Yöntem makalesi

CD63-GFP Raporlayıcı Fare Modeli Kullanılarak Adipositten Türetilen Ekstraselüler Vezikül Salgısının Karakterizasyonu In Vivo ve In Vitro

DOI:

10.3791/69670

⸱

5 Aralık 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 2Fleischer Institute for Diabetes and Metabolism, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 5Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 6Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol, adiposit kaynaklı ekstraselüler veziküllerin (EV) salgılanmasını görselleştirmek ve nicel olarak ölçmek ve bunların adil hücreler tarafından alınmasını göstermek için adipositlere özgü CD63-GFP raporlayıcı fare hattı kullanır; böylece yağ dokusu içinde parakrin bir yol ortaya çıkarır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adipositler, proteinler, lipidler ve nükleik asitlerle zenginleştirilmiş önemli miktarda EV'ler salgılayan aktif endokrin hücreler olarak giderek daha fazla tanınmaktadır. Ancak, EV salgılanmasını yöneten mekanizmalar ve farklı biyolojik bağlamlarda EV salınımının dinamikleri tam olarak anlaşılmamıştır. Bu boşluğu gidermek için, GFP etiketli CD63'ün ifadesinin Adiponectin promotör tarafından yönlendirildiği, AdEV'lerin in vivo olarak seçici etiketlenmesi ve takibi mümkün kıldığı yeni bir adiposit-spesifik CD63-GFP raporlayıcı fare hattı oluşturduk. Bu raporlayıcı modeli kullanılarak, AdEV'lerin salgılanmasını ve yağ dokularındaki APC'lere ulaşımını inceledik. Konfokal görüntüleme ve akış sitometrisi, AdEV'lerin APC'ler tarafından aktif olarak benimsendiğini ortaya koydu ve bu da yağ mikro ortamında daha önce yeterince takdir edilmeyen parakrin iletişim mekanizmasını ortaya koydu.

In vivo çalışmaları tamamlamak için, differensiyel adipositlerden EV salgılanmasının doğrudan izlenmesine olanak tanıyan in vitro bir sistem kuruldu. APC'ler, raporlayıcı farelerin deri altı beyaz yağ dokularından izole edildi ve olgun adipositlere ayrılmaları için indüklendi. Bu hücrelerde, CD63-GFP sinyalleri ayrık nokta olarak gözlemlendi ve EV salgılanması engellendiğinde plazma zarında zenginleşti; bu, bloklanan salınımda vezikül birikimi ile uyumludur. Normal büyüme koşullarında, kültür ortamına salgılanan EV'ler konsantre edilip boyut dışlama kromatografisi kullanılarak saflaştırıldı; böylece sonraki fonksiyonel ve biyokimyasal analizler yapıldı.

Bu platform, epididimal beyaz ve kahverengi yağ dokusu gibi diğer yağ depolarından türetilen APC'lere uygulanabilir veya bunları depoya özgü adipositlere ayırt ederek farklı adiposit tipleri arasında EV salgılamasının karşılaştırılmasına olanak tanır.

Bu yaklaşımlar birlikte, AdEV salgılanması ve hedefleme dinamiklerini incelemek için sağlam bir genetik araç ve tamamlayıcı bir in vitro sistem sunar. Bu gelişmeler, intra-yağ hücresel iletişimi aydınlattı ve AdEV'lerin sağlık ve hastalık üzerindeki daha geniş metabolik etkisini anlamak için zemin oluşturdu.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yağ dokusu, tüm vücut enerji homeostazında kilit rollere sahip dinamik bir endokrin organolarak giderek daha fazla tanınmaktadır 1,2,3,4,5. Klasik lipid depolama deposu işlevinin ötesinde, adipositler sistemik insülin hassasiyetini düzenler ve yağ kütlesindeki bozukluklar—fazla ya da eksiklik olsun—insülin direnci ve metabolik hastalık 6,7,8,9 ile ilişkilidir. Bu düzenleyici kapasiteye katkıda bulunması önerilen mekanizmalardan biri, salgılanan faktörler aracılığıyla hücreler arası iletişimdir. Adipokinler, yağ dokusundan gelen temel endokrin sinyaller olarak iyi tanınmış olsa da, adipositler ayrıca lipidler, proteinler, nüklein asitler ve metabolitler içeren membrana bağlı parçacıklar olan önemli sayıda ekstrasellüler vezikülleri (EV) salgılar. Adiposit salgılanan EV'lerin (AdEV'ler) diğer EV türleri gibi glikan taşıyıp taşımadığı hâlâbelirsiz 19,20,21,22,23,24. Adipositler, fare modellerinde dolaşımdaki yaklaşık %80'in adipositlerden kaynaklandığı için EV'lerin başlıca kaynağı olduğu kanıtlanmıştır; bu, başlangıçkoşulları 25 altında adiposit-spesifik Dicer knockout fareleri kullanılarak gösterilmiştir. AdEV'lerin metabolizma, iltihaplanma, insülin hassasiyeti ve adipogenezdeki rolleri rapor edilmiştir, ancak henüz tam olarakanlaşılmamıştır 26,27,28,29. Diğer potansiyel işlevler, özellikle diğer hücre tipleri ve organlarla çapraz konuşmayı arabuluculuk etmede, hâlâ büyük ölçüde bilinmemektedir. EV'lerinbolluğu 26, hem yerel hem de sistemik sinyalleşmede önemli roller oynayabileceklerini göstermektedir, ancak AdEV'lerin biyolojik önemi ve etki mekanizmaları büyük ölçüde keşfedilmemiştir. Bu bilgi eksikliği, AdEV salgısı ve fonksiyonunu incelemek için sağlam ve özel yöntemlere ihtiyaç olduğunu vurgulamaktadır.

Bu boşluğu gidermek için, Adiponectin-Cre farelerini Stopfl/fl/CD63-GFP fareleri (strain#:036865, JAX) çaprazlayarak adiposit-spesifik CD63-GFP fareleri (AdipCD63-GFP) ürettik. CRE yokluğunda CD63-GFP ifade etmeyen stopfl/fl/CD63-GFP littertermate'leri kontrol olarak kullanıldı. CD63-GFP raporlayıcı suşu, endotel ve nöron kaynaklı EV'ler dahil olmak üzere hücre tipine özgü EV'leri in vivo olarak başarıyla izlemekiçin kullanılmıştır 30,31. Adiponektin yalnızca olgun adipositlerde ekspresye ulaştığı ve adiposit öncül hücrelerinde (APC'lerde)32,33 olmadığı ve CD63EV'lerin 34'ün bir belirteci olduğundan, dolaşımda ve dokularda tespit edilen GFP+ EV'ler özellikle AdEV olarak tanımlanabilir. Bu nedenle, bu çalışmada APC'lerde tespit edilen GFP+ EV'ler, bu öncül hücreler tarafından alınmış AdEV'ler olarak yorumlanmaktadır. Bu raporlayıcı sistem, vezikül salınımının ve potansiyel hedef etkileşimlerinin in vivo ve in vitro olarak doğrudan izlenmesine olanak tanır ve diğer yağ dokusu hücre tiplerinde AdEV'lerin incelenmesini sağlar. Önemli olarak, AdEV'ler diğer hücre tiplerinden gelen EV'lere kıyasla özellikle lipid açısından zengindir; bu da onları daha yüzdürücü, kırılgan ve geleneksel ultrasantrifüj yöntemleriyle kurtarılması zor halegetirir (35,36,37). Yüksek santrifüj kuvvetleri bu veziküllere zarar verebilir veya önemli numune kayıpları ve kontaminasyona yol açabilir, bu da aşağı akış analizini zorlaştırabilir. Bu sınırlamaları aşmak için, birden fazla düşük hızlı santrifüj adımını boyut dışlama kromatografisi ile birleştiren bir iş akışını optimize ettik; bu süreç, kesme gerilimini en az tutar, vezikül bütünlüğünü korur ve saflık ile verimi artırır; böylece doğru nicelendirme ve fonksiyonel çalışmalar mümkün olur. CD63-GFP sistemi ve bu optimize edilmiş izolasyon hattı birlikte, AdEV salgısı ve işlevini yağ dokusu çapraz salgısı ve sistemik metabolik düzenlemede araştırmak için erişilebilir ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sunar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Albert Einstein Tıp Fakültesi'nin hayvan bakım ve kullanım yönergelerine uygun olarak, erkek fareler 12 saat ışık/12 saat karanlık döngüde %30-70 bağıl nemle 22 °C sıcaklıkta grup olarak yerleştirildi, yiyecek ve suya imkansız erişim sağlandı ve C57BL/6J arka planında tutuldu.

1. APC'ler tarafından salgılanan AdEV'lerin in vivo olarak tespit edilmesi

  1. Tampon hazırlığı
    1. Sindirim tamponu: HEPES tamponlu DMEM'i 50 mL DMEM'e 0,5 mL 1 M HEPES ve 0,5 g yağ asidi açısından yoksul sığır serum albümini (BSA) ekleyerek hazırlayın. Çözülene kadar karıştırın.
    2. Yıkama tamponu: PBS'yi 2,5 mM etilenediamintetraasetik asit (EDTA) ve %4 fetal sığır serumu (FBS) ile hazırlayın.
    3. Liberase ve DNase 1 stokunu 5 mg/mL ve 5 KU/mL'de hazırlayın. -20 °C'de depolayın. Hemen önce eridin.
  2. Kamine yağ dokusu toplama ve sindirim
    NOT: Dört aylık AdipCD63-GFP ve CD63-GFP kontrol fareleri karbondioksit soluma yoluyla ötenazi edildi.
    1. Steril teknikle yağ dokularını çıkarın ve 1 g dokuyu 0,5 mL sindirim tamponuna koyun, steril makasla dokuyu ince ince doğrayarak 1 mm'den büyük olmayan parçalara indirin.
    2. Kıyılmış dokuyu 0,5 mg/mL Liberaz ve 50 U/mL DNaz 1 içeren 10 mL sindirilmiş tamponda askıya alın.
    3. 37 °C sıcaklıkta bir yörünge sallayıcısında (100 rpm) 30-60 dakika kuluçka yapın. Tüpü kuluçka sırasında birkaç kez ters çevirerek dokuyu nazikçe karıştırın. Çözelti bulanık göründüğünde ve görünür doku parçaları kalmadığında, sindirim tamamlanmış sayılır.
  3. APC'lerin İzolasyonu
    1. Süspansiyonu iki hacim sindirim tamponu ile seyreldin ve tüpü 3-4 kez nazikçe ters çevirin.
    2. Sindirilmemiş dokuları çıkarmak için steril 100 μm filtreden geçirin.
    3. Filtratı 300 × g ile 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    4. Süpernatan adiposit kısmını atın ve pelleti stromal vasküler fraksiyon (SVF) olarak etiketleyin.
    5. Steril suyla taze 1× kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tamponu hazırlayın. SVF'deki kırmızı kan hücrelerini ışıktan korunarak 5 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka geçirerek parçalayın.
    6. İki hacim yıkama tamponu ekleyin, ardından 400 × g ile 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj filtrasyonu yapın.
    7. Yağ dokusu progenitor izolasyon kiti (fare) protokolünü takip edin, SVF'yi doku başına 80 μLof tamponda (PBS, pH 7.2, %0.5 BSA, 2 mM EDTA) yeniden askıya alın.
    8. Her gram doku için 20 μL adiposit olmayan progenitor deplasyon kokteyli ekleyin.
    9. Karanlıkta 2-8 °C'de 15 dakika karıştırıp kuluçka yapın.
    10. Örneği LS kolonundan geçirin ve akışı toplayın.
    11. Çalışma için APC'leri elde etmek amacıyla akışı (CD31, CD45, Ter119 için negatif) 300 × g boyunca 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın.
  4. APC alımıyla salgılanan AdEV'lerin konfokal mikroskopi ile tespiti
    1. AdipCD63-GFP veya CD63-GFP farelerinden 250 μL izole APC'leri (1 ×10 4 hücre/mL) kollajen kaplı 8 kuyruklu oda slaytlarına tohumlayın ve hücrelerin yaklaşık 6 saat boyunca tutunmasına izin verin.
    2. Hücreleri %4 paraformaldehit ile 10 dakika boyunca sabitleyin, böylece görüntüleme için hücresel ve EV yapıları korunur.
      NOT: Bu testlerde, GFP sinyalleri AdEV'leri işaretler ve konfokal mikroskopi ile APC'lerde tespit edilmeleri bu öncül hücreler tarafından AdEV'lerin alındığını gösterir.
    3. Slaytları PBS ile üç kez yıkayın, antiifade ortamıyla monte edin ve 63× yağ batırıcı objektif bulunan konfokal mikroskopla GFP sinyallerini yakalayın. GFP uyarılma ve 500-550 nm aralığında emisyon algılamak için 488 nm lazer kullanarak 0,5 μm adım boyutunda z-serisi yığınları olarak görüntüler elde edin.
  5. Akış sitometrisiyle APC alımıyla salgılanan AdEV'lerin tespiti
    1. APC'leri sayın ve canlılık boyasını (örneğin, Zombie) 1X PBS'de 1:1000 seyreltin. Hücreleri 1 × 106/ 100 μL olarak askıya alın. Tışıktan korunarak buz üzerinde 20 dakika kuluçka yapın.
    2. Hücreleri yıkama tamponu ile bir kez yıkayın. Santrifüj 300 × g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca koyun.
    3. Hücreleri 1 × 10 6 hücre/100 μL seviyesinde parlak boyama tamponunda askıya alın.
    4. Fc reseptör bloke reaktifi (örneğin, anti-CD16/CD32) ile 10 dakika boyunca 1:100 boyunca, spesifik olmayan bağlanmayı blokleyin.
    5. Sca-1 antikoru 6.000 × g ile 10 dakika boyunca 4 °C'de kullanıldı. Sonra APC tüpüne 1 μL Sca-1 antikoru ekleyin ve 20 dakika boyunca buzun üzerinde kuluçka yapın, tüpü folyo ile kapalı tutarak.
    6. 1 mL yıkama tamponu ile iki kez yıkayın, 300 × g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
    7. Akış sitometrisi ayırması için hücreleri yaklaşık 1 × 10 6 hücre/500 μL içinde yıkama tamponunda askıya alın. 405 nm mor lazer (Pacific Blue için 450/50 nm filtre) ve 488 nm mavi lazer (GFP için 530/30 nm filtre) ile donatılmış spektral akış sitometresinde Sca1+ ve GFP+ hücreleri için veri edinin. Numuneleri, Sca1+ hücreleri kapalı olarak analiz ederek, bu popülasyon içindeki GFP+ alt kümesi analiz edilir; Şekil 2'de gösterildiği gibi.

2. Salgılanan AdEV'lerin in vitro tespiti ve analizi

  1. APC'lerin olgun adipositlere ayırılması
    NOT: Tüm kültürler 37 °C ve %8CO2 olarak tutulur, aksi belirtilmedikçe.
    1. 0. Gün: Oda sıcaklığında (RT) %0,2 jelatin ile kaplayın, taze izole edilmiş APC'leri DMEM/F12 + %15 FBS + %1 Penisillin/Streptomisin (P/S) + %0,1 Primosin ile tohumlayarak %100 birleşime ulaşın.
    2. 1-8. Gün: MesenCult adipogenik farklılaşma ortamı ile değiştirin (toplamda 50 mL: 45 mL baz + 5 mL takviye + 0,5 mL GlutaMAX + 50 μL Primocin), 4. gün taze farklılaşma ortamına geçin.
    3. 9. Gün: Adipositleri PBS ile iki kez yıkayın, ardından olgun adiposit kültür ortamı (DMEM +%1 BSA + %0,2 Primosin) ile değiştirin ve 16 saat boyunca kalın.
  2. AdEV izolasyonu ve arındırma
    1. Yukarıda üretilen 15 mL adiposit kültürünü, önce 40 μm filtreden, ardından 30 μm filtreden geçirin.
    2. Filtratı 500 × g ile 5 dakika santrifüjlen, ardından 2.000 × g ile 10 dakika boyunca kalıp kalıntı hücreleri ve kalıntıları çıkarmak için kullanın.
    3. Filtratı 0,8 μm filtreden geçirin, ardından ortamı 100 kDa kesme ultrafiltrasyon ünitesi (15 mL örnek hacmi) kullanarak 4.000 × g ile 15 dakika boyunca santrifüj yaparak 15 mL'den 0,5 mL'ye konsantre edin.
    4. Örneklemeyi otomatik fraksiyon toplayıcı ile boyut hariç kromatografi (SEC) sütunlarına yükleyin ve F1-8 fraksiyonlarını toplayın.
    5. Toplanan EV fraksiyonlarını 100 kDa kesme ultrafiltrasyon ünitesi (4 mL örnek hacmi) kullanarak yoğunlaştırın ve her fraksiyonun EV içeriğinin western blot, nanopartikül takip analiz cihazı ve iletim elektron mikroskobu (TEM) ile doğrulanmasına devam edin.
  3. AdEV doğrulama, niceltme ve boyut/morfoloji değerlendirmesi
    1. Western Blot EV işaretleyicilerinin analizi
      1. Her fraksiyonu 400 μL'den 25 μL'ye konsantre edin, ardından 50 μL radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA) tamponu ve proteaz ile fosfataz inhibitörleriyle desteklenerek eklenin. Örnekleri 2× sodyum dodesil sülfat (SDS) yükleme tamponu ekleyerek denatüre edin ve proteinleri %4-12 tris-glisin jelinde çözer.
    2. EV boyutu, konsantrasyonu ve kalitesinin nanopartikül takip analiz cihazı kullanılarak analiz edilmesi.
      1. Analizden önce, EV örneklerini steril, 0.1 μm filtrelenmiş PBS ile 1:1000 oranında seyreltirin; böylece partikül konsantrasyonu optimal tespit aralığına (yaklaşık 10 7-10 9 parçacık/mL) girdiğinden emin olun. Sulandırılmış örnekleri nazikçe karıştırarak baloncuk oluşumunu önleyin.
      2. Örneği, yüksek hassasiyetli bilimsel tamamlayıcı metal-oksit-yarıiletken (sCMOS) kamera, 532 nm yeşil lazer modülü ve 10 nm (1.000 nm'e kadar)/ 106 ila10 9 parçacık/mL tespit eşiği ile donatılmış enstrumana yükleyin.
      3. Dinamik gözlem hacmi tabanlı konsantrasyon algoritması uygulayan NS Xplorer yazılım paketini kullanarak görüntüleme ve nicelik gerçekleştirin.
    3. EV morfolojisinin iletim elektron mikroskopisi (TEM) ile incelenmesi
      1. Konsantrasyon öncesi toplanan 50 μL EV'leri, EV'lerin negatif boyaması için çekirdek tesise gönderin. EV'leri, plazma temizleyiciyle temizlenmiş sadece karbon içeren, 400 mesh bakır ızgaralara uygulayın.
      2. Kısa adsorpsiyondan sonra, ızgaraları damıtılmış suyla durulayın, %1 (w/v) uranyl asetat ile negatif boyan, fazla lekeni filtre kağıdıyla temizleyin ve hava kurutmadan önce fazla lekesi filtre kağıdıyla temizleyin. Sonra, 120 KV'da çalışan bir iletim elektron mikroskobu kullanarak ızgaraları görüntüleyin.

3. Güvenlik ve atık bilgileri

  1. Paraformaldehit ve uranil asetat duman kapastonunda kişisel koruyucu ekipman (PPE) ile birlikte kullanın, çünkü her ikisi de toksiktir. Uranyl asetat atıklarını etiketlenmiş tehlikeli kaplarda toplayın.
  2. Tüm biyolojik örnekleri potansiyel olarak bulaşıcı olarak ele almakta ve materyalleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan kurumsal biyogüvenlik politikaları ve protokollerine göre bertaraf etmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konfokal mikroskopi ile APC alımıyla AdEV'lerin tespit edilmesi protokolünü kullanarak, AdipCD63-GFP ve Stopfl/fl/CD63-GFP farelerinin inguinal yağ dokularından APC'leri izole ettik ve çekirdeklerin görselleştirilmesi için DAPI ile boyadık. Konfokal mikroskopi ile incelendiğinde, Stopfl/fl/CD63-GFP farelerinden alınan APC'lerde tespit edilebilir GFP noktası bulunmamıştır (Şekil 1A). Buna karşılık, AdipCD63-GFP farelerinden izole edilen APC'ler, sitoplazma boyunca çok sa...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tanımlanan protokol, AdEV'leri ve APC'ler tarafından benimsenmesini izole etmek ve karakterize etmek için sağlam ve tekrarlanabilir bir sistem sağlayarak önemli bir metodolojik boşluğu doldurmaktadır. Diğer kaynaklardan alınan EV'lere kıyasla, AdEV'ler daha lipid açısından zengin ve yüzdürücüdür, bu da klasik ultrasantrifüj tabanlı EV izolasyon tekniklerini daha az verimlihale getirir 35. Ancak, AdEV arındırması için yayımlanmış çoğu protokol hâlâ ultrasantrifügas...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecek maddi bir çıkarı yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FACS için Einstein Akış Sitometri Çekirdeği'ne ve tüm görüntü analizleri için Analitik Görüntüleme Tesisi'ne teşekkür ederiz. Bu çalışma, kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri hibeleri DK128839 ve NCI kanser merkezi destek hibesi P30CA013330 tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.5 M EDTA, pH 8.0FisherAM9260G500x seyreltme
10x PBSFisher Scientific70-013-0321000x suyla seyreltme
1 M HEPESGibco156300801000x seyrelme
Yağ Dokusu Progenitor İzolasyon Kiti, FareMiltenyi biyotec30-106-639Kullanıma hazır
Amicon Ultra Santrifüj Filtre, 100 kDa MWCOSigmaUFC910015 mL örnek hacmi
Amicon Ultra Santrifüj Filtre, 100 kDa MWCOSigmaUFC91004 mL örnek hacmi
BSASigmaA6003Kullanıma hazır
Kalneksin antikorucalnexinAB225951000x seyrelme
CD63 antikoruabcamAB217345500x seyreltme
CD81hücre sinyal teknolojisi10037'ler500x seyreltme
Corning  BioCoat  Collagen I Kültür SlaytıSigmaCLS354630Kullanıma hazır
Corning  Hücre süzcüSigmaCLS43175040 μ m gözenek boyutu
Corning  Hücre süzcüSigmaCLS431752100 μ m gözenek boyutu
COX IV antikorHücre Sinyal Teknolojisi48441000x seyrelme
DMEMGibco11965092Kullanıma hazır
DMEM/F-12, GlutaMAX takviyesiTermobalıkçı10565018Kullanıma hazır
Dnase 1SigmaD4513Stok 5 KU/mL -20 derece ve derece; C
GlutaMAX TakviyesiGibco35050061100x seyreltme
Halt™ Proteaz ve Fosfataz İnhibitörü Kokteyli (100X)Termobalıkçı78444Kullanıma hazır
HSP70 antikoruabcamAB1816061000x seyrelme
Invitrogen eBioscience 10X RBC Lizis Tamponu (Çok Türlü)Fisher Scientific50-112-9743Suda 10 kez seyreltme
Izon Science Usa Ltd QEVORIGINAL 70NMGEN2 5/PK SDPFisher ScientificNC2042225Kullanıma hazır
LEICA STELLARIS 8 konfokal mikroskobuLeica MikroskoplarıYok
Liberase TM Araştırma DerecesiSigmaLIBTM-ROStok 5 mg/mL -20 derece ve derece; C
Millex MCE şırınga filtresiSigmaSLAA0250.8 μ m gözenek boyutu
NanoSight ProMalvern PanalyticalYok
Novex Tris-Glycine Mini Protein Jelleri, 4– 12%,TermobalıkçıXP04120BOXKullanıma hazır
Novex Tris-Glycine SDS Numune Tamponu (2x)TermobalıkçıLC2676Kullanıma hazır
Pacific Blue anti-fare Ly-6A/E (Sca-1) AntikorBioLegend10811925x seyreltme
Paraformaldehit çözeltisi (%16)Fisher Scientific50-980-487PBS ile %4'e kadar seyreltin
pluriStrainer S / 30 µ m (Hücre Süzgeci)Fisher ScientificNC092245930 μ m gözenek boyutu
Ponceau S çözümüSigmaP7170-1LKullanıma hazır
PrimocinInvivogenNC9141851500x seyreltme
DAPI ile ProLong Gold Antifade ReaktifiHücre Sinyal Teknolojisi8961SKullanıma hazır
Arındırılmış anti-fare CD16/32 AntikorBioLegend101301100x seyreltme
RIPA buffer Fisher ScientificPI89900Suda 10 kez seyreltme
Spektral akış sitometresi (Aurora 3)Cytek BiosciencesYok
Syntaxin 4 antikoruSinaptik Sistemler1100425000x seyrelme
Tecnai 20 (Geçirim Elektron Mikroskopu)FEIYok
Tergeo-EMPIE Scientific LLCYok
Vinculin antikoruabcamAB185085000x seyrelme

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kershaw, E. E., Flier, J. S. Adipose tissue as an endocrine organ. J Clin Endocrinol Metab. 89 (3), 2548-2556 (2004).
  2. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
  3. Luo, L., Liu, M. Adipose tissue in control of metabolism. J Endocrinol. 231 (3), R77-R99 (2016).
  4. Lynes, M. D., et al. The cold-induced lipokine 12,13-diHOME promotes fatty acid transport into brown adipose tissue. Nat Med. 23, 631-637 (2017).
  5. Sakers, A., De Siqueira, M. K., Seale, P., Villanueva, C. J. Adipose-tissue plasticity in health and disease. Cell. 185 (3), 419-446 (2022).
  6. Santoro, A., McGraw, T. E., Kahn, B. B. Insulin action in adipocytes, adipose remodeling, and systemic effects. Cell Metab. 33 (4), 748-757 (2021).
  7. Czech, M. P. Mechanisms of insulin resistance related to white, beige, and brown adipocytes. Mol Metab. 34, 27-42 (2020).
  8. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, 840-846 (2006).
  9. Feng, D., et al. SNAP23 regulates BAX-dependent adipocyte programmed cell death independently of canonical macroautophagy. J Clin Invest. 128 (9), 3941-3956 (2018).
  10. Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11, 85-97 (2011).
  11. Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372, 425-432 (1994).
  12. Scherer, P. E., Williams, S., Fogliano, M., Baldini, G., Lodish, H. F. A novel serum protein similar to C1q, produced exclusively in adipocytes. J Biol Chem. 270 (45), 26746-26749 (1995).
  13. Considine, R. V., et al. Serum immunoreactive-leptin concentrations in normal-weight and obese humans. N Engl J Med. 334, 292-295 (1996).
  14. Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: Direct role in obesity-linked insulin resistance. Science. 259 (5091), 87-91 (1993).
  15. Steppan, C. M., et al. The hormone resistin links obesity to diabetes. Nature. 409, 307-312 (2001).
  16. Yang, Q., et al. Serum retinol binding protein 4 contributes to insulin resistance in obesity and type 2 diabetes. Nature. 436, 356-362 (2005).
  17. Tilg, H., et al. Adipokines: Masterminds of metabolic inflammation. Nat Rev Immunol. 25, 250-265 (2025).
  18. Clemente-Suarez, V. J., et al. The role of adipokines in health and disease. Biomedicines. 11 (5), 1290(2023).
  19. Hallal, S., et al. Understanding the extracellular vesicle surface for clinical molecular biology. J Extracell Vesicles. 11 (10), e12260(2022).
  20. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  21. Le Lay, S., Scherer, P. E. Exploring adipose tissue-derived extracellular vesicles in inter-organ crosstalk: Implications for metabolic regulation and adipose tissue function. Cell Rep. 44 (6), 115732(2025).
  22. Shimoda, A., et al. Exosome surface glycans reflect osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells: Profiling by an evanescent field fluorescence-assisted lectin array system. Sci Rep. 9, 11497(2019).
  23. Albuquerque, P. C., et al. A Paracoccidioides brasiliensis glycan shares serologic and functional properties with cryptococcal glucuronoxylomannan. Fungal Genet Biol. 49 (11), 943-954 (2012).
  24. Li, Y., Tang, X., Gu, Y., Zhou, G. Adipocyte-derived extracellular vesicles: Small vesicles with big impact. Front Biosci (Landmark Ed). 28 (7), 149(2023).
  25. Thomou, T., et al. Adipose-derived circulating miRNAs regulate gene expression in other tissues. Nature. 542, 450-455 (2017).
  26. Crewe, C., et al. An endothelial-to-adipocyte extracellular vesicle axis governed by metabolic state. Cell. 175 (3), 695-708.e13 (2018).
  27. Flaherty, S. E. 3rd, et al. A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes. Science. 363 (6430), 989-993 (2019).
  28. Clement, E., et al. Adipocyte extracellular vesicles carry enzymes and fatty acids that stimulate mitochondrial metabolism and remodeling in tumor cells. EMBO J. 39, e102525(2020).
  29. Kulaj, K., et al. Adipocyte-derived extracellular vesicles increase insulin secretion through transport of insulinotropic protein cargo. Nat Commun. 14, 709(2023).
  30. McCann, J. V., et al. Reporter mice for isolating and auditing cell type-specific extracellular vesicles in vivo. Genesis. 58 (7), e23369(2020).
  31. Men, Y., et al. Exosome reporter mice reveal the involvement of exosomes in mediating neuron to astroglia communication in the CNS. Nat Commun. 10, 4136(2019).
  32. Jeffery, E., et al. Characterization of Cre recombinase models for the study of adipose tissue. Adipocyte. 3 (3), 206-211 (2014).
  33. Emont, M. P., et al. A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue. Nature. 603, 926-933 (2022).
  34. Krylova, S. V., Feng, D. The machinery of exosomes: Biogenesis, release, and uptake. Int J Mol Sci. 24 (2), (2023).
  35. Crewe, C. The challenges of interrogating adipose tissue extracellular vesicle functions in physiology. Commun Biol. 5, 581(2022).
  36. Blandin, A., et al. Lipidomic analysis of adipose-derived extracellular vesicles reveals specific EV lipid sorting informative of the obesity metabolic state. Cell Rep. 42 (3), 112169(2023).
  37. Matilainen, J., et al. Increased secretion of adipocyte-derived extracellular vesicles is associated with adipose tissue inflammation and the mobilization of excess lipid in human obesity. J Transl Med. 22, 623(2024).
  38. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  39. Olson, A. L., Knight, J. B., Pessin, J. E. Syntaxin 4, VAMP2, and/or VAMP3/cellubrevin are functional target membrane and vesicle SNAP receptors for insulin-stimulated GLUT4 translocation in adipocytes. Mol Cell Biol. 17 (5), 2425-2435 (1997).
  40. Oh, E., Miller, R. A., Thurmond, D. C. Syntaxin 4 overexpression ameliorates effects of aging and high-fat diet on glucose control and extends lifespan. Cell Metab. 22 (3), 499-507 (2015).
  41. Merz, K. E., et al. Enrichment of the exocytosis protein STX4 in skeletal muscle remediates peripheral insulin resistance and alters mitochondrial dynamics via Drp1. Nat Commun. 13, 424(2022).
  42. Yu, X., et al. Involution of brown adipose tissue through a syntaxin 4 dependent pyroptosis pathway. Nat Commun. 15, 2856(2024).
  43. Verweij, F. J., et al. Quantifying exosome secretion from single cells reveals a modulatory role for GPCR signaling. J Cell Biol. 217 (3), 1129-1142 (2018).
  44. Arora, A., Sharma, V., Gupta, R., Aggarwal, A. Isolation and characterization of extracellular vesicles derived from ex vivo culture of visceral adipose tissue. Bio Protoc. 14 (11), e5011(2024).
  45. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Sci Rep. 7, 15297(2017).
  46. Nordin, J. Z., et al. Ultrafiltration with size-exclusion liquid chromatography for high yield isolation of extracellular vesicles preserving intact biophysical and functional properties. Nanomedicine. 11 (4), 879-883 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Adipocyte EVsExtracellular VesiclesEV SecretionCD63 GFP ReporterStromal Vascular FractionAdipocyte Progenitor CellsSize Exclusion ChromatographyFlow CytometryConfocal MicroscopyNanoparticle Tracking

İlgili makaleler