Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

DBNL'nin Kalp Yetmezliğinde Moleküler Mekanizmaları: Makrofaj İmmünometabolizmasından Terapötik Etkilere Kadar

445 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69756

⸱

2 Ocak 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Ningbo University, 2Department of Cardiology, the Second Affiliated Hospital of Zhejiang University

Bu makalede

Özet

Kalp yetmezliğinde Drebrin Benzeri (DBNL)-makrofaj eksenini sistematik olarak belirlemek için multiomik Mendel randomizasyonu, tek hücreli transkriptomik ve yapı tabanlı in silico taramayı entegre eden bir protokol sunuyoruz. DBNL'yi ilaçlanabilir bir immünometabolik hedef olarak öneriyoruz.

Özet

Kalp yetmezliği (HF), temel patofizyolojik mekanizmalarını hedefleyen sınırlı etkili tedavilerle küresel bir sağlık sorunu olmaya devam etmektedir. Bu çalışmada, Mendel randomizasyonu (MR) ve tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq) birleştiren entegre multiomik yaklaşım, HF için potansiyel biyobelirteçler ve terapötik hedefler belirlemek amacıyla kullanıldı. Genom çapında ilişki çalışmalarından (GWAS'lar), ifade nicel özellik lokuslarından (eQTL'ler), metilasyondan (mQTL'ler) ve protein nicel özellik lokuslarından (pQTL) elde edilen verileri kullanarak HF'nin genetik mekanizmalarını inceledik. Kardiyak makrofajlarda gen ekspresyonunu analiz etmek için tek hücreli RNA dizileme yapıldı ve makrofaj farklılaşması sırasında DBNL'nin dinamik düzenlemesini incelemek için pseudo-time analizi kullanıldı. Moleküler kenetlenme ve dinamik simülasyonları pirinixik asit (WY-14643; PubChem CID: 4594; eşanlamlılar: 50892-23-4; WY-14643) DBNL'nin potansiyel düzenleyicisi olarak görev almaktadır. Multiomik analiz, DBNL'nin (Drebrin-benzeri) HF riskiyle ilişkili önemli bir gen olduğunu ortaya koydu. Tek hücreli RNA dizilemesi, DBNL'nin esas olarak kardiyak makrofajlarda eksprese edildiğini ve patolojik koşullar altında yukarı regülasyon olduğunu ortaya koymuştur. DBNL'nin makrofajlar tarafından ifade edilmesi, bağışıklık metabolizması ve profibrotik yollarla, özellikle IL-6/JAK/STAT3, PI3K/AKT/mTOR ve TGF-β sinyal yolları ile ilişkilidir. Pseudotime analizi, DBNL'nin özellikle kronik iltihaplanmada makrofaj farklılaşması üzerinde dinamik düzenleyici etkisi olduğunu göstermiştir. Moleküler kenetlenme ve dinamik simülasyonlar, piridin asidin DBNL'nin düzenlenmesinde potansiyel bir rolü olduğunu göstermiştir. Bu çalışma, DBNL'nin kalp yetmezliğinin ilerlemesinde rolünü açıklar ve terapötik bir hedef olarak potansiyelini öne sürmektedir. Önemli olarak, terapötik önem hesaplamalı tahminlerden çıkarılmaktadır. Bu bulgular, bağışıklık metabolizması ve makrofaj aracılı hücreler arası iletişim hakkında yeni içgörüler sunarak DBNL hedefli ilaçların ve fonksiyonel araştırmaların optimizasyonunda gelecekteki uygulamalar için teorik bir temel oluşturmaktadır. Buna rağmen, DBNL'nin terapötik hedef olarak klinik etkinliğini doğrulamak için ek deneysel doğrulama ve preklinik çalışmalar gereklidir.

Giriş

Kalp yetmezliği (HF), dünya çapında milyonlarca kişiyi etkileyen ve sağlık sistemlerine önemli ekonomik yük getiren önemli ve büyüyen küresel bir sağlıksorunudur 1. Sonuç olarak, kalp yetmezliği (HF) yönetiminde etkili müdahalelere acil bir ihtiyaç vardır.

Kalp yetmezliğinin karmaşık patofizyolojisi, sol ventrikülün miyokard kasılmasının bozulmasından kaynaklanır ve bu da pulmoner ve periferik konjeziyon gibi sistemik komplikasyonların zincirineyol açar 2. Ancak, kalp yetmezliğinin ilerlemesinin temelini oluşturan temel patofizyolojik mekanizmaların, özellikle olumsuz miyokard yeniden modellemenin, doğrudan ele alınması kritik ve karşılanmamış bir sorunolmaya devam etmektedir 3. Son on yıllarda, biyomedikal araştırma alanı, esas olarak multiomik teknolojilerin ve gelişmiş biyoinformatik metodolojilerin dahil edilmesiyle önemli bir paradigma değişimi geçirdi. Bu araçlar, yeni hastalık biyobelirteçleri ve terapötik hedefleri belirlemek için olağanüstü fırsatlar sunar. Mendel randomizasyonu (MR), titiz bir genetik epidemiyolojik yaklaşımdır ve genetik maruziyetler ile klinik sonuçlar arasındaki nedensel ilişkileri çıkarmak için tek nükleotid polimorfizmalarını (SNP) araçsal değişkenler olarak kullanır4. Randomize kontrollü çalışmaların metodolojik çerçevesini benimseyerek, Mendel randomizasyonu (MR), uyuşturucu hedeflerin tanımlanması ve yeniden kullanılması için sağlam kanıtlar sağlamak için karıştırıcı ve ters nedensellik sorunlarını etkili bir şekilde ele alır. Paralel olarak, tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq), doku heterojenliğini benzersiz çözünürlükle ortaya koyarak hücre tipine özgü gen ifadesi ve kalp gibi karmaşık organlar içindeki hücrelerarası iletişim ağları hakkında derin içgörülersunar. Genetik, transkriptomik ve proteomik verileri sentezleyen multiomik yaklaşım, hastalık mekanizmalarını aydınlatmak ve terapötik yolları belirlemek için önemli bir potansiyel sunar.

Bu teknolojik gelişmelere rağmen, kalp yetmezliğinde kalp iltihabı ve yeniden şekillendirilmesini tetikleyen özel hücresel ve moleküler mekanizmalar hakkında önemli bilgi boşlukları devam etmektedir. Biriken kanıtlar, bağışıklık hücrelerinin, özellikle makrofajların, miyokardiyal hasar ve kronik kalp yetmezliği süreçlerinde inflamatuar yanıtların ve ardından doku yeniden yapılanmanın organize edilmesinde kritik olduğunu ve bunun da hastalık ilerlemesi için kritik olduğunugöstermektedir 6. Önceki araştırmalar ağırlıklı olarak geniş inflamatuar aracılar veya hücre yüzeyi belirteçleri üzerine yoğunlaşmış, bu da bu kritik bağışıklık hücre popülasyonlarında hücre içi düzenleyici hedeflerin keşfinde önemli bir boşluk yaratmıştır. Ayrıca, geleneksel genom çapındaki ilişki çalışmaları (GWAS'lar) kalp yetmezliğiyle ilgili birçok genetik ilişkiyi tespit etmiş olsa da, kesin nedensel ilişkiler kurmakta sıkça zorluklarla karşılaşır ve bu da doğrudan terapötik çeviri için uygulanabilirliklerinisınırlar. Sonuç olarak, DNA metilasyonunu (mQTL'ler), gen ifadesini (eQTL'ler) ve protein bolluğunu (pQTL'ler) etkileyen genetik varyantları içeren kapsamlı bir multiomik Mendel randomizasyon (MR) çerçevesinin uygulanması, birden fazla biyolojik düzenleyici katmanda daha sağlam nedensel çıkarımlar elde etmek için gereklidir. Bu yaklaşım, tek katmanlı QTL çalışmalarının doğasında bulunan sınırlamaları ele alır. Özellikle, Drebrin benzeri (DBNL) protein, nöronal gelişim ve sitoskelet dinamikleri bağlamında kapsamlı araştırmaların konusuolmuştur 8; Ancak, özellikle kalp yetmezliği olmak üzere kardiyovasküler hastalıklarda işlevsel önemi ve terapötik potansiyeli büyük ölçüde keşfedilmemiştir. Bu önemli anlayış boşlukları, DBNL'nin kalp yetmezliği tedavisinde ilaç geliştirme için yeni ve potansiyel olarak uygulanabilir bir hedef olarak değerlendirilmesini engellemektedir.

Bu kritik bilgi eksikliklerini gidermek için, bu çalışma kalp yetmezliği riskiyle nedensel olarak ilişkili anahtar genleri, eQTL, mQTL ve pQTL verilerini birleştiren entegre bir multiomik MR çerçevesi aracılığıyla sağlam bir şekilde tanımlamayı amaçlamaktadır. Bu çalışma, multiomik Mendel randomizasyon analizlerinin — ekspresyonel niceliksel özellik lokusları (eQTL), metilasyon niceliksel özellik lokusları (mQTL) ve protein nicel özellik lokusları (pQTL) dahil — yüksek çözünürlüklü tek hücreli transkriptomik veriler (GSE161470) ve toplu transkriptomik veriler (GSE161472) ile entegre edilmesini içeren yeni bir yaklaşım sunmaktadır; böylece DBNL genini kalp yetmezliği için kritik bir nedensel risk faktörü olarak sistematik olarak tanımlamaktadır. Bu bulgular, DBNL'nin ağırlıklı olarak ve özgün olarak kardiyak makrofajlarda ekspreslendiğini ve ayrışma süreçleri boyunca ifadesinin dinamik olarak değiştiğini göstermektedir. Ayrıca, bu çalışmanın sonuçları DBNL'nin kalp bağışıklık mikroçevresini modüle etmedeki ve IL-6/JAK/STAT3 sinyal zinciri gibi kalp yetmezliğiyle ilişkili immünometabolik yolların ve profibrotik sinyal yollarının koordinelenmesindeki kritik rolünü açıklamaktadır. Ayrıca, hesaplamalı biyoloji teknikleri kullanılarak bu araştırma, piridil asit (WY-14643)'nin DBNL için yüksek afiniteli bir ligand olduğunu öngörerek, DBNL'nin kalp yüzünde yeni bir terapötik hedef olarak tanımlanmasını destekleyen ve hedefli farmakolojik müdahalelerin geliştirilmesini kolaylaştıran kapsamlı, çok boyutlu bir teorik çerçeve sağlamaktadır. Tek hücreli RNA dizileme kullanarak, kalp mikro ortamında tanımlanan ana gen DBNL'nin hücre-spesifik ifadesini ve fonksiyonel yollarını karakterize ettik ve DBNL'nin immünometabolik ve profibrotik sinyal yollarındaki rolünü ve kalp hücre tipleri arasındaki hücre-hücre iletişimindeki rolü araştırdık. DBNL için potansiyel küçük molekül ligandları, hesaplamalı moleküler kenetlenme ve moleküler dinamik simülasyonlarıyla tanımlandı. DBNL'nin, öncelikle kardiyak makrofajlarda ifade edilen bir yöntemin, immünometabolik yolları ve hücreler arası çapraz iletişimi düzenleyerek kalp yetmezliği ilerlemesi üzerinde nedensel etki yarattığını hipotezize sunuyoruz. Özetle, ileri multiomik Mendel randomizasyonu yüksek çözünürlüklü tek hücre analiziyle entegre ederek, kalp yetmezliği için yeni terapötik hedefleri sistematik olarak belirledik ve karakterize ettik ve potansiyel küçük molekül modülatör hedefleri araştırdık.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Veri İndir
Gen İfadesi Verileri
Mevcut çalışmada kullanılan tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq) verileri, Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) tarafından tutulan Gen İfadesi Omnibüsü (GEO) deposundan, özellikle erişimnumarası 9 GSE161470 olan veri setinden (dört kontrol örneği ve bir patolojik örnekten oluşan insan kalp dokusundan) alınmıştır. Bu veri seti ilk olarak Zhang ve ark. tarafından 2022yılında yayımlanmıştır 10. Orijinal araştırmanın temel amacı, kalp yetmezliği koşullarında insan kalp dokusunda hücresel heterojenliği ve moleküler düzenleyici mekanizmaları incelemekti. Mevcut analiz için, bu veri setinden beş örnek seçildi ve her biri insan kalp dokusundan türetilen kapsamlı tek hücreli ifade profillerini içeriyordu. Bu çalışmada kullanılan diğer veri seti de NCBI GEO kamu deposundan alınmıştır; özellikle erişim numarası GSE161472'ye karşılık gelen Seri Matris Dosyası ve GPL11154 açıklama dosyası ile birlikte bulunmaktadır. İfade profili, toplam 84 örnekten oluşmakta, bunların 37'si kontrol örneği ve 47 hastalık örneği bulunmaktadır. Bu araştırma, bütünleşik bir multiomik analizi kapsar ve tüm araştırmalar kamuya açık veriler kullanılarak gerçekleştirilir.

eQTL verileri
eQTLGen konsorsiyumundan elde edilen eQTL verileri, kandaki gen ifadesinin genetik çerçevesini ve karmaşık özellikleri etkileyen genetik faktörleriaydınlatmaya odaklanmaktadır 3. Konsorsiyum şu anda kapsamlı projesinin ikinci aşamasında, kan gen ifadesine ilişkin genom genomuz genelinde verilerin meta-analizlerini yürütmektedir.

Maruz kalma verileri - mQTL'ler
mQTL verileri, Avrupa (EUR) kohortunun yayımlanmış bir meta-analizinden elde edilmiştir; bu kohort, Avrupa kökenli11 popülasyonlardan 3.701 örneğin genetik çerçevesinde tam kan DNA metilasyonu incelenmektedir. Veri seti, 426.636 mQTL özelliği hakkında bilgi içeriyordu.

Maruz kalma verileri-pQTL
Plazma pQTL verileri deCODE veritabanından (https://www.decode.com/summarydata/)4 alındı. Bu çalışma, 2021 yılında deCODE pQTL veri setinin veri setinin verilerini kullandı ve 35.559 Avrupa kökenli bireyde 4.907 aptamerle ölçülen plazma protein seviyelerinin genom çapında ilişki çalışmasını (GWAS) kapsadı.

Sonuç verileri
Kalp yetmezliği için özet istatistikler, ağırlıklı olarak Avrupa kökenli katılımcıları içeren ve Avrupa Biyoinformatik Enstitüsü (EBI) veritabanı (GCST90162626) üzerinden erişilen büyük ölçekli genom çapında bir ilişki çalışmasından (GWAS) elde edilmiştir. Kalp yetmezliği veri seti 115.150 vaka ve 1.550.331 kontrol grubunu içeriyordu. Yayınları, önde gelen dernekleri ve ayrıntılı özet istatistikleri kapsayan GWAS Kataloğu, şu anda Genom Montajı ve dbSNP Yapısı'na eşlenmiş veriler sunmaktadır.

mQTL, eQTL ve pQTL'lerin Mendel randomizasyon analizi
Gen ifadesi, protein bolluğu, DNA metilasyon seviyeleri ve kalp yetmezliği riski arasındaki potansiyel nedensel ilişkileri sistematik olarak incelemek için, İfade nicel özellik lokusları (eQTL), protein nicel özellik lokusları (pQTL) ve metilasyon nicel özellik lokusları (mQTL) veri setleri kullanılarak Mendel randomizasyon (MR) analizleri gerçekleştirildi. Maruziyet verilerinin ön işleme aşamasında, her maruziyet değişkeniyle (gen, protein veya metilasyon bölgesi) ilişkili tek nükleotid polimorfizmaları (SNP) ilgili veritabanlarından genom genelinde P < 1 × 10⁻⁵ anlamlılık eşiğinde çıkarılarak başlangıç aday enstrümantal değişkenler (IV) olarak hizmet verildi. Daha sonra, her bir maruziyet faktörünün IV'leri için 10.000 kilobaz (kb) pencere boyutu ve 0.001 LD R² eşiği kullanılarak cihazlar arasında bağımsızlık sağlanarak bağlantı dengesizliği (LD) topaklanması gerçekleştirildi. Bu seçilmiş IV'ler, kalp yetmezliği genom çapında bir ilişki çalışmasından (GWAS; ID: GCST90162626) read_outcome_data fonksiyonunu kullanarak sadece sonuç veri setinde 5×10⁻⁵'nin altında ilişkilendirilen P değeri olan SNP'leri korur. Zayıf enstrüman yanlılığını azaltmak için, her IV için F istatistiği F = (β_exposure/SE_exposure)² olarak hesaplandı ve sonraki analizlere yalnızca F > 10 olan cihazlar dahil edildi. Nedensel etki tahmini için, maruziyet ve sonuç veri setleri arasındaki allel hizalanması TwoSampleMR paketinden harmonize_data fonksiyonu kullanılarak gerçekleştirildi. MR analizleri daha sonra dört tamamlayıcı istatistiksel yaklaşımla gerçekleştirildi: (1) SNP'ler arasında Wald oran tahminlerinin meta-analizlerini sağlayan ters varyans ağırlıklı (IVW) yöntemi; (2) MR-Egger regresyonu, yönsel pleiotropiyi Doğrudan Etkiden Bağımsız Enstrüman Gücü (InSIDE) varsayımına dahil ederek bir kesişim terimi dahil eder; (3) %50'ye kadar geçersiz olsa bile tutarlı nedensel tahminler veren ağırlıklı medyan yöntem; ve (4) MR-Egger'a kıyasla en sık nedensel etki tahmin kümesini belirleyen ağırlıklı mod yöntemi. Yalnızca tek bir enstrümantal değişken mevcut olduğunda, yalnızca Wald oran yöntemi uygulanmıştır. Bulguların sağlamlığını değerlendirmek için, mr_heterogeneity fonksiyonu üzerinden heterojenlik testi, mr_pleiotropy_test kullanılarak pleiotropi değerlendirmesi ve mr_leaveoneout fonksiyonu üzerinden uygulanan tek bir analiz analizleri dahil olmak üzere kapsamlı duyarlılık analizleri yapıldı; bu analizler her SNP'yi yinerateli olarak hariç tutarak bireysel varyantların genel sonuçlar üzerindeki etkisini belirledi. Önemli çağrışımlar, mr_scatter_plot ve mr_forest_plot gibi grafiksel araçlarla görselleştirildi. Bu analitik boru hattı, çalışma boyunca metodolojik tutarlılığı korumak için eQTL, pQTL ve mQTL veri setlerinde eşit şekilde uygulandı.

Kolokalizasyon analizi
Coloc yöntemi, eQTL özet verileri ve kalp yetmezliği GWAS ile bir kolokalizasyonanalizi yapıldı 5. Indeks tek-nükleotid polimorfizması (SNP), 100 kb bir topaklanma penceresi içinde posterior olasılığı hesaplamak için kullanıldı. Kolokalizasyon (kolok) analizinde, H3 hipotezi, gen ekspresyonu ve kalp yetmezliği gibi iki özelliğin ilişkili olduğunu ancak belirgin nedensel varyantlara sahip olma olasılığını ifade eder. Buna karşılık, H4 Hipotezi, iki özellik arasındaki ilişkinin tek ve paylaşılan nedensel varyanttan kaynaklandığı gerisindeki olasılığı gösterir. SNP'nin bir eşiği. PP. 0,90'dan yüksek H4 kolokalizasyonu belirlemek için kullanıldı.

İmmün sızma
CIBERSORT yöntemi, mikro ortam içindeki bağışıklık hücre tiplerini değerlendirmek için yaygın olarak benimsenenbir tekniktir. Destek vektör regresyon prensipleri kullanılarak, bağışıklık hücre alt tiplerinin ekspresyon matriksinin dekonvolüsyon analizi yapılabilir. 547 biyobelirteç dahil ederek, CIBERSORT T hücreleri, B hücreleri, plazma hücreleri ve çeşitli miyeloid hücre alt popülasyonları dahil olmak üzere 22 insan bağışıklık hücresi fenotipini ayırt edebilir. GSE161472 veri seti kullanılarak, CIBERSORT algoritması ve entegre LM22 imza matrisi kullanılarak bir analiz yapıldı; bu matris 22 farklı insan bağışıklık hücre tipinin gen ifade profillerini karakterize eder. Bu 22 bağışıklık hücresi popülasyonunun sızma seviyeleri her bireysel örnek için nicelendirildi. Daha sonra, cor.test fonksiyonu anahtar genlerin ekspresyonu ile ilgili bağışıklık hücresi infiltrasyon seviyeleri arasındaki korelasyonları değerlendirmek için uygulanmıştır.

Tek hücreli RNA dizilemesi veri işleme ve kalite kontrolü
Tek hücreli ifade profili verileri, R (V4.3.0) ortamında Seurat (V4.3.0) paketi kullanılarakişlenmiştir 6. Bu çalışma, tek hücreli RNA dizileme verilerinin analizi için geleneksel bir iş akışı kullandı. Başlangıçta, ifade profilleri Seurat paketi kullanılarak ithal edildi. Hücreler, her hücrenin toplam UMI sayısı, ekspres gen sayısı, mitokondriyal okuma oranı ve ribozomal okuma oranı gibi çeşitli kalite ölçütlerine göre filtrelendi. Dışnamalar, medyandan üçten fazla medyan mutlak sapma (MAD) sapan değerler olarak tanımlandı. Uygulanan özel filtreleme eşikleri şu şekildeydi: nFeature_RNA ≥ 200, percent.mt ≤ 2.15718, nFeature_RNA ≤ 2840.941 ve nCount_RNA ≤ 5194.27. Genellikle, aşırı yüksek toplam UMI sayısı ve ekspres gen sayısı gösteren hücreler çift olarak sınıflandırılırken, mitokondriyal veya ribozomal okuma oranı yüksek olan hücreler düşük kalitede kabul edilir ve potansiyel olarak apoptoz veya parçalanmaya uğrayabilirdi. Bu filtreleme adımlarını takip ederek, DoubletFinder (sürüm 2.0.4) kullanılarak her örnekten çift tek tek tanımlanıp çıkarıldı ve hücre kalite kontrol süreci tamamlandı. Başlangıçta, veri normalizeData fonksiyonu kullanılarak gerçekleştirildi. Hücre döngüsü durumu daha sonra CellCycleScoring fonksiyonu ile değerlendirildi ve FindVariableFeatures yöntemiyle yüksek değişkenlikli genler tanımlandı. Veri seti daha sonra ScaleData kullanılarak ölçeklendirilerek verileri standartlaştırdı ve mitokondriyal genlerin, ribozomal genlerin ve hücre döngüsü etkilerinin sonraki analizler üzerindeki etkisini azalttı. Doğrusal boyut azaltma, RunPCA fonksiyonu aracılığıyla ana bileşen analizi (PCA) kullanılarak gerçekleştirildi ve önemli ana bileşenler daha fazla analiz için seçildi. Farklı örnekler arasındaki toplu etkileri ele almak için Harmony algoritması (sürüm 1.1.0) kullanıldı. Bu yaklaşım, PCA alanında farklı partilerden benzer hücreleri tekrar ederek kümeler içinde parti çeşitliliğini korurken. Veri setinde gözlemlenen nispeten hafif parti etkileri göz önüne alındığında, varsayılan parametreler (θ = 2) uygulanmıştır. Daha sonra doğrusal olmayan boyut azaltma RunUMAP kullanılarak gerçekleştirildi, ardından FindNeighbors üzerinden hücre komşuluk grafiği oluşturuldu ve FindClusters ile hücre kümelenmesi yapıldı. Hücre tipi açıklaması için hiyerarşik bir açıklama çerçevesi uygulandı: birincil manuel açıklama, CellMarker veritabanı ve ilgili literatür tarafından bilgilendirilen karakteristik gen ifade desenlerine dayanıyordu; bu, referans olarak SingleR yazılımından alınan otomatik notasyon sonuçlarıyla tamamlandı. Hücre tipi tanımlamasının doğruluğunu ve kapsamlılığını artırmak için, İnsan Birincil Hücre Atlası (HPCA), BlueprintEncode, MonacoImmune, DatabaseImmuneCell ve NovershternHaematopoietic gibi birçok yetkili veritabanına danışıldı. Hücre açıklaması, CellMarker (http://117.50.127.228/CellMarker/CellMarkerBrowse.jsp) veritabanında sorgulama yapılarak ve literatür incelenerek gerçekleştirildi; bu destek SingleR (V2.4.0)yazılımı 13 tarafından sağlanan otomatik annotasyon desteğiyle sağlandı. Amacı, ilgili dokuda bulunan hücre tiplerini ve bunlara bağlı işaretleyicigenleri 14.

Ligand - reseptör etkileşimlerinin analizi
Bu çalışmada, CellCall (sürüm 1.0.7) hücrelerarası iletişim ağlarının kapsamlı analiziniyapmak için kullanılmıştır 15. Seurat'tan türetilen hücre tipi açıklamaları ham sayım matrisi ile birlikte kullanılarak, insan genomu için yapılandırılmış parametrelerle normalize edilmiş bir analiz nesnesi oluşturuldu. TransCommuProfile fonksiyonu, hücre-hücre etkileşimlerinin gücünü ağırlaştırılmış bir algoritma aracılığıyla niceltmek için uygulandı ve güvenilir ligand-reseptör çiftlerini belirlemek için p değeri 0.05 < bir anlamlılık eşiği uygulandı. Önemli etkileşim çiftleri daha sonra getHyperPathway fonksiyonu aracılığıyla KEGG yol zenginleştirme analizine tabi tutuldu ve hücre tipleri ile yollar arasındaki ilişkiler baloncuk grafikleriyle gösterildi. Genel iletişim ağı nihayetinde dairesel bir grafikle görselleştirildi; burada sekiz farklı renk farklı hücre tiplerini gösteriyordu. Etkileşim gücü ve yönlülüğü, ok özellikleriyle temsil edildi ve hücreler arası sinyal dinamiklerinin ayrıntılı bir karakterizasyonunu sağladı.

Sözde zaman analizi
Kalp yetmezliğinin ilerlemesi boyunca makrofajların dinamik transkripsiyonel düzenlemesini araştırmak için, bu çalışma Monocle algoritmasını kullanarak makrofaj alt popülasyonlarında pseudotime analizi yapmıştır. Hedef hücre alt popülasyonlarına karşılık gelen gen ifade matrisi, yüksek değişkenlikli genlerin sıralanma özellikleri olarak seçildiği tek hücreli yörünge analiz nesneleri oluşturmak için çıkarıldı. DDRTree boyut azaltma tekniği kullanılarak, hücreler iki boyutlu bir uzaya haritalanarak farklılaşma yörüngesi yeniden oluşturuldu. Hücrelerin pseudo-zaman ekseni boyunca dağılımını belirlemek ve ifadesi sözde zaman içinde önemli ölçüde değişen genleri belirlemek için görselleştirme analizleri yapıldı. Sonraki analizler, DBNL ana genine odaklanmış ve hücre yörüngesi boyunca ifade dinamiklerini karakterize etmiş, kalp yüzündeki makrofajların transkripsiyonel yeniden programlama mekanizmalarını açıklamıştır16.

Gen seti zenginleştirme analizi (GSEA)
Bu çalışmada, kalp yetmezliğinde rol alan anahtar genlerle ilişkili düzenleyici mekanizmaları açıklamak için GSEA yaklaşımı kullanıldı. Daha önce tanımlanmış anahtar genler kullanılarak, örnekler medyan ekspresyon değerine göre yüksek ve düşük ekspresyonlu kohortlara ayrıldı. Diferansiyel ifade analizi limma paketi kullanılarak yapıldı ve log fold change'e (logFC) göre sıralanmış bir gen listesi oluşturuldu. Sonraki KEGG yol zenginleştirme analizi, MsigDB veritabanından elde edilen gen setleri referans arka plan olarak kullanılarak, clusterProfiler aracı kullanılarak gerçekleştirildi. Daha sonra GSEA algoritması, iki ifade grubu arasında anlamlı zenginleştirilmiş sinyal yollarını belirlemek için uygulandı ve 0,05'in altında ayarlanmış bir p-değer eşiği istatistiksel anlamlılığı belirlemek için kullanıldı. Kritik yollar içindeki çekirdek genlerin düzenleyici işlevlerini göstermek için, çoklu yol GSEA grafikleri ve dairesel ağ diyagramları dahil olmak üzere çeşitli görselleştirme teknikleri kullanıldı.

Gen kümesi varyasyon analizi (GSVA)
GSVA, transkriptomik verilerde gen seti zenginleşmesini değerlendirmek için kullanılan parametrik olmayan, denetimsiz bir yaklaşımdır. Bu yöntem, belirli gen setleri için bileşik puanlar hesaplayarak gen düzeyindeki varyasyonları yol düzeyinde varyasyonlara dönüştürür ve çeşitli örneklerde biyolojik fonksiyonel değişikliklerin değerlendirilmesini kolaylaştırır. Mevcut çalışmada, gen setleri Moleküler İmzalar Veritabanı'ndan alınmıştır. GSVA algoritması, her gen seti için bileşik skorları hesaplamak için kullanıldı ve farklı örneklerde potansiyel biyolojik fonksiyonel değişikliklerin değerlendirilmesini mümkün kıldı. GSVA zenginleştirme analizinin sonuçları ek materyalde (Ek Tablo 1) sunulmaktadır.

CTD ilaç tahmini
Hedef gen (DBNL) Karşılaştırmalı Toksikogenomik Veritabanı (CTD) arama alanına girildi, hastalık kategorisi "kardiyovasküler hastalık" seçildi ve sorgu, "kalp yetmezliği" durumuyla ilişkili ilaç tahmin verilerini almak için yürütüldü. Elde edilen tahmin sonuçları, veri görselleştirmesini kolaylaştırmak ve gen-kimyasal etkileşim ağ haritası oluşturulmasını sağlamak için Cytoscape yazılımına aktarıldı.

Moleküler kenetlenme yöntemleri
İnsan DBNL proteininin (UniProt ID: Q9UJU6) üç boyutlu kristal yapısı çözülmemiş olması nedeniyle, bu çalışma DBNL'nin üç boyutlu yapısını AlphaFold317 temelinde öngörmüştür. Pirinixic acid (WY-14643), PubChem veritabanından (PubChem CID: 5694) indirilebilir. Daha sonra, protein yapısı MGLTools yazılımı (sürüm 1.5.7)18 kullanılarak ön işlenmiş ve hidrojen atomlarının eklenmesi gibi adımlar da dahildir. Aynı zamanda, proteinler ve küçük moleküller kenetlenmek için gereken PDBQT formatına dönüştürüldü. AutoDock Vina yazılımı (sürüm 1.1.2)19 , potansiyel bağlanma modlarını incelemek için küresel moleküler kenetlenme (exogenity=16, num_modes=30) için kullanıldı. Kenetlenme hesaplamaları tamamlandıktan sonra, en yüksek afiniteye sahip kompleks konformasyon, en düşük bağlanma serbest enerjisi ile gösterilen, sonraki moleküler dinamik simülasyonları için başlangıç yapısı olarak seçilmelidir.

Moleküler dinamik simülasyon yöntemi
Aday bileşikler ile proteinler arasındaki bağlanma kararlılığı ve etkileşim mekanizmalarını sistematik olarak incelemek için, GROMACS yazılım paketi (sürüm 2024.03)20 kullanılarak geleneksel moleküler dinamik (MD) simülasyonları gerçekleştirilmiştir. Protein parametreleri Amber14SB kuvvetalanı 21 kullanılarak oluşturuldu, su molekülü modeli TIP3P model22 kullanılarak oluşturuldu ve ligand topoloji parametreleri Genel Amber Güç Alanı (GAFF) tabanlı Antechamber Python Parser Interface (ACPYPE) aracı kullanılarak oluşturuldu. Ligand-protein kompleksi sistemi daha sonra TIP3P su molekülleriyle dolu periyodik sınır sektaedrik bir kutu içinde konumlandırıldı. Sodyum (Na⁺) ve klorür (Cl⁻) iyonları dahil edilerek 0,15 mol/L konsantrasyonu elde edildi ve sistemin genel yükünü nötralize etti. Sistem inşaatı tamamlandıktan sonra, ilk adım, 50.000 adımda en dik iniş yöntemiyle enerjiyi en aza indirmeyi ve yapıdaki potansiyel olarak makul olmayan konformasyonları ortadan kaldırmayı içeriyordu. Daha sonra sistem dengesinin iki aşaması gerçekleştirildi: 100 ps NVT (sabit parçacık sayısı, hacmi ve sıcaklık) simülasyonu, ardından 100 ps NPT (sabit parçacık sayısı, basınç ve sıcaklık) simülasyonu. Bu simülasyonlarda, proteinin yapısal bütünlüğünü korumak için protein omurgasının ağır atomlarına konumsal kısıtlamalar uygulandı. Sıcaklık, V-yeniden ölçekleme termostatı kullanılarak 300 K seviyesinde tutuldu ve basınç Parrinello-Rahman barostatı kullanılarak basınç bağlantısı olarak 1 bar olarak ayarlandı. Dengeleme aşaması tamamlandığında, tüm konumsal kısıtlamaların ortadan kaldırıldığı 100 nanosaniyelik bir üretim aşaması simülasyonu gerçekleştirilir. Yörünge, 2 femtosaniyelik bir zaman adımı kullanılarak entegre edildi ve uzun menzilli elektrostatik etkileşimleri hassas şekilde yönetmek için parçacık-mesh Ewald (PME) yöntemi kullanıldı. Yörünge her 10 ps'te kaydedildi ve sonraki analiz için toplam 10000 kare çıktı. Ayrıca, simülasyondan 90-100 ns aralığında kararlı yörüngeler çıkarıldı ve ligand protein komplekslerinin bağlanma serbest enerjisi gmx MMPBSA aracı23 kullanılarak hesaplandı.

İstatistiksel analiz
Bu Mendel randomizasyon (MR) analizinin geçerliliği üç temel varsayıma bağlıdır. (1) İlgililik: Enstrümmental değişkenler (IV) maruziyetle güçlü bir ilişki göstermelidir. (2) Bağımsızlık: IV'ler, hem maruz kalmayı hem de sonucu etkileyen herhangi bir karıştırıcı unsurdan bağımsız olmalıdır. (3) Dışlama Kısıtlaması: IV'ler, sonucu yalnızca maruziyete etkileriyle etkilidir. Bu varsayımın ihlali, yani bir IV'nin maruziyete dahil olmayan yollarla sonucu etkilemesi, yatay pleiotropi olarak adlandırılır. Tüm istatistiksel analizler R versiyonu 4.3.0 kullanılarak iki taraflı testlerle yapıldı ve 0.05'in altında olan p değeri genellikle istatistiksel anlamlılığı göstermek için kabul edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

DBNL'nin kalp yetmezliği riskiyle ilişkili bir gen olarak Mendel randomizasyonu ve kolokalizasyon analiziyle tanımlanması
Kalp yetmezliğiyle ilgili örnekler için sonuç tanımlayıcısı GCST90162626, özet istatistikler veri setinden alındı. 1.247 ifade nicel özellik lokusu (eQTL) çifti arasındaki nedensel ilişkiler ve sonuçlar extract_instruments ve extract_outcome_data fonksiyonları kullanılarak belirlendi (Ek Tablo 2). Sonraki Mendel randomizasyon analizi, eQTL-pozitif sonuçlarla ilişki...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

İltihap, kalp yetmezliğinin (HF) patofizyolojisinin temel bir unsurunu oluştursa da, önceki araştırmalar ağırlıklı olarak genelleştirilmiş inflamatuar aracılar ve hücre yüzeyi belirteçleriüzerine yoğunlaşmıştır 17,18,24. Bu odak, ilgili spesifik hücresel mekanizmaların açıklanmasını kısıtlamıştır. Bu sınırlamaları aşmak için, multiomik Mendel randomizasyonu (MR) ile tek hücreli transkriptomik an...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden çıkarları olmadığını belirtirler.

Teşekkürler

Bu araştırma programı, Çin Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (LTGY24H020001), Zhejiang Eyaleti Geleneksel Çin Tıbbı Bilim ve Teknoloji Projesi (2023ZR131, 2023ZL158), Ningbo Kamu Refah Anahtarı Projesi (2024S030), Ningbo Ana Teknoloji Ar-Ge Programı (2022Z149), Zhejiang Eyaleti Aterosklerotik Hastalıklar için Hassas Tıp Ana Laboratuvarı (2022E10026) tarafından desteklendi. ve Zhejiang Tıp Derneği Klinik Tıbbi Araştırmalar için Özel Fon Projesi (2021ZYC-A11) ile birlikte yer aldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
CellMarker VeritabanıHarbin Tıp Üniversitesi (CellMarker 2.0)http://bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/CellMarker/CellMarker Veritabanı; Tek hücre annotasyonu sırasında doku/hücre tipi belirteç genlerini sorgulamak için
Karşılaştırmalı Toksikogenomik Veri Tabanı (CTD)CTD (Duke Üniversitesi ve diğerleri)http://ctdbase.org/CTD Veritabanı; İlaç tahmini için kullanılan kimyasallar, genler, fenotipler ve hastalıklar arasındaki etkileşimleri geri almak için
deCODE Plazma pQTL Veri Seti (2021, 4.907 aptamer, 35.559 Avrupa örneği)deCODE genetiğihttps://www.decode.com/summarydata/2021 pQTL veri açıklaması; MR analizi için pQTL maruziyet verisi olarak kullanıldı
eQTLGen Whole Blood eQTL VerilerieQTLGen Konsorsiyumuhttps://www.eqtlgen.org/eQTLGen faz I/II (kullanıma göre özel versiyon); MR ve kolokalizasyon analizi için eQTL maruziyet verisi olarak kullanıldı
GEO Tek Hücreli RNA-seq Veri Seti GSE161470 (İnsan Kalp Dokusu: 4 kontrol + 1 patolojik örnek)NCBI Gen İfadesi Omnibüsü (GEO)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE161470GSE161470; İnsan kalp dokusunun tek hücreli RNA dizileme verilerini alarak sonraki analiz için
GWAS KataloğuNHGRI– EBIhttps://www.ebi.ac.uk/gwas/GWAS Kataloğu; HF ile ilgili GWAS bilgilerini, açıklamalarını ve yardımcı analizleri almak için
Kalp Yetmezliği GWAS Özet İstatistikleri (GCST90162626)NHGRI– EBI GWAS Kataloğuhttps://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90162626Çalışma başvurusu: GCST90162626; MR ve kololokalizasyon analizi için sonuç verisi olarak kullanılmıştır
Moleküler İmza Veritabanı (MSigDB) v7.0Broad Enstitüsühttps://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdbMSigDB v7.0; GSEA / GSVA arka plan gen setleri ve yol açıklamaları için
Pirinixik asit (WY-14643) Yapı Verileri (PubChem)NCBI PubChemhttps://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5694PubChem CID: 5694; Moleküler kenetlenme ve dinamik simülasyonu için ligand 3D yapısını elde etmek amacıyla kullanılır
UniProt Protein Veritabanı (DBNL, UniProt ID: Q9UJU6)UniProt Konsorsiyumuhttps://www.uniprot.org/uniprot/Q9UJU6UniProt: Q9UJU6; DBNL'nin amino asit dizisini elde etmek için yapı tahmini ve kenetlenme için kullanılır
Tam Kan mQTL Meta-Analizi (Ref 11, 3.701 Avrupa örneği, 426.636 mQTL özelliği)Yazarlar / Konsorsiyum (referansınız 11'e göre)Orijinal veritabanı URL'si / DOI eklemek için bekleyen yazarDOI veya veri seti kimliğine referans verin; MR analizi için mQTL maruziyet verisi olarak kullanıldı

Kaynaklar

  1. Darvish, M., et al. Heart failure: Assessment of the global economic burden. Eur Heart J. 46 (31), 3069-3078 (2025).
  2. Giambartolomei, C., et al. Bayesian test for colocalisation between pairs of genetic association studies using summary statistics. PLoS Genet. 10 (5), e1004383(2014).
  3. Ferkingstad, E., et al. Large-scale integration of the plasma proteome with genetics and disease. Nat Genet. 53 (12), 1712-1721 (2021).
  4. Yang, M., et al. No evidence of a genetic causal relationship between ankylosing spondylitis and gut microbiota: A two-sample mendelian randomization study. Nutrients. 15 (4), 1057(2023).
  5. Lee, D. S., et al. Simultaneous profiling of 3D genome structure and DNA methylation in single human cells. Nat Methods. 16 (10), 999-1006 (2019).
  6. Martini, E., et al. Single-cell sequencing of mouse heart immune infiltrate in pressure overload-driven heart failure reveals extent of immune activation. Circulation. 140 (25), 2089-2107 (2019).
  7. van der Ende, M. Y., Said, M. A., van Veldhuisen, D. J., Verweij, N., van der Harst, P. Genome-wide studies of heart failure and endophenotypes: Lessons learned and future directions. Cardiovasc Res. 114 (9), 1209-1225 (2018).
  8. Inoue, S., et al. Drebrin-like (Dbnl) controls neuronal migration via regulating N-cadherin expression in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 39 (4), 678-691 (2019).
  9. Luo, X., et al. Chamber-enriched gene expression profiles in failing human hearts with reduced ejection fraction. Sci Rep. 11 (1), 11839(2021).
  10. Lingscheid, T., et al. Pharmacokinetics of nirmatrelvir and ritonavir in COVID-19 patients with end-stage renal disease on intermittent hemodialysis. Antimicrob Agents Chemother. 66 (11), e0122922(2022).
  11. Hatton, A. A., et al. Genetic control of DNA methylation is largely shared across European and East Asian populations. Nat Commun. 15 (1), 2713(2024).
  12. Bense, R. D., et al. Relevance of tumor-infiltrating immune cell composition and functionality for disease outcome in breast cancer. J Natl Cancer Inst. 109 (1), djw192(2017).
  13. Hu, C., et al. CellMarker 2.0: An updated database of manually curated cell markers in human/mouse and web tools based on scRNA-seq data. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D870-D876 (2023).
  14. Aran, D., et al. Reference-based analysis of lung single-cell sequencing reveals a transitional profibrotic macrophage. Nat Immunol. 20 (2), 163-172 (2019).
  15. Zhang, Y., et al. CellCall: integrating paired ligand-receptor and transcription factor activities for cell-cell communication. Nucleic Acids Res. 49 (15), 8520-8534 (2021).
  16. Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nat Biotechnol. 32 (4), 381-386 (2014).
  17. Abramson, J., et al. Accurate structure prediction of biomolecular interactions with AlphaFold 3. Nature. 630 (8016), 493-500 (2024).
  18. Morris, G. M., et al. AutoDock4 and AutoDockTools4: Automated docking with selective receptor flexibility. J Comput Chem. 30 (16), 2785-2791 (2009).
  19. Trott, O., Olson, A. J. AutoDock Vina: Improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. J Comput Chem. 31 (2), 455-461 (2010).
  20. Abraham, M. J., et al. GROMACS: High performance molecular simulations through multi-level parallelism from laptops to supercomputers. SoftwareX. 1, 19-25 (2015).
  21. Hornak, V., Abel, R., Okur, A., Strockbine, B., Roitberg, A., Simmerling, C. Comparison of multiple Amber force fields and development of improved protein backbone parameters. Proteins. 65 (3), 712-725 (2006).
  22. Zahn, D., Schilling, B., Kast, S. M. Enhancement of the wolf damped coulomb potential: Static, dynamic, and dielectric properties of liquid water from molecular simulation. J Phys Chem B. 106 (41), 10725-10732 (2002).
  23. Valdés-Tresanco, M. S., Valdés-Tresanco, M. E., Valiente, P. A., Moreno, E. gmx_MMPBSA: A new tool to perform end-state free energy calculations with GROMACS. J Chem Theory Comput. 17 (10), 6281-6291 (2021).
  24. Davis, A. P., Wiegers, T. C., Johnson, R. J., Sciaky, D., Wiegers, J., Mattingly, C. J. Comparative toxicogenomics database (CTD): Update 2023. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D1257-D1262 (2023).
  25. Stiber, J. A., et al. The actin-binding protein drebrin inhibits neointimal hyperplasia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (5), 984-993 (2016).
  26. Liu, N., et al. HIP-55/DBNL-dependent regulation of adrenergic receptor mediates the ERK1/2 proliferative pathway. Mol Biosyst. 10 (7), 1932-1939 (2014).
  27. Bai, Y., et al. Identification of drug targets for Sjögren's syndrome: Multi-omics Mendelian randomization and colocalization analyses. Front Immunol. 15, 1419363(2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

DBNL Reg lasyonuTek H cre RNA DizilemeMendelyen RandomizasyonMultiomik AnalizKardiyak MakrofajlarTerap tik HedeflerIL 6 JAK STAT3PI3K AKT mTOR
Video yakında
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.