Research Article

Hiperglisemi ile uyarılan endotel hücrelerin entegre transkriptomik ve sekretom proteomik analizi ve hedef bileşiklerin taraması

DOI:

10.3791/69578

⸱

December 30th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hebei Luoxue Innovation Medicine Research Institute, 2State Key Laboratory for Innovation and Transformation of Luobing Theory, 3Hebei University of Chinese Medicine, 4Hebei Medical University, 5Chengde Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, diyabetik komplikasyonlarda endotel disfonksiyonu için moleküler sürücüleri ve terapötik hedefleri belirlemek amacıyla ağ farmakolojik tarama ile birleştirilmiş entegre bir çoklu omik üretim hattı (transkriptom ve proteom) oluşturur.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Endotel disfonksiyonu, diyabetik böbrek hastalığının (DKD) temel bir itici kaynağıdır, ancak sistemik moleküler mekanizmaları hâlâ tam olarak çözülmemiştir. Entegre çoklu omik analizin, hiperglisemi kaynaklı endotel hasarını haritalayabileceğini ve yeniden kullanılabilir tedavileri belirleyebileceğini öne sürdük. Hiperglisemik endotel hücreleri ve diyabetik böbreklerden transkriptomik/sekretom profillerini entegre etmek için yeniden kullanılabilir bir hesaplama boru hattı uygulandı. Bu, yaygın olarak 534 gen/protein tespit etti. Fonksiyonel zenginleştirme, hücre dışı matriks yeniden modellenmesi, hücreler arası iletişim ve iltihaplanma yollarının aktivasyonunu ortaya koydu. Çapraz veri doğrulaması, 278 yüksek güvenli aracıyı geliştirdi ve protein-protein etkileşim ağı analizi on hub genini tespit etti. Ağ farmakolojisi kullanarak, onaylanmış bir ilaç kütüphanesini taradık ve bu ağı hedef alabilecek birkaç aday bileşiği (örneğin, bruceantin, idelalisib) belirledik. Ayrıca, transkripsiyon faktörü düzenlemesi ve örnek moleküler kenetlenme simülasyonları (örneğin, CTCF/BRD4 ile idelalisib) deneysel doğrulama için mekanik hipotezler sağlamıştır. Sonuç olarak, bu çalışma DKD'de endotel patojenik mekanizmalarını tanımlayan ve yeniden amaçlanabilir ilaç adaylarını belirleyen, mekanik ve terapötik keşif için stratejik bir yaklaşım sunan yeniden kullanılabilir çok omik bir çerçeve oluşturmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diyabet, küresel bir sağlık sorunu olarak, 2021 yılında dünya çapında 529 milyon kişiyi etkiledi ve tahminlere göre 2050 yılına kadar 1,31 milyar insanıetkileyecek. 1. Glisemik kontrolün ötesinde, uzun vadeli komplikasyonlar morbidite, ölüm oranı ve yaşam kalitesinin düşmesinin birincil kaynağıdır. Bunlar arasında mikrovasküler komplikasyonlar (örneğin, diyabetik böbrek hastalığı (DKD), retinopati, nöropati) ve makrovasküler komplikasyonlar (örneğin, hızlandırılmış ateroskleroz) bulunur. Kritik olarak, DKD diyabet hastalarının %30-%40'ını etkiler ve dünya genelinde son evre böbrek hastalığının (ESRD) başlıcanedenini oluşturur 2. Bu komplikasyonların derin yükü, altta yatan mekanizmalarını hedefleyen yeni tedavilere acil bir şekilde karşılanmamış bir ihtiyacı ortaya koymaktadır.

Tüm kan damarlarının iç tabakasını oluşturan endotel hücreleri (AK'ler) damar sağlığının temel bekçileridir. Hiperglisemi kaynaklı endotel disfonksiyonu, diyabetik vaskülopati ve organ hasarının merkezi bir itici güçüolarak görev yapar 3,4. Yüksek glukoz seviyeleri, EK'lerde düzensiz nitrik oksit (NO) biyoyararlanılılığı, artan endotelelin-1 (ET-1) salgılanması, adezyon moleküllerinin ifadesinin (örneğin, VCAM-1, ICAM-1) yükseltilmesi (örneğin, VCAM-1, ICAM-1), aşırı reaktif oksijen türleri (ROS) üretimi (örneğin, NADPH oksidazlar yoluyla) ve kalıcı düşük dereceli iltihap gibi bir dizi uyumsuz yanıtı tetikler; 3,4. Bu değişiklikler topluca, vazodilatasyonun bozulmasına, artan damar geçirgenliğine, lökosit adezyonu ve infiltrasyonuna, pro-trombotik durumlara ve nihayetinde damar yeniden şekillendirmesine yolaçar 5. Böbrek mikrovasküsü içinde, glomerüler endotel hasarı filtrasyon bariyerini bozar, albuminüriyi teşvik eder ve doğrudan ekstrasellüler matriks (ECM) birikimine, glomeruloskleroza ve tubulointerstisyelfibrozis 5,6'ya katkıda bulunur. Yerleşik böbrek hücrelerinin ardından aktivasyonu ve inflamatuar hücrelerin akını, böbrek hasarını artıran bir kısır döngüoluşturur 5,7. Önemli olarak, klinik çalışmalar sistemik endotel disfonksiyonunun belirteçlerinin diyabet hastalarında albüminurinin başlangıcı ve ilerlemesi ile azalan glomerüler filtrasyon oranı (GFR) ile güçlü bir şekilde korelasyon gösterdiğini göstermektedir (6,7,8), bu da insan hastalık sonuçlarıyla doğrudan ilgisini vurgulamaktadır. Kabul edilen merkeziyetine rağmen, kronik hiperglisemi nedeniyle EC'lerde indüklenen hassas transkripsiyonel ve sekretör yeniden programlamanın kapsamlı ve sistem düzeyinde anlaşılması—özellikle böbrek fibrozisinin anahtarı olan ECM yeniden modellemesini tetikleyen değişiklikler—tam olarak tanımlanmamıştır; bu da DKD ve diğer diyabetik damar komplikasyonları için yeni, mekanistik terapötik hedeflerin belirlenmesinisınırlamaktadır 7,8.

Diyabette endotel disfonksiyonunun temelini oluşturan derin moleküler karmaşıklık, geleneksel tek hedefli tedavi yaklaşımlarına büyük bir meydan okuma oluşturur. İşte bu noktada hesaplamalı biyoloji ve biyoinformatik, vazgeçilmez araçlar olarak ortaya çıkar; bu da patolojik ağlar içindeki nedensel merkezleri önceliklendirmek ve çoklu hedefli tedavi stratejilerini belirlemek için çeşitli, yüksek boyutlu omik veri setlerinin entegrasyonunu ve madenciliğini mümkünkılar. Kritik olarak, geleneksel tek modaliteli yaklaşımlar (örneğin, sadece transkriptom/proteom veya farmakolojik tarama) moleküler katmanlar arasındaki kritik etkileşimi (örneğin, gen ifadesi, protein dinamikleri, ilaç yanıtı) sıklıkla kaçırır ve sinerjik sürücüleri veya hedef dışı etkileri yakalayamaz 10,11. Entegre çoklu omik boru hattı, aynı sistemde transkriptomik, sekretomik ve farmakolojik verileri eşzamanlı profilleyerek bu sınırlamaları aşarak bütüncül hastalık mekanizması görünümü sunar. Ağ farmakolojisi, ligand/hedef tahmin algoritmaları ve in silico moleküler kenetlenme, onaylanmış ilaç kütüphanelerinin sistematik olarak keşfedilmesini sağlar; bu da karmaşık hastalık imzalarını karşı koyabilen bileşiklerin yeniden konumlandırılmasını veya keşfinihızlandırır. Bu paradigma değişimi, endotel düzensizliğini ve DKD gibi yıkıcı mikrovasküler sonuçlarına yönelik tedavileri belirlemede özellikle umut vaat ediyor; bu da daha iyi etkinlik ve azalan yan etki profilleri potansiyeli sunuyor. Hiperglisemiye maruz kalan endotel hücrelerinin transkriptomik/sekretomik analizlerinin entegrasyonu, yaygın olarak 534 yukarı regülasyona sahip molekülü tespit etti. Fonksiyonel zenginleştirme, hücre dışı matris yeniden modellenmesi, oksidatif stres ve iltihabı erken DKD patogenezinde rol oynadı. Çapraz veritabanı analizi, PPI genlerinin PPI ağlarıyla geliştirilen 278 yüksek güvenli hedefi önceliklendirdi. Onaylanmış ilaçların ağ farmakoloji taraması, bu merkezleri hedefleyen 85 aday bileşiği (brefeldin-A, bruceantin, parasetamol ve idelalisib dahil) öngördü. In silico transkripsiyon faktörü tahmini ve kenetlenme mekanizmalarını araştırdı. Bu çalışma, DKD'nin endotel sürücülerini tanımlar, hesaplamalı keşif boru hattı oluşturur ve doğrulama için terapötik adaylar sunar. Sonuç olarak, bu boru hattının diyabet komplikasyonları için terapötik keşif programlarını teşvik etmesi beklenmektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan deneyleri, Hebei Yiling Tıbbi Araştırma Enstitüsü'nün Hayvan Araştırmaları ve Etik Komitesi'nin onayıyla (onay numarası: N2024082) gerçekleştirildi. Bu çalışmada kullanılan deneysel malzemeler ve aletler için Malzeme Tablosunu inceleyin. Personel, TRIzol (deri/göz tahriş edicisi, fenol içerir) ve proteaz inhibitörleri (potansiyel solunum solunum/cilt duyarlıları) gibi tehlikeli reaktiflerle çalışırken uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) giymek zorundadır. Biyolojik/sıvı atıkları otoklavlanabilir torbalarda ve tehlikeli kimyasal atıkları kurumsal tehlikeli bertaraf için belirlenmiş kaplarda ayırın. Tüketici malzemeleri bertaraf etmeden önce dezinfekte edin.

Diyabetik nefropati fare modellemesi

Erkek db/db ve db/m fareleri (12 haftalık), belirli patojensiz (SPF) koşullarda 22 ± 2 °C ve %56 ± %5 nemde, 12 saatlik ışık/karanlık döngüler ve geçici olarak yiyecek/suya erişim sağlandı. 1 haftalık bir aklimatizasyon döneminden sonra, fareler rastgele sayısal tanımlayıcılar atanmış ve deneysel gruplara dağıtılmıştır. DB/DB fareleri, DKD'nin oluşması için 6 hafta boyunca yüksek proteinli diyetle beslendi. Başarılı modelleme, db/m kontrollerine kıyasla idrar albümin-kreatinin oranının (UACR) belirgin şekilde yükselmesiyle doğrulandı; erken DKD12 için birincil fonksiyonel biyobelirteç olarak UACR >30 mg/g kullanıldı.

Yüksek glukozlu endotel hücre modellemesi

İnsan Böbrek Glomerüler Endotel Hücreleri (HRGEC) standart koşullar altında hazırlanmıştır. HRGEC'ler ya normal glukoz (NG, 5,5 mM D-glikoz) ya da yüksek glukoz (HG, 30 mM D-glikoz) ortamında kültürlendi ve %5 CO 2 ile 37 °C nemli kuluçka makinesindetutuldu. Hücreler ya kesintisiz olarak HG'ye maruz bırakıldı ya da 24 saat boyunca kontrol koşullarında yetiştirildi, ardından sonraki analizler yapıldı. Osmotik kontrol (HM, 5,5 mM D-glikoz ve 24,5 mM mannitol içerir) dahil edilmelidir. Tüm koşullar katı hücre uygunluk kriterlerini karşılamalıdır: canlılık ≥85%, apoptoz seviyeleri 15'in altında kaldı, HG'de HM ile karşılaştırıldığında ROS artışları %20'yi geçmedi ve LDH salınımı %10'un altında kalarak hücresel bütünlüğü sonraki analizlerden önce doğruladı.

Koşullu medya koleksiyonu

Koşullu ortamlar (CM), salgım analizi için standart bir protokolkullanılarak 13 ve modifikasyonlarla toplanmıştır. 24 saat yüksek glikoz (30 mM D-glikoz), normal glukoz (5,5 mM D-glikoz) veya osmotik kontrol (5,5 mM D-glukoz + 24,5 mM mannitol) uyarımından sonra, HRGEC'ler steril fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) ile yıkanarak kalan serum proteinleri alındı. Hücreler, serumsuz, fenol kırmızısı içermeyen endotel bazal ortamla yenilendi ve %5 CO₂ ile 37 °C'de 12 saat boyunca kuluçka edildi, böylece salgılanan faktörler biriktirildi.

CM, önceden soğutulmuş santrifüj tüpleri kullanılarak hasat edildi. Aşağıda açıklandığı gibi sıralı olarak örnek işleme yapıldı.

Birincil açıklama: CM, RNase/DNase içermeyen konik tüplere aktarıldı ve 4 °C'de 10 dakika boyunca 3.000 x g seviyesinde santrifüj edildi. Peletli enkaz atıldı.

Proteaz inhibisyonu: Birincil açıklamadan 2 dakika sonra, EDTA-sız proteaz inhibitörü kokteyli 1x son konsantrasyona (1:50) eklendi ve bu konsantrasyon 1x fosfataz inhibitörü içerdi.

Konsantrasyon: Süpernatant hemen önceden durulanmış PBS santrifüj filtrelerine (3 kDa MWCO) yüklenir ve 4.000 x g sıcaklığında 90 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjlenir ve 10 kat konsantrasyon elde edilir.

İkincil açıklama: Konsantre önceden soğutulan mikrosantrifüj tüplerine aktarıldı ve 12.000 x g sıcaklıkta, 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjlendi. Süpernatant toplanarak pellet edilmiş agregalardan kaçınıldı.

Depolama: 50 μL hacimli Aliquotlar, steril, düşük protein bağlayıcı kriyoviallerde üretildi. Şişeler, hasat tamamlandıktan sonra 30 dakika içinde sıvı azotta fırlanarak donduruldu. Şişeler -80 °C'de saklanıyordu (donma-erime döngüsü yoktu).

CM partileri endotoksin testi geçirdi (<0.25 EU/mL). Serumsuz kuluçka protokolü stres indüksiyonu göstermedi (HSP70/CHOP immünoblotları tarafından doğrulandı). CM protein verimi, hasat sırasında canlı hücre sayısı/DNA içeriğine normalleştirildi. İşlem titizliği korundu: teknik tamamen steril; ≤30 dakika hasattan dondurmaya kadar süre; rotor sıcaklığı dengesi doğrulandı.

Koşullu ortam ile işlenmiş böbrek tübüleri hücrelerinin CCK-8 testi

Endotel sekretomunun böbrek tübüler hücre yaşamılığı üzerindeki fonksiyonel etkisini değerlendirmek için, belirlenmiş protokollere uygun olarak, İnsan böbrek proksimal tübüler epitel hücre hattı HK-2 üzerinde CCK-8 testi yapıldı. HK-2 hücreleri, %10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş DMEM ortamında kültürlendi. Analiz için, hücreler kuyu başına 5 x 10³ hücre yoğunluğunda 96 kuyu ölçülü plakalara tohumlanmıştır. Hücrelerin serum açlığı %0,5 FBS içeren ortamda CM tedavisinden hemen önce 12 saat boyunca gerçekleştirildi.

CM, eşit toplam normalize protein kütlesiyle uygulandı. Dondurulmuş CM aliquotları 37 °C'de kuru bir banyoda (<5 dakika) çözüldü ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 10.000 x g seviyesinde santrifüjle arıtıldı. HK-2 hücreleri (100 μL/well) HG-CM, NG-CM veya HM-CM ile muamele edildi ve protein/DNA içeriğine göre normalleştirildi. Her koşul için toplam 3 biyolojik replika (her biri 3 teknik kopya) hazırlandı. Örnekler %5 CO₂ ile 37 °C'de 24 saat kuluçka edildi. Hücre yaşamı, Hücre Sayma Kiti 8 kullanılarak değerlendirildi. Bunu yapmak için her kuyuya 10 μL CCK-8 çözeltisi eklendi ve 37 °C'de 1-4 saat kuluçka edildi. Absorbans 450 nm olarak mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçüldü. Uygulanabilirlik şu şekilde hesaplandı:

Yaşamlılık (%) = [(A_sample - A_blank) / (A_baseline_control - A_blank)] x 100

Oksidatif stres tespiti

Membran lipid peroksidasyonunun ana son ürünlerinden biri olan hücresel malondialdehit (MDA) seviyeleri, TBA testiyle nicelendi. Hücre lizatları (1 x 107 hücre) 10.000 x g üzerinde 15 dakika boyunca santrifüj ile aydınlaştırıldı ve ardından 0,02 mL süpernatant, 0,02 mL MDA standartlarıyla birlikte örnek tüplerine alikotasyon edildi. Aliquot'a 0,02 mL clarificant ve 0,6 mL asit reaktif eklendi. Örnekler/standartlar 0,2 mL kromojenik ajan ile işlendi (kontrol tüpleri: 0,2 mL %50 asetik asit eklendi). 100 °C'de 40 dakika boyunca mühürleme, karıştırma ve kuluçka aşamasından sonra örnekler soğutuldu ve ardından 9569 x g sıcaklığında 10 dakika santrifüjlendi. Üst yüzey, OD₅₃₂ ölçümü için 250 μL'de mikroplakalara aktarıldı.

Transkriptomik profilleme

Toplam RNA, üreticinin protokolüne uygun olarak TRIzol reaktifi kullanılarak izole edildi. RNA miktarı ve saflığı sırasıyla bir spektrofotometre ve parça analizörü ile değerlendirildi. Kütüphane yapımının dizilenmesinde yalnızca yüksek kaliteli RNA örnekleri, RNA Bütünlük Numarası (RIN) > 7.0 ile kullanıldı.

Poliadenillenmiş (poliadenillenmiş (poli(A)+) mRNA, iki tur oligo(dT) manyetik boncuk bazlı seçilimle zenginleştirildi. Arıtılmış mRNA, magnezyum bazlı parçalanma kiti kullanılarak 94 °C'de 5-7 dakika boyunca 200-300 nukleotite parçalandı. Birinci zincir cDNA sentezi ters transkriptaz ile yapıldı, ardından dUTP varlığında E. coli DNA polimeraz I ve RNase H kullanılarak ikinci zincir cDNA sentezi yapıldı (zincir özgüllüğünü sağlamak için). Sonraki adımlar arasında uç tamiri, A-tailing, adaptör ligasyonu ve manyetik boncuklarla boyut seçimi yer aldı. PCR amplifikasyonundan önce, dUTP'ye dahil edilen ikinci iplik UDG enzimiyle sindirildi.

PCR kullanılarak ortalama 400 ± 50 bp arasında bir insert boyutu olan zincire özgü bir kütüphane oluşturuldu, bunlar aşağıdaki koşullarda yapıldı: 98 °C'de 1 dakika boyunca başlangıç denatürasyonu; 14 denatürasyon döngüsü 98 °C'de 10 saniye, tavlama 60 °C'de 30 saniye ve 72 °C'de 30 saniye uzatma; ve 72 °C'de 5 dakika boyunca son bir uzatma yapıldı. Eşleştirilmiş uçlu 150 bp dizileme Illumina platformunda yapıldı ve örnek başına ≥40 milyon okuma derinliği (Q30 > %85) oldu.

Transkriptomik verilerin biyoinformatik analizi

Ham okumaların kalite kontrolü FastQC (v0.11.8) kullanılarak yapıldı ve GRCh38.p13 referans genomu ile HISAT2 (v2.2.1) hizalanması yapıldı. Transkript niceliklendirmesi ve örnek başına transkript montajı, varsayılan parametrelerle StringTie (v2.1.6) kullanılarak gerçekleştirildi. Tüm derlenmiş transkriptomlar, gffcompare yazılımı kullanılarak (v0.12.6; gffcompare bağımsız bir araçtır, StringTie'nin parçası değildir ve versiyonu ortak kararlı sürüme düzeltilmiştir) kullanılarak bireysel örneklerden birleştirilmiştir. Diferansiyel ifade analizi, DESeq2 (v1.38.3) ile |log2 kat değişimi (FC)| eşikleri kullanılarak gerçekleştirildi. > 1 ve yanlış keşif oranı (FDR) < 0.05. Parti etkileri variancePartition paketiyle düzeltildi.

Sekretom proteomik analizi

CM, daha önce tanımlanmış yöntem13 ile NG, HG veya HM kontrol koşullarında kültürlenen HRGEC'lerden sekresom analizi için değişikliklerle toplanmıştır. Hücreler uyarıldıktan sonra PBS ile yıkanıp serumsuz ortamda 12 saat kuluçka uygulandı. CM toplanıp 3.000 x g hassasiyetinde 10 dakika (4 °C) santrifüj edildi.

Her örnekten eşit miktarda peptit karıştırıldı ve ardından çözücü A (%5 ACN, pH 9.8) ile seyreltildi ve kolona enjekte edildi. Peptit karışımının fraksiyonasyonu, İkili Hızlı Ayırma Sistemi üzerinde 3,5 μm 4,6 x 150 300Extend-C18 kolonu kullanılarak gerçekleştirildi. Gradient elüsyonu 0,3 mL/dakika akış hızında gerçekleştirildi: 38 dakikada %5-%21 çözücü B (%97 ACN, pH 9,8), 20 dakikada %21,5 ila %40 arası çözücü B, 2 dakikada %40-%90 çözücü B, 3 dakika %90 çözücü B ve 10 dakika boyunca %5 çözücü B dengelendi. Elusyon, zirveler 214 nm'de izlendi ve her dakika kesirler toplandı. Fraksiyonlar, elusyon zirvelerinin kromatografiyalarına göre birleştirildi. Toplamda 10 fraksiyon toplandı ve ardından dondurularak kurutuldu.

Mobil faz A (%100 su, %0,1 formik asit) ve B (%80 asetonitrile) hazırlanmış, kurutulmuş peptit örnekleri %0,1 formik asit ile yeniden oluşturulmuş ve 20.000 x g sıcaklıkta 10 dakika boyunca santrifüjlenmiştir. Ayrım, UHPLC sıvı faz sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. Örnekler, 8 dakikalık gradyanla 2,5 μL/dakika ile ES906 HPLC kolonuna (150 mm) beslendi ve aşağıdaki etkili gradyanla ayrıldı: 0-4 dakika, %4 mobil faz B doğrusal olarak %25'e yükseldi; 4-6,9 dakika, mobil B aşaması doğrusal olarak %25'ten %35'e yükselir; 6,9-7,3 dakika, mobil B aşaması doğrusal olarak %35'ten %99'a yükseliyor; 7,3-8,0 dakika, mobil B fazı %99'da korundu. Sıvı fazlı ayrılmış peptidler, DIA modunun alınması için bir kütle spektrometresine aktarıldı. Ana parametreler şu şekilde ayarlandı: normalleştirilmiş çarpışma enerjisi %25, varsayılan yük durumu 2, çözünürlük 240.000, her 0,6 saniyede bir tarama, tarama aralığı 380-980 m/z, kütle spektrometrisi AGC %500. Parçalanma iyon taramaları maksimum 3 ms tarama süresiyle kaydedildi ve 380 ila 980 m/z arasında değişen 300 adet 2-Th tarama penceresi kullanıldı.

DIA-NN (https://www.nature.com/articles/s41592-019-0638-x, sürüm 1.9.1), DIA verilerini kütüphanesiz bir yöntemle analiz etmek için kullanıldı. MS/MS verileri, Uniprot veritabanından indirilen protein dizileriyle karşılaştırıldığında arandı: enzim: Tripsin/P; Maksimum kaçırılan dekolte: 2; sabit modifikasyon: karbamidometil(C); değişken modifikasyonlar: oksidasyon (M) ve asetil (protein N-term); öncü kütle toleransı: 20 ppm; parça kütle toleransı: 0.05Da. Sonuçlar %1 FDR ile filtrelendi ve sadece bu filtre kriterini geçen protein grupları sonraki analizde kullanıldı.

Omikler fonksiyonel zenginleştirme analizi (GO, KEGG ve GSEA)

Fonksiyonel zenginleştirme analizleri, belirlenmiş biyoinformatik boru hatlarını takip ederek farklı olarak ifade edilen genler (transkriptomik) ve proteinler (sekretom proteomik) filtrelenmiş setlerde gerçekleştirildi. Tanımlayıcılar Org.Hs.eg.db kullanılarak eşlendi. GO zenginleştirmesi (biyolojik süreçler, moleküler fonksiyonlar, hücresel bileşenler) clusterProfiler ile gerçekleştirildi. Benjamini-Hochberg p-değeri < 0,05 düzeltilmiş ve anlamsal benzerlik azaltımı (cutoff=0,7) yoğun terimlere uygulanmıştır. KEGG yol analizi KEGG REST API (HAS, 2023 sürüm) kullanılarak gerçekleştirildi. Yekutieli FDR düzeltmesi ile hipergeometrik testler kullanıldı. Yol topolojisi görselleştirmesi Pathview ile yapıldı. GSEA, sinyal-gürültü gen sıralamasıyla dereceye dayalı bir yaklaşımla uygulanmıştır. MSigDB koleksiyonlarına (HALLMARK, C2, C5; v2023.2) ve kürenle diyabetik endotel imzalarına karşı test zenginleştirmesi yapıldı. Anlamlılık 1000 fenotip permütasyonu sonrası değerlendirildi (FDR %25<).

Protein-protein etkileşim ağı analizi

Patojenik aday havuzundaki çekirdek moleküler düzenleyicileri belirlemek için, entegre bir hesaplama iş akışı kullanılarak PPI ağ inşası ve topolojik analiz gerçekleştirildi. 278 aday gen STRING veritabanına (v12.0; Homo sapiens; kanıt kaynakları arasında deneysel, ortak ifade ve özenle oluşturulmuş veri tabanları bulunuyordu; yüksek güvenli kenarlar için etkileşim güveni (birleşik puan) eşiği >0.7; ve ek bir etkileşimli enflasyon yok. Sonuçlar Cytoscape'e (v3.9.1) aktarıldı ve ağ topolojisi analizi MCODE (v1.5.2) ve CytoHubba (v0.4.1) eklentileri kullanılarak gerçekleştirildi. Daha sonra, ağ düğümlerin bağlantı derecesine göre görsel olarak optimize edildi; böylece yüksek bağlantıya sahip düğümler daha koyu renkte, daha büyük boyutta ve etikette daha belirgin oldu.

Diyabetik böbrek hastalığı hedef gen setinin geliştirilmesi

Birlikte regülasyonlu mRNA/proteinler için kriterler şu şekilde tanımlandı: transkriptom (FDR < 0.05 ve |log2FC| > 1) ve sekretom (FDR < 0.01 ve |log2FC| > 1.5). Protein ve gen isimleri UniProt kullanılarak normalleştirildi ve birleşik bir formata (Gen Sembolü) dönüştürüldü. Diyabetik böbrek hastalığı için, GeneCards (Sürüm 5.25, sorgu terimi: Diyabetik Nefropatiler, erişim tarihi Temmuz 2025), Karşılaştırmalı Toksikogenomik Veritabanı (CTD; https://ctdbase.org/, sorgu terimi: Diyabetik Nefropatiler, erişim tarihi Temmuz 2025) ve Open Targets Platform (https://platform.opentargets.org/, Sürüm 0.13.8, sorgu terimi: Diyabetik Nefropatiler, erişim tarihi Temmuz 2025) dahil olmak üzere bir hedef gen seti oluşturuldu 13,14,15. Bu referans kapsamlı diyabet böbrek hastalığı referans seti olarak belirlendi. Birlikte regülasyonlu mRNA'lar/proteinler ile bu gen seti arasındaki kesişim, aşağı akış analizleri için belirlendi.

CCL2 protein tespiti

CCL2'yi nicelendirmek için, 96 kuyuluğa sahip bir plaka yakalama antikoru (100 μL/kuyuyu) ile kaplandı ve gece boyunca 4 °C'de kuluçka edildi. Ertesi gün, plaka 2x tampon ile yıkanmış ve RT'de 1 saat boyunca ELISA sulandırıcı (200 μL/well) ile bloklanmıştır. 7 noktalı standart eğri, S1 standardının 2 kat seri seyreltmeleriyle hazırlandı, ardından örnekler (100 μL/kuyup) eklenip 400 rpm'de 2 saat kuluçka edildi. 5 kez yıkandıktan sonra, algılayıcı antikor (100 μL/kuyruk) eklenip 400 rpm'de 1 saat kuluçka hale getirildi, ardından enzim çözeltisi (100 μL/kuyyu) eklendi ve 400 rpm'de 30 dakika kuluçka uygulandı. Örnekler TMB substratı ile geliştirildi (15-30 dakika, RT). Reaksiyon asit (100 μL/kuyup) ile durdu ve soğurma 450 nm'de okundu (620 nm referans isteğe bağlı). Önemli adımlar arasında sıkı yıkama, zamanlanmış kuluçkalar ve tekrarlanabilirliği sağlamak için standart seyreltmeler bulunur.

İlaç yeniden konumlandırma

Terapötik bileşikler şu platform kullanılarak tahmin edilmiştir: LINCS L1000 Karakteristik Yön İmzaları Arama Motoru (L1000CDS2; https://maayanlab.cloud/L1000CDS2). Bu platform, girdi gen ifadesi imzalarını tersine çevirebilen veya taklit edebilen küçük moleküller veya bileşik kombinasyonlarını belirlemek için MODZ yöntemi ve karakteristik yönanalizini kullanır 16. Aday ilaçlar, bu platformla farklı şekilde ifade edilen böbrek genlerinin düzensizliğini tersine çeviren ilaçlar olarak tanımlanmıştır. Bileşikler, doku kolonundaki seçilmiş böbrekler tarafından böbrek hücre hatlarındaki ters skorlarına göre sıralandı ve en üst sıradaki adaylar, ana protein hedeflerine bağlanma eğilimlerini değerlendirmek için moleküler docking'e tabi tutuldu.

Eşregülatif transkripsiyon faktörü ekranı

hTFtarget veritabanı, gen setine ko-düzenleyici TFsbinding için sorgulandı. hTFtarget veritabanı, insan transkripsiyon faktörü (TF)-hedef gen ilişkilerini belirlemek için çeşitli hücreler, dokular ve koşullar üzerinde büyük ölçekli ChIP-Seq veri setlerini hesaplamalı olarak analiz ederek analiz edilmiştir. Entegre hattı, ChIP-Seq zirve sinyallerini epigenetik bağlamla birleştirerek promotörlerde/güçlendiricilerde TF bağlanmasını tespit etti ve açıkça uzaylı-zaman düzenleyici dinamikleri hesaba kattı. Zhang ve ark. tarafından gösterildiği gibi, TF hedeflerinin veya gen düzenleyicilerinin keşfini, ChIP-Seq verilerinin görselleştirildiğini, TF işbirliği incelemesini ve bağlanma noktalarının tahminini mümkün kılan çok boyutlu bir platformolarak hizmet etti 17.

Küçük molekül-protein kenetlenmesi için hesaplamalı boru hattı ve analiz

AutoDock Vina 1.2.018, aktif bileşenler ile transkripsiyon faktörleri BRD4, CTCF, EP300 ve SPI1 arasındaki bağlanma etkileşimlerinin moleküler bağlanma analizini yapmak için kullanıldı. BRD4 (PDB ID: 7REK), CTCF (PDB ID: 5K5I), EP300 (PDB ID: 5NU5) ve SPI1 (PDB ID: 8E3K) kristal yapıları Protein Veri Bankası (https://www.rcsb.org/)19,20'den alınmıştır. SDF formatındaki küçük molekül yapıları PubChem veritabanından indirildi (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ 21), Open Babel 2.4.1 kullanılarak MOL2 formatına dönüştürüldü ve PyRx 0.8 ile enerji minimize edildi. Protein ön işleme, su moleküllerinin çıkarılması, hidrojen atomlarının eklenmesi, Gasteiger yüklerinin hesaplanması ve bunların PDBQT formatına dönüştürülmesiyle (AutoDock Vina için gereklidir) gerçekleştirilirdi. Yarı esnek bir kenetlenme stratejisi kullanıldı; her proteindeki birlikte kristalleşmiş ligandların bağlanma noktalarına göre kenetlenme ızgarası konumu ve boyutları tanımlandı. MA9-086, BRD4 için pozitif kontrol ligandı olarak kullanılırken, EP300 için XDM-CBP olarak görev yapar. CTCF ve SPI1 (bilinen pozitif ligandlar olmayan) için, Proteins Plus çevrimiçi platformu (https://proteins.plus/) kullanılarak yapısal analizle potansiyel bağlanma cepleri tespit edildi. Bağlama ızgarası parametreleri şu şekilde ayarlandı (x, y ve z eksenleri boyunca koordinatlar ve boyutlar şcinsinden): BRD4 merkezi (-11.907, -8.617, -3.973) ve kutu boyutu (18.387, 18.387, 18.387); CTCF merkezi (15.165, 4.854, 6.388) ve kutu boyutu (17.25, 20.25, 9.75); EP300 orta (39.781, 5.326, 9.998) ve kutu boyutu (16.516, 16.516, 16.516); SPI1 merkezi (3.155, -3.853, 0.668) ve kutu boyutu (17.25, 25.5, 10.5) olarak belirlendi. Kenetleme sırasında enerji aralığı 3, tüketimlilik parametresi 8 ve ızgara aralığı 0.375 şolarak ayarlandı. Bağlanma stabilitesi, daha düşük değerlerin daha stabil konformasyonları ve daha yüksek etkileşim olasılığını gösterdiği bağlanma enerjisinden değerlendirildi; <-5 kcal/mol eşiği güçlü bağlanmaaktivitesi olarak tanımlandı 22,23. Son olarak, bileşikler ve reseptörler arasındaki etkileşim modları PyMOL kullanılarak tanımlandı.

İstatistiksel analiz

Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmaktadır. İstatistiksel testler normallik (Shapiro-Wilk) ve varyans homojenliği (Levene testi) temelinde seçilmiştir. Gruplar arası karşılaştırmalar için eşleşmemiş t-testleri (iki grup) veya tek yönlü ANOVA ile LSD sonrası testler (≥3 grup) kullanıldı. P < 0.05 değer eşiği olarak tanımlanmıştır. Grafikler GraphPad Prism 9.0 ile oluşturuldu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hiperglisemik endotel sekretomunun böbrek tübülleri üzerindeki patojenik etkisinin gösterilmesi

Bu çalışma, hiperglisemik endotel sekretomunun patojenik etkisinin doğrulanmasıyla başladı. Hiperglisemik insan glomerüler endotel hücrelerinden (HG-CM) alınan koşullu ortam, kontrol gruplarına kıyasla insan proksimal tübul epitel hücrelerinin (HK-2) canlılığını önemli ölçüde azaltmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, hiperglisemi kaynaklı endotel sekretom disfonksiyonunu, entegre çoklu omik ve hesaplamalı yaklaşımlar aracılığıyla diyabetik böbrek hasarının kritik bir itici kaynağı olarak ortaya koymaktadır. Böbrek tübüllerine yönelik sekretom aracılı sitotoksisitenin, DKD patogenezinde matriks yeniden modellemesi, oksidatif stres ve iltihaplanma çekirdek yollarına yakınan 534 endotel kaynaklı faktörün sistematik düzensizliğiyle örtüştiğinin gösterilmesi. Mekanistik olarak doğrulanmış CCL2...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (32200644), Hebei Bilim ve Teknoloji Programı Projesi (246W2501D, 252W7716D) ve Yanzhao Altın Platformu (A20240022) tarafından desteklendi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CCL2 ELISA kitiThermo Fisher Scientific#88-7399-88
CCR2 inhibitörüMerck Millipore#227016
Hücre Yaşam Değerlendirme KitiYedi BiyoteknolojiCCK-8, SC119-01
DNA DizîleyiciIlluminaNovaSeq 6000
Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi SistemiThermo Fisher ScientificUltiMate 3000 İkili RSLC
HRGEC'ler Kültür ortamıŞanghay Zhong Qiao Xin Zhou Biyoteknoloji A., Ltd.1001
İnsan Böbrek Glomerüler Endotel Hücreleri (HRGECler)Şanghay Zhongqiao Xinzhou BiyoteknolojisiPRI-H-00038
İnsan Böbrek Tübüler Epitel Hücresi Tam Medium ProcellCM-H193
İnsan Böbrek Tübüler Epitel Hücreleri (HK2)ProcellCP-H193
Erkek db/db ve db/m fareler (4 haftalık)Hangzhou Ziyuan Biyoteknoloji A.Ş., Ltd.SCXK 20190004
Kütle SpektrometresiThermo Fisher ScientificAstral
Mikroplaka Absorbans OkuyucuMoleküler CihazlarSpectraMax iD5
Proteaz İnhibitörü Kokteyli (EDTA içermemiş)RochecOmplete, #5056489001
RNA Ekstraksiyon ReaktifiThermo Fisher ScientificTRIzol, #15596026
RNA Kalite AnalizörüAgilent Teknolojileri5300 Parça Analizörü, M5311AA
RNA Nicelik Ölçme CihazıThermo Fisher ScientificQubit 3.0, Q33216
ROS tespit kitiThermo Fisher Scientific#EEA019
Ultrafiltrasyon Santrifüj Cihazları (3 kDa MWCO)Merck MilliporeAmicon Ultra-4

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tuttle, K. R., et al. Diabetic kidney disease: a report from an ADA Consensus Conference. Diabetes Care. 37 (10), 2864-2883 (2014).
  2. Gu, H. F. Genetic and Epigenetic Studies in Diabetic Kidney Disease. Front Genet. 10, 507(2019).
  3. Młynarska, E., et al. Novel Insights into Diabetic Kidney Disease. Int J Mol Sci. 25 (18), (2024).
  4. Tanase, D. M., et al. Oxidative Stress and NRF2/KEAP1/ARE Pathway in Diabetic Kidney Disease (DKD): New Perspectives. Biomolecules. 12 (9), (2022).
  5. Li, S., et al. Research progress on extracellular vesicles in the renal tubular injury of diabetic kidney disease. Front Endocrinol (Lausanne). 14, 1257430(2023).
  6. Chen, Y., et al. ANGPT2/CAV1 regulates albumin transcytosis of glomerular endothelial cells under high glucose exposure and is impaired by losartan. Nefrologia (Engl Ed). 44 (1), 50-60 (2024).
  7. Chae, S. Y., Kim, Y., Park, C. W. Oxidative Stress Induced by Lipotoxicity and Renal Hypoxia in Diabetic Kidney Disease and Possible Therapeutic Interventions: Targeting the Lipid Metabolism and Hypoxia. Antioxidants. 12 (12), (2023).
  8. Wang, X., et al. CERS6-derived ceramides aggravate kidney fibrosis by inhibiting PINK1-mediated mitophagy in diabetic kidney disease. Am J Physiol Cell Physiol. 325 (2), C538-C549 (2023).
  9. Zou, Y., et al. Development and internal validation of machine learning algorithms for end-stage renal disease risk prediction model of people with type 2 diabetes mellitus and diabetic kidney disease. Ren Fail. 44 (1), 562-570 (2022).
  10. Ma, L., et al. Baicalin Alleviates Oxidative Stress and Inflammation in Diabetic Nephropathy via Nrf2 and MAPK Signaling Pathway. Drug Des Devel Ther. 15, 3207-3221 (2021).
  11. Du, L., et al. Inhibition of S100A8/A9 ameliorates renal interstitial fibrosis in diabetic nephropathy. Metabolism. 144, 155376(2023).
  12. Imafuku, T., et al. Cysteinylated Albumin as a Potential Biomarker for the Progression of Kidney Disease in Patients With Type 2 Diabetes. Diabetes Care. 44 (6), e115-e117 (2021).
  13. Ochoa, D., et al. The next-generation Open Targets Platform: reimagined, redesigned, rebuilt. Nuc Acids Res. 51 (D1), D1353-D1359 (2023).
  14. Safran, M., et al. GeneCards Version 3: the human gene integrator. Database (Oxford). 2010, baq020(2010).
  15. Davis, A. P., et al. Comparative Toxicogenomics Database (CTD): update 2023. Nucl Acids Res. 51 (D1), D1257-D2126 (2023).
  16. Duan, Q., et al. L1000CDS2: LINCS L1000 characteristic direction signatures search engine. NPJ Syst Biol Appl. 2 (1), (2016).
  17. Zhang, Q., et al. hTFtarget: A Comprehensive Database for Regulations of Human Transcription Factors and Their Targets. Genom Proteo Bioinfo. 18 (2), 120-128 (2020).
  18. Trott, O., Olson, A. J. AutoDock Vina: Improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. J Comp Chem. 31 (2), 455-461 (2009).
  19. Karuppasamy, M. P., Venkateswaran, S., Subbiah, P. PDB-2-PBv3.0: An updated protein block database. J Bioinfo Comp Biol. 18 (02), (2020).
  20. O'Boyle, N. M., et al. Open Babel: An open chemical toolbox. J Cheminfo. 3 (1), (2011).
  21. Kim, S., et al. PubChem Substance and Compound databases. Nuc Acids Res. 44 (D1), D1202-D1213 (2016).
  22. Li, B., Rui, J., Ding, X., Yang, X. Exploring the multicomponent synergy mechanism of Banxia Xiexin Decoction on irritable bowel syndrome by a systems pharmacology strategy. J Ethnopharmacol. 233, 158-168 (2019).
  23. Xue, B., et al. A System-Level Investigation into the Mechanisms of Chinese Traditional Medicine: Compound Danshen Formula for Cardiovascular Disease Treatment. PLoS ONE. 7 (9), (2012).
  24. Kasiske, B. L., et al. Response to Bui et al, "Patient Functional Status at Transplant and Its Impact on Posttransplant Survival of Adult Deceased-donor Kidney Recipients". Transplantation. 104 (2), e59(2020).
  25. Kawecki, C., Lenting, P. J., Denis, C. V. von Willebrand factor and inflammation. J Thromb Haemost. 15 (7), 1285-1294 (2017).
  26. Wilkening, A., et al. C-C chemokine receptor type 2 mediates glomerular injury and interstitial fibrosis in focal segmental glomerulosclerosis. Nephrol Dial Transplant. 35 (2), 227-239 (2020).
  27. Karasek, D., et al. Association of pigment epithelium derived factor with von Willebrand factor and plasminogen activator inhibitor 1 in patients with type 2 diabetes. Physiol Res. 68 (3), 409-418 (2019).
  28. Liu, J., et al. Single-Cell Spatial Transcriptomics Unveils Platelet-Fueled Cycling Macrophages for Kidney Fibrosis. Adv Sci (Weinh). 11 (29), e2308505(2024).
  29. Passi, I., Salwan, S., Kumar, B. US-FDA Approved Drugs in 2020 and 2021: A Review. Mini Rev Med Chem. 23 (12), 1273-1297 (2023).
  30. Das, P., Delost, M. D., Qureshi, M. H., Smith, D. T., Njardarson, J. T. A Survey of the Structures of US FDA Approved Combination Drugs. J Med Chem. 62 (9), 4265-4311 (2019).
  31. Zhou, L., et al. Brefeldin A inhibits colorectal cancer growth by triggering Bip/Akt-regulated autophagy. Faseb J. 33 (4), 5520-5534 (2019).
  32. Issa, M. E., Berndt, S., Carpentier, G., Pezzuto, J. M., Cuendet, M. Bruceantin inhibits multiple myeloma cancer stem cell proliferation. Cancer Biol Ther. 17 (9), 966-975 (2016).
  33. Guzzi, F., Cirillo, L., Roperto, R. M., Romagnani, P., Lazzeri, E. Molecular Mechanisms of the Acute Kidney Injury to Chronic Kidney Disease Transition: An Updated View. Int J Mol Sci. 20 (19), (2019).
  34. Tesch, G. H. MCP-1/CCL2: a new diagnostic marker and therapeutic target for progressive renal injury in diabetic nephropathy. Am J Physiol Renal Physiol. 294 (4), F697-F701 (2008).
  35. Wu, F., Sun, C. The Role of Chemokine Receptors in Renal Fibrosis. Rev Physiol Biochem Pharmacol. 177, 1-24 (2020).
  36. Davids, M. S., et al. An Integrated Safety Analysis of the Next Generation PI3Kδ Inhibitor Umbralisib (TGR-1202) in Patients with Relapsed/Refractory Lymphoid Malignancies. blood. 130, 4037(2017).
  37. Marar, P. V., Kumar, A., Swami, R., Shrivastava, S., Jeengar, M. K. Unlocking the Potential of Brusatol as an Antitumoral Agent: Molecular Mechanisms and Therapeutic Benefits. Rev Brasileira Farmaco. 34, 250-260 (2024).
  38. Seifert, S. A., et al. Acute hepatotoxicity associated with therapeutic doses of intravenous acetaminophen. Clin Toxicol. 54 (3), 282-285 (2016).
  39. Bolesta, S., Haber, S. L. Hepatotoxicity Associated with Chronic Acetaminophen Administration in Patients without Risk Factors. Ann Pharmacother. 36 (2), 331-333 (2002).
  40. Zhao, L., Zou, Y., Liu, F. Transforming Growth Factor-Beta1 in Diabetic Kidney Disease. Front Cell Dev Biol. 8, 187(2020).
  41. Matoba, K., et al. Unraveling the Role of Inflammation in the Pathogenesis of Diabetic Kidney Disease. Int J Mol Sci. 20 (14), (2019).
  42. Ezzo, M., Hinz, B. Novel approaches to target fibroblast mechanotransduction in fibroproliferative diseases. Pharmacol Ther. 250, 108528(2023).
  43. Giarratana, A. O., Prendergast, C. M., Salvatore, M. M., Capaccione, K. M. TGF-β signaling: critical nexus of fibrogenesis and cancer. J Transl Med. 22 (1), 594(2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Endothelial DysfunctionDiabetic Kidney DiseaseMulti Omics AnalysisTranscriptomic ProfilingSecretome ProteomicsHyperglycemic Endothelial CellsProtein Interaction NetworkDrug RepurposingNetwork PharmacologyMolecular Docking

Related Articles