Yöntem makalesi

İçsel Kontrast kullanarak DNA moleküllerinin spektroskopik süper çözünürlüklü görüntülemesi

DOI:

10.3791/69917

⸱

6 Mart 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 2Center for Physical Genomics and Engineering, Northwestern University, 3Department of Gastroenterology and Hepatology, Northwestern Memorial Hospital

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, DNA içsel floresan spektrumlarının örnek hazırlanması, veri toplama ve analizi üzerine ayrıntılı işlemler sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Süper çözünürlüklü görüntüleme, nano ölçekte yapısal detayları ortaya çıkararak biyolojik araştırmalarda devrim niteliğinde bir yol açmıştır. Çoğu optik süper çözünürlüklü yöntem, moleküler türlerin belirli etiketlenmesini sağlayan ancak hücresel işlevleri bozabilir, linker moleküllerinden yanlış hatalar getirebilir ve bireysel DNA moleküllerinin ölçeğinde kromatin görüntüleme için gereken tutarlı yüksek etiketleme yoğunluğunu sağlayamayan biyomoleküllerin floresan etiketlenmesine dayanır. Etiketsiz , yerinde genomik görüntülemeyi nanometre çözünürlüklü mümkün kılan bir teknoloji, biyolojiyi derinden etkiler. Burada, spektroskopik tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi (sSMLM) gerçekleştirmek için DNA'nın içsel floresansını kullanan bir protokol sunuyoruz. Protokol, örnek hazırlama, veri toplama ve spektral analizi detaylandırır. Kısaca, polinükleotid çözeltisi camın üzerine bırakılıp saatlerce kurumasına bırakılarak ince bir DNA jeli oluşturulur. Jel oluşumundan sonra, örnek sSMLM kullanılarak görüntüleme tamponu varlığında görüntülenir. Kaydedilen veri seti, mekânsal yerelleştirmeler sağlayan sıfır dereceden bir görüntü ve her lokalizasyonun emisyon spektrumunu kodlayan birinci dereceden bir görüntüden oluşur. Mekânsal rekonstrüksiyonlar sıfırıncı dereceden verilerden üretilir, ardından karşılık gelen spektrumlar birinci dereceden sinyalden çıkarılır. Son olarak, farklı uzunluklar, dizileri ve bileşimlere sahip çoklu uyarılma dalga boyları ve DNA molekülleri kullanılarak bu yaklaşımın uygulanabilirliğini gösteriyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Süper çözünürlüklü floresan mikroskopi teknikleri — yapılandırılmış aydınlatma mikroskopisi (SIM), uyarılmış emisyon azalma mikroskopisi (STED) ve fotoaktifize lokalizasyon mikroskopisi (PALM) ile stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) gibi tek molekül lokalizasyon mikroskopisi (SMLM) yöntemleri — optik mikroskopinin çözünürlüğünü kırınımsınırı 1,2,3,4'ün çok ötesine taşımıştır.5,6,7, kromatin 8,9,10,11,12'nin nano ölçekli organizasyonuna eşi benzeri görülmemiş erişim sağlar. Ancak, nükleik asit yapılarını görselleştirmek için mevcut boyama yöntemleri, DNA'nın kendisi yerine DNA ile ilişkili proteinlerin etiketlenmesine dayanır veya doğal kromatin konfigürasyonunu bozup hücre yaşamını tehlikeye atabilecek küçük moleküllü boyalarkullanır 13,14. Bu sınırlamalar nedeniyle, etiketsiz optik süper çözünürlüklü görüntüleme yöntemlerinin yerli, bozucu olmayan koşullarda geliştirilmesi son derece arzu edilir. Burada sunulan protokol, içsel floresansın güvenilir şekilde tespit edilebildiği sentetik saflaştırılmış tek veya çift zincirli DNA nükleotitleri için tasarlanmıştır; sabit hücreli veya canlı hücrede nükleer DNA moleküllerinin görüntülenmesi için optimize edilmemiştir.

Nükleik asitler, son derece düşük kuantum verimleri (UV uyarılma altında yaklaşık 10−4) ve odasıcaklığında ultrahızlı floresans bozunması nedeniyle uzun süre floresan olmayan olarak kabul edildiğinden, DNA'nın içsel floresansı (özellikle floresans ömrü) üzerine yapılan çalışmalar, femtosaniye spektroskopisi geliştirilene kadar nadirdi. Nükleotidlerin UV aydınlatması altında zayıf floresans olduğu, görünür aralıkta emilimlerinin ise oldukça zayıf olduğu iyi kabul edilmiştir. Buna rağmen, yakın zamanda fizyolojik olarak ilgili konsantrasyonlarda değiştirilmemiş nüklein asitlerin görünür ışıkla uyarlanan floresansınınvar olduğu gözlemlenmiştir 16. Bu olgu muhtemelen gözden kaçmış olabilir çünkü nükleotidlerin fotokimyasal çalışmalarının çoğu seyreltilmiş çözeltilerde (10-100 μM)17,18,19,20 yapılırken, çekirdekler ve kromozomlarda DNA konsantrasyonları 0.1-1 M 21,22,23'e ulaşabilmektedir. Daha da önemlisi, görünür aydınlatma altında stokastik floresans değişimigözlemlenmişti 16; bu da lokalizasyona dayalı süper çözünürlüklü mikroskopide endozen kontrast ajanı olarak modifiye edilmemiş nukleik asitlerin kullanılmasının temelini oluşturdu.

Görünür ışık uyarılması altında fizyolojik konsantrasyonlarda basit dizilere sahip nukleotid monomerleri ve tek zincirli DNA moleküllerinin fotokimyasal özellikleriaraştırılmıştır 24. Ayrıca, bu DNA moleküllerinin stokastik floresans anahtarlama özelliklerine sahip olduğu gösterilmiştir; bu, değişken tükenme koşullarında nükleotidlerin floresans geri kazanımı incelenerek temel durum tükenmesi (GSD)6,7 teorisiyle iyi uyum sağlar. Ayrıca, nükleotidler nispeten yüksek kuantum verimleri ve düşük sistemlerarası geçiş olasılıkları gösterdiği için, tek moleküllü emisyon olaylarının foton sayıları ve yanıp sönme süreleri, STORM'daki popüler dış boya boyalarının (örneğin Alexa Fluor 647) ile karşılaştırılabilir; farklıspektrumlar 25,26 sergiler ve DNA'yı yüksek çözünürlüklü görüntüleme için ideal bir içsel kontrast ajanı yapar. Ayrıca, önceki bölümde açıklanan spektral regresyon algoritmasının uygulanması, polinükleotidlerin ve doğrusal tek zincirli DNA liflerinin on nanometre altı süper çözünürlüklü görüntülemesinimümkün kılar 27.

DNA içsel floresansının tam spektrumunu yakalamak için, spektral tespit için çift kamalı prizma (DWP) kullandık; bu prizma aynı anda yüksek verimli tek moleküllü spektroskopik analiz ve görüntülemeyi minimum iletim kaybı ve dalga cephesihatası ile 28,29,30 ve otomatik veri işleme için açık kaynaklı spektroskopik SMLM analiz yazılımı (RainbowSTORM) kullandık 31,32. Bu yetenek üzerine inşa ederek, spektroskopik tespite ve özel spektral analiz hattına entegre edilmiş çok lazerli bir SMLM platformu geliştirdik. Burada sunduğumuz protokol, örnek hazırlama, veri toplama ve analizi kapsayarak, tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisinde DNA içsel floresansını kullanmak için tekrarlanabilir bir iş akışı sağlar. Tek zincirli oligonukleotidler ve çift zincirli DNA moleküllerinin içsel kontrastla görüntülenmesi üzerine kavram kanıtı çalışmalarını mümkün kılmanın ötesinde, bu yaklaşım, DNA'nın içsel floresansı ile hesaplamalı yöntemlerle birleştirildiği sıralar tahmini gibi doğal, etiketsiz koşullarda DNA görüntülemede daha geniş uygulamalar için bir temel oluşturdu.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. DNA jel örneklerinin hazırlanması (Şekil 1A)

  1. DNA örneğini (oligonukleotid veya çift zincirli DNA) tozunu nukleazsız deionize suda 100 mM nihai konsantrasyona kadar çözün ve stok çözeltiyi -4 °C'de saklayın.
  2. Tekrarlanan donma-erime döngülerini en aza indirmek için 5 μL aliquot hazırlayın. Dondurulmuş alikotlar kullanıyorsanız, hacmine bağlı olarak oda sıcaklığında 5-15 dakika eritin.
  3. Bir cam slaytı laboratuvar mendiliyle nazikçe temizleyin. 100 mM DNA molekülü çözeltisinden 5 μL pipetleyin yeni temizlenmiş cam slayta ve 1-3 saat buharlaşarak bir DNA jeli oluşturulur.
  4. Güvenlik için bu basamağı bir buharlı davlumbonun içinde çalıştırın. Malzeme Tablosu'na göre görüntüleme tamponu hazırlayın. Hem β-merkaptoetanol tamponu hem de DABCO tamponu, DNA moleküllerinin stokastik foto-anahtarlamasını desteklemek için doğrulandı.
  5. Güvenlik için bu basamağı bir buharlı davlumbonun içinde çalıştırın. DNA jeline 5 μL görüntüleme tamponu ekleyin ve görüntülemeden hemen önce üstüne bir örtü koyun. Kapalı numunenin içinde baloncuklar olabilir. Kapalı numunenin içindeki kabarcıkları çıkarmak için cımbız kullanın,

2. sSMLM sisteminin kalibrasyonu ve veri edinimi (Şekil 1B)

  1. Spektroskopik SMLMsistemi 33'ün aşağıdaki kalibrasyonu için 100 nm çapında ve 4 μm aralıklı bir nanodelik dizisi hazırlanır; bu dizide 8 sıra x 5 sütun halinde düzenlenir.
    NOT: Alternatif olarak, Amerika Birleşik Devletleri Hava Kuvvetleri (USAF) 1951 çözünürlük tablosu (R3L1S4N) da spektral kalibrasyon33 için kullanılabilir.
    1. Nanodelik dizisini ardışık metal sputtering ve odaklı iyon ışını (FIB) frezeleme ile üretmek. İlk olarak, 150 nm kalınlığında bir alüminyum filmi, 75 W'ta DC sputtering ile 3 mTorr'da dakikada 20 standart santimetreküp (SCCM) argon akışı ile 22 x 22 mm borosilikat cam kapak örtüsü üzerine yerleştirin.
    2. 30 kV hızlandırma voltajında çalışan FIB frezeleme kullanarak alüminyum tabakaya 5 x 8 nanodelik bir diziyi desenlendirin.
  2. Spektroskopik SMLM sistemini (Şekil 2) açın, kameranın önüne dar bant genişliğine (532 nm, 580 nm, 633 nm, 680 nm ve 750 nm) yerleştirin ve kalibrasyon örneğini aydınlatmak için beyaz bir ışık kaynağı (örneğin mikroskop lambası) kullanın.
  3. Her filtreyle 10 kare toplayın. Lambanın düşük yoğunluğu ve kameranın yakın kızılötesi bölgesinde düşük verimliliği nedeniyle 532 nm, 580 nm, 633 nm ve 680 nm için pozlama süresini 200 ms'e ve 750 nm için 2000 ms'e ayarlayın (Şekil 3).
  4. DNA jel örneğini mikroskopa yükleyin, örtü tarafının hedefe baktığından emin olun ve veri toplama için kamera yazılımını açın.
  5. Otomatik odak takip sistemi yardımıyla uygun z-konumunu belirleyin, böylece net stokastik yanıp sönme görünür olur. Bu adım kritiktir ve sabır gerektirir çünkü DNA jel örneklerinde hücre yapıları gibi belirgin morfolojik ipuçları yoktur ve doğru sinyale ulaşmak zorlaşır.
  6. ObjektİFin kaplama kenarına değmediğinden emin olun, çünkü bu, tampon sızıntısına daldırma yağına ve izleme ile uğraşmaya neden olabilir.
  7. Tipik aydınlatma gücü 5 kW/cm² ve 30 ms pozlama süresiyle 10.000-30.000 kare elde edinin. Gerekirse kare sayısını, aydınlatma gücünü ve pozlama süresini ayarlayın. Edinimden sonra, yazılım verileri varsayılan olarak nd2 formatında kaydeder.
  8. Deney tamamlandıktan sonra, cam sürgülü onaylı bir keskin atık konteynerine (örneğin, kırık cam veya keski atık kutusu) atın ve kalan tüm tamponları kurumsal güvenlik yönergelerine uygun olarak belirlenen kimyasal sıvı atık konteynerine atabilirsiniz.

3. Kalibrasyon ve spektroskopi verilerinin analizi (Şekil 1C)

  1. Alınan DNA örneğinin ham görüntü yığınını Bio-Formats Eklentisi kullanılarak FIJI'ye (Windows 64-bit) yükleyin.
  2. Arka plandan çıkarılan bir veri seti elde etmek için yığından minimum projeksiyonu çıkarın ve spektral analiz için kaydedin. Yüklü ham görüntü yığını için Image > Stacks > Z Project seçeneğini seçin ve Projeksiyon tipinde Minimum yoğunluğu seçin. Sonra Process > Image calculator'ı seçerek ham görüntü yığınından minimum projeksiyonu çıkarıp TIFF olarak kaydedin.
  3. ThunderSTORM eklentisini (sürüm 1.3) kullanarak sıfırıncı dereceden ham görüntü yığınında yerelleştirme tanımlaması gerçekleştirin. Uygun parametreleri kullanarak sıfırıncı dereceden görüntüyü yeniden inşa edin ve emisyon olay koordinatlarını (birim: nm) çıkarabilirsiniz (örneğin, eşik = 1.2 x std (Wave.F1), sigma = 1.5, uyum yarıçapı = 3). Kırpılmış sıfırıncı dereceden ham görüntü yığını için Eklenti > ThunderSTORM > Çalıştır analizini seçin.
  4. FIJI ve açık kaynak yazılımı RainbowSTORM'u (32'de GitHub bağlantısı, MATLAB versiyonu 2020b'den daha yeni) kullanarak kalibrasyon verilerini işleyerek yatay ve dikey kaymalar ile 31,32 dalga boyları arasındaki ilişkiyi elde edin.
    1. ThunderSTORM eklentisini kullanarak 5 dalga boyunun kalibrasyon görüntülerinde yerelleştirme tanımlaması gerçekleştirin. Uygun parametreleri (örneğin, eşik = 5 x std (Wave.F1), sigma = 1.5, uyum yarıçapı = 3) kullanarak nanodeliklerin sıfırıncı derecedeki lokalizasyonlarını ve birinci derecedeki karşılık gelen spektral lokalizasyonlarını yeniden inşa edin.
    2. Eşiği (örneğin, 5-10 x std aralığında (Wave.F1)) ayarlayın, her kalibrasyon görüntüsü için 80 lokalizasyon oluşana kadar.
    3. RainbowSTORM'u çalıştırın ve Spektral Kalibrasyon > önceki adımdaki her kalibrasyon dalga boyu (532 nm, 580 nm, 633 nm, 680 nm, 750 nm) için CSV dosyalarını gezip yükleyin. Kalibrasyon Dosyasını Kaydet'e tıklayın.
  5. Nanometre tabanlı koordinatları piksel koordinatlarına dönüştürün ve kalibrasyonda belirlenen sıfır dereceden birinci mertebedene yatay ve dikey kaymalara dayalı spektral pencereye eşlenerek (Şekil 4) DNA içsel floresansının tam spektrumunu ölçmek için onları eşleştirin.
    1. Aşağıdaki adımlarla tam spektrum verisini çıkarmak için özelleştirilmiş Pythonscripts 34 (sürüm 3.11.7) kullanın.
    2. Arka plandan çıkarılan görüntü yığını (.tiff) için 3.2. adımdan doğru dosya yolları, 3.3 adımdan elde edilen yerelleştirme CSV dosyası (.csv) ve 3.4. adımdan kalibrasyon dosyası (.mat) için doğru dosya yolları ayarlandı.
    3. 3D DWP ile elde edilen 488 nm veri için yatay kaydırma olarak 900-950 piksel kullanın; bu da kapsama sağlamak için 484-588 nm spektral pencereye karşılık gelir; bu aralık 500-550 nm filtre aralığından biraz daha geniştir.
    4. 3D DWP ile elde edilen 532 nm veri için yatay kaydırma olarak 925-984 piksel kullanın; bu, yine 590-650 nm filtre aralığından daha geniş olmak üzere seçilen 525-750 nm spektral pencereye karşılık gelir.
    5. 3D DWP ile hem 488 nm hem de 532 nm veri için dikey kaydırma olarak 23 piksel kullanın.
      Yukarıdaki değerler, RainbowSTORM kullanılarak elde edilen spektral kalibrasyon eğrisinden türetilmiştir. Tam spektrum ölçümü için Python betikleri34'te bulunabilir.
  6. Sonraki analizler (karşılaştırma, sınıflandırma vb.) için doğrusal olmayan spektrumu 3. dereceden polinom uyumu kullanarak doğrusal olmayan spektrumu lineerleştirin (Şekil 3).

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir DNA örneğinin bir görüntü yığını için örnek hazırlamadan veri toplama ve analizine kadar tüm süreç yaklaşık 120 dakika sürer; DNA jel oluşumu 1 saat sürerse (Şekil 1). Erime, jel oluşumu ve spektral kalibrasyon için toplam süre, deneydeki görüntü veya örnek sayısına bakılmaksızın yaklaşık 90 dakika olarak sabitlenir. Verimliliği en üst düzeye çıkarmak için, tek bir oturumda birkaç örnek üzerinden birden fazla görüntü yığını toplanmasını öneririz.

DWP'den sonra elde edilen temsil eden gerçek zamanlı görüntüler, floresans sinyallerinin sıfırıncı dereceye (solda, mekansal bilgiyi içeren) ve birinci dereceye (sağda, spektral bilgiyi içeren) olarak ikiye ayrıldığı Şekil 1B ve Şekil 3A'da gösterilmiştir. Şekil 1B'de, görüntüler 2B DWP konfigürasyonu kullanılarak alınmıştır; burada sıfırıncı ve birinci dereceden görüntüler arasındaki mesafe nispeten küçüktür. Buna karşılık, Şekil 3A , iki kırınım sırası, çift kanatlı 3D görüntüleme için mühendislik yapımı optik yol farkı nedeniyle daha geniş bir şekilde ayrıldığı 3D DWP kullanılarak toplanan verileri gösterir. Şekil 1C, Şekil 3 ve Şekil 4'te sunulan tüm veriler 3D DWP konfigürasyonu kullanılarak toplanmıştır. 2D ve 3D görüntüleme arasındaki seçim deneysel hedefe bağlıdır: sentezlenmiş DNA örneklerinin içsel floresans spektral ölçümleri için, bu örneklerin ilgili üç boyutlu yapısal özelliklere sahip olmaması nedeniyle genellikle 2D DWP tercih edilir; ancak eksenel bilgi istendiğinde 3D DWP konfigürasyonu da kullanılabilir.

Bu temsilci sonuçlar birlikte, DWP tabanlı görüntüleme platformunun bireysel DNA moleküllerinden uzamsal lokalizasyon ve emisyon spektrumlarını gerçek zamanlı olarak aynı anda çözebilme temel yeteneğini göstermektedir. Sistemin uygun performansı, sıfırıncı dereceden uzamsal görüntü ile birinci dereceden spektral dağılmış görüntü arasındaki net ve kararlı ayrımla gösterilir; her tek molekül lokalizasyonu, sıfırıncı derecede belirgin bir spektral ize karşılık gelir. Kantal spektral analiz, sıfırıncı dereceden görüntüde izole tek moleküllü olayların tanımlanması, ilgili birinci dereceden sinyalin göreli piksel kaymasının ölçülmesi ve bu kaymanın kalibre edilmiş bir eşleme fonksiyonu kullanılarak dalga boyuna dönüştürülmesiyle gerçekleştirilir. Piksel yer değiştirme ile emisyon dalgaboyu arasındaki ilişki doğrusal olmadığından, ham veri28'den doğrusal olarak doğrusal emisyon spektrumlarını yeniden oluşturmak için üçüncü dereceden polinom uyumu uygulanır. Ortaya çıkan tek moleküllü spektrumlar, makine öğrenimi veya derin öğrenme modelleri dahil olmak üzere hesaplamalı analiz boru hatlarına entegre edilebilir; böylece farklı aydınlatma koşulları ve fotofiziksel durumlar altında DNA dizisi bileşimi veya moleküler yapısı spektral sınıflandırılması ve çıkarılmasını mümkün kılar.

Bu protokolde gösterilen tüm veriler β-merkaptoetanol bazlı görüntülemetamponu 35 kullanılarak toplanmıştır. Prensipte, florofor foto-anahtarlama davranışını geliştiren herhangi bir görüntüleme tamponu, örneğin DABCO tabanlı görüntüleme tamponu36, bu yaklaşımla uyumlu olmalıdır. Test edilen DNA molekülleri arasında 20 bazlı tek zincirli A, G, C, T bulunur; 40 bazlı tek telli AC zincir (A1C1, A5C5, A10C10, A20C20); tek zincirli 5-, 8-, 12-, 16-base Guanine; 20 bazlı çift çift zincirli GC ve AT (ayrıntılı bilgi için Materyaller Tablosu'na bakınız). 20 ve 40 bazlı DNA yapılarının seçimi, 40 bazlı bir DNA zincirinin 40 x 3.4 = 13.6 nm'den daha az etkin boyutta kompakt bir konformasyon benimsediği ve bu da yeniden oluşturulan SMLM görüntüsünün çözünürlük sınırının altına girdiği gözlemine dayanır. Uyarılma dalga boyları (488 nm ve 532 nm) belirli diziler için benzersiz olarak optimize edilmemiş, bunun yerine, her iki dalga boyu kullanılarak farklı baz bileşimleri ve konformasyon durumları üzerinde içsel DNA floresansının sağlam şekilde tespit edilebileceğini göstermek için seçilmiştir. Ek Şekil 1'de gösterildiği gibi görüntüleme tamponunu test ettik ve neredeyse hiç stokastik blink sinyali tespit edilmediğini bulduk; bu da tampon bileşenleri ve cam yüzey işlemlerini ekartı olarak gördü. Sadece DNA jeli + görüntüleme tamponu önemli sayıda göz kırpma gösterdi. Cam slaytlar ve kapak örtüleri temiz ve dikkatlice işlenmişti, örnek jeli ise kapalı bir ortamda oluşturulmuştu. Bu nedenle, tespit edilen sinyallerin safsızlıklardan veya substrat otofloresansından gelmesi pek olası değildir. Ayrıca kurutma jelinden ve DNA çözeltisinden gelen sinyali ölçtük ve belirgin bir fark olmadığını bulduk; bu nedenle kurutma sırasında fotokimyasal artefaktlar sinyallerin ana kaynağı değildir. Fotodegradasyon ürünleri genellikle geniş spektrumlar gösterir ve bizim çalışmamızda hiç gözlemlenmemiş bir yanıp sönme özelliği yoktur. Tespit sınırları, lokalizasyonların minimum foton sayısı ile yansıtılan nicel sınırlar 30 - 50 [foton sayısı]dır. Bu değer, sabit hücrelerde AF647 etiketli H3K9me3 gibi DNA örnekleri ve etiketlenmiş sistemler için aynı kalır. DNA içsel floresansının ortalama lokalizasyon hassasiyeti yaklaşık 15 - 25 nm iken, AF647 yaklaşık 10 - 15 nm'dir.

2D senaryoda, yeniden oluşturulan SMLM görüntüsünün piksel boyutu 22 nm'dir. Stokastik emisyonların lokalizasyonlarının hassasiyeti ortalama ~20 nm'dir; bu, tek molekülün lokalize olduğu güven aralığını tanımlar. Ancak, içsel floresans için test edilen örneklerin biyolojik yapısı yoktur, bu nedenle yapıların çözünürlüğü yorumlanamaz. Koherent Raman saçılma mikroskobisinin 250 - 300 nm37 çözünürlüklü olduğu, UV iki-fotonun ise 300 nm38 çözünürlükte olduğu bildirilmektedir. Koherent Raman saçma görüntülemenin sinyal-gürültü oranı 10 - 10039 büyüklüğündedir; UV 2-foton mikroskopisi için ise 2 - 20 (genellikle sinyal-her iken-standart sapma, SSDR olarak ifade edilir)40,41 içindir. SSMLM kullanılarak DNA içsel floresansı için SNR, düşük foton sayısı ve kamera algılama gürültüsünün getirdiği sınırlamalar nedeniyle yaklaşık 5'tir.

figure-results-1
Şekil 1: Tahmini sürelerle iş akışı. (A) Numune hazırlama, stokun çözülmesini, DNA jelinin hazırlanmasını ve görüntüleme tamponu eklenmesini içerir. Toplam süre, örnek ve ortama bağlı olarak 1-3 saat arasında değişir. (B) Her bir satın alma için özel tasarlanmış bir nanodelik dizisi örneğiyle kalibrasyon süreci gereklidir. Toplam kalibrasyon süresi yaklaşık 20 dakika olacak ve örnek araması (10.000 kare ve 50 ms pozlama süresi) dahil olmak üzere bir görüntü yığını için veri toplama süresi yaklaşık 10 dakika olacaktır. (C) Analiz boru hattı, FIJI ön işleme ve Python'da spektral analiz içerir. FIJI'de ön işleme yaklaşık 10 dakika sürerken, spektral analiz yerleşik kodlarla hızlıdır. Sunulan spektrumlar 16 bazlı Guanin'den toplanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Optik şema. Dört lazer çizgisi (405 nm, 488 nm, 532 nm, 647 nm) lazer hizalanması yoluyla ters mikroskopa yönlendirilir, böylece sistem stabil ve kullanımı kolay hale gelir. DWP, sCMOS kamerasının hemen önüne yerleştirilerek spektroskopik tek moleküllü algılamaya olanak tanır. DWP için kalibrasyon yapılırken, kamera ile DWP arasına bir filtre tekeri yerleştirilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Spektral kalibrasyon. Kullanılan kalibrasyon dalga boyları 532 nm, 580 nm, 633 nm, 680 nm ve 750 nm'dir. Bu merkezi dalga boylarına sahip dar bant genişliği filtreleri sıralı olarak DWP'den sonra ve kameradan önce yerleştirerek, farklı dalga boylarındaki yatay ve dikey kaymalara karşılık gelen kaymalar ölçülebilir ve piksel konumu ile dalgaboyu arasında kalibrasyon eğrisinin eşlenmesi mümkün olur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Seçilmiş çift zincirli ve tek zincirli DNA moleküllerinin sırasıyla 532 nm ve 488 nm uyarılma altındaki spektrumları. (A - B) GC_alter'nin doğrusal olmayan ve doğrusal olmayan spektrumları, her iki zinciri de 20 bazlı 5'-GCGCGCGCGCGCGCGCGCGC'3' olarak adlandırılan çift zincirli DNA molekülü türüne atıfta bulunur. Vurgulanmış yeşil spektrum ortalama eğriyi gösterir. (C - D) A10C10'un doğrusal olmayan ve doğrusal olmayan spektrumları, 40 baz uzunluğuna sahip ve 10 adenin ile 10 sitozin (5'- AAAAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCCAAAAAAAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3') tek zincirli bir DNA molekülü türüne atıfta bulunur. Vurgulanmış mavi spektrum ortalama eğriyi gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: İçsel DNA floresansı için kontrol deneyleri. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, hem tek zincirli hem çift zincirli DNA moleküllerinden DNA içsel floresansının tam spektrumunu yakalamak için ilk kez bir protokol sunuyoruz; bu protokol, örnek hazırlığından veri toplama ve hesaplama analizine kadar iş akışını kapsıyor. Bu protokol, dışsal problar yerine içsel floresans kullanılarak DNA moleküllerinin etiketsiz süper çözünürlüklü görüntülemesini sağlar. Prensipte, bu yaklaşım sabit hücrelere ve potansiyel olarak canlı hücre görüntülemesine de genişletilebilir; çünkü kimyasal etiketleme ve antikor tabanlı amplifikasyondan kaçınır. Çekirdek içindeki kromatin DNA, RNA ve farklı protein türlerini içerir; bu da DNA jelinden çok daha karmaşık bir sistemdir. Şu anda, DNA moleküllerinden düşük foton sayısı nedeniyle, sabit/canlı hücrelerde çekirdek içinden stokastik emisyonlar zordur. Ancak izole kromozomlar veya çekirdekler için DNA içsel floresans sinyali 16,24,27 olarak bildirilmişti. Ancak mevcut halinde, protokol sentezlenmiş DNA örnekleri kullanılarak in vitro ortamlarla sınırlıdır. Buna karşılık, nükleer DNA veya kromatini immünboyama ile etiketlemek genellikle uzun ve çok aşamalı işlemler içerir — söndürme, bloklama ve birincil ve ikincil antikor kuluçkaları dahil — ve bunlar birkaç saat sürebilir (genellikle hedef başına ~5 saat) ve doğal kromatin yapısına hem deneysel karmaşıklık hem de potansiyel bozulmalar getirebilir. Dış etiketleri ortadan kaldırarak, içsel floresans tabanlı görüntüleme sadece örnek hazırlanma süresini önemli ölçüde azaltmakla kalmaz, aynı zamanda hacimli floresan problar ve antikorlarla ilişkili yapısal bozulmalar ve bağlantı hatalarını da önler; böylece DNA'nın daha sadık nano ölçekli lokalizasyonu sağlanır.

Etiketsiz yapısına ve kavramsal sadeliğine rağmen, bu protokolün başarılı uygulanması birkaç kritik deneysel detaya dikkatli dikkat gerektirir. Örneğin, örnek hazırlığı sırasında, DNA jel oluşumu için yeterli zaman olmaması, tam forma edilmiş jellere kıyasla tespit edilebilir tek moleküllü lokalizasyonların sayısını azaltır. Genellikle, jelin oluşması yaklaşık 1,5 saat sürer. Çözelti tamamen kurutmadıysa, biraz daha bekle. 22 x 22 mm örtülü bir örtü için 5 μL görüntüleme tamponu yeterlidir; oysa daha fazla bir tampon hacmi sızıntıya yol açabilir; bu da nesnenin yağ batdırma arayüzünü bozabilir ve görüntüleme performansını olumsuz etkileyebilir. Eğer sızıntı olursa, laboratuvar mendiliyle dikkatlice çıkarılabilir. Odaklanırken, hedefi en alt z konumundan yavaş yavaş yükseltin. Amaç daldırma yağını aktive ettikten sonra, sık sık stokastik tek molekül emisyon olayları yaşanan odak düzlemini tanımlamak için ince ayarlama modunu kullanın. Büyük jel kümeleri, üst üste binen birinci dereceden spektrumlarla toplanmış sinyaller üretirse, alternatif bir görüntüleme alanı seçin.

Avantajlarına rağmen, bu protokolün uygulanabilirliği ve performansı değerlendirilirken dikkate alınması gereken birkaç önemli sınırlama vardır. Birincisi, doğru spektral çıkarma, bireysel tek moleküllü olaylar arasında yeterli mekansal ayrım gerektirir; Büyük DNA jel kümelerinden veya yoğun şekilde paketlenmiş makromoleküler yapımlardan kaynaklanan yüksek lokalizasyon yoğunlukları, üst üste binen birinci dereceden spektral izlere yol açabilir ve bu da güvenilir spektrum yeniden yapılandırmasını karmaşıklaştırabilir veya engelleyebilir. İkinci olarak, yöntem optik hizalama ve odak kararlılığına hassastır; çünkü çift kamalı prizmanın küçük hizalanmaları veya optimal odak düzleminden sapmalar dalga boyu kalibrasyonunda sistematik hatalara yol açabilir ve sinyal-gürültü oranını azaltabilir. Üçüncü olarak, protokol şu anda spektral karıştırmayı uygulamamaktadır; bu da yüksek moleküler yoğunluklu veya birden fazla spektral olarak örtüşen türlere sahip örneklerde kullanımını sınırlamaktadır. Bu faktörler birlikte, yöntemin pratik çalışma rejimini tanımlar ve protokolü daha karmaşık veya kalabalık biyolojik sistemlere genişletirken dikkatlice değerlendirilmelidir.

Bu protokolde RainbowSTORM yalnızca spektral kalibrasyon için kullanılır, ancak yazılım ayrıca 2B/3D kalibrasyon, sSMLM veri analizi ve görüntü yeniden yapılandırması için güçlü araçlar da sağlar. Bu tür analiz araçları, spektroskopik süper çözünürlüklü görüntülemede mekânsal lokalizasyon bilgisini spektral okumalarla bağlamak için oldukça uygundur ve bu protokolün gelecekteki uzantılarında daha da kullanılabilir. Son olarak, bu protokol RNA, tubulin gibi diğer biyolojikmakromolekül türleri 43,44,45 için potansiyel olarak uygulanabilir. Tespit edilen spektrum, derin öğrenmemodelleri 46 gibi hesaplamalı modellere de beslenebilir; böylece sınıflandırma yapılabilir; böylece farklı aydınlatma altında içsel spektrumlardan ve fotofiziksel özelliklerden dizi veya moleküler yapıyı tahmin edebilir. Bu çalışma ayrıca, doğal yapıların dış etiketlenmesi veya denatürizasyonundan kaçınan etiketsiz, moleküler özgül kromatin görüntülemenin yolunu açmaktadır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden çıkarları olmadığını belirtirler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden R02CA225002, U54CA261694, R01CA289294 ve U54CA268084 hibeleri ile Ulusal Bilim Vakfı'ndan CBET-2430743 hibesi ile desteklenmiştir. Prof. Hao F. Zhang'ın Northwestern Üniversitesi'ndeki laboratuvarına, spektroskopik SMLM sisteminin önemli bir parçası olan çift kamalı prizma cihazı için teşekkür ediyoruz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
görüntüleme için 488 nm emisyon filtresiChroma Technology Corp.ET525/50M
Kalibrasyon için 532 nm bant geçirici filtreThorlabsFL532-3
görüntüleme için 532 nm emisyon filtresiChroma Technology Corp.ET620/60M
Kalibrasyon için 580 nm bant geçişli filtreThorlabsFB580-10
Kalibrasyon için 633 nm bant geçişli filtreThorlabsFL632.8-3
Kalibrasyon için 680 nm bant geçişli filtreThorlabsFB680-10
Kalibrasyon için 750 nm bant geçişli filtreThorlabsFB750-10
Beta-merkaptoetanol SigmaM6250
BME görüntüleme tamponuNANA7 μ L GLOX, 7 μ L Beta-merkaptoetanol ve 690 μ L glikoz tamponu
Sığır karaciğerinden katalazSigmaC100
DABCO (1,4-di-azobisicyclo-(2.2.2.)-oktan)SigmaD27802
DABCO görüntüleme tamponuNANA65 mM DABCO+30 mM Sodyum sülfit + 30 mM DTT 1 M  DNAse'de, RNAse serbest deionize su. Sodyum sülfit PBS ile 10 kez çözünmelidir; görüntüleme tamponunu oluşturmadan önce 1 M'ye kadar devam eder.
Spektroskopik SMLM için DNA deplexiIDTNA20 tabanlı çift çift zincirli GC_alter, GC_conti, AT_alter ve AT_conti.
Örneğin GC_alter her iki iplik de 5' olarak - GCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCCGCGCGCCGCGCGCGCGCGCGCG GC_conti bir ipliği 5' uzunluğunda - GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG diğeri ise 5' olarak - CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC - 3'
Tüm örnekler HPLC standardındadır.
DNA oligonukleotid/çift zincirli DNAIDTNA
Spektroskopik SMLM için DNA oligolarıIDTNA20 tabanlı A, G, C, T; 40 tabanlı tek zincirli AC zinciri (A1C1, A5C5, A10C10, A20C20);   tek zincirli 5-, 8-, 12-, 16-bazlı Guanine.
Örneğin A10C10 is
5'- AAAAAAAACCCCC
CCCCCAAAAAAAA
AACCCCCCCCCC - 3'
Tüm örnekler HPLC standardındadır.
DNaz/RNase-Serbest Damıtılmış SuInvitrogen10977015
DTT (DL-Ditiothreitol)Sigma43816
GLOXNANA14 mg glikoz oksidaz, 50 μ L katalaz (17 mg/ml) + 200 μ L tampon A, yani 10 mM Tris (pH 8.0) ve 50 mM NaCl. 
Glikoz tamponuNANA50 mM Tris (pH 8.0), 50 mM NaCl ve %10 glikoz. 
Glukoz oksidazSigmaG7141
Glikoz, tozThermo Fisher15023021
PBS (10X)Thermo FisherJ62036. K3
PBS (1X)Gibco10010023
Sodyum klorürThermo Fisher424290010
Sodyum sülfit SigmaS0505
Tris (1M) pH 8.0InvitrogenAM9856

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ellis, R. J., Minton, A. P. Join the crowd. Nature. 425 (6953), 27-28 (2003).
  2. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780(1994).
  3. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  4. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  5. Gustafsson, M. G. L. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
  6. Hell, S. W., Kroug, M. Ground-state-depletion fluorescence microscopy: a concept for breaking the diffraction resolution limit. Appl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).
  7. Fölling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
  8. Ricci, M., Manzo, C., García-Parajo, M. F., Lakadamyali, M., Cosma, M. Chromatin fibers are formed by heterogeneous groups of nucleosomes in vivo. Cell. 160 (6), 1145-1158 (2015).
  9. Bintu, B., et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 362 (6413), eaau1783(2018).
  10. Matsuda, A., et al. Condensed mitotic chromosome structure at nanometer resolution using PALM and EGFP-histones. PLoS One. 5 (9), e12768(2010).
  11. Bohn, M., et al. Localization microscopy reveals expression-dependent parameters of chromatin nanostructure. Biophys J. 99 (5), 1358-1367 (2010).
  12. Acosta, N., et al. Three-color single-molecule localization microscopy in chromatin. Light Sci Appl. 14, 7(2025).
  13. Almassalha, L. M., et al. Label-free imaging of the native, living cellular nanoarchitecture using partial-wave spectroscopic microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (42), E6372-E6381 (2016).
  14. Beerman, T. A., et al. Effects of analogs of the DNA minor groove binder Hoechst 33258 on topoisomerase II and I mediated activities. Biochim Biophys Acta. 1131 (1), 53-61 (1992).
  15. Cadet, J., Anselmino, C., Douki, T., Voituriez, L. New trends in photobiology. J Photochem Photobiol B. 15 (4), 277-298 (1992).
  16. Dong, B., et al. Superresolution intrinsic fluorescence imaging of chromatin utilizing native, unmodified nucleic acids for contrast. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (35), 9716-9721 (2016).
  17. Vayá, I., Gustavsson, T., Miannay, F., Douki, T., Markovitsi, D. Fluorescence of natural DNA: from the femtosecond to the nanosecond time scales. J Am Chem Soc. 132 (34), 11834-11835 (2010).
  18. Anders, A. DNA fluorescence at room temperature excited by means of a dye laser. Chem Phys Lett. 81 (2), 270-272 (1981).
  19. Plessow, R., Brockhinke, A., Eimer, W., Kohse-Höinghaus, K. Intrinsic time- and wavelength-resolved fluorescence of oligonucleotides: a systematic investigation using a novel picosecond laser approach. J Phys Chem B. 104 (15), 3695-3704 (2000).
  20. Takaya, T., et al. UV excitation of single DNA and RNA strands produces high yields of exciplex states between two stacked bases. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (30), 10285-10290 (2008).
  21. Bancaud, A., et al. A fractal model for nuclear organization: current evidence and biological implications. Nucleic Acids Res. 40 (18), 8783-8792 (2012).
  22. Daban, J. R. High concentration of DNA in condensed chromatin. Biochem Cell Biol. 81 (3), 91-99 (2003).
  23. Bohrmann, B., et al. Concentration evaluation of chromatin in unstained resin-embedded sections by means of low-dose ratio-contrast imaging in STEM. Ultramicroscopy. 49 (1-4), 235-251 (1993).
  24. Dong, B., et al. Stochastic fluorescence switching of nucleic acids under visible light illumination. Opt Express. 25 (7), 7929-7944 (2017).
  25. Gong, R., et al. DNA spectroscopic intrinsic-contrast photon-localization optical nanoscopy. Proc SPIE. 13326, 133260F(2025).
  26. Wang, G., et al. Label-free DNA spectroscopic photon-localization nanoscopy. Optica Biophotonic Congress. , (2025).
  27. Eshein, A., et al. Sub-10-nm imaging of nucleic acids using spectroscopic intrinsic-contrast photon-localization optical nanoscopy (SICLON). Opt Lett. 43 (23), 5817-5820 (2018).
  28. Song, K. H., et al. Monolithic dual-wedge prism-based spectroscopic single-molecule localization microscopy. Nanophotonics. 11 (8), 1527-1535 (2022).
  29. Song, K. H., Sun, C., Zhang, H. F. Design strategy for a dual-wedge prism imaging spectrometer in spectroscopic nanoscopy. Rev Sci Instrum. 94 (2), 023702(2023).
  30. Yeo, W. H., Sun, C., Zhang, H. F. Physically informed Monte Carlo simulation of dual-wedge prism-based spectroscopic single-molecule localization microscopy. J Biomed Opt. 29 (S1), S11501(2023).
  31. Davis, J. L., et al. RainbowSTORM: an open-source ImageJ plug-in for spectroscopic single-molecule localization microscopy (sSMLM) data analysis and image reconstruction. Bioinformatics. 36 (19), 4972-4974 (2020).
  32. Davis, J. L., et al. RainbowSTORM v2 (MATLAB app). , https://github.com/FOIL-NU/sSMLM-protocol (2020).
  33. Brenner, B., et al. Implementation and calibration of spectroscopic single-molecule localization microscopy. BMC Methods. 2 (1), 2(2025).
  34. sSMLM for DNA intrinsic fluorescence (Python scripts). , Backman Lab. https://github.com/BackmanLab/sSMLM-for-DNA-intrinsic-fluorescence (2025).
  35. N-STORM protocol. , Molecular Vista. Available from: https://www.mvi-inc.com/wp-content/uploads/N-STORM+Protocol.pdf (2014).
  36. Abdelsayed, V., Boukhatem, H., Olivier, N. An optimized buffer for repeatable multicolor STORM. ACS Photonics. 9 (12), 3926-3934 (2022).
  37. Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Phys Rev Lett. 82 (20), 4142(1999).
  38. Benninger, R. K. P., Piston, D. W. Two‐photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Curr Protoc Cell Biol. 59 (1), 4-11 (2013).
  39. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Ann Rev Biomed Eng. 17 (1), 415-445 (2015).
  40. Song, J., et al. SNR enhanced high-speed two-photon microscopy using a pulse picker and time gating detection. Sci Rep. 13 (1), 14244(2023).
  41. Luu, P., Fraser, S. E., Schneider, F. More than double the fun with two-photon excitation microscopy. Comm Biol. 7 (1), 364(2024).
  42. Van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
  43. Wang, D., et al. Research progress on the luminescence of biomacromolecules. J Mater Sci Technol. 76, 60-75 (2021).
  44. Varejão, N., Reverter, D. Using intrinsic fluorescence to measure protein stability upon thermal and chemical denaturation. Methods Mol Biol. 2581, 229-241 (2023).
  45. Sindrewicz, P., et al. Intrinsic tryptophan fluorescence spectroscopy reliably determines galectin-ligand interactions. Sci Rep. 9 (1), 11851(2019).
  46. Ho, C. S., et al. Rapid identification of pathogenic bacteria using Raman spectroscopy and deep learning. Nat Commun. 10 (1), 4927(2019).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

DNA Molek l G r nt lementrinsik Floresansaretleyicisiz Genomik G r nt lemeTek Molek l LokalizasyonuDNA Jel Haz rlamaSpektral AnalizStokastik G z K rpmaThunderSTORM EklentisiRainbowSTORM Yaz l m

İlgili makaleler