkarma kiti kullanılarak çıkarıldı. Toplam RNA konsantrasyonu, tam spektrumlu ultraviyole görünür spektrofotometre ile belirlendi. RNA'nın bütünlüğü ve netliği biyolojik bir analizör ile belirlendi. cDNA kütüphanesi oluşturulup doğrulandıktan sonra, transkriptomik dizileme yüksek verimli bir dizileme platformu kullanılarak gerçekleştirildi. Dizileme prosedürü, her biri 100 baz çiftinikapsayan 24,25,26 bireysel okumalar üretti. Dizi süreci hizalama sonuçları, RSEMyazılımı 27 kullanılarak istatistiksel analizden geçirildi. C. oleifera'nın çeşitli gelişim evrelerinde diferansiyel ekspresyon genleri (DEG) DESeq diferansiyel analizyazılımı 28,29 kullanılarak tanımlanmıştır.
6. De novo montaj ve UniGene açıklaması
SeqPrep http://github.com/jstjohn/SeqPrep) ve Sickle (http://github.com/najoshi/sickle) ham verileri filtrelemek için kullanıldı; düşük kaliteli dizileri ve kirlenmiş adaptörleri kaldırdı. Daha sonra her örnekten elde edilen temiz okumalar Trinityyazılımı 30,31 kullanılarak birleştirildi. Toplanan tüm transkriptler, Swiss-Prot'a karşı BLASTX hizalamasına, ökaryotik tam genomlar için ortolog grup kümelerine ve KEGG veritabanlarına sıralı sırayla tabi tutuldu. Tipik bir Kesme E-değeri (E-değeri <10−5), fonksiyon açıklamalarını almak için ayarlanmıştı. KEGG, ilgili metabolikyolların 32'sini analiz etmek için kullanıldı.
7. Genlerin fonksiyonel açıklaması ve farklı şekilde ifade edilen genlerin analizi
Gen ve izoform bollukları RSEMyazılımı 27 kullanılarak istatistiksel olarak analiz edilmiştir. Farklı şekilde eksprese edilen genleri (DEG) tanımlamak için bir kesme (P < 0.05, FDR < 0.01, |log2FC|>1) ayarlandı. Bir milyon eşlenmiş parça başına kb transkript başına beklenen parça sayısı (FPKM), şu anda gen ifadeseviyelerini tahmin etmek için en yaygın kullanılan yöntem olarak 28 olmaktadır. Üç farklı büyüme ve gelişim evresinden (YAT1, YAS2 ve YAT3) tüm genlerin FPKM değerleri hesaplandı. Hiyerarşik kümeleme analizi yapılarak diferansiyel gen ifade seviyeleri incelendi. Bu arada, KEGG yolu, KOBAS29 kullanılarak tüm transkriptom ile karşılaştırıldığında Bonferroni ile düzeltilmiş P ≤ 0.05'te metabolik yollarda anlamlı zenginleşmiş DEG'leri belirlemek için hazırlandı.
8. Analitik yöntemler
Veriler, ortalama değerler ve standart sapmalar hesaplanmak için Excel kullanılarak sunuldu. SPSS yazılımı tarafından istatistiksel analiz için varyans analizi (ANOVA) kullanıldı ve Duncan'ın çoklu aralık testi üç aşama arasındaki besin içeriğindeki önemli farkları değerlendirmek için kullanıldı. Daha sonra, gruplar arasındaki anlamlı farklar En Az Anlamlı Fark (LSD) yöntemiyle post-hoc çoklu karşılaştırmalar kullanılarak belirlendi. Deneysel ve analitik bulguları görselleştirmek için Origin yazılımı kullanılarak grafikler ve grafikler oluşturuldu. 'ns' ile istatistiksel anlamlılık belirtilmemiştir (P > 0.05). İstatistiksel olarak anlamlı farklar sırasıyla '*' (P < 0.05), '**' (P < 0.01), '***' (P < 0.001) ve '****' (P < 0.0001) ile gösterildi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
C. oleifera yapraklarındaki farklı büyüme dönemlerinde azotlu bileşik içeriğinin karşılaştırılması
Azot, bitkilerin büyümesini ve gelişimini kolaylaştırmada çok önemliydi ve üreme süreçleri üzerinde derin bir etki yarattı. Sonuç olarak, bitkilerdeki genel azot içeriğinin anlaşılması, araştırma çalışmaları için önemli bir öneme sahiptir. C. oleifera yapraklarındaki toplam azot içeriği, bitki...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Çözünür şekerler, bitkilerde temel enerji kaynakları ve yapısal bileşenler olarak hizmet eder, çeşitli fizyolojik aktiviteleri ve biyosentetik süreçleri besler. Çözünür şeker içeriğindeki değişiklikler, meyve ağaçlarında vejetatif tomurcukların çiçek tomurcuklarına dönüşme sürecini doğrudan veya dolaylıolarak etkiler 10. Bazı araştırmalar, bol çözünür şekerlerin gerekliliğinin, meyve ağacı çiçek tomurcuklarının farklılaşması
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu çalışma, Anhui Eyaleti Genç Bilim Araştırmacıları Vakfı (2008085QC135), Wanxi Koleji Doktora Sonrası Araştırma Çalışma Istasyonu Araştırma Projesi (WXBSH2020003), Anhui Eyaleti Doktora Sonrası Bilimsel Araştırma Programı (2024A767), Anhui Bilim Teknolojileri Fakültesi İşletme Görevlendirme Programı (2024jsqygz79) ve Anhui Eyaleti Ormancılık Araştırma ve İnovasyon Projesi, Belge No. 4 [2024] tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Biyoanalizör 2100 | Agilent Technologies, Inc. (ABD) | — | RNA bütünlüğü ve netliğini değerlendirmek için kullanılır |
| DESeq yazılımı | Kaynak kodu | 3.2 | Diferansiyel ifade analizi için kullanılır |
| EASYspin Plus kiti (Tam RNA izolasyonu) | Aidlab Biotechnology Co., Ltd. (Çin) | RN 28 (Aidlab) | C. oleifera yapraklarından toplam RNA ekstraksiyonu için kullanılır |
| HiSeq 2000 dizileme platformu | Illumina (Çin) | — | Transkriptom dizileme için kullanılır, okuma uzunluğu 100 bp |
| Kjeldahl yöntemi/Kjeltec 2300 | Foss Tecator (İsveç) | — | Toplam azot konsantrasyonu için (Bao 2007) |
| Çözünür protein belirleme yöntemi | Konsantre sülfürik asit | 6104-58-1(aladdin) | Chen Jianxun tarafından geliştirilen yöntem (Chen ve ark. 2015) |
| Çözünür şeker belirleme yöntemi | Anthrone | 90-44-8 (Macklin) | Zhang Zhilang' s yöntemi (Zhang ve ark. 2003) |
| Potasyum dikromat oksidasyonu - demir sülfat titrasyon yöntemi | Potasyum dikromat Demirli Sülfat | NA (aladdin) 7782-63-0 (aladdin) | Organik karbon belirleme için (Bao 2007) |
| RSEM yazılımı | Kaynak kodu | 1.2.3 | Dizi hizalama istatistiksel analizinde kullanılır |
| Termo Bilimsel NanoDrop 2000C spektrofotometresi | ABI (ABD) | — | RNA konsantrasyonunu belirlemek için kullanılır |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste