Yöntem makalesi

CAR T Hücrelerinde CRISPR-Cas9 Ekranlarının İyileştirmesi: Kütüphane Hazırlığı için Geliştirilmiş Bir Yöntem

DOI:

10.3791/69721

⸱

2 Ocak 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hemato-Oncology Program, Cima Universidad de Navarra, IdiSNA, 2Centro de Investigacion Biomedica en Red de Cancer (CIBERONC), 3Computational Biology and Translational Genomics Program, Cima Universidad de Navarra, IdiSNA, 4Cancer Center Clinica Universidad de Navarra (CCUN), 5Data Science and Artificial Intelligence Institute (DATAI), Universidad de Navarra, 6Hematology and Cell Therapy Department, Clinica Universidad de Navarra, IdiSNA

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birincil CAR T hücreleri için optimize edilmiş bir CRISPR-Cas9 knockout tarama protokolü geliştirdik. Enzimatik sindirim ve sgRNA kaseti çekilmesiyle gDNA taşınmasını azaltarak, bu yaklaşım PCR artefaktlarını en aza indirerek doğru sgRNA tespitini ve fonksiyonel gen hedeflerinin sağlam tanımlanmasını sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücre tedavileri, birçok hematolojik malignitede dikkat çekici etkinlik göstermiş, ancak başarıları katı tümörlerde tam olarak tekrarlanmamıştır. Ayrıca, hematolojik kanserlerde bile, CAR T hücresi infüzyonundan sonra nüks uzun vadeli sonuçları olumsuz etkilemeye devam eder. Bu zorluklar, CAR T hücresinin etkinliğini, kalıcılığını, tümörü aşmayı ve mikroçevre aracılı direnci aşmayı artıran stratejiler geliştirme ihtiyacını vurgulamaktadır. Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)-Cas9 tabanlı tarama platformları, CAR T hücresi fonksiyonunu düzenleyen genleri sistematik olarak tanımlamak için güçlü bir yaklaşım sunar. Genetik bozulmaları fenotipik sonuçlarla ilişkilendirerek, bu testler aktivasyon, çoğaltı, hafıza oluşumu ve sitotoksisiteyi kontrol eden yolların keşfini mümkün kılar. Standart iş akışları, tek bir rehber RNA (sgRNA) kütüphanesiyle önemli sayıda hücrenin transdüksiyonu, Cas9 aracılı düzenleme, düzenlenen hücrelerin seçimi ve dizileme öncesi genomik DNA (gDNA) sgRNA kasetlerinin PCR amplifikasyonunu içerir. Ancak, büyük miktarda gDNA kullanılarak PCR amplifikasyonu önemli zorluklar yaratır ve genellikle sgRNA'ları seçici olarak amplifikasyon ve geri kazanmada başarısız olur. Burada, birincil insan CAR T hücrelerinde test ettiğimiz optimize edilmiş bir CRISPR-Cas9 nakatlant tarama protokolünü tanımlıyoruz. Buradaki yöntem, sgRNA kütüphanesi hazırlığı sırasında enzimatik sindirim ve sgRNA kasetinin seçici olarak aşağı çekilmesiyle gDNA taşınmasını azaltan ara bir adımı içerir; böylece ilk PCR amplifikasyonunun verimliliğini artırır. Bu değişiklik, önceki denemelerimizde geleneksel 1 ve 2 adımlı PCR amplifikasyon protokolleriyle elde edilmeyen CAR T hücre ekranlarımız üzerinden sgRNA bilgisini almamıza olanak sağladı. Sonuç olarak, bu optimize edilmiş iş akışı zorlu örneklerde CRISPR tarama kütüphanesinin hazırlanmasını kolaylaştırır ve terapötik etkinliği artırmak için hedeflenebilecek temel genetik belirleyicilerin tanımlanmasını sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İmmünoterapi, bağışıklık sistemini kullanmak ve modüle etmek için yeni stratejiler sunarak kanser tedavisinde devrim niteliğinde bir yol açtı. Bunlar arasında, kimerik antijen reseptörü (CAR) T hücre tedavisi, en dönüştürücü yaklaşımlardan biri olarak ortaya çıkmıştır. Bu tedavi, hastanın T hücrelerinin belirli bir tümör antijenini tanıyacak sentetik bir reseptör ile gen mühendisliğini içerir ve böylece antitümöraktivitesini artırır. CAR T hücreleri, hematolojik kanserlerde dikkat çekici başarılar göstermiştir; CD19 veya BCMA hedefli tedaviler alan hastalarda kısa ömürlü remisyonlardan uzun süreli hastalıksız hayatta kalmaya ve minimal toksisiteye kadar çeşitli sonuçlargöstermiştir 2. Bugüne kadar FDA, hematolojik kanserler için yedi CAR T hücresi ürünüonaylamıştır 3. Bu gelişmelere rağmen, önemli sınırlamalar hâlâ devam etmektedir. Zorluklar, genellikle hastanın T hücrelerinin üretim süreci veya uygunluğu tarafından etkilenen CAR T hücre ürününden kaynaklanır; bu hücreler hastalık ilerlemesi, önceki tedaviler veya yaş nedeniyle bozulabilir. Antijen aşağı regülasyonu gibi tümör-içsel direnç mekanizmaları da etkinliğizayıflatabilir 4. Ayrıca, immünosupresif tümör mikroçevresi, özellikle katı tümörlü hastalarda CAR T hücresinin kalıcılığını ve işlevini ciddi şekilde sınırlayan ekbir engel oluşturur 5. Bu nedenle, CAR T hücre tedavilerinin hem başlangıç hem de uzun vadeli etkinliğinin artırılması acil bir ihtiyaç vardır.

CRISPR-Cas9 gen düzenlemesinin ortaya çıkışı, gen fonksiyonunu büyük ölçekli tarama yaklaşımlarıyla disseksiye etmek için güçlü araçlar sağlamıştır. Bu testlerde, hücreler genellikle lentiviral vektörler tarafından sağlanan tek kılavuzlu RNA (sgRNA) kütüphanesiyle transdüksiyon edilir; böylece her hücre için bir sgRNA ve stabil genomik entegrasyon sağlanır. Cas9 aracılı düzenleme ve transdüksiyon edilen hücrelerin seçilmesinin ardından, genomik DNA (gDNA) çıkarılır ve sgRNA kasetleri kütüphane hazırlığı için PCR ile amplifikasyon edilir. Yüksek verimli dizileme işlemi farklı fenotipler arasında sgRNA dağılımlarının nicelendirilmesini sağlar ve böylece incelenen süreci olumlu veya olumsuz düzenleyen genleritespit eder 6.

CRISPR taraması, T hücre biyolojisini araştırmak ve son zamanlarda CAR T hücre performansını artırmak için yaygın olarak uygulanmıştır. Genom çapındaki taramalar, aktivasyon, proliferasyon ve farklılaşma gibi temel T hücresi süreçlerinin düzenleyicilerini tespit etmiştir. Örneğin, FAM49B, T hücresi reseptörsinyal 7'nin düzenleyicisi olarak tanımlanmışken, SOCS1, TCEB2, RASA2 ve CBLBuyarım 8 sonrası proliferasyon için gerekli olduğu gösterilmiştir. Bu temel yolların ötesinde, CRISPR taraması T hücresi hafızası ve tükenmezliğinde rol alan genleri de açıklamıştır. In vivo çalışmalar, Fli1'i, hafıza veya yorgunluk öncüllerini bozmadan efektör yanıtlarınıartırma adayı olarak tanımlamış 9 ve kromatin remodelörü Arid1a'yı T hücresi tükenimini azaltan bir düzenleyici olaraktanımlamıştır 10. T yardımcı tip 2 (Th2) diferensiyonunun düzenleyicileri de buyaklaşımla tanımlanmıştır 11. 25 kinazı hedefleyen özel bir sgRNA kütüphanesi kullanarak, p38'in genleşmeyi, hafıza oluşumunu ve oksidatif ile genomik stresten korumayı teşvikettiği bulundu 12. Benzer şekilde, CD8+ T hücrelerinde REGNASE-1 etkisi uzun ömürlü bir efektör fenotipi sağladı ve melanoma ve lösemi modellerinde tümör kontrolünüiyileştirdi 13. Genom genelinde ek taramalar, Dhx37'nin T hücresi aktivasyonunun ve sitotoksisite14'ün düzenleyicisi olduğunu belirlerken, LTBR ve diğer genler CAR T ve γδ T hücrelerinde T hücresi fonksiyonunu güçlendiricilerolarak doğrulandı 15. Daha yakın zamanda, CRISPR taraması doğrudan CAR T hücrelerine uygulanmış ve CAR T antitümöraktivitesini 16 artıran prolin metabolizmasında rol alan PRODH2 enzimi ve glioblastoma modellerinde CAR T etkinliğini artıran TLE4 ve IKZF2 gibi yeni hedefler ortayaçıkmıştır.

CRISPR ekranlarında kritik bir adım, sgRNA kasetlerinin aşırı büyük miktarda gDNA'dan seçici olarak amplifikasyonudur; bu zorluk, CRISPR taramalarında kullanılan çok sayıda hücre nedeniyle aşılması zor bir durumdur. Bu kadar büyük miktarda DNA taşınmasından PCR amplifikasyonu, DNA ve polimeraz moleküllerinin fiziksel difüzyonunu sınırlayan moleküler kalabalıklaşma, primerler ve polimerazın DNA arka planına geçici özgün olmayan bağlanması, hedef dışı amplifikasyon (primer tükenmesi) veya DNA fosfat omurgasında Mg2+ sekestrasyonu gibi çeşitli teknik zorluklarda yer alır 18, 19,20,21. Bu durum genellikle PCR arızası ve/veya önyargıya yol açar. Bu sorunları azaltmak için, sgRNA amplifikasyonunu adaptör eklemeden iki PCRadımına ayırmak, biyotinile oligolar ve manyetik boncuk yakalama23,24 ile hedef zenginleştirme veya parça zenginleştirme için sgRNA kasetinin yanında krestriksiyon bölgeleriyle plazmidler tasarlamak gibi farklı stratejilerönerilmiştir 25.

Bu çalışmada, birincil insan CAR T hücreleri için optimize edilmiş bir CRISPR-Cas9 knockout tarama protokolü sunuyoruz. Kullanılan CRISPR kütüphanesi Brunello Kinome 1'dir; bu kütüphane, 763 insan kinaz genini (hedef başına 4 sgRNA) hedefleyen 3052 benzersiz 20nt uzunluğunda sgRNA içerir. T hücreleri, sağlıklı bağışçılardan alınan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) ile zenginleştirilmiş fraksiyondan CD4+ ve CD8+ manyetik pozitif seçilerek izole edildi. Anti-CD3 ve anti-CD28 ile aktive edildikten sonra, T hücreleri CRISPR tarama kütüphanesi ile spreenfekte edildi ve ardından CAR lentivirüsü ile transdüksiyona geçirildi. Hücreler genişletilip ardından Cas9 proteini tanıtılmak için nükleofekt edildi. CRISPR içeren hücreler puromisin ile seçildi ve CAR-pozitif T hücreleri sıralandı. Ekstraksiyondan sonra, genomik DNA kısıtlama enzimleri (RE) ile sindirildi ve sgRNA içeren parçalar biotin prob-streptavidin yakalamasıyla aşağı çekildi. Sonrasında, sgRNA seçici olarak amplifikasyon edilip ardışık iki PCR ile indekslendi ve ortaya çıkan kütüphaneler sıralandı. GDNA taşınmasını azaltmak için ara bir adım ekleyerek ilgilendiğimiz sgRNA'yı seçici olarak geri aldık ve amplifikasyon yaptık; bu da kinazların CAR T hücrelerindeki rolünü incelememize olanak tanıdı.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Universidad de Navarra yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm denekler yazılı bilgilendirilmiş onay sağladı. Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. T hücre izolasyonu ve aktivasyonu

  1. PBMC izolyasyonu
    1. Etilen diamintetraasetik asit (EDTA) tüpleriyle donörlerden kan örnekleri alın, kan örneklerini 50 mL konik tüplere aktarın ve PBS ile kanı inceltin (1:1 seyreltme).
    2. 50 mL'lik konik bir tüpün tabanına 15 mL yoğunluk gradyanı ortamı ekleyin (PBMC'ler için yoğunluk: 1.07). Sonra, pipet kontrolörünün en yavaş hızına (yoğunluk gradyanlı medium tabakası) dikkatlice 25 mL seyreltilmiş kan ekleyin. Frensiz 800 × g'de 30 dakika santrifüj yapın.
    3. PBMC halkasını/katmanını Pasteur pipetiyle 50 mL'lik konik bir tüpte topla ve yıkama için toplam hacmi 50 mL'ye PBS ekleyin. Santrifüj 650 × g'de 8 dakika boyunca koyun. Üst yüzeyi at.
      NOT: Süpernatantın bulanıklığını kontrol et, orada hücre olmadığından emin olun. Şüpheniz varsa, süspansiyonu orijinal 50 mL konik boru sayısının iki katına ayırın, PBS ekleyin ve 50 mL'ye kadar ekleyin ve tekrar santrifüj yapın.
    4. 50 mL PBS ile tekrar süzülür. Hücre sayacında akridin portakalın-propidyum iyodit (AOPI) ile sayın. Santrifüj 650 × g'de 8 dakika koyun.
  2. CD4 ve CD8 manyetik seçimi
    1. Floresansla aktive hücre ayırma (FACS) tamponu hazırlayın: PBS, EDTA 2.5 μM, BSA %0.5 ve filtre 0.2 μm içinden filtreleyin.
    2. PBMC'leri 10 ×6 hücre başına 80 μL FACS tampon steril olarak yeniden süzülün ve 10 ×10 6 hücreye 10 μL mikroboncuk CD4 ve 10 μL mikroboncuk CD8 ekleyin. 4 °C'de 20 dakika kuluçka yapın.
    3. 10 mL FACS tamponu ekleyin ve 8 dakika boyunca 650 × g değerinde santrifüj yapın. Süpernatantı tamamen at.
    4. 1 × 108 hücre FACS Buffer için 500 μL ile 15 mL'lik konik bir tüpte yeniden süzülür.
      NOT: Bir kanal 200 x 106 hücre kapasitesine sahiptir.
    5. AutoMacs (yüksek hızlı manyetik hücre sorterici) izolasyonu için Possel programını kullanın.
    6. 10 mL PBS ekleyin, floresan hücre sayacında AOPI ile sayın ve 650 × g ile 8 dakika boyunca santrifüj yapın.
    7. Hücreleri 1 x 106/mL T hücresi büyüme ortamında %3 insan serumu (HS), %1 penisilin/streptomisin (P/S), 625 IU/mL interlökin (IL)-7, 85 IU/mL IL-15 içeren T hücresi ortamında yeniden süspansiyona alın. Her 1 mL başına 10 μL T hücresi uyarım reaktifi ekleyin ve iyi karıştırın. 24 kuyu başına 2 mL levha (p24w) ile 24 saat boyunca 37 °C'de kuluçka yapın.

2. CAR T hücresi üretimi ve CRISPR taraması

  1. Kütüphane spenfeksiyonu ve CAR transdüksiyonu
    1. İlgili miktarda lentivirus CRISPR kütüphanesini ekleyin (örneğin, Brunello Kinome 1 kütüphanesi. Ek Tablo 1'e bakınız), titrasyon testinde belirlenmiş ve 8 μg/mL polibren olarak belirlenmiştir.
    2. 700 x g sıcaklığında 32 °C'de 1 saat 30 dakika boyunca santrifüjle ile sprefekte edilir.
    3. Ortamı %3 HS, %1 P/S, 625 IU/mL IL-7, 85 IU/mL IL-15 içeren taze T hücresi büyüme ortamı ile değiştirin (son [hücre]= 106 hücre/mL).
    4. 6 saat sonra, ilgili CAR lentiviral vektör miktarını 3 enfeksiyon çokluğuna (MOI) ekleyip 4 gün kuluçka yapın.
  2. Cas 9 elektroporasyonu
    1. CAR T hücrelerini toplayın, bir kez PBS ile yıkayın ve floresan hücre sayacında AOPI içeren hücreleri sayın.
    2. 4 μM Cas9'u elektroporasyon tamponunda hazırlayın.
    3. CAR T hücrelerini 5 μL her 5 ×10 6 hücrede yeniden süzülür. Çoklu kuyu şeridinin her kuyusuna dikkatlice 50 μL hücre süspansiyonu ekleyin ve baloncuk oluşturmadan. Sonra, pipet ucu kullanarak olası kabarcıkları çıkarın ve ucu kuyunun kenarları boyunca geçirin.
      NOT: Bir kuvette herhangi bir kuyuda örnek kalmamışsa, aynı hacimde elektroporasyon tamponu ekleyin. Bu kritik bir adımdır: Makine bir balon veya hacim farkı algılarsa hata verir.
    4. CAR T hücrelerini nükleofekt etmek için EXPAND T CELL 3 programını kullanın.
    5. Hücreleri küvetlerdeki kuluçka makinesinde 37 °C'de 40 dakika boyunca bırakın.
    6. Çekirdeklenmiş hücreleri %3 HS, %1 P/S, 625 IU/mL IL-7, 85 IU/mL IL-15 (son [hücre]= 106 hücre/mL) içeren T hücresi büyüme ortamında yeniden süzülün ve 3 gün boyunca 37 °C'de kuluçka yapın.
  3. Puromisin seçilimi
    1. Floresan hücre sayacında AOPI ile say.
    2. IL7 ve IL15 içeren T hücresi büyüme ortamı ile 1 x 106 hücre/mL olarak ayarlayın.
    3. Medyaya puromisin (2,5 μg/mL) ekleyin.
    4. 6 gün boyunca her 2 günde bir hücreleri sayın ve hücre büyüme ortamında %3 HS, %1 P/S, 625 IU/mL IL-7, 85 IU/mL IL-15 ve 2,5 μg/mL puromisin içeren hücre büyüme ortamı ile 1 x 106 hücre/mL olarak ayarlanın.
    5. CAR %'sini kontrol et.
  4. CAR T hücre popülasyonlarını ayırın ve numuneleri (kuru hücre pelleti) -80 °C'de depolayın.

3. gDNA'nın izolasyonu

NOT: Süreç boyunca hücre veya gDNA kayıplarından kaçının, çünkü bu, sgRNA'ların temsililiğini zayıflatabilir. En az 500x sgRNA kapsama alanı hedefleyin.

  1. Hücreler ve doku DNA çıkarma kiti kullanılarak örneklerden gDNA çıkarın. GDNA iyileşmesini maksimize etmek için iki kez elute yapın.
    NOT: GDNA'yı daha verimli geri kazanmak için 4 x 106 hücre/sütun kullanmayın.
  2. dsDNA nicelendirme kiti ile gDNA konsantrasyonunu ölçün.
    NOT: Konsantrasyon protokolün sonraki adımları için çok düşükse, DNA'yı yoğunlaştırmak için katı fazlı geri dönebilir immobilizasyon (SPRI) boncuk bazlı temizlik reaktifi kullanın.

4. sgRNA kasetinin zenginleştirilmesi (ve gDNA transferinin eliminasyonu)

  1. Krestriksiyon enzim sindirimi
    1. Toplam 50 μL hacimde 20 U enzim/s enzimle maksimum 5 μg gDNA sindirin (örneğin, lentiGuide-puro omurgası, Brunello Kinome 1 kütüphanesi için NdeI ve PspXI kombinasyonunu kullanın) toplam hacimde 50 μL. İstenen sgRNA temsiliyetini elde etmek için reaksiyon sayısını artırın.
      NOT: Kasetin yan bölgelerini kesmek için kısıtlama enzimlerini seçin, ancak bazı sgRNA'ların bir kısıtlama bölgesi olabileceğini unutmayın. Bu sgRNA'lar bu adımda kaybolur ve dizilemede görünmezler. Bu rehberin olmaması sindirim kontrolü görevi görür. Ek Tablo 1 , PspXI ve NdeI tarafından bölünen Kinome 1 sgRNA'larının bir listesini göstermektedir.
    2. Bir termosiklinde 37 °C'de gece boyunca kuluçka yapın.
    3. 2 kez SPRI temizliği yapın.
      1. 10 mL Elution Buffer (EB) (10 mM Tris-HCl, pH 8.0) ve 50 mL taze %70 etanol hazırlayın.
      2. Boncukları girdablandırın ve sindirim ürününe 100 μL ekleyin.
      3. Pipetle iyice karıştırın ve 5 dakika kuluçka yapın. 5 dakika daha manyetize edin.
      4. Mıknatıs üzerindeyken peleti rahatsız etmeden %70 etanol 200 μL ekleyin. 30 saniye bekleyin, sonra süpernatantı atın.
      5. 4.1.3.3 adımını tekrarlayın, toplamda 2 yıkama yapın. Boncukları 2 dakika kurutmaya bırakın.
      6. Mıknatıstan çıkarın, 40 μL elusyon tamponu ekleyin ve boncukları pipetle yeniden askıya alın. 2 dakika kuluçka yapın.
      7. 2 dakika mıknatıslaştırın ve süpernatantı yeni bir tüpe aktarın.
        NOT: Bu protokolü ilk kez kururken, (kapiller) elektroforezi yoluyla sindirimi doğrulayın. Bir lekeye dikkat edildiğinden emin olun.
  2. sgRNA kasetinin aşağı indirilmesi.
    1. Streptavidin manyetik boncuklarının hazırlanması.
      1. Yıkama/Bağlama Tamponu 2 kez hazırlanır: 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 2 m NaCl, 1 mM EDTA. H2O ile hacmin yarısını 1x ile seyreltin.
      2. Boncukları 1 dakika girdabla tutun.
      3. İstenilen boncuk hacmini bir tüpe aktarın (genellikle 1 mg yeterlidir), eşit miktarda Yıkama/Bağlama Tamponu 1 kat veya en az 1 mL ekleyin ve tekrar askıya alın.
      4. Tüpü 1 dakika boyunca bir mıknatıs üzerine yerleştirin ve süpernatantı atın.
      5. Tüpü mıknatıstan çıkarın ve yıkanmış boncukları, şişeden alınan ilk boncuk hacmiyle aynı 1x Yıkama/Bağlama Tamponu hacminde yeniden askıya alın.
      6. Toplamda 3 yıkama için tekrarlayın.
      7. Boncukları 2x Yıkama/Bağlama Tamponunda yeniden askıya alın.
    2. 4.1.3.6. adımdan itibaren arındırılmış sindirime Tablo 1'de listelenen 5 μL 10 μM pulldown primer ekleyin.
    3. 96 °C'de kuru bir banyoda 5 dakika kuluçka yapın, ardından hemen 5 dakika buz haline getirin.
    4. 1 mg önceden yıkanmış streptavidin manyetik boncuk ekleyin.
      NOT: Biotin-streptavidin bağlanması en iyi 1 M NaCl'de çalışır. Eşit miktarda boncuk ve biyotinile DNA karıştırdığınızdan emin olun.
    5. 20 dakika kuluçka yapın ve karışımı her 4 dakikada bir yeniden süzüldürün.
    6. 5 dakika mıknatıslaştır.
    7. Boncukları 1× Yıkama/Bağlama Tamponu ile 3 kez yıkayın.
    8. Boncukları 50 μL EB 8.0'da yeniden askıya alın.
      NOT: Burada kullanılan sgRNA kasetleri streptavidin boncuklarına bağlıdır. Onları atmayın.

5. sgRNA kütüphanesi hazırlığı

  1. PCR1
    1. PCR1 karışımını 20 μL Herculase 5x tampon, 1 μL dNTP (100 mM), 1 μL DNA polimeraz, 2.5 μL 10 μM PCR1 ileri ve geri primer ile Tablo 1'de listelenen ve 23 μL PCR kalitesinde su ile hazırlayın. Pipet karıştırın ve 4.2.8. adımdan itibaren boncuklara PCR1 karışımı ekleyin.
      NOT: Tablo 1, Brunello Kinome Kütüphanesi 1 için tasarlanmış PCR1 primerlerini listeler.
    2. Tüpleri bir termosiklere yerleştirin ve Tablo 2'de açıklanan PCR1 programını çalıştırın.
      NOT: Termosiklenin 100 μL reaksiyonları karşılayabildiğinden emin olun. Aksi takdirde, 50 μL reaksiyonlarda alikota kullanılır. Gerekirse ölçeklen.
    3. Aynı örneklerden tüm PCR1'leri tek bir tüpte topla.
    4. SPRI temizliği PCR1'de 150 μL (1,5x) boncuk kullanılarak (4.1.3.3-4.1.3.7 adımlarını izleyin). Her PCR reaksiyonunu 100 μL EB 8.0'da yeniden askıya alın.
      NOT: Bu protokolü ilk kez kurarsanız, PCR ürününün boyutunu ve kalitesini 2 μL 30 döngülü PCR ürününü bir kapiller elektroforez sisteminde (örneğin Agilent'in TapeStation Sistemleri) çalıştırarak doğrulayın.
  2. PCR2
    1. PCR2 karışımını, 10 μL PCR1 ürünü, 10 μL 5X tampon, 0,5 μL dNTP (100 mM), 1 μL DNA polimeraz, 1,25 μL 10 μM PCR2 primerleri ile hazırlayın (her örnek için farklı rP7-i7-BC ve P5-i5-BC kombinasyonu kullanın) ve toplam hacmi 50 μL olmak üzere 26 μL PCR kalitesinde su ekleyin.
      NOT: Kütüphane temsilini korumak için, kütüphanedeki her 104 yapı için bir PCR2 reaksiyonu gerçekleştirin.
    2. Tüpleri bir termosiklere yerleştirin ve Tablo 2'de açıklanan PCR2 programını çalıştırın.
    3. SPRI temizliği PCR2'de 75 μL (1,5x) boncuk kullanılarak yapılır (4.1.3.3-4.1.3.7 adımlarını izleyin). Her PCR reaksiyonunu 50 μL EB 8.0'da yeniden askıya alın.
  3. PCR2'yi (yani sgRNA kütüphanesini) dsDNA nicelendirme kiti kullanarak nicelikleştirin ve amplikon boyutunu kapiller elektroforezi ile doğrulayın (örneğin, TapeStation Sistemleri). Örnekleri bir araya getir.
  4. Bir Illumina enstrümanında bir sekans.
    NOT: Buradaki 3052 sgRNA Brunello Kinome 1 kütüphanesi için, örnek başına 100-200 milyon okuma dizileme derinliği genellikle yeterlidir.

6. Analiz

  1. bcl2fastq kullanılarak demultiplex örnekleri.
  2. FastQC ile oluşturulan fastq dosyalarının kalitesini kontrol edin.
  3. sgRNA'nın yanındaki kaset dizilerini ve kılavuzun uzunluğunu (20 nt) kullanarak sgRNA'nın dizisini çıkarın.
  4. Çıkarılan diziyi Bowtie2 kullanarak kütüphane referansına hizalayarak kütüphanedeki varsayımsal rehberlerin kaçının gerçek sgRNA olduğunu kontrol edin. Samtools kullanarak hizalama hakkında bilgi içeren SAM dosyasını BAM formatına dönüştürün ve özet dosyaları oluşturun.
  5. MAGecK yazılımından sayma fonksiyonuyla düzenlenen ve kontrol örneklerindeki her sgRNA için okuma sayısını sayın ve normalize edin.
  6. Sayıları MAGecK'nin test fonksiyonuyla karşılaştırarak RRA puanlarını ve aday genlerin listesini elde edin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol Bölümünde açıklandığı gibi, CAR T hücreleri belirlenen protokol26'ya göre üretilmiştir. CRISPR taraması için, Wang ve ark.17 tarafından geliştirilen iş akışını uyarladık (Şekil 1A). Kısa süreliğine, iki bağımsız donörden alınan T hücreleri izole edilip 24 saat boyunca aktive edildi; ardından hem CRISPR sgRNA kütüphanesi hem de CAR lentiviral vektörü ile ardışık transdüksiyon yapıldı ve 5. günde %67 ve %72 CAR pozitif hücrelere ulaştı. Hücrelerin bir kısmı nakatlanma indükleri için Cas9 proteiniyle nükleofekt edilirken, kalan hücreler sgRNA temsili için bir temel olarak hizmet verirdi. Transdüksiyon edilen hücreler antibiyotiklerle seçildi ve daha sonra incelenen fenotiplere göre ayrı popülasyonlar sıralandı. CAR T hücre proliferasyonu, AOPI tabanlı hücre sayıları kullanılarak ekran boyunca izlendi ve katlama değişimi olarak ifade edildi (Şekil 1B). 8, 10 ve 12. günlerde puromisin takviyesinin ardından, her iki donörde de CRISPR kütüphanesiyle transdüksiyon edilen CAR T hücrelerinin başarılı zenginleşmesini doğruladık; bu, hayatta kalma ve çoğalma ile kanıtlandı. Transdüksiyon yapılmamış T hücreleri (UTD) ve CRISPR kütüphanesi transdüksiyonu olmayan CAR T hücreleri, antibiyotik seçimi kontrol olarak kullanıldı.

Genomik DNA çıkarımından sonra, PCR amplifikasyonu ile sgRNA kütüphaneleri hazırlandı. Aşırı gDNA taşınmasından kaynaklanan sorunları aşmak için, kısıtlama enzimi sindirimi ve sgRNA kasetinin biotin-streptavidin çekilmesini içeren bir protokol uyguladık (Şekil 2A,B). gDNA, sgRNA kasetinin yanındaki krestriksiyon enzimleri NdeI ve PspXI hedef alanlarıyla sindirildi (Şekil 2C). PCR1 primer tavlama noktalarının yukarısına bağlanmak için tasarlanmış biyotinillenmiş oligolar, sgRNA kaset parçalarını yakalamak için kullanıldı, ardından streptavidin boncuklarıyla aşağı çekilerek taşıyıcı gDNA'yı ortadan kaldırdı. SgRNA içeren parçalar daha sonra seçici olarak amplifikasyona uğradı (Şekil 2D) ve ardışık 2 PCR ile indekslendi.

Her örnekten kütüphaneler Yeni Nesil Dizileme (NGS) kullanılarak sıralandı. Demultiplexing, kalite kontrol ve sgRNA tanımlamasından sonra, veriler MAGeCK boru hattıyla analiz edildi. İlk olarak, sayım komutu kontrol (bazal) ve Cas9 ile düzenlenmiş örneklerdeki sgRNA okuma sayılarını niceleştirmiş ve normalleştirmiştir (Şekil 3A,B). Pearson ve Spearman korelasyonları, deney sırasında sgRNA'nın temsiliyetinin (donör gDNA) plazmidik kütüphaneyle karşılaştırıldığında korunduğunu göstermektedir (Şekil 3C). Sonrasında, test komutu her iki durumu karşılaştırarak her genin sağlam rütbe toplama (RRA) puanları atadı (Şekil 3D). Önemli ölçüde zenginleşmiş veya tükenmiş genler, p < 0.05 ve log fold değişimi (LFC) > 0.5 eşikleri kullanılarak tanımlanmıştır (Şekil 3E). Son olarak, aday genlerin yol zenginleştirme analizi Metascape kullanılarak gerçekleştirildi ve tanımlanan düzenleyicilerle ilişkili en önemli Gen Ontolojisi terimleri ortaya çıkarıldı (Şekil 3F).

figure-results-1
Şekil 1: CAR T hücrelerinde CRISPR taraması. (A) CAR T hücrelerinde CRISPR taramasının şeması. (B) Puromisin (P) ile transdüksiyon edilen hücrelerin seçimi. Plazmidik kütüphaneler, pozitif seçim için bir puromisin direnç geni içerir. Antibiyotik, transdüye edilmemiş (UTD) ve CAR T hücrelerinden oluşan transdüsyelenmemiş örneklerde ve transdüze edilmiş CAR T hücrelerine 8. günde ortama eklendi. Puromisin içermeyen örnekler proliferasyonun kontrolü için kullanıldı. İki bağımsız bağışçının verileri gösterilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: sgRNA zenginleştirme analizi için kütüphane hazırlığı. (A) Kütüphane hazırlığı protokolünün şeması. (B) Kısıtlama enziminin (makas) kesim boyutlarının ve PCR1 primerlerin (ok) ve biyotinillenmiş primerlerin (yeşil noktalı ok) tavlama bölgelerinin göreli lokalizasyonu şeması. (C) RE sindirim öncesi ve sonrası gDNA'nın elektroforezi. (D) PCR1 sonrası sgRNA kasetlerinin seçici zenginleştirilmesi. İki fenotipin bazal ve Cas9 örneklerinden iki bağımsız bağışçıdan elde edilen veriler gösterilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: MAGeCK ile rehber zenginleştirme analizi. (A) MAGeCK sayım fonksiyonunun çıktısının özeti. (B) Okuma sayılarının dağılışı. (C) Donör gDNA ile plazmid kütüphanesi sayıları arasındaki korelasyon için Pearson ve Spearman katsayıları. (D) Modifiye edilmiş sağlam sıralama toplama (RRA puanı) ile sıralanmış potansiyel zenginleştirilmiş/tükenmiş genler. (E) Kırmızı renkte önemli genleri (p-değeri < 0.05, LFC > 0.5) gösteren volkan grafiki. (F) Zenginleştirilmiş anlamlı genlerin Metascape yol analizinden sonra Top Gen Ontology (GO) terimleri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Astarların dizisi. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: PCR koşulları. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Kinome 1 kütüphanesindeki sgRNA listesi ve NdeI ile PspXI ile sindirim sırasında kaybedilen sgRNA'lar Lütfen bu dosyayı indirmek için buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR taraması, tek kılavuzlu pertürbasyon ilkesine dayanır; yani her hücre için yalnızca bir sgRNA entegre olmalıdır. Bunu başarmak için sgRNA'lar genellikle lentiviral vektörler aracılığıyla teslim edilir ve enfeksiyonun çokluğu (MOI) dikkatlice kontrol edilmelidir. Bir Vergi Yardımı. 0.3 genellikle önerilir ve hücrelerin %25 ila %30'u tek bir viralparçacık 6 ile transdüksiyon yapılır. Bu nedenle, gerekli viral parçacıkların hacmini belirlemek için doğru titrasyon gereklidir. Bir diğer kritik adım ise protokol sırasında sgRNA kapsamının kaybı. Hasat sırasında hücre kaybı, gDNA çıkarımı sırasında verimsizlikler (özellikle kolon aşırı yüklenmesi ve DNA'nın eksik elüsyonu) veya PCR amplifikasyonu sırasında aşırı şablon bu kayba katkıda bulunabilir ve bu nedenle sgRNA analizimizi çarpıtabilir. Biotinile oligolar konusunda, sentezde kullanılan serbest biotinin streptavidin boncuklarını doygunlaştırmasını önlemek için HPLC ile saflaştırılmış olmaları en iyisidir. Ayrıca, sonraki PCR'larda biyotinillenmiş primerlerden amplifikasyonu önlemek için 3' amino-modifikatörü şiddetle önerilmektedir. Ayrıca, bu oligoları tasarlarken, amplifikasyon sırasında rekabeti önlemek için PCR1 primerlerle herhangi bir örtüşmeden kaçının. Ayrıca, biyoinformatik analiz dikkatli bir dikkat gerektirir: sgRNA çıkarma desenleri plazmid omurgasına bağlıdır (örneğin, lentiGuide-puro veya lentiCRISPR v2) ve hizalama katlığı tam eşleşmeden uyumsuzluğa toleransa kadar değişebilir. Ayrıca, bu protokol bir sindirim aşaması içerdiğinden, kısıtlama noktaları içeren bazı sgRNA'lar kaybolabilir ve referans kütüphanesinin ayarlanması gerekebilir.

Bu çalışmada, sgRNA içeren parçaları sindirim yoluyla zenginleştiren optimize edilmiş bir CRISPR tarama kütüphanesi hazırlama protokolü öneriyoruz ve daha da önemlisi bir açılma adımı sunuyoruz. Kısıtlama enzim sindirimi, daha önce gDNA girdisini azaltmak ve sgRNAkasetleri 27 için zenginleştirme stratejisi olarak önerilmiştir. Benzer şekilde, biyotinillenmiş problar moleküler biyolojide spesifik nüklein asitleri veya protein-nüklein asitkomplekslerini yakalamak için yaygın olarak uygulanmıştır 28,29,30,31.

Protokolümüz bu ilkeler üzerine inşa edilir ve birincil CAR T hücrelerinde CRISPR taraması için uyarlanır, ancak bazı sınırlamalar da kabul edilmelidir. Birincisi, birincil CAR T hücreleri, genleşme kapasiteleri sınırlı olduğu için tarama ölçeğine kısıtlamalar getirir. Yeterli kapsamı ve sgRNA temsilini korumak için çok sayıda başlangıç hücresi gereklidir. Bu mümkün olmadığında, daha küçük özel kütüphanelerkullanılabilir 12, ancak bu genetik sorgulama kapsamını azaltır. Biyolojik değişkenlik ise başka bir zorluktur; bağışçılar arasındaki farklar bekleniyor ve önemli izimlerin örtüşmesi genellikle mütevazı17 kalıyor. İkinci olarak, zenginleştirme stratejisi kısıtlama enzim kesim noktalarının varlığı ve konumuna dayanır. Nadir durumlarda, bu siteler sgRNA dizilerinde bulunabilir ve bu da sınırlı yedekliliğe sahip küçük kütüphaneler için daha sorunludur. Ancak, çoğu kütüphane, özellikle genom çapındaki tasarımlar, hedef başına birden fazla sgRNA içerir ve bu da kılavuz kaybının genel etkisini en aza indirir. Son olarak, sonikasyon ve probyakalama 24 gibi alternatif parçalanma tabanlı zenginleştirme stratejileri, kısıtlama enzim sindiriminin uygun olmadığı durumlarda bazı esneklik sağlayabilir.

Genel olarak, sgRNA kaseti, CRISPR ile düzenlenmiş hücrelerdeki toplam genomik DNA'nın çok küçük bir kısmını temsil eder ve başarılı kütüphane hazırlığı için verimli zenginleştirmeyi kritik hale getirir. Standart protokollerle karşılaştırıldığında, optimize edilmiş iş akışımız gDNA taşınmasını azaltır ve ilgilenilen sgRNA'nın PCR amplifikasyonunu destekler. gDNA parçalanması ve biyotinile edilmiş prob pulldown'ın streptavidin boncuklarıyla birleşimi kavramsal olarak yeni olmasa da, CRISPR taramasına entegrasyonu yaygın PCR tuzaklarını önler ve CRISPR ekran tekrarlanabilirliğini artırır. Ayrıca, her önemli adımda standartlaştırılmış kalite kontrol metriklerinin (örneğin sıralama sonrası T hücresi saflığı, puromisin dirençli hücrelerin oranı, gDNA bütünlüğü ve CAR transdüksiyon verimliliği) dahil edilmesi, iş akışının sağlamlığını ve tekrarlanabilirliğini daha da artıracaktır. Sonuç olarak, birincil CAR T hücreleri bağlamında ve sadece iki donörle geliştirilmiş olmasına rağmen (bu bir sınırlama olabilir, ancak her donörden birkaç örnek kullanılmıştır), bu optimize edilmiş protokol büyük gDNA taşıyıcılarına sahip diğer CRISPR taramaları ve NGS iş akışlarına geniş çapta uygulanabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, MICIU/AEI /10.13039/501100011033 ve FEDER, UE tarafından finanse edilen PID2022-137914OB-I00 projesi tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) tarafından Red de Terapias Avanzadas TERAV ve TERAV+ (RD21/0017/0009 ve RD24/0014/0010) ile Centro de Investigacion Biomedica en Red de Cancer CIBERONC (CB16/12/00489) aracılığıyla desteklenmiştir. Bu çalışma, Gobierno de Navarra Salud (GN2023/08 ve GN2024/04) ve Proyectos Estratégicos (DIAMANTE 0011-1411-2023-000105 ve 0011-1411-2023-000074) tarafından desteklenmiştir. Şekil 1B ve Şekil 2A BioRender.com

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
4200 TapeStationÇevikG2991A
Acridine PortakalInvitrogenA1301
AMPure XP Beckman CoulterA63881
autoMACS NEO SeparatorMiltenyi130-120-327Yüksek hızlı manyetik hücre ayırıcı
Biotinile oligolarIDT
BSASigmaA9647
Çellometre K2 Floresan Hücre SayacıRevvityCMT-K2-MX-150Floresan hücre sayacı
CHT4 Sayım OdalarıRevvityCHT4-SD100-002
CytoSinct CD4 NanoboncuklarıGenScriptL00863-1
CytoSinct CD8 NanoboncuklarGenScriptL00864-1
dNTPÇevik200418-51
Dynabeads M-280 StreptavidinInvitrogen11206D
DynaMag-2 mıknatısInvitrogen12321D
EDTA 0.5 M pH 8.0Invitrogen15575-038
EtanolMerck1,00,98,31,000
ExPERT ATX ElektroporatörüMaxCyteExPERT ATx
Ficoll-PaqueCytiva17544203
Filtropur S 0.2 & micro; mSarstedt83,18,26,001
GenCRISPR Ultra NLS-Cas9-AraştırmaGenScriptZ03621-1
Herculase Buffer 5XÇevik600675-525X tampon
Herculase II Füzyon EnzimiÇevik600679-51DNA polimeraz
IL-15Miltenyi130-095-765
IL-7Miltenyi130-095-362
Mastercycler X50aEppendorf6313HG006059
MaxCyte Elektroporasyon TamponuCytivaEPB1
NdeINew England BiolabsR0111L
Nukleospin dokusuMacherey-Nagel74,09,52,250
PBSGibco14190-094
PolybreneMerckTR-1003-6
Temel BilgilerThermoFisher
Propidium iyotSigmaP4864
PspXINew England BiolabsR0656S
PuromysinGibcoA11138-03
Qubit 3.0 FlorometreInvitrogenQ33216
Kubit HS DNA testiInvitrogenQ32851
R-50x3 Steril Kuyu İşleme MontajıMaxCyteLM243882
T Hücresi TransAct insanMiltenyi130-111-160T hücresi stimülasyon reaktifi
Tape Station HSD1000Çevik5067-5585
TEXMACSMiltenyi130-097-196T hücresi büyüme ortamı
Tris Buffer, 1.0 M, pH 8.0, Moleküler Biyoloji DerecesiEMD Milipore648314
Su, moleküler biyoloji için, DNAse, RNA ve Proteaz içermiyorTermoBilimsel327390010

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brudno, J. N., Maus, M. V., Hinrichs, C. S. CAR T cells and T-cell therapies for cancer: A translational science review. JAMA. 332 (22), 1924-1935 (2024).
  2. Cappell, K. M., Kochenderfer, J. N. Long-term outcomes following CAR T cell therapy: What we know so far. Nat Rev Clin Oncol. 20 (6), 359-371 (2023).
  3. Cui, K., et al. The challenges and progress of CAR-T cell therapy in the treatment of solid tumors. Mol Cell Biochem. 480 (10), 5345-5367 (2025).
  4. Shah, N. N., Fry, T. J. Mechanisms of resistance to CAR T cell therapy. Nat Rev Clin Oncol. 16 (6), 372-385 (2019).
  5. Redondo-Frutos, R. A., et al. Genetic engineering in CAR T cells for solid tumors: Current state, barriers and future developments. Hum Gene Ther. 36 (17-18), 1138-1153 (2025).
  6. Bock, C., et al. High-content CRISPR screening. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-23 (2022).
  7. Shang, W., et al. Genome-wide CRISPR screen identifies FAM49B as a key regulator of actin dynamics and T cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (17), E4051-E4060 (2018).
  8. Shifrut, E., et al. Genome-wide CRISPR screens in primary human T cells reveal key regulators of immune function. Cell. 175 (7), 1958-1971 (2018).
  9. Chen, Z., et al. In vivo CD8+ T cell CRISPR screening reveals control by Fli1 in infection and cancer. Cell. 184 (5), 1262-1280.e22 (2021).
  10. Belk, J. A., et al. Genome-wide CRISPR screens of T cell exhaustion identify chromatin remodeling factors that limit T cell persistence. Cancer Cell. 40 (7), 768-786.e7 (2022).
  11. Henriksson, J., et al. Genome-wide CRISPR screens in T helper cells reveal pervasive crosstalk between activation and differentiation. Cell. 176 (4), 882-896.e18 (2019).
  12. Gurusamy, D., et al. Multi-phenotype CRISPR-Cas9 screen identifies p38 kinase as a target for adoptive immunotherapies. Cancer Cell. 37 (6), 818-833.e9 (2020).
  13. Wei, J., et al. Targeting REGNASE-1 programs long-lived effector T cells for cancer therapy. Nature. 576 (7787), 471-476 (2019).
  14. Dong, M. B., et al. Systematic immunotherapy target discovery using genome-scale in vivo CRISPR screens in CD8 T cells. Cell. 178 (5), 1189-1204.e23 (2019).
  15. Legut, M., et al. A genome-scale screen for synthetic drivers of T cell proliferation. Nature. 603 (7902), 728-735 (2022).
  16. Ye, L., et al. A genome-scale gain-of-function CRISPR screen in CD8 T cells identifies proline metabolism as a means to enhance CAR-T therapy. Cell Metab. 34 (4), 595-614.e14 (2022).
  17. Wang, D., et al. CRISPR screening of CAR T cells and cancer stem cells reveals critical dependencies for cell-based therapies. Cancer Discov. 11 (5), 1192-1211 (2021).
  18. Yukl, S. A., Kaiser, P., Kim, P., Li, P., Wong, J. K. Advantages of using the QIAshredder instead of restriction digestion to prepare DNA for droplet digital PCR. BioTechniques. 56 (4), 194(2014).
  19. Latham, S., Hughes, E., Budgen, B., Morley, A. Inhibition of the PCR by genomic DNA. PLoS One. 18 (4), e0284538(2023).
  20. Owczarzy, R., Moreira, B. G., You, Y., Behlke, M. A., Wälder, J. A. Predicting stability of DNA duplexes in solutions containing magnesium and monovalent cations. Biochemistry. 47 (19), 5336-5353 (2008).
  21. Sasaki, Y., Miyoshi, D., Sugimoto, N. Effect of molecular crowding on DNA polymerase activity. Biotechnol J. 1 (4), 440-446 (2006).
  22. Seitz, V., Schaper, S., Dröge, A., Lenze, D., Hummel, M., Hennig, S. A new method to prevent carryover contaminations in two-step PCR NGS library preparations. Nucleic Acids Res. 43 (20), e135(2015).
  23. Giuffre, A., et al. Overview of the Agilent Technologies SureSelectTM target enrichment system. J Biomol Tech. 22 (Suppl), S30(2011).
  24. Chen, R., Im, H., Snyder, M. Whole-exome enrichment with the Roche NimbleGen SeqCap EZ Exome Library SR platform. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (7), 634-641 (2015).
  25. Horlbeck, M. A., et al. Compact and highly active next-generation libraries for CRISPR-mediated gene repression and activation. eLife. 5, e19760(2016).
  26. Rodriguez-Marquez, P., et al. density influences antitumoral efficacy of BCMA CAR T cells and correlates with clinical outcome. Sci Adv. 8 (39), 514(2022).
  27. Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  28. Dash, S., Balasubramaniam, M., Dash, C., Pandhare, J. Biotin-based pulldown assay to validate mRNA targets of cellular miRNAs. J Vis Exp. (136), e57786(2018).
  29. Tsuji, Y. Optimization of biotinylated RNA or DNA pulldown assays for detection of binding proteins: Examples of IRP1, IRP2, HuR, AUF1, and Nrf2. Int J Mol Sci. 24 (4), 3604(2023).
  30. Sui, H., Chen, Q., Imamichi, T. A pulldown assay using DNA/RNA-conjugated beads with a customized competition strategy: An effective approach to identify DNA/RNA binding proteins. MethodsX. 7, 100890(2020).
  31. Chaparian, R. R., van Kessel, J. C. Promoter pulldown assay: A biochemical screen for DNA-binding proteins. Methods Mol Biol. 2346, 165-172 (2021).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

CRISPR TaramasCas9 D zenlemesisgRNA K t phanesiAk SitometrisiGenomik DNA EkstraksiyonuRestriksiyon Enzimi SindirimiYol Zenginle tirmesiGen Ontolojisi

İlgili makaleler