Tek Hücreli Histon Post-Translasyonel Modifikasyonlarının Çoklayıcı Analizi için Otomatik Örnek Hazırlığı (sc-hPTM2)

Summary

Burada, izotopik iki plex etiketleme stratejisi ve ArgC sindirimi kullanarak tek hücreli histon post-translasyonel modifikasyon analizini otomatikleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu iş akışı, tek hücre çözünürlükte kromatin heterojenliği ve epigenetik yanıtların nicel, tekrarlanabilir ve yüksek hassasiyetli profillenmesini mümkün kılar.

Abstract

Histon post-translasyonel modifikasyonlar (hPTM'ler), kromatin organizasyonu ve gen ifadesinin merkezi düzenleyicileridir. Onların düzensizliği gelişim, kanser ve yaşlanmayla bağlantılıdır. hPTM'leri incelemek için tercih edilen yöntem kütle spektrometrisi olsa da, çoğu protokol toplu örnekler için tasarlanmıştır ve hücreden hücreye değişkenliği çözemez. Bu nedenle histon PTM analizinin tek hücre seviyesine genişletilmesi gereklidir ancak teknik olarak zordur; çünkü histonlar düşük bollukta, lizin açısından zengindir ve ciddi şekilde modifiye edilmiştir.

Burada, nano sıvı işleme kullanarak histon PTM analizi için otomatik tek hücreli proteomik iş akışını tanımlıyoruz. Sistem, bireysel hücrelerin nanolitre ölçekli işlemesini minimum işlem ve yüksek tekrarlanabilirlikle mümkün kılar. İş akışı, arginin kalıntılarını parçalayan ve histon proteomiklerinde genellikle gereken lizin bloklayıcı türev adımlarını ortadan kaldıran ArgC Ultra proteaz ile sindirimi içerir. Koşullar arasında nicel karşılaştırma sağlamak için, propionik anhidrit ve deuterli anhidrit olan propionik anhidrit-d10 ile iki pleksli etiketleme stratejisi uygularız. Otomatik örnek hazırlama, izotopik çoklama ve ArgC Ultra sindiriminin bu kombinasyonu, tek hücreli histon PTM analizi için daha sade ve hassas bir protokol ortaya çıkarır.

Bu yöntem, kromatin heterojenliğinin ve epigenetik bozulmaların tek hücre çözünürlükte etkilerinin araştırılmasına olanak tanır. İş akışını göstermek için HepG2/C3A hepatosellüler karsinom hücrelerinden sferoidler ürettik ve bunları hiperasetilasyonu indükleyen histon deasetilaz inhibitörü olan sodyum bütirat ile tedavi ettik.

Introduction

Histonlar kromatinin tekrarlayan birimleri olan nukleozomların protein bileşenleridir. N-terminal kuyrukları lizin ve arginin kalıntıları açısından zengindir ve asetilasyon, metilasyon ve fosforilasyon gibi post-translasyonel modifikasyonlar (PTM) tarafından yüksek derecede düzenlenir. Bu değişiklikler, DNA erişilebilirliğini ve böylece transkripsiyon, çoğaltma ve onarım gibi kontrol süreçlerini etkiler. Değişen histon PTM kalıpları, kanserden nörodejenerasyona ve yaşlanmaya kadar hastalık durumlarıyla güçlü şekilde^{ilişkilidir 1,2}. Bu nedenle, histon PTM analizi epigenetik ve proteomik araştırmalarında büyük ilgi görmüştür. Kütle spektrometrisi (MS), histon modifikasyonlarının sahaya özgü ve nicel analizini sağlar, ancak histonlar benzersiz analitik zorluklar sunar. Amino asit bileşimleri, çoklu modifikasyon noktaları ve karmaşık kombinatoryal desenleri, tipik proteinlere göre analiz edilmesini daha zor kılar. Yerleşik protokoller, sindirimden önce lizin kalıntılarını bloklamak için kimyasal türevleşmeye dayanır; bu da peptit geri kazanımı ve kromatografik performansı^{iyileştirir.} Toplu analizlerde etkili olmasına rağmen, bu çok aşamalı türev protokolleri tek hücreli girdiler için sorunlu kayıplar yaratabilir. Tek hücre analizi giderek daha önemli hale gelir çünkü biyolojik sistemler doğası gereği heterojendir. Toplu histon, birçok hücre arasında ortalama sinyalleri analiz eder ve bu değişkenliği yakalayamaz. Hücre alt popülasyonları kromatin durumlarında farklılık gösterebilir ve bu farklılıklar gelişimi, hücresel yeniden programlanmayı veya ilaç yanıtlarını^{tetikleyebilir 4,5}.

Burada, çoklu hücreli tek hücreli histon PTM analizi (sc-hPTM2) için otomatik bir örnek hazırlama yöntemi sunuyoruz. Bu yöntem, bireysel hücrelerin ve nanolitre ölçekli reaktiflerin otomatik olarak hassas şekilde dağıtılmasına olanak tanıyan CellenONE sistemine dayanır. Bu yöntem, damla hazırlamanın ilk kez cam^{slayt 6} üzerinde kullanılmasını tanıtan nano proteomik örnek hazırlama (nPOP) yönteminin bir varyasyonudur. nPOP platformu, gelişmiş otomatik tek hücreli proteomiğe sahiptir, ancak standart triptik sindirim protokolü yüksek lizin içeriği ve geniş modifikasyon yoğunluğu nedeniyle histonlar için optimal değildir. Burada, CellenONE sistemini altın standardı histon türevini propionik anhidrit ile birleştirecek şekilde uyarladık ve izotop etiketleme ekledik; böylece histon translasyonel sonrası modifikasyonların tek hücre çözünürlükte doğru ve kapsamlı nicelendirilmesini sağladı. Özellikle, protein sindirimi için ArgC Ultra proteaz kullanarak protokolü basitleştiriyoruz. Tripsinin aksine, ArgC yalnızca arginin kalıntılarını parçalar ve lizin blokajı gerektirmez. Bu, iki aşamalı türev stratejisine olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve protokolü kolaylaştırır. Ayrıca, yöntem propionik anhidrit ve propionik anhidrid-d10 kullanılarak iki pleksli izotop etiketleme şemasını içerir; böylece 2 hücre aynı anda analiz^{edilebiliyor 7,3}. Sindirim ve etiketlemeden sonra, tek hücreli örnekler sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi (LC-MS)/MS ile veri bağımsız alım (DIA) kullanılarak elde edilip analiz edilir. Elimizde, bu yöntemin histon PTM'lerinin nicelendirilmesinde hem hassasiyet hem de tekrarlanabilirlik açısından önceki yönteme^{kıyasla arttığı gösterilmiştir 8}.

Yöntemi göstermek için, HepG2/C3A hepatosellüler karsinom hücrelerinden türetilen sferoidlerde tek hücreli histon PTM dinamiklerini profil ettik. Bu sferoidleri, histon asetilasyonunu artıran ve kromatin^{regülasyonu 9,10'u} prob etmek için bir ölçüt olarak hizmet veren, iyi karakterize edilmiş bir histon deasetilaz inhibitörü olan sodyum bütirat ile işledik. Kontrol ve sodyum bütirat ile işlenmiş sferoidleri tek hücre çözünürlükte karşılaştırarak, temsilli sonuçların prensipin kanıtını gösteriyoruz ve kromatin biyolojisi ile kanser epigenetiğinde daha geniş uygulama potansiyelini vurguluyoruz. Özellikle, protokol için 3D^{sferoidler 10'un} büyümesi ve tedavisi, kütle^{spektrometrisi 11'de} histon peptitlerinin edinimi ve EpiProfile¹² yazılımı kullanılarak veri analizi hakkında önceki bir yayına atıfta bulunuyoruz.

Protocol

1. Tamponlar ve reaktifler

1. HepG2/C3A hücreleri için hücre büyüme ortamları: %10 fetal sığır serumu (FBS), temel olmayan amino asitler (%1 v/v), L-glutamin (%1 v/v) ve penisillin/streptomisin (%0,5 v/v) içeren Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM, 4.5g/L glikoz) hazırla. Büyüme ortamı 4 °C'de depolanır.
2. Ana karışım: ArgC Ultra 60 ng/μL, HEPES 6 mM, n -dodesil-β-D-maltozid (DDM) 0,03%, Ditiothreitol (DTT) 10 mM LC-MS kalitesinde suda hazırlanın.
3. HA çözeltisi: LC-MS sınıfı suda %1 (v/v) hidroksilamin hazırlayın.
4. Yıkama çözeltisi: %0,1 (w/w) formik asit içeren (tamamen LC-MS sınıfında) içeren 50:50 asetonitril/su karışımından 10 mL hazırlayın.
5. Mobil Faz A (MPA) - %0,1 formik asit: 999 mL HPLC kalitesinde suya 1 mL konsantre formik asit ekleyin ve iyi karıştırın.
6. Mobil Faz B (MPB) - %80 HPLC derecesi asetonitril + %0,1 formik asit: 199 mL HPLC kalitesinde suya 800 mL HPLC kalitesinde asetonitril ekleyin. Sonra, bu çözeltiye 1 mL konsantre formik asit ekleyin ve karıştırın.

2. Sferoidlerin hazırlanması

1. Küre hazırlıkları için Stransky S ve ^ark.11'e bakınız.
2. HepG2/C3A hepatosellüler karsinom hücrelerini dönen üç boyutlu (3D) bir biyoreaktörde 5-7 gün boyunca kültürlenerek ~400-600 μm çapına ulaşana kadar uniform sferoid oluşumunu teşvik eder. %10 FBS, %1 önemsiz amino asit, %1 L-glutamin ve %0,5 penisillin/streptomisin takviyesi içeren DMEM kullanın. Tedaviye kadar küreoidleri 37 °C ve %5_CO2 içinde tutun.
   NOT: Şekil 1A , referans kağıdında kürelerin hazırlanmasında kullanılan ekipmanı göstermektedir.

3. Hücre kültürü ve tedavisi

1. ~10 sferoid, 2 mL büyüme ortamı içeren doku-kültür 6-kuyu bir plakaya koyun.
2. Hücreleri nemlendirilmiş %5_CO2 kuluçka makinesinde 37 °C'de kuluçka yapın.
3. Sferoidleri 24 saat boyunca 5 mM sodyum butirat ile işledin veya kontrol için aynı hacimde su ekleyin (Şekil 1B).

4. Hücre izolasyonu ve tek hücreli süspansiyon hazırlığı

1. 24 saat tedaviden sonra, hücreleri 37 °C'de 3-5 dakika boyunca 1 mL tripLE ile kuluçka edin.
2. Küre parçalanıp tek hücreler elde edilene kadar nazikçe yukarı aşağı pipet yapın.
3. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpte toplayıp 10 mL'ye kadar buz gibi 1x PBS ile seyreltir, 500 g'da 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı aspire edin.
4. Hücreleri 1 mL buz gibi soğuk 1x PBS ile yeniden süzülün ve son konsantrasyonu 1 μM olan Sytox yeşil ölü hücre boyası ekleyin.
5. Hücreyi Sytox yeşili ile karanlık bir ortamda buz üzerinde 20 dakika kuluçka yapın.
6. Hücreyi 10 mL buz gibi soğuk 1x PBS ile yıkayın, 500 g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı aspire edin.
7. Hücreleri 1 mL buz gibi soğuk 1x PBS ile yeniden süspansiyona alın ve nihai konsantrasyonu %0,5 olan paraformaldehit (PFA) ekleyin.
8. Hücreyi PFA ile 15 dakika boyunca buzda kuluçka yapın.
   NOT: Sytox yeşili genellikle membran geçirimliliği nedeniyle fiksasyonla uyumlu olmasa da, test ettiğimiz hücrelerde Sytox yeşili hücrelerin oranı fiksasyondan 8 saat sonra aynı kalır ve histon protein sızıntısı belirtisi yoktur.
9. Hücreyi 10 mL buz gibi soğuk 1x PBS ile yıkayın, 500 g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı aspire edin.
10. Hücreleri son konsantrasyon olarak 200-500 hücre/μL olarak yeniden yapılandırın.
    NOT: Birikme eğiliminde olmayan küçük hücreler için 500 hücre/μL konsantrasyon önerilirken, birikme eğiliminde olan büyük hücreler için 200 hücre/μL konsantrasyon önerilir. Hücre süspansiyonu agregasyona yatkınsa, aspirasyondan önce 40 μm süzgeçten geçirerek nozul tıkanmasını önleyin. 40 μm'den büyük hücreler ilgi çekiciyse ve muhtemelen bir örnekte bulunuyorsa, çok büyük agregaları çıkarmak için 70 μm'lik bir süzgeç kullanılabilir.
11. Hücreleri buzda saklayıp ayıklama için enstrumana yüklenene kadar saklanın.

5. Yazılım bağlantısı ve sistem başlatma

1. cellenONE sistemini açın (Şekil 2A), kontrol bilgisayarını başlatın, yazılımı başlatın ve v2.0-nPOP2 kullanıcı çalışma alanını açın; nPOP için gereken tüm alan dosyaları ve çalıştırma şablonları oraya önceden yükleniyor.
2. Cihazın soğutucusunun açık olduğundan emin olun, ardından çig noktası kovalama değerini cihazın şu anda bildirdiği iç sıcaklığa göre ayarlayın.
3. Sistemi, ekrandaki talimatlara uygun olarak 1 ve 3 yuvalarına yerleştirilen PDC-70, kaplama tipi 2 dağıtım nozulları (Şekil 2B) ile astarlayın.
4. Her nozulun darbe genişliğini ve sürücü voltajını üreticinin ambalajında belirtilen değerlere ayarlayın.
   NOT: İki ayrı nozul kullanmak, dağıtım tutarlılığını korur: biri hücre askısını, diğeri reaktifleri sağlar, böylece nozula yapışan herhangi bir kalıntı sonraki düşüşleri tehlikeye atmaz. Son toplama aşamasında her iki nozulun kullanılması da numune kurtarımı hızlandırır.
   1. (KRİTİK ADIM) Maksimum manyetik verimliliği için, iki nozül arasındaki z-offset <50 μm fark etmelidir. Bunu, her nozul için optimal temas pozisyonunu belirleyerek ve Nozul Kurulumu sekmesinde Z-yüksekliği okumalarını karşılaştırarak belirleyin.
5. Nemlendirici rezervuarını belirtilen dolum hattına kadar de-iyonize su ile doldurun.

6. Sıvı taşıyıcıda ön çalışma yapılandırması

1. Hazırlanacak cam slayt miktarını seçin (Şekil 2C). Bu seçim, analiz edilmesi planlanan toplam hücre sayısını doğrudan tanımlar.
2. 2-plex çoklama şeması için (Şekil 3A), 320 hücreli tek bir slayt yükleyin.

7. Sürgü kenarlarına dimetil sülfüsit (DMSO) "hendek" dağıtmak

NOT: Şekil 3B, DMSO hendeğinden başlayarak cellenONE'daki örneklerin hazırlanması adımlarını göstermektedir. Damla buharlaşmasına karşı ek bir önleme olarak, DMSO sürgülerin kenarları boyunca dağıtılır.

1. Ana sekmede, 0_Dispense_DMSO_Moat için koşu seçeneğini seçin.
2. Target Setup sekmesine gidin, uygun şema klasöründen DMSO_Moat.fld dosyasını yükleyin ve Alan Sayısı'nı Y'ye ayarlayın, böylece işlenmesi planlanan slayt sayısını eşleştirin.
3. Aliquot 150 μL LC-MS sınıfı DMSO'yu yeni bir PCR tüpüne yerleştirin ve CellenWASH istasyonunun 2. pozisyonuna boku alet kapağına bakacak şekilde yerleştirin.
4. Run sekmesini açın ve Start Run'a tıklayın. Sistem, 10 μL DMSO çekecek ve damlanın stabilitesinin kullanıcı onayı için duraklatır. Üç otomatik drop test damlası ateşleyin (Şekil 4A); Üçü de mükemmel şekilde oluştuysa, Devam Et'e tıklayın.
5. Dağıtımdan sonra memelikler otomatik olarak suyuyor ve cihaz, kalite kontrolü için tüm slaytlarda görüntüler yakalar. Her slaytta bir DMSO damlası olduğunu doğrulamak ve eksik veya hedefsiz damlacıkları kontrol etmek için görüntüleri inceleyin (Şekil 4B).

8. DMSO dağıtımı

1. Ana sekmede, 1_Dispense_DMSO için koşu seçeneğini seçin.
2. Target Setup sekmesini açın, DMSO.fld alan dosyasını (Şekil 4C) uygun şema dizininden aktarın ve İşlemeyeceğiniz slayt sayısına eşdeğer olarak Alan Sayısını Y olarak ayarlayın.
3. Aliquot 150 μL LC-MS sınıfı DMSO'yu yeni bir PCR tüpüne yerleştirin ve CellenWASH istasyonunun 2. pozisyonuna boku alet kapağına bakacak şekilde yerleştirin.
4. Run sekmesini açın ve Start Run'a tıklayın. Sistem, 10 μL DMSO çekecek ve damlanın stabilitesinin kullanıcı onayı için duraklatır. Üç otomatik drop test damlası atın; Üçü de mükemmel şekilde oluştuysa, Devam Et'e tıklayın.
5. Bitiştirme işlemi sırasında yazılım nozulları otomatik olarak temizler ve kalite güvencesi için her slaytta görüntüler yakalar. Her slaytta bir DMSO damlası olduğunu doğrulamak ve eksik ya da hedefsiz damlacıkları kontrol etmek için görüntüleri gözden geçirin.

9. Cep telefonu dağıtımı

1. Ana sekmede, 2_Dispense_Cells için koşu seçeneğini seçin.
2. Hedef Kurulum sekmesinde, seçilen çoklu eksileme şeması dizininin Cells Field Files alt klasörünü açın.
3. Deney iki koşul içerdiği için, sıralamaya hazırlanacak örnekle eşleşen alan dosyasını seçin—ya CellType_A.fld ya da CellType_B.fld.
4. Dosya yüklendikten sonra, Alan Sayısını Y olarak ayarlayın, böylece bu çalışma için toplam slayt sayısına eşit olur.
5. 4.11. adımdan itibaren hücre süspansiyonunu buz üzerinde 10 dakika boyunca vakum pompasıyla desizleştirin.
6. Hazırlanan hücre süspansiyonundan 150 μL temiz bir CellenVIAL'a aktarın, ardından şişeyi CellenWASH karuselinin 1 numaralı yuvasına kapağı alet kapısına doğru yönlendirerek yerleştirin.
7. Nozul Kurulumu sekmesine gidin > Görevi Yap ve şişeden örneği çekmek için Take10ul_CellenVIAL_nozzle1 çalıştırın.
8. Nozul Kurulumu sekmesinde kalarak, hücre dağıtıcı görüntüleyiciyi (Şekil 5A) başlatın ve boyut ile uzatmaya göre çıkarma bölgesi ve kapı nesnelerini tanımlayan haritalama rutinini çalıştırın. Şekil 5A'da gösterilen tek hücreli izolasyon parametreleri, sferoidlerden ayrılmış HepG2/C3A hücrelerinin dağıtılmasında kullanılan tam ayarlarla örtüşür.
9. Sonra T > F seçerek floresans modunu aktive edin. Seçim modunu negatif olarak ayarlayın. Ölü hücrelerin izole edilmemesi için boyut ve yoğunluk için izolasyon parametre aralığını minimumdan maksimum değere çıkarmak.
10. Eşleme parametreleriyle doğrulayın, Çalıştır sekmesini açın, Çalıştır düğmesine tıklayın, ardından yazılım komutlarını takip edin. Dağıtım bittiğinde, cihaz nomeleri otomatik olarak yıkayacak ve damlaların yerleşimi ile düzenliliğini incelemek için slayt görüntüleri yakalayacak.
    NOT: Hücre sıralaması sırasında, çalışma sırasında izole edilen her hücrenin görüntüleri alınır (Şekil 5B).
11. Hücre ayırma işlemi bittikten sonra dağıtım penceresini kapatın.
12. Bölüm 9 bitene kadar kalan hücre askısını buzda tutun; Fazlalık daha sonra toplu örnekler, ampirik kütüphane oluşturma veya ek doğrulama çalışmaları için kullanılabilir.

10. Sindirim master karışımı dağıtımı

1. Ana sekmede, 2_Dispense_Digest_10ulPickup için koşu seçeneğini seçin.
2. Target Setup sekmesini açın, uygun multiplexing-scheme klasöründen Digest.fld'yi yükleyin ve bu çalışma için slayt sayısına eşit olacak şekilde Alan Sayısını Y olarak ayarlayın.
3. Taze bir sindirim master karışımı hazırlayın ve çözeltiyi vakum pompasıyla buz üzerinde 10 dakika boyunca gazdan gazlayın (Ana karışım: ArgC Ultra 60 ng/μL, HEPES 6 mM, DDM 0,03%, DTT 10 mM LC-MS kalitesinde suda).
4. Ana karışımın 20 μL'sini 384 kuyu bir plakaya pipet yapın ve plakayı X1 sisteminin içine yerleştirin.
5. Run sekmesinde Start Run tuşuna tıklayın ve talimatları takip edin. Sistem reaktifi aspire ettikten sonra, istendiğinde damla stabilitesini doğrulayın.
6. Dağıtım bittiğinde, cihaz nozulları otomatik olarak sigarlar ve her slaytı fotoğraflar; Her damlanın sindirim karışımını eşit şekilde aldığından emin olmak için görüntüleri inceleyin.
7. Sindirim için slaytları gece boyunca kübe edin, belirtilen nem ve çiy noktası ayarlarını koruyun. Her damlacık ~13,5 nL sindirim karışımı içerir. Sindirimi gece boyunca ~%75 orantı göreceli nemde gerçekleştirin; çiğ noktası damlaların buharlaşmasını önlemek için odanın sıcaklığından 1-2 °C altında tutulur.

11. Gece boyunca kuluçka

1. Ana sekmede, 4_Incubation_16h'e kadar koşu seçeneğini seçin.
2. Run sekmesine geç, Start Run'a tıklayın.
   NOT: Aletler, damlaların durumunu izlemek için her 30 dakikada bir slaytların fotoğrafını çekecek. Kuluçka sırasında kuruyor veya şişirirse, çiğ noktası ayarını gerektiği gibi ayarlayın.
3. Kuluçka tamamlandığında, kuluçkanın tamamlandığına dair bir mesaj açılır.
   NOT: Hızlı sindirimler (≤4 saat) daha yüksek etkili enzim-substrat koşullarıyla mümkün olabilir; Bu burada değerlendirilmedi, bu yüzden doğrulanan koşul 16 saat olarak kalır.

12. Buharlaşma

NOT: Etiketleme aşamasına geçmeden önce, damlaların durumu kontrol edilmek önerilir; suyun etiketleme verimliliğine engel olabileceğinden ve su çok şişmediğinden emin olun. Bu amaçla buharlaşma aşaması önerilir.

1. Ana sekmede, 5_Evaporation için koşu seçeneğini seçin.
2. Dosya, Soğutma Ünitesi Kontrolü'ne gidin ve Çiğ Noktası Kontrolü altında Sabit Kontrol Sıcaklığı'nı 23 °C'ye ayarlayın.
3. Run sekmesine geç, Start Run'a tıklayın. Kurutma 5 dakika sürer ve cihazlar kurutmadan sonra slaytların fotoğraflarını otomatik olarak çeker.
4. Fotoğrafları inceleyin; Damlalar yeterince kuruysa, koşu durdurun. Eğer yoksa, devam et'e tıklayın ve 5 dakika daha kurutun (Şekil 6A).
5. Koşu sonunda önceki Çiy Noktası Kontrolü'ne geri dönün.

13. Etiketler dağıtılır

1. Ana sekmede, 6_Dispense_PA_Labels için koşu seçeneğini seçin.
2. Target Setup sekmesine gidin, uygun şema klasöründen Labels.fld dosyasını yükleyin ve İşleme planlanan slayt sayısını eşleştirerek Alan Sayısı'nı Y olarak ayarlayın.
3. Aliquot 150 μL LC-MS sınıfı DMSO'yu CellenWASH istasyonunun 2 numaralı yuvasına yerleştirdi.
4. Çoklu histon türevi için iki etiketleme stokunun bir stok çözümü hazırlayın: DMSO'da %25 (v/v) propionik anhidrit ve DMSO'da %25 (v/v) propionik anhidrit-d₁₀ .
   NOT: Her iki çözeltiyi de plakaya aktarmadan önce gazdan ayırarak baloncuk oluşumunu en aza indirin.
5. Her etiketleme reaktifinden 20 μL 384 kuyuluğa uygun bir plakanın belirlenmiş kuyularına dağıtın ve plakayı X1 sisteminin içine yerleştirin. Her damla, ~10 nL etiketleme reaktifi alır (%25 propionik anhidrit veya %25 propionik anhidrit-d₁₀ DMSO).
6. Çalıştır sekmesine geçin, Çalıştır'a tıklayın ve talimatları takip edin.
7. Etiketlerin 1 saat boyunca kaydırmada tepki vermesine izin verin.
8. Dağıtımdan sonra, cihaz nomeleri otomatik olarak sigaret eder ve her slaytı fotoğraflar. Görüntüleri gözden geçirerek tüm slaytlarda eşit dağılımını ve doğru damla yerleşimini doğrulayın.

14. HA dağıtımı

1. HA çözeltisini hazırlayın ve kullanmadan önce gazdan temizleyin.
2. Şişeyi doldur. HA çözeltisinin 150 μL'sini temiz bir PCR tüpüne pipet edin, CellenWASH yuvası 2'ye yerleştirin ve kapağı enstrüman kapağına doğru yönlendirin.
3. Koşu profilini seçin. Ana sekmede 7_Dispense_Quench seçin.
4. Alan dosyasını yapılandırın. Hedef Kurulum sekmesini açın, uygun çoklu çalışma şeması klasöründen HA.fld dosyasını yükleyin ve Alan Sayısını Y olarak ayarlayın, böylece toplam slayt sayısına eşit olur.
5. Koşuya başla. Çalıştır'a gidin, Start Run'a tıklayın ve ekrandaki talimatları takip edin.
6. Kuluçka için. HA'nın slaytlara tepki vermesine 30 dakika bekleyin.
7. Dağıtımı doğrulayın. Tamamlandıktan sonra, sistem nomelikleri yıkar ve her slayt incelemesinin görüntülerini çekerek damlaların düzgün yerleşimi ve hacmini doğrular.

15. Örnek alım

1. Yıkama çözümünü WashTray XL'de hazırlayın.
2. Tahsilat plakasını kur. 2 μL 0,01% (w/w) DDM'yi LC-MS kalitesinde suya taze 384 kuyu tazeliğindeki her kuyuya dağıtın ve plakayı sıvı işleyicinin içine yerleştirin.
3. Pick-up koşusunu seçin. Ana sekmede, profil 8_Pickup_2plex seçin.
4. Saha dosyasını yükleyin. Target Setup sekmesini açın, doğru multiplexing-scheme dizininden Pick-up.fld'yi içe aktarın ve Saha Sayısı'nı Y olarak ayarlayın ki slayt sayısına uysun.
5. Koşuyu gerçekleştir. Çalıştır sekmesine geçin, Çalıştır'a tıklayın ve talimatları takip edin. Cihaz, her damlayı toplayacak, memelikleri yıkacak ve slaytları incelemek için fotoğraflayacak ve her numunenin alındığını doğruldacak.

16. Teslim alma sonrası işleme

1. 384 kuyu plakasını yapışkan folyo ile mühürleyin ve kısa bir süre santrifüj ile damlaları kuyunun tabanlarına getirin.
2. Folyoyu çıkarın ve örnekleri vakum konsansantatörlerinde düşük ısıda kurutun.
3. Plakayı yapışkan folyo ile mühürleyin ve kurutulmuş plakayı -80 °C'de LC-MS/MS analizine hazır olana kadar saklayın.

17. Toplu numune hazırlama

1. 9. bölümden kalan süspansiyon kullanılarak, hücreleri aşağı döndürüp 1x PBS ile yeniden süzülerek 2.000 hücre/μL konsantrasyon elde edilir. Bu, bölüm 10 tamamlandıktan sonra yapılmalıdır.
2. Termal lizi: kalan süspansiyonu -80 °C'de 10 dakika boyunca snap-freeze ile dondurun, ardından 10 dakika boyunca 90 °C'de ısı şoku uygulanır.
3. Tüpün oda sıcaklığına soğumasına izin verin.
4. 25 μL lizatı bir PCR tüpüne aktarın ve önceden hazırlanmış sindirim karışımından 5 μL ekleyin.
5. Gece boyunca (16 ≈saat) 37 °C sıcaklıkta termal döngücü içinde kuluçka yapın.
6. Işık etiketi türevleme: 5 μL yeni %25 (v/v) ışık etiketi asetonitrile ekleyin ve 1 saat kuluçka yapın.
7. Reaksiyon söndürme: %1 (w/w) hidroksilamin (HA) çözeltisi 5 μL eklenin ve 30 dakika kuluçka yapın.
8. Örneği düşük ısıya ayarlanmış vakum konsansantretörde kurutun, ardından LC-MS/MS için hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.

18. LC/MS kurulumu ve veri toplama

NOT: Bu makale için veri toplamak için, İyon Optikleri 75 μm ID x 25 cm x 1.7 μm analitik sütunlu LC-MS\MS sistem kurulumu yapılmaktadır.

1. Mobil aşamaları HPLC üzerinde çalışmaya hazırlayın:
   Mobil Faz A (MPA): HPLC sınıfı suda %0,1 formik asit
   Mobil Faz B (MPB): HPLC dereceli asetonitrildə %0,1 formik asit
2. HPLC yöntemini 30 dakikalık aktif gradyan için programlayın: %5-23 MPB 25,7 dakikada, %23-35 MPB 2,6 dakikada ve %35-45 MPB 1,7 dakikada, 200 nL/dakika akış hızında. Otomatik numune almayı %0,1 FA + %0,01 DDM ile 'kuru' alma için yeniden askıya alacak şekilde programlayın.
3. Veri bağımsız edinim (DIA) gerçekleştirmek için MS edinim yöntemini kurun:
   NOT: Bu ayarlar, FAIMS Pro Duo ile donatılmış Thermo Exploris 480 için özel ve enstrumanınıza göre değişebilir. Aşağıda açıklandığı gibi benzer m/z aralıklarına sahip DIA tek hücreli proteomikler için yaygın olanların kullanılması önerilir.
   1. MS'yi tam tarama hızı 300-1100 m/z arasında ve 120.000 çözünürlüğe, AGC hedefini %300, maksimum enjeksiyon süresi 246 ms ve FAIMS CV'sini -50 V olarak ayarlayın.
   2. MS/MS'yi 300-1100 m/z arasında DIA taraması olarak ayarlayın, çözünürlüğü 60.000, izolasyon penceresi 50 m/z, HCD çarpışma enerjisi %27, ilk kütle 120 m/z, AGC hedefi %1000, maksimum enjeksiyon süresi 118 ms ve FAIMS CV -50 V.
4. Tek hücreleri içeren 384 kuyu plakadan folyo contasını çıkarın. Toplu örnek %0,1 FA + %0,01 DDM ile 100 hücre/μL ile yeniden oluşturulur ve 10 μL kuyunu, örneğin P24 gibi boş bir kuyuya aktarılır. Sonra plakayı delinebilir bir kauçuk matla mühürleyin ve otomatik numune almaya yükleyin.
5. Kuyruk çalıştırma çalışmaları: önce toplu örnekleri, ardından tek hücre kümelerini çalıştırın.

19. Veri analizi

1. Ham verileri EpiProfile2.1 ile çalıştırarak propionik anhidrit ile etiketlenmiş hücreler için peptidoform bolluklarıyla çıktıyı alın.
   NOT: Veri işleme için EpiProfile 2.1'i kullanabilmek için örneklerin bir Thermo cihazında alınması gerekir. Bu yazılım, kanonik versiyonuyla yaklaşık 250 peptioform çıkarır, ancak organizma, ilgi çekici ek modifikasyonlar, mutasyonlar vb. olarak ^{düzenlenebilir.12}.
2. Ham veriyi EpiProfile2.1_D5 ile çalıştırın, propionik anhidrid-d10 ile etiketlenmiş hücreler için peptidoform bolluklarıyla çıktı alın.
3. Meta verileri Epiprofile çıktılarıyla quantQC programıyla bağlayan eşleme işlemi gerçekleştirilir.
4. Başarısız örnekleri boşluklarla karşılaştırarak filtreleyin.
5. Örneklerin en az %50'sinde olmayan peptidoformları filtreleyin.
6. Tek hücre yoğunluğu sinyali boşluklardaki %150 sinyalden fazla olmayan peptidoformları filtreleyin.
7. Sonuç tablosunu (Şekil 7A) alın ve gerektiğinde verileri daha fazla işleyin.

Results

Tek hücreli histon proteomik iş akışımızın sistemimizi kullanarak uygulamasını göstermek için, 5 mM sodyum bütirat ile işlenmiş HepG2/C3A hücrelerinin sferoidlerini 24 saat boyunca analiz ettik. LC-MS/MS alınımından sonra, hem hafif (propionik anhidrit) hem de ağır (propionik anhidrid-d10) etiketleme için ham veriler EpiProfile ile işlendi ve peptit ve histon işaretlerinin bolluğunu temsil eden normalize veriler elde edildi. QuantQC R paketi, sıvı işleyicinin edinim meta verilerini EpiProfile çıktılarına eşlemek için kul...

Discussion

Tek hücre düzeyinde histon sonrası translasyonel modifikasyonları ölçebilme yeteneği, kromatin düzenlemesinin gerçek heterojenliğini anlamak için kritik bir adımı temsil eder. Geleneksel toplu yöntemler, hPTM'lerin dokular arasındaki ortalama dağılımı hakkında paha biçilmez bilgiler sağlamış, ancak giderek daha fazla biyolojik olarak anlamlı olarak kabul edilen hücreden hücreye değişkenliği^{gizlemektedir 5}. Tek hücreli proteomik yaklaşımlar artık bu gizli karmaşıkl...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri	Bio-Rad	2239480
1000 µ L geniş delikli pipet uçları	Fisher Scientific	14222703
200 µ L geniş delikli pipet uçları	Fisher Scientific	14222730
384 kuyuklu PCR plakası Lo Bind	Eppendorf	30129547
96 kuyuklu vakum manifold	Millipore	MAVM0960R
Asetonitril, Optima LC-MS/MS derecesi	Fisher Scientific	A955-1
Yapıştırıcı PCR plaka folyoları	Thermo Fisher	AB0626
Ansusuz asetonitril	Fisher Scientific	AA42311AK	Toptan etiket stok çözümü
Arg-C Ultra, Kütle Spec Sınıfı	Promega	VA1831
Hücre kültürü derecesi su	Corning	25-055-CV
CellenVIALS	SCIENION	/	Katalog numarası bir teklif ile birlikte gelir
DMSO, Ansusuz	Thermo Fisher	D12345	Etiket stok çözümü
DTT	Sigma	D0632-5G
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta Aracı (DMEM)	Fisher Scientific	MT17205CV
Fetal Sığır Serumu	Fisher Scientific	MT35010CV
Formik asit	Termo	28905
Formik asit %98– LC-MS LiChropur için %100	Sigma	5330020050
Hank'in Dengeli Tuz Çözümü (HBSS)	Fisher Scientific	MT21022CV
HEPES (Ultra Pure)	Thermo Fisher	11344041
HPLC derecesi asetonitril	Fisher Scientific	A955-4
HPLC kalitesinde su	Fisher Scientific	W5-4
Hidroksilamin çözeltisi %50 wt. H2O içinde	Sigma	438227-50ML
L-glutamin	Fisher Scientific	MT25015CI
n-Dodesil-beta-Maltosid (DDM) Deterjan	Fisher Scientific	BN2005
Esansiyiz olmayan amino asitler	Fisher Scientific	MT25025CI
Orbitrap Exploris 480 Kütle Spektrometresi	Thermo Fisher	BRE725539
Paraformaldehit 16% Sulu Çözelti EM Derecesi	Elektron Mikroskopi Bilimleri	15710-S
PDC-CM (tip 2 kaplama)	SCIENION	/	Katalog numarası bir teklif ile birlikte gelir
Penisillin-Streptomisin	Fisher Scientific	MT3002CI
Fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS), 10x, pH 7.4, RNase içermeyen	Thermo Fisher	AM9625
Pierce Dimetilsülfüfoksit (DMSO), LC-MS Sınıfı	Thermo Fisher	85190
Pipet tabancası	Eppendorf	Z666467 (Milipore Sigma)
Propionik anhidrit ≥ 99%	Sigma	240311-50G
Propionik anhidrid-d10 ≥ 98 atom %D, ≥ %99 (CP)	Sigma	615692-1G
Soğutmalı santrifüj	Termo	75-217-420
SciCHIP H1 kaplamalı cam sürgüler	SCIENION	/	Katalog numarası bir teklif ile birlikte gelir
SpeedVac vakum konsantratör (96 kuyu plakalar)	Termo	15308325	Savant SPD1010
Steril başlık	Termo	1375
Steril serolojik pipetler	Fisher Scientific	1367549
SYTOX Yeşil Ölü Hücre Boyaması, akış sitometrisi için	Thermo Fisher	S34860
TrypLE Ekspres Enzimi (1X), fenol kırmızısı yok	Thermo Fisher	12604013
Vortex	Sigma	Z258415
Su banyosu	Fisher Scientific	FSGPD10