Method Article

Yoğun Nükleer Ortamda Kromatinin Araştırılması İçin Çok Etiketli Tek Molekül Lokalizasyon Mikroskopi Protokolü

DOI:

10.3791/69868

⸱

June 5th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 2Center for Physical Genomics and Engineering, Northwestern University, 3Department of Gastroenterology and Hepatology, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uzaysal analiz için euchromatin, heterokromatin ve RNAP II'nin tekrarlanabilir haritalanmasını sağlayan üç renkli kromatin tek molekül lokalizasyon mikroskopisi (SMLM) boyama ve analiz protokolü sunuyoruz. Bu protokol, kromatinle ilişkili hedefler dahil olmak üzere yoğun nükleer ortamlarda verimli çok renkli etiketleme sağlar ve güvenilir eşzamanlı tespiti sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Süper çözünürlüklü mikroskopi, biyolojik yapıları kırınım sınırının ötesine sorgulama yeteneğimizi dramatik şekilde geliştirmiş ve kromatin, nükleer lamina ve nükleoller gibi yoğun toplanmış nükleer yapıları incelemek için vazgeçilmez hale getirmiştir. Kromatin, nanometre boyutlarındaki nükleozomlardan mikron ölçeğindeki alanlara kadar çok ölçekli organizasyon sergiler; bu da hem yüksek çözünürlük hem de moleküler özgülüye sahip görüntüleme yaklaşımlarını gerektirir. Tek molekül lokalizasyon mikroskopisi (SMLM), özellikle stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM), epigenetik işaretlerin hassas haritalanmasını sağlar ve kromatin yapısı ile fonksiyonu hakkında kritik bir bakış sunar. Ancak, nükleer ortamda çoklu etiketli görüntüleme, antikor erişiminin azalması, artan spesifik olmayan bağlanma ve florofor kararsızlığı gibi benzersiz zorluklar sunar. Bu sorunları ele almak için, yüksek yoğunluklu nükleer ortamlar için optimize edilmiş ardışık bir immünoetiketleme protokolü sunuyoruz; bu protokol, minimum çapraz salgılama ve daha az sinyal bozulması ile sağlam üç renkli SMLM sağlıyor. Bu yöntem, çoklu hedefler arasında tekrarlanabilir ve yüksek isabetli etiketleme sağlamak için optimize edilmiş tampon formülasyonları, florofor seçimi ve antikor doğrulama stratejilerini içerir. Önemli olarak, bu protokolü, tek bir moleküler hedeften gelen lokalizasyonları mekansal çapa (tohum noktaları) olarak kullanarak, hedeflerarası mesafeleri, yerel yoğunlukları ve çok etiketli ortak yakınlığı niceleyen hesaplamalı analiz boru hattıyla entegre ediyoruz. Bu, kromatin bileşenlerinin nano ölçekte detaylı bir mekansal analizini mümkün kılar. Bu protokol, yoğun hücrealtı ortamlarda çok bileşenli görüntüleme ve nicel analiz için tekrarlanabilir bir çerçeve olarak hizmet veriyor ve kromatin gibi karmaşık nükleer mimarileri araştıran araştırmacılar için güçlü bir araç sunuyor.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisinin (SMLM) ortaya çıkışı, nanometre ölçeğinde 1,2,3,4,5 biyolojik yapıların eşi benzeri görülmemiş bir şekilde keşfedilmesini mümkün kıldı. Tek hedef görüntülemenin ötesinde, çok renkli SMLM'ye genişletilme, birden fazla moleküler türün eşzamanlı görselleştirilmesine ve alt-kırınım yapıları arasındaki mekansal ve zamansalilişkilere olanak tanıyarak alanı daha da ilerletmiştir; 6,7,8,9,9,10,11 . Ancak, çok çaplı SMLM'nin bol dağılım histon modifikasyonlarına uygulanması, nükleer DNA'nın yoğun, polimerik yapısı ve bu ortamda antikorların sınırlı erişilebilirliği nedeniyle hâlâzordur 12,13,14,15,16,17,18.

Kromatin, nanometre ölçekli nükleozom montajlarından mikrometre ölçekli nükleer mimariye kadar uzanan hiyerarşik, çok ölçekli bir organizasyon sergiler. En büyük ölçeklerde, kromozomlar belirgin kromozom bölgelerinde bulunur; genom bu bölgelerde A/B bölmeleri ve topolojik olarak ilişkili alanlar (TAD) olarak bölünür; bu alanlar, döngü ekstrüzyonu gibi mekanizmalar aracılığıyla uzun vadeli düzenleyici etkileşimlerisınırlar. 200 nm altındaki ölçeklerde, kromatin ayrık euchromatin ve heterokromatin blokları yerine heterojen paketleme alanlarından (PD) oluşan düzensiz bir polimer olarak organize edilir; transkripsiyonel olarak aktif bölgeler tercihen PDsınırlarına (23,24,25,26,27,28,29) lokalize olur . En küçük ölçeklerde (5-20 nm), kromatin düzensiz nükleozom yapımları ve nükleozom kavramalarından oluşur; bu da tekdüz bir üst dereceden katlanma motifinin yokluğunu vurgular ve genom organizasyonunun ortaya çıkan, ölçeke bağlıdoğasını vurgular. Kromatin immünopresipitasyon dizileme ve yüksek verimli kromatin konformasyon yakalama 19,30,31,32,33 gibi dizileme tabanlı yaklaşımların hızla ilerlemesiyle birlikte, kromatin mezoscale organizasyonel yapılarının çeşitli özellikleri tanımlanmıştır 31,32. Ancak, görüntülemenin aksine, bu teknikler yalnızca bu yapılar çözüldükten sonra gözlemlenen mekânsal geometriyi yakalayamıyor. Kromatin elektron mikroskopisi (ChromEM24) ve kromatin taramalı geçirimli elektron mikroskobu (ChromSTEM25) gibi elektron mikroskopisi yöntemleri, kromatinin heterojen olduğunu ve 50-200 nm uzunluk ölçeklerindepaketleme alanlarına organize olduğunu ortaya koymuştur (25,28,29). Bu teknikler, kromatin paketleme alanlarını tanımlamak için etkileyici çözünürlük sağlamakla birlikte, SMLM'nin sunduğu moleküler olarak spesifik eşlemeleri sağlayamıyorlar. Nano ölçekli topografyada görüntüleme için DNA puanları birikimi (DNA-PAINT22) ve çoklu floresans in situ hibridizasyon (FISH)19yüksek çoklamaya olanak tanır; ancak DNA-BOYA, oligonukleotid açısından zengin nükleer ortamda rastgele bağlanma olaylarından kaynaklanan yüksek arka plan gürültüsündengüçlü şekilde etkilenirken, geleneksel ısı denatürasyonu temelli FISH yöntemleri doğal kromatin katlanmasının bozulmasını gerektirir. Önceki çalışmalar, bu uzunluk ölçeğinde kromatini incelemek için süper çözünürlüklü görüntüleme teknikleri kullanmış ve önceki faz ayrımmodelleri 12,23,34,35'e karşı oluşan bir paketleme alanlarının hibrit bileşimi tespit etmiştir. Bu protokol, bu bulguların biyolojik önemini tartışan daha önce yayımlanmış bir makaledenkaynaklanmaktadır 34. Bu nedenle, yüksek çözünürlük ve çoklu çevrim yetenekleri sayesinde, immünboyama tabanlı dSTORM, neredeyse doğal koşullarda çok renkli kromatin görüntüleme için en uygulanabilir strateji olmaya devam etmektedir.

Bu protokol, ikiden fazla nükleer hedefin etiketlenmesini gösteren ilk protokol değildir; önceki çalışmalar bireysel protein komplekslerini veyagenleri 12,36 olarak etiketlemiştir. Nükleozom post-translasyonel histon modifikasyonlarının başarılı etiketlenmesine rağmen, çok renkli kromatin SMLM etiketleme, görüntüleme ve analiz önemli zorluklar yaratmaktadır. İlk olarak, yoğun kromatin ortamında immünboyama, aşırı arka plan olmadan yeterli penetrasyon ve bağlanma sağlamak için antikor konsantrasyonu, kuluçka dizisi ve tampon bileşiminin optimize edilmesini gerektirir. İkincisi, euchromatin, heterokromatin ve RNA polimeraz gibi enzimler arasındaki etkileşimlerin basit ikili dışlamaların ötesine geçmesi nedeniyle birden fazla etiketin kapsamlı analizi gereklidir. Şu ana kadar, kromatin dSTORM görüntülemesinde gösterilen maksimum renk sayısı iki 18,37,38,39 olarak kalmıştır.

Burada, üç renkli kromatin SMLM görüntüleme ve analizi için sağlam bir protokol sunuyoruz. Boyama iş akışımız, antikor kuluçka süresini optimize eder ve çoklu etiketler için uzun süreli görüntüleme seansları için geliştirilmişgörüntüleme tamponları 40kullanır. İki renkli mesafe analizi ve üç renkli eklem yoğunluğu analizi için hesaplamalı boru hatlarını daha ayrıntılı olarak tanımlıyoruz; böylece heterokromatin, euchromatin ve transkripsiyon makineleri arasındaki ilişkilerin nicel karakterizasyonunu mümkün kılıyoruz. Heterokromatin ve euchromatinin ayrılmasını öneren önceki iki renkli kromatin SMLM çalışmalarının aksine, üç renkli kromatin görüntülemesi genomun paketleme alanlarına düzenlendiğini, euchromatin ve aktif transkripsiyonun oluşturucu heterokromatin çekirdeklerinin çevresinde lokalize olduğunuortaya koymaktadır 34.

Bu protokol, topluluğa çok renkli kromatin SMLM gerçekleştirmek için tekrarlanabilir bir çerçeve sağlar ve birden fazla fonksiyonel olarak bağlanmış nükleer hedef için uygun analiz stratejileri oluşturur. Metodolojik boşlukları kapatarak, kromatin alan organizasyonunun supra-nükleozomal düzeyde sistematik olarak keşfedilmesini mümkün kılarak, dizileme ve elektron mikroskopi yaklaşımlarını tamamlarken doğal nükleer mimariyi korur. Bu makale, yayımlanmış birmakalenin genişletilmiş protokolüdür 34.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Sonraki protokol bölümü, aşağıda belirtilen boyama süreci ve satın alma süreci olarak ayrılacaktır. Veri analiz eğitimleri için, etiketli histon modifikasyonları için çoklu etiket analizini detaylandıran ilgiliyayın 34'e lütfen bakınız.

1. Boyama süreci:

NOT: Protokol boyunca 35 mm çanaklar veya 8 iyi hazırlanmış tabak bahsedilmektedir. Grubumuzun hücre kültürü için kullandığı kaplar bunlardır, ancak daha küçük ve verimli yöntemler mümkün olsa da. Alternatif malzemeler kullanılırsa, tampon antikorları için önerilen konsantrasyonların korunduğundan emin olun. Bu protokolün ardışık yapısı nedeniyle, antikor seçimi başarılı etiketleme için önemlidir. Hedeflerimiz için konak antikorlarımızın farklı olmasını sağlamak için standart mantık kullanıyoruz; böylece ikincil antikorlarımız farklı konak türleri hedef alarak hedef dışı etkileri etkili bir şekilde en aza indirebilir. Etiketleme sırası, çekirdek içindeki hedef konumuna göre belirlenir. Kromatin paketlemealanları 25,28,34,35'i hedeflediğimiz ve bunun difüzyon odaklı bir süreç olduğunu anladığımız için, yoğun heterokromatik bölgelerde sterik dışlanmayı en aza indirmek için önce heterokromatik hedefleri, ardından euchromatin ve son olarak RNAPII ile etiketleriz. Protokolün geliştirilmesi sırasında tamponların optimizasyonu ampirik olarak gerçekleştirilmiştir. İlk hedeften sonra keçi serumunun dahil edilmesinin, sonraki adımlarda hedef dışı etkileri azaltmaya yardımcı olduğunu bulduk.

  1. Tampon hazırlığı
    1. Tampon bileşenleri:
      NOT: Depolama ve hazırlık süreleri dahil olmak üzere bileşenler hakkında daha fazla bilgi için lütfen Malzeme Tablosu'na bakınız. Deneysel hatalardan kaçınmak için kullanıcının protokole başlamadan önce tüm çözümlerin hazır olmasını öneriyoruz. Söndürme çözümü en son yapılmalıdır.
    2. Engelleme tamponu yapın
    3. Deney için gereken tampon hacmindeki nihai konsantrasyon %3 olacak şekilde sığır serum albümini (BSA) tartın ve santrifüj tüpüne ekleyin. Tüpü 45° açıya eğin ki BSA kristalleri tüpte yayılsın, ardından fosfat tamponlu tuzlu (PBS) ekleyin. Bu, çözünmeyen kristal kümelerinin oluşmasını önlemek için yapılır.
    4. Tüm kristaller çözünene kadar tüpü oda sıcaklığında bırakın. Tüp veya girdap sallamayın - bu, baloncuk oluşumuna neden olur, bu da proteinleri yüzeye çeker ve BSA'nın tamamen çözülmesini engeller.
    5. Tamamen çözündükten sonra, Triton X-100 eklenerek nihai konsantrasyonu %0.2 (v/v) olur ve 1.3. adımda seçilen hacme göre yapılır. Kristaller tamamen çözünmemişse, çözeltiyi yavaşça karıştırmak için birkaç kez yukarı aşağı pipet yapın, böylece kabarcık oluşmadan.
      NOT: Modifiye tampon yapıyorsanız, bu sürece %10 keçi serumunu ekleyin. Ancak, modifiye bloklama tamponları kullanım sırasında taze yapılmalı ve uzun süre saklanmamalı, ancak nihai konsantrasyonların malzeme tablosunda belirtildiği gibi olduğundan emin olunmalıdır - %3 BSA, %0,2 Triton X-100.
    6. Yıkama tamponu yapın:
      1.1.2'de tampon engelleme adımlarını tekrarlayın, ancak kolaylığınız için malzeme bölümünde ve burada listelenen konsantrasyonları kullanın (%0,2 BSA, %0,1 Triton X-100 1X -DPBS'de ve modifiye %1 keçi serumu için)
    7. Sabit çözüm oluşturun:
      1. PBS'yi santrifüj tüpüne ekleyin.
      2. Santrifüj tüpüne uygun miktarda %16 paraformaldehit ekleyin ve nihai konsantrasyon %4 olur.
        NOT: Hücreleri kuluçka makinesinden çıkarırken taze ve hazır hazırlanın. Mevcut fiksatif çözelti genellikle glutaraldehit kullanmasa da, paraformaldehit ile karşılaştırıldığında daha sağlam fiksasyon ve daha uzun ömürlü fiksasyon nedeniyle dahil edilebilir ve faydalı olabilir. dSTORM kurulumu, glutaraldehitten (GA) gelen floresans ömür boyu sinyalleri için yeteneklere sahip değildir, ancak bu yeteneği olan kullanıcılar florofor etiketli yapılardan ayırmak için faydalı olabilir.
    8. Söndürme çözümü yapın:
      1. Sodyum borohidridi tartma kağıdına tartın.
      2. Santrifüj tüpünü hazırlayın.
      3. Tüpe Sodyum borohidrid ekleyin.
      4. PBS'i tüpe ekleyin.
        NOT: PBS eklendikten sonra çözelti baloncuklar olmalı.
    9. Görüntüleme tamponu oluşturun:
      1. 1,4-Diazabisikleoktan (DABCO) deyonize RNASE, DNAZ içermeyen suda çözünerek 1 M konsantrasyonda 13 mL DABCO çözeltisi oluşturulur.
      2. DABCO tamamen çözünene ve pH 8.0'a ulaşana kadar 12 M HCl (~240 μL) ekleyin.
      3. 1 M Sodyum Sülfit'i 10X PBS içinde çözünerek hazırlayın. DTT için herhangi bir hazırlık gerekmez.
      4. Son hazırlık için, önceki stokları kullanarak 30 mM Sodyum Sülfit ve 30 mM DTT (1 M stok) ile deiyonize suda 65 mM DABCO yapılabilir.
      5. HH'ı HCl ve NaOH ile titrasyon yoluyla ayarlayın ve pH 8.0'a kadar yapın. Depo, 4°C sıcaklıkta 2 aydan fazla olmayan şekilde kaplı ve mühürlenmiş olarak kapalı ve mühürlenmiştir. Kullanım boyunca pH'ı takip edin.
  2. İlk etiket boyama süreci detayları:
    1. Takıntı:
      1. Kuluçka makinesinden canlı hücreleri alın ve hücre kültür ortamını tabaktan çıkarın. Hücre kültür ortamını biyotehlike atık konteynerine atın.
      2. Hücreleri kaplayacak kadar PBS ekleyin (35 mm çanak için 1 mL ve bir cam cam slayt için 500 μL).
      3. Tabağı nazikçe karıştırarak hücreleri PBS ile yıkayın, sonra PBS'yi tabaktan çıkarın. PBS'yi biyolojik tehlike içeren bir atık konteynerine atın.
      4. Hücreleri kapatacak kadar fiksatif çözelti ekleyin (35 mm çanak için 1 mL ve bir cam cam slaytı için 500 μL), sonra hücreleri 10 dakika sabitlemeye bırakın.
      5. Hücreler sabitlenirken, soğutma çözeltisi için sodyum borohidriti tartın ve santrifüj tüpüne ekleyin.
      6. Fiksatif çözeltiyi tabaktan çıkarın ve uygun etiketlenmiş sıvı kimyasal atık konteynerine atın.
    2. Söndürme
      1. Kabın yüzeyini kaplayacak kadar PBS ekleyin (35 mm çanak için 1 mL ve cam slayt için 500 μL), sonra tabağı bir silkeleyiciye koyun (standart herhangi bir çalkalayıcı uygundur) ve hücreleri yıkamak için 5 dakika kullanın.
      2. Kabı shaker'dan çıkarın, PBS'yi çıkarın ve uygun etiketli sıvı kimyasal atık konteynerine atın.
      3. Kabın yüzeyini kaplamak için yeterince (250 μL, 8 kuyu çanak) söndürme çözeltisi ekleyin (35 mm bir tabak için 1 mL ve bir cam slayt için 500 μL), ardından hücrelerdeki otofloresansı söndürmek için kabı 7 dakika boyunca bir shaker üzerine koyun.
      4. Hücreler silkeleyicideyken, kalan söndürme çözeltisini uygun şekilde etiketlenmiş sıvı kimyasal atık konteynerinde santrifüj tüpündeki atabilirsiniz.
      5. Kabı shaker'dan çıkarın, söndürme çözeltisini çıkarın ve uygun etiketlenmiş sıvı kimyasal atık konteynerine atın.
      6. Kabın yüzeyini kaplamak için yeterince (250 μL, 8 kuyu çanak) PBS ekleyin (35 mm çanağı için 1 mL ve cam slaytı için 500 μL), ardından hücreleri yıkamak için kabı 5 dakika boyunca bir silkeleyiciye koyun.
      7. Kabı shaker'dan çıkarın, PBS'yi çıkarın ve uygun etiketli sıvı kimyasal atık konteynerine atın.
      8. 1.2.2.6 ve 1.2.2.7 adımlarını iki kez daha tekrarlayın (toplamda 3 PBS yıkaması olur).
    3. Bloklama
      1. Çanakta yüzeyi kaplamak için yeterli bloklama tamponu ekleyin (250 μL, 8 kuyu çanak, 35 mm çanak için 1 mL ve odalı cam sürgü için 500 μL).
      2. Kabı en az 1 saat boyunca bir çalkalayıcıya koyarak hücre zarlarını geçirebilir ve bağlanma noktalarını bloklayın (belirsiz bölgeleri işgal edin ki hedef alanlara müdahale etmesin). (Başarılı bloklama süresinin 20 dakika olduğunu belirlemek için çeşitli testler yapmış olsak da, en az 1 saat veya daha uzun bir süre ve gece boyunca bloklamayı şiddetle tavsiye ederiz. Hedef ve hücre hattı göz önüne alındığında optimizasyon gerekebilir.)
      3. Hücreler çalkalayıcıdayken, birincil antikor boyama çözeltisi hazırlayın (satıcı web sitesindeki önerilen konsantrasyona bakınız veya malzemeler bölümündeki tabloya bakınız).
      4. Yapılacak boyama çözeltilerinin toplam hacmini belirlemek için, hücreleri kapatmak için gereken hacme 0,5 mL ekleyin (örneğin bir 35 mm tabak için 1,5 mL bir çözelti hazırlayın).
      5. 1.2.3.1 bölümünde belirlenen hacmi bloklama tampon stokundan çıkarın ve bu hacmi boyama çözeltisini hazırlamak için yeni bir santrifüj tüpüne ekleyin.
      6. Doğru nihai konsantrasyonu elde etmek için bloklama tamponu içine uygun miktarda birincil antikor stoku ekleyin. Sıkça kullanılan birkaç antikor için birincil antikor stok hacimleri malzemeler bölümünde bulunabilir.
      7. Kabı shaker'dan çıkarın, engelleyici tamponu çıkarın ve uygun etiketlenmiş sıvı kimyasal atık konteynerine atın.
    4. Birincil antikor boyama:
      1. Kabın yüzeyini kaplayacak kadar birincil antikor boyama çözeltisi ekleyin (35 mm çanak için 1 mL ve cam cam slayt için 500 μL), ardından hücresel hedefleri etiketlemek için kabı en az 1-2 saat ve gece boyunca bir çalkalayıcıya koyun.
      2. Kabı shaker'dan çıkarın, birincil antikor boyama çözeltisini çıkarın ve uygun etiketlenmiş sıvı kimyasal atık konteynerine atın.
      3. Kabın yüzeyini kaplamak için yeterince yıkama tamponu ekleyin (35 mm bir tabak için 1 mL ve bir cam cam slayt için 500 μL), ardından hücreleri yıkamak için kabı 5 dakika boyunca bir silkeleyiciye koyun.
      4. Kabı shaker'dan çıkarın, yıkama tamponunu çıkarın ve uygun etiketlenmiş sıvı kimyasal atık konteynerine atın.
      5. 1.2.4.3 ve 1.2.4.4 adımlarını iki kez daha tekrarlayın (toplamda 3 yıkama tampon yıkama için).
      6. Son yıkamada hücreler shaker'dayken, ikincil antikor boyama çözeltisi hazırlayın (satıcı web sitesindeki önerilen konsantrasyona bakınız veya önceki deneylere bakınız).
      7. Yapılacak boyama çözeltilerinin toplam hacmini belirlemek için, hücreleri kapatmak için gereken hacme 0,5 mL ekleyin (örneğin bir 35 mm tabak için 1,5 mL bir çözelti hazırlayın).
      8. 1.2.4.7 bölümünde belirlenen hacmi bloklama tamponundan çıkarır ve bu hacmi boyama çözeltisini hazırlamak için yeni bir santrifüj tüpüne eklenir.
      9. Doğru nihai konsantrasyonu elde etmek için bloklama tampponuna uygun miktarda ikincil antikor stoku ekleyin. Sıkça kullanılan birkaç antikor için ikincil antikor stok hacimleri materyal tablosunda bulunabilir.
      10. Santrifüj tüpünü ikincil antikor boyama çözeltisi ile alüminyum folyoyla sarın, ta ki tabak hücrelerine eklemeye hazır olana kadar.
    5. İkincil antikor boyama:
      1. Kabın yüzeyini kaplayacak kadar ikincil antikor boyama çözeltisi ekleyin (35 mm çanak için 1 mL ve cam cam slayt için 500 μL), ardından kapı en az 40 dakika boyunca bir çalkalayıcıya koyarak etiketlenmiş hücresel hedeflere floroforlar ekleyin.
      2. Florofor ağartmasını önlemek için tabağın alüminyum folyo ile kaplı olduğundan emin olun.
      3. Kabı shaker'dan çıkarın, ikincil antikor boyama çözeltisini çıkarın ve uygun etiketlenmiş sıvı kimyasal atık konteynerine atın.
      4. Kabın yüzeyini kaplayacak kadar PBS ekleyin (35 mm çanak için 1 mL ve cam cam slayt için 500 μL), ardından hücreleri yıkamak için kabı 5 dakika boyunca bir shaker üzerinde koyun.
      5. Kabı shaker'dan çıkarın, PBS'yi çıkarın ve uygun etiketli sıvı kimyasal atık konteynerine atın.
      6. 1.2.5.4 ve 1.2.5.5 bölümlerini bir kez daha tekrarlayın (toplamda 2 PBS yıkaması olur).
      7. Hücreler artık görüntülenebilir veya daha sonra görüntüleme için depolanabilir. Hemen görüntüleme yaparsanız, Satın alma bölümündeki adımları izleyin. Daha sonra görüntüleme için depolayacaksanız, aşağıdaki adımları takip etmeye devam edin.
      8. Depoya yüzeyi kaplayacak kadar PBS ekleyin (35 mm çanak için 1 mL ve cam cam slaytı için 500 μL) depo öncesi.
      9. Tabağı parafilmle, ardından hem sıvı buharlaşmanı hem de florofor ağartmasını önlemek için alüminyum folyo ile sar.
      10. Paketlenmiş kabı 4°C'de saklamaya hazır olana kadar sakla.
        NOT: Bu protokolde kullanılan etiketler için, kablar görüntü kalitesinin önemli ölçüde etkilenmesinden önce 2-3 gün saklanabilir; Ancak, farklı antikorlar farklı stabilitelere sahip olabilir ancak uygun depolama ile protokol tamamlandıktan sonra bir süre stabil kalır. Etiketlenmiş bir yemeğin bir haftadan uzun süre saklanması önerilmez çünkü fiksasyon çözeltisi uzun vadeli stabilite için yeterince yoğun değildir.
  3. Sonraki etiket boyama süreci:
    1. Engelleme:
      1. 1.2.3.1 - 1.2.3.2 bölümlerine bakın ancak keçi serumu ile bloklama tamponu kullanın. Bloklama için kuluçka süresi 1 saat kadar kısa olabilir, ancak bu sonraki etiketler için üst sınır olarak gece boyunca (18-24 saat) daha uzun süreler öneriyoruz, böylece hedef dışı bağlanmayı azaltıyoruz. Lütfen önceki deneylere bakınız.
      2. Bu arada, bloklama tamponu yerine primer antikor çözeltileri için keçi serumu ile bloklama tamponu hazırlayın.
    2. Birincil antikor boyama:
      1. Değiştirilmiş bloklama tamponu ve yıkama tamponunu keçi serumu ile hazırlayın, yıkama tamponu ise keçi serumu ile tampon hazırlayın, tampon hazırlama bölümünde detaylandırıldığı gibi.
      2. Değiştirilmiş bloklama ve yıkama tamponlarını kullanarak 1.2.3-1.2.4 (Bloklama ve birincil antikor boyama) bölümlerine bakınız:
        NOT: Birincil antikorların kuluçka süresi 1 saat kadar kısa ve gece boyunca (8-24 saat) kadar uzun olabilir. En iyi etiketleme performansı, özellikle çoklu etiket için daha uzun kuluçka süreleriyle elde edilmiştir. Bu protokoldeki veriler gece boyunca kuluçka aşamalarıyla hazırlanmıştır.
      3. Kuluçka süresi bitmeden kısa bir süre önce, modifiye bloklama tamponu 1.1.3'te ikincil antikor çözeltileri hazırlanın.
    3. İkincil antikor boyama:
      1. Bölüm 1.2.5'e (İkincil antikor boyama) bakınız ancak keçi serumu ile bloklayıcı tampon kullanın.
        NOT: Kuluçka süresinin 1 saat kadar kısa olabileceğini lütfen unutmayın, ancak benzer performansla daha uzun süreleri (2-4 saat) test ettik. Sonraki etiketler için lütfen bölüm 1.3'ü tekrarlayın.

2. Satın alma süreci

NOT: Veri toplama için, kullanılan mikroskopla uyumlu Nikon Görüntüleme Yazılımı (NIS) eleman yazılımını kullanın. Filtre, ışık yolu ve kamera ayarlarını kontrol edebilen herhangi bir yazılım bu protokol için uygundur. Aşağıdaki görüntüleme protokolü, örneğin Toplam İç Yansıtma Flüoresansı (TIRF) aydınlatması için uyarlanmıştır; ancak etiketleme protokolü birden fazla görüntüleme biçimiyle uyumludur. STORM için bu etiketleme protokolüyle TIRF dışı görüntüleme mümkündür ve 3D STORM uygulamaları için gereklidir. Alternatif görüntüleme yöntemleri için lütfen standart bir protokol kullanın.

  1. Sonraki etiket boyama süreci:
    1. Gerekli optik bileşenleri açın ve uygun yazılımla bağlantı kurun. Çoğu durumda, örneğin NIS'te olduğu gibi, yazılım bilgisayar mikroskop, kamera ve sahne kontrolüyle doğru iletişim kuramadıkça tam olarak başlatılmaz.
    2. Open NIS Software (veya eşdeğeri).
    3. Canlı görüntü kur: Canlı görünümü açın >kamera ayarlarında otomatik ölçeklendirmeyi > tutun ve pozlama süresini 30 ms'e ayarlayın.
    4. Satın almalar için veri yolu oluşturun.
    5. Üst panele geçin Edinin> Hızlı Zaman Geçişi> Yol
    6. İlk edinim için doğru dosya adını seçin ve kare sayısını 10.000 olarak belirleyin.
      NOT: Bu adımlar, görüntüleme başladıktan sonra numunenin ışık kaynağına maruz kalma süresini sınırlamak için atılır.
    7. TIRF'in kritik açısının ve sıfır açısının alınmadan önce önceden ayarlandığından emin olun. Bunu nasıl başaracağınıza dair çevrimiçi kaynaklara bakınız. Daha önce belirtildiği gibi, TIRF aydınlatması kullanmazsanız bu adım atlanabilir.
    8. Kamera için uygun ışık yolunu seçin ve Lamps altında (NIS veya eşdeğer yazılımda) Epi Aydınlatma seçeneğini açın, böylece aynanın lazer dışı standart ışık kaynağından geniş alan aydınlatmasına ayarlandığından emin olun.
  2. Örnek hazırlığı:
    1. Örnekleri alın ve numuneye görüntüleme tamponu (bölüm 1.1 Buffer Hazırlanması'nda tanımlanan formülasyon) ekleyin. (Kullanılan görüntüleme tamponuna bağlı olarak, farklı önlem önlemleri alınması gerekebilir. Örnekleri ışıktan koruyun.)
    2. Objektîfe yağ ekledikten sonra, örneği doğru tutucuyla sahneye koyun ve Mükemmel Odak'ı açın, ardından numuneye odaklanın.
  3. Görüntüleme adımları:
    1. Lazer noktasını bul ve tabak üzerinde hücre olmayan bir noktaya git.
    2. TIRF aydınlatmasını aç.
    3. Filtreyi uygun filtreyle eşleştirerek kırmızı (veya bu özel örnek için veri elde eden lazeri ile) geçirin.
      NOT: Malzemeler tablosunda tarif edildiği gibi çok deşikli bir filtre kullanın. Çok çentikli filtre gerekli değildir ve kullanıcılar, boyamada kullanılan floroforlar için tasarlanmış ayırt edici olmayan filtre küpleri de görüntüleme yapabilirler.
    4. Lazeri en düşük lazer gücünde ~ 1 mW çalıştırın (bu aydınlatma kaynağına bağlıdır ama kazara ağartmayı önlemek için yapılır) ve ayna açısını kritik açıya ayarlayın.
    5. Yakında hücre yoksa, lazer noktası canlı görüntüde net görünene kadar lazer gücünü artırın.
    6. İlgi Bölgesi (ROI) aracını kullanın, lazer noktasının bulunduğu ROI'yi çizin, ayarlayın ve kaydedin.
      NOT: Çok etiketli örnekler için, lütfen örnek için gerekli tüm ışık kaynaklarının lazer noktalarının hizalandığından emin olun. Bu protokolde üç lazer kullanıyoruz ve tüm noktaların hizalı olduğundan emin oluruz. Bu çok önemlidir çünkü mekânsal verilerin ortak kaydı lazer hizalanması gerektirir.
    7. Epi aydınlatmaya ve Parlak alan filtresine geri dönün.
    8. ROI tanım aracını kullanarak uygun sağlıklı bir hücre bulmak için gezinin (örneğin, uygun bir HCT116 hücresi yapışkan, çokgen veya oval şekile sahip ve net hücre sınırına sahip olmalıdır).
    9. ROI'yi çekirdeğe odalayın ve ROI konumuna yakınlaştırmak için OK tuşuna tıklayın (Hücrenin sağlığı çekirdeğin geniş alan floresan görüntülerinden doğrudan belirlenemediği için parlak alan aydınlatması ile gerçekleştirilin.
    10. 2.3.2'de kullanılan aynı yöntemle TIRF aydınlatmasına geri dön.
    11. En uzun dalga boyu etiketli hedef için uygun filtreyi seçin (çoğu durumda bu çok kırmızı olur, yani Alexa Fluor 647 etiketli hedef). Genellikle, en uzun dalga boyu önce seçilir, çünkü işaretlenmiş hedeflerde spektrumların örtüşmesi durumunda daha kısa dalga boylu foto-ağartma örnekleri kullanılır.
    12. Her lazaj için düşük lazer gücünde (çoklu etiketli durumda bu 3 lazer olur) lazeri açın ve örneğin doğru hizalandığından emin olmak için çekirdeği aydınlatın.
    13. Numunenin TIRF ile aydınlatıldığından emin olmak için TIRF kontrollerini kullanın.
    14. İhtiyaçlara göre satın alma için uygun Z-pozisyonunu seçin. Ancak, bu satın alma öncesinde ayarlanabilir.
    15. Set exposure time based on needs of the fluorophores (use anywhere between 10‬-30 ms).
    16. Hızlı Timelapse> Edin'e tıklayın.
    17. Çerçeveleri ≥10.000'e ayarlayın ve Apply seçeneğine tıklayarak dosyayı belirtilen dizinde oluşturun.
    18. Lazer gücünü %50'ye açın ve numuneyi foto-çamaşır suyu ile kullanın.
    19. Çekirdek başlangıçta ağartmalı ama kısa süre sonra (saniyeler sonra) yanıp sönmeye başlamalıdır.
    20. İstediğiniz kritik açıya ve Z-pozisyonuna geri dönün, kaydedilen pozisyonları değiştirerek veya ayna açısını ve Z-konumunu manuel olarak kontrol ederek hızlı zaman geçişi elde edin.
    21. Aşamada kayma olmadığından emin olun, aksi takdirde çok kanallı görüntülerin ortak kaydı doğru şekilde yapılmaz. Güven belirteçleri (floresan mikroboncuklar) kullanın veya Z-konumunu satın alma başında kaydedecek şekilde kaydedin, cihazda çok noktalı alım için konum kaydetme yöntemiyle kayma düzeltmesi için daha sonra kullanın.
    22. Filtreyi değiştirin (veya çok notlu ve gerekli florofor için geçiş bandı kullanıyorsanız bırakın) ve 2.3.17-2.3.20 bölümlerini tekrarlayın (Sonraki etiketler için her zaman düşük lazer gücünde başladığınızdan emin olun, parametreleri ayarlayın ve edinin).
  4. Veri işleme:
    1. Bio-Formats eklentisini kullanarak ham görüntü yığınını FIJI'ye yükleyin. Image> Stacks> Z Project seçerek minimum yoğunluklu projeksiyon oluşturun ve projeksiyon türü olarak Minimum yoğunluk seçin. Bu minimum projeksiyonu ham görüntü yığınından Process > Image Calculator ile çıkarın. Ortaya çıkan görüntüde, arka plan çıkarma işlemi (Süreç > Arka Plan Çıkarma) 5 piksel yuvarlanan top yarıçapıyla gerçekleştirilir.
    2. Bireysel hücreler için ilgi alanını (ROI) manuel olarak veya Nuclei Outline eklentisi (Eklentiler > GDSC > Cells > Nuclei Outline) ile tanımlayın.
    3. Tanımlanmış yatırım getirisi içinde önceden işlenmiş görüntü yığınında ThunderSTORM eklentisini (Eklentiler > ThunderSTORM > Çalıştır analizi) kullanarak yerelleştirme analizi yapılabilir. Sağlam lokalizasyon için uygun parametreler kullanın (örneğin, görüntü filtresi: B-spline, düzen = 3, ölçek = 2; tepe yoğunluk eşiği = 1,5× std (Wave.F1); alt piksel lokalizasyon yöntemi: Gaussian, sigma = 2; uyum yarıçapı = 4; uyum yöntemi: maksimum olasılık). Ortaya çıkan koordinatlar, süper çözünürlüklü görüntünün yeniden oluşturulması için kullanılabilir.
    4. Çok kanallı deneyler için, birleşik kromatin rekonstrüksiyonlu dSTORM görüntüsü oluşturmak üzere kanalları birleştirin (Görsel > Color > Merge Channels).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Temsil eden üç renkli kromatin dSTORM görüntüleri

Önerilen ardışık boyama protokolü, BJ fibroblast, HCT116, AC16, HeLa, MCF10A gibi çeşitli hücre hatları için geçerli olarak test edilmiştir. Şekil 1 , BJ fibroblast, HeLa ve MCF10A hücrelerinden temsil eden görüntüleri göstermektedir.

Simüle edilmiş veri setleri kullanılarak analiz boru hattının doğrulanması

Üç renkli bir immünofloresan protokolünün geliştirilmesi, çok hedefli nükleer SMLM verilerinin karmaşıklığını yönetebilen özel bir hesaplama yaklaşımının oluşturulmasını gerektirmiştir (Şekil 2A,2 B). Birden fazla hedefin yakın arada bulunduğu yoğun kromatin ortamı göz önüne alındığında, yeniden oluşturulmuş görüntüler yerine yerelleştirme koordinatlarını doğrudan işleyen bir nokta-bulut analiz çerçevesi uyguladık. Bu yaklaşım, nokta-bulut verileri için mevcut olan kapsamlı kümeleme analizaraçlarından yararlanır (40,41,42). Kontrol edilen simüle veri setleri kullanarak biyolojik olarak anlamlı mekânsal desenleri ayırt etme yeteneğini sistematik olarak değerlendirdik. Farklı kromatin organizasyon senaryolarını temsil etmek için dört dağılım türü oluşturuldu: sıkı kümelenmiş modifikasyonlar için normal dağılım, dağılmış desenler için uniform dağılım, toroidal dağılım modelleme dışlama bölgeleri ve rastgele dağılım olarak organizasyonel kontrol (Şekil 2C). Bu simüle edilen desenler deneysel H3K9me3 verilerinden türetilen gerçek heterokromatin küme pozisyonlarına sabitlenmiş, gerçekçi nükleer mekansal kısıtlamalar korunmuştur. Bu analiz çerçevesi, SMLMverilerinde küme analizi için kullanılan birçok yöntemden biri olan DBSCAN kümeleme yöntemini (epsilon = 50 nm, minimum puan = 3) kullanır. Doğru kümeleme parametrelerini sağlamak için, kromatin paketlemealanları 34'ün tespiti için özel bir optimizasyon yöntemi daha önce tanımlamıştık. Lütfen bunu analizin ilk adımı olarak kullanıldığında, kullanıcıların hedeflerinin yapısı, ortamı ve işlevi üzerinden seçimi yönlendiren parametreleri optimize etmeleri gerektiğini unutmayın. Burada küme sınırları, konveks gövde hesaplamalarıyla belirlenir ve alan geometrisiyle ilgili varsayımlar ortadan kaldırılır. Doğrulamamız, tüm simüle edilen dağılım desenleri arasında ayırt edici mesafe histogram profilleri aracılığıyla net ayrım olduğunu gösterdi (Şekil 2D). Her mekânsal organizasyon tipi, heterokromatin centroidlerine göre lokalizasyonlar analiz edildiğinde karakteristik imzalar üretti. Ortak doluluk analizi, kontrollü mekansal ilişkilerle çift işaretleyici simülasyonları kullanılarak test edilmiştir (Şekil 2E). Mekânsal olarak ayrılmış işaretleyiciler (normal-toroidal konfigürasyon) beklendiği gibi minimum eklem yoğunluğu sağlamış ve düz dağılım profilleri elde edilmiştir (Şekil 2E). Örtüşen işaret desenleri (normal-rastgele konfigürasyon), referans noktalarından uzaklaştıkça eklem yoğunluğunun azalmasına yol açtı ve teorik tahminlerle eşleşti. Bu doğrulama sonuçları, çerçevemizin karmaşık çoklu hedefli veri setlerinde mekansal bağlantı ilişkilerini tespit etme ve niceliklendirme kapasitesini göstermektedir. Bu simüle edilmiş veri setlerinin nasıl oluşturulduğuna dair daha fazla bilgi için lütfen tam yayın34'e bakınız.

Kromatin organizasyon analizinden temsil eden sonuçlar

Biyolojik örneklerde doğrulanmış analiz yaklaşımımızın uygulanması, bu protokol sayesinde elde edilebilecek karakteristik mekansal organizasyon kalıplarını ortaya koymaktadır. H3K9me3, H3K27ac ve RNA Polimeraz II için üç renkli boyama prosedürümüzle işlenen HeLa hücrelerini kullanarak bu metodolojinin mümkün kıldığı analitik yetenekleri gösteriyoruz. H3K9me3 heterokromatin, önceki süper çözünürlüklü araştırmalar 23,28,35'te 200 nm ölçeğinde konsantrik kromatin organizasyonu için kanıtlar verilmiş olarak ideal referans sistemi olarak hizmet vermektedir. Analiz, heterokromatin domainlerinin DBSCAN tabanlı tanımlanmasıyla başlar; bunlar daha sonra etkili yarıçapa göre kategorize edilir: küçük alanlar (25-40 nm), orta alanlar (40-80 nm) ve büyük alanlar (80-253 nm). Bu boyut tabakalaşması, DNA paketleme alanı boyutlarındaki belgelenmiş heterojenliği açıklar; ortalama alanlar yaklaşık80 nm yarıçapta 25 büyüklüğündedir. Mesafe ölçümleri, proksimal euchromatin ve polimeraz sinyallerini yakalamak için 1,5x küme yarıçapı arama penceresi (Şekil 2B üst) kullanır (Şekil 3A,B).

Temsilci sonuçlar, hem H3K27ac hem de RNA Polimeraz II'nin tüm alan kategorilerinde heterokromatin sınırlarına yakın tutarlı şekilde lokalize olduğunu göstermektedir; bu, önceki çalışmalar 28,44 ve kromatin domainlerine göre transkripsiyon konumu modelleriyle uyumlu olarak28,44 ve kromatin domainlerine göre modeller olarak 23,35,45,46 ile örtüşmektedir. Nicel mesafe analizi, alan çevrelerine çok yakın ortalama konumları ortaya koyar: büyük alanlarda -1,0 nm mesafede H3K27ac ve sınırlardan 8,4 nm mesafede RNA Polimeraz II bulunurken, küçük alanlar küçük konumsal farklılıklarla karşılaştırılabilir çevresel ilişkiler gösterir. Bu ölçümler, aktif kromatin elementlerinin tamamen dışlanmamak yerine baskılayıcı ve izin veren domainler arasındaki arayüzde yoğunlaştığını gösterir. Ortak yoğunluk analizi, protokolün ortak etiketlenmiş hedefler arasındaki mekânsal bağlılığı ortaya çıkarma kapasitesini gösterir (Şekil 3C-F). Heterokromatin alanlarına ilişkin analiz, en yüksek eklem yoğunluğunun alan sınırlarının hemen dışında gerçekleştiğini (r/r₀> 1) göstermektedir; bu da periferik bölgelerde ayrıcalıklı H3K27ac-RNA Polimeraz II ko-lokalizasyonunu gösterir (Şekil 3G-I). Bu sonuçlar, bu boyama ve analiz hattının yoğun ortamlarda karmaşık mekansal ilişkilerin araştırılmasına nasıl yardımcı olabileceğini gösteriyor.

figure-results-1
Şekil 1: Kullanılan hücrelerin üç renkli fotoğrafı. (A) BJ fibroblast, (B) HeLa ve (C) MCF10A'nın üç renkli görüntüleri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Heterokromatin kümelerine göre hedeflerin mekânsal organizasyonu için nicel analiz çerçevesi. (A) Bu çalışmada kullanılan çok kanallı SMLM verileri için analiz boru hattı. (B) Tanımlanmış heterokromatin kümeleri için çevreye mesafe hesaplamalarının şematiği ve Ortak Affinite Sayımı yöntemi. Her iki yöntem de, heterokromatin küme yapısına göre iki hedefin düzenini niceliksel olarak belirlemek için kullanılır. (C) Hedef yapıların farklı biyolojik organizasyonlarını belirlemekiçin kullanılan 34 çalışmada kullanılan belirli heterokromatin kümeleri etrafında örnek scatter dağılımları (bir alan içinde kümelenmiş vs alan çevresinde kümelenmiş ve ilişkilendirilmemiş ve rastgele dağıtılmış). (D) Merkezi kümelenmiş, rastgele dağılım ve toroidsel dağılımlı için periferi histogramına olan mesafe ve (E) Simülasyon vakaları için Joint affinity eğrileri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Histon bölgeleri etrafındaki transkripsiyon belirteçlerinin nicel mekansal ilişkileri. (A) Çok etiketli HeLa hücrelerinin örnek biyolojik verileri için periferi histogramına mesafe sonuçları. Küçük (<40 nm), orta (40-80 nm) ve büyük (>120 nm) alanlar için RNAPII ve (B) H3K9me3 kümelerine göre H3K27ac. (C-E) Bir HeLa Hücrelerinin (H3K9me3, H3k27ac, RNAPII2-S2p) üç etiketli dSTORM görüntüsü için örnek görüntüler, tek bir alan için damarlı ve yakınlaştırılmış görüntü ile. (F) E'de görümlenen alan ölçülü (kırmızı) konveks gövde uyumu, analiz bölgesi gri renkte. (G) Veri setindeki orta boyutlu verilerdeki tüm alanlar için analiz ROI'sinde H3K27ac ve H3K27ac (H) ile RNAPII'ye göre RNAPII için affinite grafikleri. (I) Tüm orta boyutlu alanlar için analiz ROI'sinde RNAPII ve H3K27ac ortak yoğunluğu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu üç renkli SMLM protokolü, yoğun nükleer ortamda kromatin organizasyonunu araştırma yeteneğimizde önemli bir ilerlemeyi temsil etmektedir. Ardışık immünoflüoresans etiketleme yaklaşımı, analizin temelini nokta olarak lokalizasyon tahminleri kullanan nokta-bulut mekânsal analiziyle birleştiğinde, araştırmacılara daha önce geleneksel mikroskopi teknikleriyle tespit edilemez olan farklı kromatin modifikasyonları ile aktif transkripsiyon makineleri arasındaki nano ölçekli ilişkileri incelemek için güçlü bir araç sunar.

Protokolün ardışık boyama stratejisi, çoklu hedefli nükleer görüntülemenin temel zorluklarını ele alır. Sitoplazmik veya zarla ilişkili yapıların aksine, nükleer kromatin hedefleri çok yüksek yoğunlukta ve örtüşen mekansal alanlarda bulunur. Her etiketleme turundan sonra ikincil antikor konak türlerinden serumu dahil eden modifiye edilmiş bloklama yaklaşımımız, hedef özgüllüğünü korurken antikor çiftleri arasında çapraz reaktiviteyi etkili bir şekilde önler. 4°C'de gece boyunca kuluçkalar, nükleer hacmi boyunca tam antikor penetrasyonunu sağlar; bu, nicel SMLM analizi için gerekli olan eşit etiketleme yoğunluğunun sağlanması için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, birden fazla hücre hattı boyunca 15-20 nm çözünürlüklü görüntüler güvenilir şekilde üretir ve kromatin organizasyon çalışmaları için geniş çapta uygulanabilirdir.

Görüntüleme seansı için sorun giderme ipuçları aşağıda verilmiştir. Çekirdekler ağartmazsa, en olası neden numunede yeterli lazer yoğunluğu olmamasıdır; bu da düşük güç ayarından veya yanlış TIRF açısından kaynaklanabilir; bu durumda, lazer hizasını kontrol ederek, lazer gücünü artırarak ve TIRF açısını dikkatlice ayarlayarak sorun giderir. Çekirdekte göz kırpmalar çok azdırsa ama sürekli parlak kalırsa, bu çekirdeklerin yeterince ağartmadığını gösterir. Eğer kırpmalar çok seyrekse ve çekirdekler hiç görünmüyorsa, en olası açıklama başarısız boyamadır ve protokol tekrarlanmadan önce reaktifler ile antikorlar kontrol edilmelidir. Buna karşılık, nükleer göz kırpma sayısı çok yüksekse (arzu edilen bir sonuç), bireysel ve iyi ayrılmış tek moleküllü göz kırpmaların görsel olarak çözülebilmesi için daha uzun bir ağartma süresi gerekir. Geleneksel SMLM deneylerinde, uygun etiketleme yoğunluğu genellikle mikrotubullar gibi iyi tanımlanmış referans yapılar kullanılarak tahmin edilebilir; ancak kromatin oldukça heterojen bir organizasyon sergiler ve iyi tanımlanmış bir yer-gerçeklik yapısına sahip değildir, bu da bu tahmini daha zor hale getirir. Ampirik optimizasyon ve önceki deneyimlere dayanarak, etkili etiketleme yoğunluğunun μm² başına yaklaşık 100 lokalizasyona ulaşmasını sağlayarak kromatin paketleme alanlarının sağlam yeniden inşası sağlanmasını sağlıyoruz. Protokolümüzde herhangi bir güven işareti kullanmadık ama kullanıcıların varsa önerdiğini önerdik. Deneylerimizde, yansal kaymalar 0.2 piksel (~5nm'den az) içinde kalır, bu da göz ardı edilebilir. Bu nedenle, güven göstergeleri kullanmadık.

H3K9me3, H3K27ac ve RNA polimeraz II'nin seçimi, nano ölçekli düzeyde kromatin organizasyonu hakkında tamamlayıcı bilgiler sağlar. H3K9me3, yerleşik heterokromatini temsil eden ve otomatik kümeleme algoritmalarıyla güvenilir şekilde tanımlanabilen ayrık, iyi tanımlanmış kümeler oluşturduğu için ideal bir uzamsal referans olarak hizmet verir. H3K27ac, gen düzenlemesine aktif olarak katılan güçlendirici ile ilişkili kromatini işaretlerken, RNA Polimeraz II doğrudan aktif transkripsiyon noktalarını gösterir. Bu üç hedef, transkripsiyonel makinelerin ve düzenleyici kromatin modifikasyonlarının nükleer mimari içindeki heterokromatik bölgelere göre nasıl organize edildiğini araştırmaya olanak tanır.

Nokta-bulut analiz çerçevesi, yoğun nükleer ortamlarda kapsamlı mekânsal analizi mümkün kılarak önceki kromatin organizasyon çalışmalarının kritik sınırlamalarını ele alır. Geleneksel çift karşılaştırma yöntemleri, aynı nükleer bölgelerde birden fazla kromatin modifikasyonu bir arada bulunduğunda oluşan karmaşık mekansal ilişkileri yakalayamaz. Yaklaşımımız, H3K27ac ve RNA polimeraz II'nin H3K9me3 kümelerine göre nerede birlikte lokalize olduğunu ortaya koymak için eklem yoğunluk analizini kullanır ve ayrı iki renkli deneylerden elde edilemeyecek niceliksel bilgiler sağlar.

Temsilci sonuçlar, katı kromatin bölümlendirmesi yerine tutarlı bir organizasyon modeli göstermektedir. Hem H3K27ac hem de RNA polimeraz II, farklı alan boyutlarında heterokromatin küme çevrelerinde tercihli olarak lokalize olur; nicel ölçümler, küme sınırlarının 10 nm içinde konumlandığını gösterir; bu da benzer yöntemler ve modellere sahip diğer grupların bulgularınıdestekleyen 23,28,35,45,46 . Eklem yoğunluğu analizi, aktif transkripsiyon mekanizması ile güçlendirici ile ilişkili kromatinin en sık heterokromatik kümelerin çevresindeki bölgelerde çiftleştiğini ortaya koymaktadır. Bu bulgular, basit faz ayrımı modellerine meydan okuyor ve farklı kromatin modifikasyonlarının ayrı ayrı bölmeler oluşturmak yerine yakın mekânsal yakınlığı koruması gereken entegre organizasyon ilkelerini destekler.

Protokolün modüler tasarımı, hedef ikame yoluyla çeşitli kromatin biyolojisi sorularının incelenmesini sağlarken aynı analitik çerçeveyi korur. Çoğaltma zamanlaması çalışmaları, proliferasyon hücre nükleer antijeni (PCNA) ve mini kromozom bakımı (MCM) gibi hücre döngüsü proteinlerinin yerine geçebilirken, DNA hasar yanıt araştırmaları γH2AX ve onarım faktörlerini hedefleyebilir. Hücre döngüsü çalışmaları, bölünme sırasında değişen histon modifikasyonlarını inceleyebilir ve farklılaşma araştırmaları, soy bağlılığıyla ilişkili epigenetik işaretlere odaklanabilir. Ardışık etiketleme yaklaşımı, güvenilir antikorların var olduğu herhangi bir nükleer protein veya kromatin modifikasyonu kombinasyonunu kabul eder; bu kombinasyon öncelikle spektral uyumluluk ve çapraz reaktivite faktörleriyle sınırlıdır. Bu esneklik, araştırmacıların çeşitli hücresel süreçlerde kromatin dinamikleriyle ilgili temel soruları ele almasını sağlarken, nicel mekansal analiz yeteneklerini korurken.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün yazarlarının açıklamaları veya rekabet eden çıkarları yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, NIH hibeleri U54CA268084, U54CA261694 ve R01CA228272, Ulusal Bilim Vakfı hibeleri EFMA-1830961 ve CBET-2430743 ile Rob ve Kristin Goldman, Bay David Sachs ve Christina Carinato Hayırsever Vakfı'nın hayırsever desteğiyle desteklendi.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Andor iXon Ultra 888 elektron çoğaltan CCD AndorDU-888U3-CSO-#BV NA
Sığır serum albüminiSigma AldrichA7030Buffer bloklamada ve yıkamada kullanılır. BSA tabanlı bloklama tamponunu 4°C; C
Changchun New Industries Optoelectronics Tech. Co., Ltd., Model MGL-FN-532 (532 nm) PSU-H-LED https://www.cnilaser.com/MGL-FN-532.htmNA
Koherent OBIS Lazer Kutusu (405 nm, 488 nm, 532 nm, 552 nm, 637 nm) & nbsp;Tutarlı1228877 3&ndash ile kolimlenmiş lazerler; 10 kW/cm³ örnek alınan ortalama güç, dalga boyu kanalı başına en az 10.000 kare toplanır   10&ntir; 30  ms  Satın alma süresi. 
DABCO (1,4-Diazabicyclo-(2.2.2)-oktan)SigmaD27802NA
DBPS (1X)Thermo Fisher14190-136NA
Distile suNANAHer türlü damıtılmış su iyidir ve nbsp;
DTT (Ditiothreitol), 1MSigma43816NA
Sekiz iyi odalı kapak camCellvisC8-1.5H-NHerhangi bir cam taban plakası olabilir, ancak hacimler kapa göre ayarlanmalıdır.
Keçi Fare Karşıtı AF568Thermo FisherA11004Stok Konsantrasyonu: 2 mg/mL
Stabilite Etiketleme Sonrası: 2&ntir; 3 gün
Keçi karşıtı Tavşan AF647Thermo FisherA21245Stok Konsantrasyonu: 2 mg/mL
Etiketleme sonrası stabilite: 4&ntir; 5 gün
Keçi Sıçanına Karşı A488Thermo FisherA11006Stok Konsantrasyonu: 2 mg/mL
Stabilite Etiketleme Sonrası: 2&ntir; 3 gün
H3K27ac Birincil AntikorThermo FisherMA5-23516Stok Konsantrasyonu: 1.0 mg/mL 
H3K9me3 Birincil Antikor AbcamAB1769156Stok Konsantrasyonu: 1.287 mg/mL 
Yüksek Berraklıkta Poli-Propilen Konik Tüp 15 mL   Corning 352096Fiksasyon ve Sönme Çözümleri için Kullanılır 
Yüksek Berraklıkta Poli-Propilen Konik Tüp 50 mLCorning35207040 mL'lik çalışan bloklama ve yıkama tamponları için kullanılır
Hidroklorik asit (HCl), 12MSigma258148NA
Mükemmel odak sistemi ile Nikon Eclipse Ti-E;NiikonTI-DH 611392 Ters mikroskop 
Nikon SR APO TIRF, 100x büyütme, 1.49 NA Nikonhttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/cfi-apochromat-tirf-series  NA
Normal keçi serumuAbcamAB7481-1002İlk etiket bittikten sonra kullanılır. Bloklama ve Yıkama Tamponlarında olmalı
Paraformaldehit 16 % Elektron Mikroskopi Bilimleri15710Fiksatif çözelti olarak kullanılıyor ve yapımından sonra 2 hafta içinde tükenmesi gerekiyor. 4° derecede ışıktan korun; C
Fosfat tamponlu tuzlu (PBS) 10XAmbionAM9625NA
Pipet Uçları 1000 uLSureOne02-707-404Her türlü pipet ucu sorun değil, yeter ki s hacim için uygun
RNAPII-PS2AbcamAB252855Stok Konsantrasyonu: 0.98 mg/mL
Sodyum BorohidritThermo FisherS678-10Her seferinde buffer'i söndürmek için fresh kullanın. 
Sodyum hidroksit (NaOH)Thermo Fisher A16037.36NA
Sodyum sülfitSigmaS0505NA
Triton X-100 %10Thermo Fisher 28314NA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Multiplexed DNA-PAINT imaging of the heterogeneity of late endosome/lysosome protein composition. bioRxiv: The Preprint Server for Biology. , (2024).">Bond, C., Hugelier, S., Xing, J., Sorokina, E. M., Lakadamyali, M. Multiplexed DNA-PAINT imaging of the heterogeneity of late endosome/lysosome protein composition. bioRxiv: The Preprint Server for Biology. , (2024).
  2. Quantitative single-molecule localization microscopy. Annu. Rev. Biophys. 52 (1), 139-160 (2023).">Hugelier, S., Colosi, P. L., Lakadamyali, M. Quantitative single-molecule localization microscopy. Annu. Rev. Biophys. 52 (1), 139-160 (2023).
  3. Single-molecule localization microscopy. Nat. Rev. Methods Primers. 1, 39(2021).">Lelek, M., et al. Single-molecule localization microscopy. Nat. Rev. Methods Primers. 1, 39(2021).
  4. Super-resolution imaging with stochastic single-molecule localization: concepts, technical developments, and biological applications. Microsc Res Tech. 77 (7), 502-509 (2014).">Oddone, A., Vilanova, I. V., Tam, J., Lakadamyali, M. Super-resolution imaging with stochastic single-molecule localization: concepts, technical developments, and biological applications. Microsc Res Tech. 77 (7), 502-509 (2014).
  5. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).">Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
  6. Super resolution imaging of chromatin in pluripotency, differentiation, and reprogramming. Curr Opin Genet Dev. 46, 186-193 (2017).">Ricci, M. A., Cosma, M. P., Lakadamyali, M. Super resolution imaging of chromatin in pluripotency, differentiation, and reprogramming. Curr Opin Genet Dev. 46, 186-193 (2017).
  7. Aberrant chromatin reorganization in cells from diseased fibrous connective tissue in response to altered chemomechanical cues. Nat Biomed Eng. 7 (2), 177-191 (2023).">Heo, S. J., et al. Aberrant chromatin reorganization in cells from diseased fibrous connective tissue in response to altered chemomechanical cues. Nat Biomed Eng. 7 (2), 177-191 (2023).
  8. Comprehensive molecular characterization of the hippo signaling pathway in cancer. Cell Rep. 25 (5), 1304-1317.e5 (2018).">Wang, Y., et al. Comprehensive molecular characterization of the hippo signaling pathway in cancer. Cell Rep. 25 (5), 1304-1317.e5 (2018).
  9. Multicolor super-resolution imaging using spectroscopic single-molecule localization microscopy with optimal spectral dispersion. Appl Opt. 58 (9), 2248-2255 (2019).">Zhang, Y., et al. Multicolor super-resolution imaging using spectroscopic single-molecule localization microscopy with optimal spectral dispersion. Appl Opt. 58 (9), 2248-2255 (2019).
  10. Correlative single molecule lattice light sheet imaging reveals the dynamic relationship between nucleosomes and the local chromatin environment. Nat Comm. 15 (1), 4178(2024).">Daugird, T. A., et al. Correlative single molecule lattice light sheet imaging reveals the dynamic relationship between nucleosomes and the local chromatin environment. Nat Comm. 15 (1), 4178(2024).
  11. Active transcription and epigenetic reactions synergistically regulate meso-scale genomic organization. Nat Comm. 15 (1), 4338(2024).">Kant, A., et al. Active transcription and epigenetic reactions synergistically regulate meso-scale genomic organization. Nat Comm. 15 (1), 4338(2024).
  12. Three-dimensional spectral precision distance microscopy of chromatin nanostructures after triple-colour DNA labelling: a study of the BCR region on chromosome 22 and the Philadelphia chromosome. J Microsc. 199 (2), 96-105 (2000).">Esa, A., et al. Three-dimensional spectral precision distance microscopy of chromatin nanostructures after triple-colour DNA labelling: a study of the BCR region on chromosome 22 and the Philadelphia chromosome. J Microsc. 199 (2), 96-105 (2000).
  13. Superresolution imaging of HIV in infected cells with FlAsH-PALM. Proc Natl Acad Sci. 109 (22), 8564-8569 (2012).">Lelek, M., Di Nunzio, F., Henriques, R., Charneau, P., Arhel, N., Zimmer, C. Superresolution imaging of HIV in infected cells with FlAsH-PALM. Proc Natl Acad Sci. 109 (22), 8564-8569 (2012).
  14. Tailoring fluorescent labels for far-field nanoscopy. Far-Field Optical Nanoscopy. , 159-188 (2015).">Yushchenko, D. A., Bruchez, M. P. Tailoring fluorescent labels for far-field nanoscopy. Far-Field Optical Nanoscopy. , 159-188 (2015).
  15. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu rev phys chem. 62, 507-530 (2011).">Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu rev phys chem. 62, 507-530 (2011).
  16. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopath. 49 (4), 406-410 (2006).">Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopath. 49 (4), 406-410 (2006).
  17. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C723-C742 (2011).">Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C723-C742 (2011).
  18. Super resolution microscopy reveals how elongating RNA polymerase II and nascent RNA interact with nucleosome clutches. Nucl Acids Res. 50 (1), 175-190 (2022).">Castells-Garcia, A., et al. Super resolution microscopy reveals how elongating RNA polymerase II and nascent RNA interact with nucleosome clutches. Nucl Acids Res. 50 (1), 175-190 (2022).
  19. A high-throughput DNA FISH protocol to visualize genome regions in human cells. STAR protocols. 2 (3), 100741(2021).">Finn, E. H., Misteli, T. A high-throughput DNA FISH protocol to visualize genome regions in human cells. STAR protocols. 2 (3), 100741(2021).
  20. Chromatin organization by an interplay of loop extrusion and compartmental segregation. Proc Natl Acad Sci. 115 (29), E6697-E6706 (2018).">Nuebler, J., Fudenberg, G., Imakaev, M., Abdennur, N., Mirny, L. A. Chromatin organization by an interplay of loop extrusion and compartmental segregation. Proc Natl Acad Sci. 115 (29), E6697-E6706 (2018).
  21. Genome folding through loop extrusion by SMC complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (7), 445-464 (2021).">Davidson, I. F., Peters, J. M. Genome folding through loop extrusion by SMC complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (7), 445-464 (2021).
  22. Unraveling cellular complexity with transient adapters in highly multiplexed super-resolution imaging. Cell. 187 (7), 1769-1784.e18 (2024).">Schueder, F., et al. Unraveling cellular complexity with transient adapters in highly multiplexed super-resolution imaging. Cell. 187 (7), 1769-1784.e18 (2024).
  23. Chromatin arranges in chains of mesoscale domains with nanoscale functional topography independent of cohesin. Sci Adv. 6 (39), eaba8811(2020).">Miron, E., et al. Chromatin arranges in chains of mesoscale domains with nanoscale functional topography independent of cohesin. Sci Adv. 6 (39), eaba8811(2020).
  24. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction n interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), eaag0025(2017).">Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction n interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), eaag0025(2017).
  25. Analysis of three-dimensional chromatin packing domains by chromatin scanning transmission electron microscopy (ChromSTEM). Sci Rep. 12 (1), 12198(2022).">Li, Y., et al. Analysis of three-dimensional chromatin packing domains by chromatin scanning transmission electron microscopy (ChromSTEM). Sci Rep. 12 (1), 12198(2022).
  26. Heterochromatin as an important driver of genome organization. Front Cell Dev Biol. 8, (2020).">Penagos-Puig, A., Furlan-Magaril, M. Heterochromatin as an important driver of genome organization. Front Cell Dev Biol. 8, (2020).
  27. Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).">Millán-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).
  28. Nanoscale chromatin imaging and analysis platform bridges 4D chromatin organization with molecular function. Sci Adv. 7 (1), eabe4310(2021).">Li, Y., et al. Nanoscale chromatin imaging and analysis platform bridges 4D chromatin organization with molecular function. Sci Adv. 7 (1), eabe4310(2021).
  29. Mature chromatin packing domains persist after RAD21 depletion in 3D. Sci Adv. 11 (4), eadp0855(2025).">Li, W. S., et al. Mature chromatin packing domains persist after RAD21 depletion in 3D. Sci Adv. 11 (4), eadp0855(2025).
  30. Chromatin accessibility: methods, mechanisms, and biological insights. Nucleus. 13 (1), 236-276 (2022).">Mansisidor, A. R., Risca, V. I. Chromatin accessibility: methods, mechanisms, and biological insights. Nucleus. 13 (1), 236-276 (2022).
  31. Decoding topologically associating domains with ultra-low resolution Hi-C data by graph structural entropy. Nat Comm. 9 (1), 3265(2018).">Li, A., et al. Decoding topologically associating domains with ultra-low resolution Hi-C data by graph structural entropy. Nat Comm. 9 (1), 3265(2018).
  32. Principles of genome folding into topologically associating domains. Sci Adv. 5 (4), eaaw1668(2019).">Szabo, Q., Bantignies, F., Cavalli, G. Principles of genome folding into topologically associating domains. Sci Adv. 5 (4), eaaw1668(2019).
  33. Next-generation sequencing technology: current trends and advancements. Biology. 12 (7), 997(2023).">Satam, H., et al. Next-generation sequencing technology: current trends and advancements. Biology. 12 (7), 997(2023).
  34. Three-color single-molecule localization microscopy in chromatin. Light: Sci Appl. 14 (1), 123(2025).">Acosta, N., et al. Three-color single-molecule localization microscopy in chromatin. Light: Sci Appl. 14 (1), 123(2025).
  35. Chromatin conformation, gene transcription, and nucleosome remodeling as an emergent system. Sci Adv. 11 (2), eadq6652(2025).">Almassalha, L. M., et al. Chromatin conformation, gene transcription, and nucleosome remodeling as an emergent system. Sci Adv. 11 (2), eadq6652(2025).
  36. Ultrafast data mining of molecular assemblies in multiplexed high-density super-resolution images. Nat Comm. 10 (1), 119(2019).">Yin, Y., Lee, W. T. C., Rothenberg, E. Ultrafast data mining of molecular assemblies in multiplexed high-density super-resolution images. Nat Comm. 10 (1), 119(2019).
  37. Super-resolution imaging of higher-order chromatin structures at different epigenomic states in single mammalian cells. Cell Rep. 24 (4), 873-882 (2018).">Xu, J., et al. Super-resolution imaging of higher-order chromatin structures at different epigenomic states in single mammalian cells. Cell Rep. 24 (4), 873-882 (2018).
  38. Imaging higher-order chromatin structures in single cells using stochastic optical reconstruction microscopy. Bio-Protocol. 9 (3), e3160(2019).">Xu, J., Liu, Y. Imaging higher-order chromatin structures in single cells using stochastic optical reconstruction microscopy. Bio-Protocol. 9 (3), e3160(2019).
  39. Super-resolution microscopy reveals how histone tail acetylation affects DNA compaction within nucleosomes in vivo. Nucleic Acids Res. 47 (16), (2019).">Otterstrom, J., Castells-Garcia, A., Vicario, C., Gomez-Garcia, P. A., Cosma, M. P., Lakadamyali, M. Super-resolution microscopy reveals how histone tail acetylation affects DNA compaction within nucleosomes in vivo. Nucleic Acids Res. 47 (16), (2019).
  40. An optimized buffer for repeatable multicolor STORM. ACS Photonics. 9 (12), 3926-3934 (2022).">Abdelsayed, V., Boukhatem, H., Olivier, N. An optimized buffer for repeatable multicolor STORM. ACS Photonics. 9 (12), 3926-3934 (2022).
  41. Advanced image-free analysis of the nano-organization of chromatin and other biomolecules by single molecule localization microscopy (SMLM). Comput Struct Biotechnol J. 21, 2018-2034 (2023).">Weidner, J., et al. Advanced image-free analysis of the nano-organization of chromatin and other biomolecules by single molecule localization microscopy (SMLM). Comput Struct Biotechnol J. 21, 2018-2034 (2023).
  42. A framework for evaluating the performance of SMLM cluster analysis algorithms. Nat Methods. 20 (2), 259-267 (2023).">Nieves, D. J., et al. A framework for evaluating the performance of SMLM cluster analysis algorithms. Nat Methods. 20 (2), 259-267 (2023).
  43. Recent development of computational cluster analysis methods for single-molecule localization microscopy images. Comput Struct Biotechnol J. 21, 879-888 (2023).">Hyun, Y., Kim, D. Recent development of computational cluster analysis methods for single-molecule localization microscopy images. Comput Struct Biotechnol J. 21, 879-888 (2023).
  44. Functional nuclear organization of transcription and DNA replication: a topographical marriage between chromatin domains and the interchromatin compartment. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 75 (0), 475-492 (2010).">Markaki, Y., et al. Functional nuclear organization of transcription and DNA replication: a topographical marriage between chromatin domains and the interchromatin compartment. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 75 (0), 475-492 (2010).
  45. Space-time dynamics of genome replication studied with super-resolved microscopy. Postepy biochem. 70 (1), 8-21 (2024).">Gelléri, M., Sterr, M., Strickfaden, H., Cremer, C., Cremer, T., Cremer, M. Space-time dynamics of genome replication studied with super-resolved microscopy. Postepy biochem. 70 (1), 8-21 (2024).
  46. The 4D nucleome: Evidence for a dynamic nuclear landscape based on co-aligned active and inactive nuclear compartments. FEBS Letters. 589 (20), 2931-2943 (2015).">Cremer, T., et al. The 4D nucleome: Evidence for a dynamic nuclear landscape based on co-aligned active and inactive nuclear compartments. FEBS Letters. 589 (20), 2931-2943 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule LocalizationChromatin StructureSuper Resolution MicroscopySequential ImmunolabelingDense Nuclear EnvironmentThree Color SMLMEpigenetic MarksAntibody StainingFluorophore SelectionSpatial Analysis Chromatin

Related Articles