Yöntem makalesi

Esnek ve Güvenilir Yapıştırma için Erişilebilir Silikon Çip-Membran Sızdırmazlık Prosedürü

818 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/69980

⸱

20 Mart 2026

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Medical Biology, EXPIRE Lab, University of Groningen, University Medical Center Groningen, 2GRIAC Research Institute, University of Groningen, University Medical Center Groningen, 3Department of Biomaterials and Biomedical Technology, University Medical Center Groningen, University of Groningen, 4Tissue Engineering and Cells Therapy Group (GITTC), School of Medicine, University of Antioquia, Alma Mater Hospital of Antioquia, 5Department of Pulmonary Diseases, University Medical Center Groningen, University of Groningen

Bu makalede

Özet

Polidimetilsiloksan (PDMS) çip cihazlarının zarları için su geçirmez silikon bazlı contalar üretmek için yenilikçi bir sızdırmazlık protokolü. Laboratuvarlarda çip modelleri kurmak ve küçük ölçekli çip platformu geliştirme için tasarlanmıştır. Protokolü plastik ve doğal doku zarları kullanarak gösteriyoruz. Bu işlem yalnızca PDMS, toluen, küf, membran ve vakum odası gerektirir.

Özet

Organ-on-Chip platformları, biyomedikal araştırmaların hızla büyüyen bir yönüdür. Bu alanın genişlemesi, inşa ve uygulama için çeşitli materyaller ve metodolojiler ortaya çıkarmıştır. Ticari olarak sağlanan veya akademide geliştirilen farklı cihazların sayısı artmaya devam ederken, Organ-on-Chip alanına giren yeni araştırmacılar için genellikle büyük bir adım atılması gereken büyük bir gelişme vardır. Hem yeni hem de devam eden çip teknolojilerinde temel sorunlardan biri, çip cihazlarının güvenli ve sızıntısız bir şekilde mühürlenmesi sağlanmasıdır. Bu makalede, silikon çipler ile farklı malzemelerden yapılmış üç kültür membranı arasında güvenilir su geçirmez bağlantılar sağlayan bir çip sızdırmazlık iş akışını sunarak çip geliştirmeye yeni bir yol sunuyoruz. Sunulan prosedür, sınırlı giriş materyalleriyle yeni çip geliştirme için erişilebilir olup hava-sıvı arayüzü (ALI) Organ-on-Chip sağlar. Bu çipler, gözenekli bir zardan beslenen ve apikal olarak havaya maruz kalan hücre kültürü için tasarlanmıştır; örneğin bağırsak-, deri veya burada sunulan durumda olduğu gibi, Çip üzerindeki hava yolu-da. İki farklı çip kalıp 3D tasarımı sunuyoruz; bunların ticari olarak mevcut plastik zarlara ve domuz ekstraselülüler matriks (ECM) iskelelerine bağlanmasını gösteriyoruz. Bu Airway-on-Chip cihaz kendi içinde üretilebilir; karşılaşılabilecek farklı engeller burada sunuluyor ve bunların önceki Hava Yolu Çip olarak kullanımlarının bir vitrini sunuluyor. Bu yeni sızdırmazlık prosedürü, toluenle inceltilmiş Polidimetilsiloksan (PDMS) harcının süpürülmesini ve toluenin çıkarılmasını içeriyor; bu da gözenekli plastik veya doğal ECM membran yüzeyine ince ve güçlü bir silikon tabaka yerleştiriyor. Bu prosedürün ikinci yeniliği, birbirine kapatılan malzemelerdeki farklı termal genleşme nedeniyle membranların bozulmasını önlemek için PDMS harcının oda sıcaklığında kürlenmesidir. Bu, test edilen malzemeleri bağlamak için geniş çapta uygulanabilir bir tekniğe yol açar ve içsel kültür membranlarına sahip çok odalı PDMS çipleri üretilir.

Giriş

Organ-on-Chip cihazları, biyomedikal araştırmaların temel taşlarından biri haline geliyor; dünya genelindeki laboratuvarlarda geliştirilen çok çeşitli ticari ve açık erişimlimodeller 1. Bu modeller araştırmanın önemli bir parçası haline gelerek geleneksel statik plastik ve hayvanmodellerinin yerini almaya devam ettikçe 2,3, bu modellerin dünya çapında çeşitli geçmişlere sahip araştırmacılar tarafından kolayca erişilebilir ve erişilebilir olması giderek daha önemli hale gelmektedir. Bunun merkezinde, girdi ve üretim maliyetlerinden bağımsız olarak özelleştirilmiş, küçük partili geliştirme sağlanabilmeerişilebilirliği 4, özellikle ticari olmayan veya akademikmodellerde 1.

Çip Üzerinde teknolojilerdeki en büyük zorluklardan biri, akış sırasında sızıntı olmadan çiplerin güvenli bir şekilde sızdırmazlık sağlamasıdır. Çip cihazlarında sızıntı testleriyle ilgili yakın tarihli bir incelemede, hem endüstride hem de akademide model ve deneysel başarısızlık için en üst düzey bir yöntem olarak odalar arasında veya çevreye sızıntıolduğunu belirtti 5,6. Başarılı bir sızdırmazlık elde edememesinin birçok nedeni vardır: cihazların küçük boyutları, uygulanan akış ve basınç, ve öncelikle bu cihazların katmanlar halinde birbirine kapatılmış ve farklı süreçlerle köprülenmiş farklı malzemelerdenoluşması 6. Çip platformlarında kültür membranı olarak kullanılan farklı malzemelerin yelpazesi, polietilen tereftalat (PET), polikarbonat (PC), PDMS ve ECM membranları dahil olmak üzere, uygulama alanları kadargeniştir. Bunun sonucunda, bu farklı malzemeleri nihai cihazlara bağlamak için birçok farklı prosedür ve tedavi mevcuttur. Bu prosedürler arasında yapıştırıcı/PDMS ile sıkıştırma, plazma aracılı silan kimyası, yapıların kimyasal işlevselleştirilmesi, elektrospin ve buharlaştırılmış çözücü bağlanması yer alır; bunlar model7'deki malzemelere bağlı olarak yer alır. Bu süreçlerin farklı beceri setleri ve laboratuvar ortamları gerektirmesi, Çip Üzerinde araştırmanın akademik erişilebilirliğine bazı sınırlamalar getirir. Ticari sistemlere dahil olmanın maliyetleri ve kısıtlamaları akademik erişimi sınırlarken, çip ve gerekli ekipman üretiminin uzun, çok aşamalı süreçlerinin bağımsız akademik gelişimlerini sınırladığı tespitedilmiştir 1,8,9. Bu araştırmanın önünde, güncel konulardan biri, modellerin tekrarlanabilirlikleri için standartlaştırılması ve doğrulanmasıdır10,11. Ancak bu noktaya ulaşırken birçok laboratuvar için çip geliştirmeye başlamak, belirli araştırma sorularını yanıtlamak, hayvan çalışmalarını değiştirmek ve daha biyolojik olarak ilgili modellerde çalışmak için bir boşlukvar.

Bu makalede, çoğu araştırma ortamında yalnızca beceri ve ekipman gerektiren bir çip sızdırmazlık iş akışını sunuyoruz. Bu prosedür, üç farklı membran malzemesi için su geçirmez PDMS çip-membran arayüzleri üretir. Süreç yalnızca sınırlı aktif çalışma süresi gerektirir, çip dışı laboratuvar ortamlarında uygulanabilir ve küçük parti çip üretiminden orta partiye ölçeklenebilir.

Sunulan sızdırmazlık prosedürü gözenekli plastik veya ECM membranlarıyla gerçekleştirilebilir; Sunulan örnek çipler, hava maruziyeti olan bir hava yolu cihazı olarak uygulanmak üzere bu prosedürle oluşturulmuştur. Bu işlem, zarlar işlem için gerekli olan gözenekler içerdiği takdirde benzer diğer cihazlar için de kullanılabilir. Sağlanan çiplerin birincil uygulaması ALI kültürü ve hava yolu epitel hücreleri içindir, ancak diğer uygulamalar ve mezenkimal hücreler veya bağırsak hücreleriyle birlikte kültür modelleri için de kullanılabilir, örneğin 8,13. İlk sunulan çip, büyük ölçekli kültür alanına (92 mm2) sahip standart bir hava yolu üzerine çiptir ve iki kültür odası bulunur; bunlar arasında hava maruziyeti için apikal bir oda, gözenekli bir membranla bazal odadan ayrılır; bu odada medium ve isteğe bağlı başka bir su altında kültürlenmiş hücre tipi (örneğin, fibroblastlar, endotel hücreler) bulunur. ALI uygulamaları için, apikal tohumlanmış hücrelerin üst kanala medya sızmasını önlemek için sıkı bir bariyer koruyabilmesi çok önemlidir. İkinci çip birincinin tasarımıyla aynıdır; zarın her iki yanında iki ek odaya sahiptir; burada domuz ECM kullanılarak kültür zarının gerilmesini sağlar, böylece negatif basınç uygulanarak doğal bir hava yolunun gerilmesini taklit eder.

Sızdırmazlık sürecimiz, PDMS çip geliştirme alanından birkaç unsuru iki farklı yeni koşullar ekleyerek bir araya getiriyor. İlk olarak, tozunla inceltilmiş PDMS harcına vakumun hızlı uygulanması; bu da toluenin zarlara kimyasal saldırısını önler, silikonla membranın gözeneklerine veya yüzey özelliklerine girmesini teşvik eder ve ince yer değiştirmeye dayanıklı bir yüzeye yol açar. Toluen, katı PDMS yüzeylerinde şişlik ve deformasyon oluşturur, ancak yüksek konsantrasyonlarda bir çözücü olarak işlev görür, bu nedenle bu işlemde sıvı PDMS'yi inceltmek için kullanılır. Burada kullanılan PC ve PET zarları gibi plastikler için, toluen hızla kaldırılmazsa bozulma ve stres çatlamasına neden olur. Harcı elle uygularken yalnızca önceden yapılmış çip-yarı duvarına uygulanması ve kültür alanına hiç girmemesi dikkat edilmelidir; çünkü bu kültür zarlarının gözeneklerini tıkayacak ve hücre kültüründe bozulma ve değişime yol açacak PDMS alanları üretir. İkinci olarak, PDMS harcının oda sıcaklığında (RT) 72 saatten fazla kürlenmesi, membranın hem çip yarısından hem de harçtan kaymasını engeller; bu durum, termal genleşmeden sonra malzemelerin farklı derecelere küçülmesiyle gerçekleşebilir.

3D yazıcı veya mikro-frezen ile ( Ek Dosya 1, Ek Dosya 2'de açıklandığı gibi) iki çip kalıp tasarımı ve PDMS ile toluen14'ten ince bir harç oluşturma yöntemini sunuyoruz. Bu yöntem, bir cihaz içinde ticari plastik zarların (PET, PC) sızdırmazlığını sağlar. Ayrıca, aynı çipi domuz doğal ECM membranıyla oluşturarak döngüsel esneme yeteneğine sahip biyolojik bir çip üreterek bu sürecin uygulama aralığını test ettik. Organ-on-Chip'ler, in vivo ortamın fizyolojik özelliklerini taklit etmeyi amaçladığından, nefes alma sırasında vücutta deneyimlenen mekanik kuvvetleri, örneğin akan havadan kaynaklanan kesme gerintileri ve daralan hava yollarının mekanik manzarası gibi mekanik kuvvetleri üretebilen Airway-on-Chip'ler biyolojik olarak son derece önemlidir16. Kullanılan zar, bazal membran, lamina propria ile birlikte kollajen, laminin ve çevresindeki diğer matriks proteinlerinden oluşur. Bildiğimiz kadarıyla, bu ilk doğal bazal membran bazlı çip olup, esneme olasılığına sahip ilk çiptir; böylece örneğin nefes alma gibi mekanik stresin silikon olmayan ECMmembranı 15 üzerinde taklit edilmesini kolaylaştırır. Bu yenilikçi uygulama, plastik ve ECM ile mühürleme işlemimizin işlevini vurguluyor. Son olarak, bu çip ve membran sızdırmazlık prosedürünün, ALI hücrekültürü 8 için kullanılabilecek bir Hava Yolu Çip olarak uygulanmasını sunuyoruz.

Protokol

Bu çalışma, Hayvanlar Üzerinde Deneyler Yasası kapsamında etik kurul onayı dışında tutuldu çünkü malzemeler ölüm sonrası temin ediliyordu ve hiçbir hayvan bilimsel amaçlarla kurban edilmedi (Wet op de dierproeven). Birincil insan hava yolu epitel hücrelerinin izolasyon protokolü, Groningen Üniversitesi Tıp Merkezi araştırma koduna (14 Ocak 2025'te erişilmiştir https://umcgresearch.org/w/research-code-umcg ve insan vücudu materyalinin kullanımına ilişkin ulusal ve etik mesleki yönergelere (https://www.coreon.org/wp-content/uploads/2020/04/coreon-code-of-conduct-english.pdf 14 Ocak 2025'te erişilmiştir) doğrultusunda yapılmıştır. Bu çalışma, trakeobronşial doku nakillerden kaldığı ve Hollanda Medeni Kanunu ile Wet op de orgaandonatie (bağışçı yasası) uyarınca tamamen anonimleştirildiği için etik kurul onayı gerekliliğinden muaf tutuldu.

1. Çip-yarım ve Membran Hazırlığı

  1. Çip Üretimi
    1. İndir. Bu makalenin Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2'den çipin üst ve alt yarısı için STL tasarım dosyaları. Üst kalıp 5 mm derinliğinde bir chip-half üretir, alt kalıp ise 3 mm derinliğinde chip-half üretir; Her iki çip yarısında da 1 mm derinliğinde kültür odaları bulunur. Alternatif olarak, uygun CAD yazılımı kullanarak bir çip tasarımı üretin.
    2. 3D baskı için bir dilim dosyası ya da çip kalıplarını mikro frezeleme için frezeleme yolu hazırlayın. Mikro frezelemeli kalıplar kullanıma hazır olacaktır; Reçine baskılı kalıplar, PDMS kalıbı olarak uygun şekilde hazırlanmak için UV çapraz bağlamadan önce iki adet 24 saat 99,9% etanol yıkaması gerektirir.
  2. PDMS çip yarısı üretimi (Şekil 1)
    1. Sıvı PDMS bazını kürleyici maddeyle 10:1 oranında iyice karıştırın ve tüm hava kabarcıkları temizlenene kadar vakum odasında degasörün.
    2. Kalıpları geniş bir nozüllü şırıngayla doldurun, tüm kabarcıklar temizlenene kadar vakum odasında ~10 dakika gaz kullanın. Kalıpları kuru fırına 2 saat boyunca 65 °C'de sertleşene kadar koyun.
    3. Kalıplardan katı talaş yarılarını bir bistürpelle çıkarın ve kenarlarından flaşları kesin. Odanın her iki ucundaki üst yarıya dört giriş ve alt odanın girişlerinin yerini gösteren iki bitişik halka biyopsi punch'ı ile ekleyin.
      NOT: Sunulan sonuçlar için 2 mm biyopsi punch kullanıldı ve kültür sırasında ortam ve hava akışı için 2 mm silikon tüp yerleştirildi. 1 mm ve 2 mm girişler, sırasıyla 200 ve 1000 μm uç boyutlarına karşılık gelen pipetle hücre tohumlamasını kolaylaştırır. Diğer delik boyutları farklı boru veya pompa sistemleri için kullanılabilir.
  3. Zar hazırlığı (Şekil 2)
    1. İndir. Bu makaledeki Ek Dosya 3'ten membran şablonu için STL tasarım dosyaları. Şablonu 3D baskı veya eşdeğer bir üretim yöntemiyle hazırlayarak tutarlı bir membran şekli elde edin.
    2. Şablonu PET veya PC membranının üzerine yerleştirin, membran bir neşterle şekil alınırken sıkıca tutun.
      NOT: Bu noktada, membranlar bir petri kabında hücre kültürü için matris proteinleriyle kaplanabilir ve membran bağlanmasını bozmadan. Bu, sadece zarın hücre büyümesi için işlevselleştirilmesini sağlar ve PDMS duvarlarını daha önce tarif edildiği gibi hücresizbırakır 8.

2. Zar bağı

  1. PDMS Havan Hazırlığı
    1. Sıvı PDMS (adım 1.2.1) ile toluen 7:5 oranında karıştırın ve daha önce tarif edildiği gibi geniş nozullu bir şırıngayla yukarı aşağı şırınga ile iyicekarıştırın 14. Her çip için sadece 8 damla gerekir; Her parti için 1,4 mL toluen içeren 1,4 mL PDMS önerilir ve bu ölçekte 8 çip için yeterlidir. Düzenli harç karışımı, güvenilir membran bağlanması için önemlidir.
      DIKKAT: Toluen uçucu ve son derece yanıcıdır. Maruziyet, sinir ve solunum sistemlerine zarar verebilir. Sadece buharlı davlumbaz içinde, herhangi bir ateşleme kaynağından uzak bir yerde kullanın ve emici malzeme ile havalandırma ile dökülmeleri kontrol edin. Kullanım sırasında sıçramadan ve geçirimsiz (nitril) eldivenlerden korunmak için koruyucu gözlük takın. Tüm laboratuvar malzemelerini (pipet uçları, kaplar vb.) 24 saat boyunca duman kaponunda bırakın, bundan sonra toluen buharlaşmış olur ve tüm malzemeler uzman atık hizmetleri aracılığıyla onaylı, etiketlenmiş kaplara atılabilir. Tolueni asla lavaboya atmayın. Daha fazla bilgi için Güvenlik Veri Formu'na (SDS) bakabilirsiniz.
      NOT: Havanı kullanım noktasında, erken toluen buharlaşmasını ve plastik kontaminasyonu önlemek için cam olmayan bir kapta, tercihen tek kullanımlıkta hazırlanın ve kullanımdan sonra doğrudan atın. PDMS camın yüzeyini sertleştirir ve kısmen çıkarılamaz olur; Toluen, laboratuvarda yaygın olarak kullanılan çoğu plastiği çözer ve zarar verir.
  2. PET/PC Membran Ekeri (Şekil 2)
    1. Harcı hızla PDMS çip-yarısının yüzeyine uygulayın; burada zar pipet ucu ile yerleştirilecek.
      NOT: Zarın altındaki tüm alan harç ile ıslatılmalıdır. En ince katmanı elde etmek için ucuyla sıkı bir tutuş uygulanmalıdır. Mikroskopi katmanların 3 ile 5 μm arasında olduğunu gösterir.
    2. Hazırlanan membranı (adım 1.3) bir ucunda temiz bir forseps ile tutun, uçunu ıslak harç üzerine çip için doğru konuma yerleştirin ve membranın yerine düşmesine izin verin.
      NOT: Bu noktadan sonra zarın kaymasına izin vermeyin; Islak PDMS odaya girdiğinde, zar üzerinde düzensiz ve kullanılamaz duvarlar oluşturur. Kayma olursa, silikon kültür alanını kaplayacak ve bu da zarın her iki tarafındaki hücre kültürü potansiyelini bozar, zarı atır ve önceki adımı tekrarlar.
    3. Zarı forsepsle nazikçe yerinde tutun ve PDMS harcını membranın üstüne tekrar uygulayın; her vuruşta kamarcıqları çıkararak membranı orijinal konumundan hareket ettirmeden sabitlemek için odadan nazikçe uzaklaşın.
      NOT: PDMS'yi zarın iç kültür bölgesine uygulamamaya dikkat edin; Bu çok önemlidir çünkü silikon hücre yapışmasını önler ve kültür zarının doğal yüzeyini bozur.
    4. Çip yarılarını ıslak harç tutturulmasından hemen sonra membranlı bir vakum odasına yerleştirin ve 25 mBar vakum altında oda sıcaklığında 72 saat boyunca kürleyin.
      NOT: Zarları bağlı olan çip yarıları oda sıcaklığında kürlenmelidir. PET/PC ve PDMS farklı derecelerde termal genleşme yaşar ve ısı kürleme, silikon soğudukça genletip sonra küçülür, böylece şişmiş bir membran oluşur (Şekil 3).
  3. Tam Çip Yapımı
    1. Membrana bağlı çip yarıları artık çipin ikinci yarısına bağlanabilir. En tutarlı sonuçlar için her iki yarıyı O2 Plazma tedavisine (320 mBar, 30 s) maruz bırakın ve hafif baskı altında elle hızlıca birbirine bastırın.
      DIKKAT: Oksijenli plazma fırınları oksijenle doygun ortamlar, ozon gibi tehlikeli oksitler ve yoğun UV radyasyonu üretir. Fırınlar iyi havalandırılan bir alana veya buhar davlumbazına kurulmalıdır. Fırın penceresi tüm UV radyasyonlarını engellemeli, ancak gözlük takmak tavsiye edilir. Yanıcı maddeler ve metaller oksijen plazma alanından uzak tutulmalıdır; böylece hızlı yanma veya toksik gaz salınımını önleyebilir. Oksijen plazması SDS belgesine başvurmak, bu protokolde belirtilen materyaller dışındaki herhangi bir malzeme için gereklidir.
      NOT: Plazma fırını yoksa, benzer bir bağlanma plazma çubuğu ile veya ikinci yarıya PDMS harç uygulanarak ve yarıları oda sıcaklığında hafif sıkıştırma altında 72 saat13 boyunca kürleyerek sağlanabilir. TamO2 Plazma fırınına kıyasla daha az etkili olsa da, bu seçenekler fırın bulunmadığında kullanılabilir.

Sonuçlar

Membran Mühür Bütünlüğü Testi
Mühürlenmiş çipin bütünlüğünü test etmek için, üst kültür odası mavi boyalı yarı su ile, alt kısmı ise saf yarı su ile doldurulur. Kırplar gece boyunca bırakılır ve üst odadan membranın çevresindeki alt odaya mavi boya sızıntısı değerlendirilir.

Yöntemimizle hazırlanan tam donanımlı silikon çipler, membran bütünlüğünü bozmadan uzununa 35° açıya deforme edilebilir; şimdi üst yarıya her iki tarafta esnek PDMS harç ile bağlanır. PDMS çiplerinin deformasyonu, örneğin yarılar veya çipler petri kabına yapıştığında kullanımın normal bir parçasıdır.

Çipler, akış kaynaklı basınçla performanslarını test etmek için çift yönlü bir şırınga pompası sistemine bağlandı. PET ve PC membranlı çipler, odalar arasında sızıntı veya çiplerin patlaması olmadan 30 kPa'ya (pompaların sağladığı maksimum basınç) kadar çalıştırılabilir. Önceki çalışmalarda, çipler standart olarak 150 μL/s hızında çalıştırılır ve bu da her cihazın odalarına 0.7 Pa basınçuygular 8.

Zar bağlanmasının görselleştirilmesi
RT vakum mühürleme sonucu sıvı PDMS harcının mikroskop altında membranın 0,4 μm gözeneklerine girmesini görselleştirmek için PDMS harç Nil Kırmızısı ile boyandı. Nil Kırmızısı, hidrofobik bir boya olduğu ve sıvı haliyle PDMS ile iyi karıştığı için seçilmiştir. Boya, ışık mikroskopisi altında kırmızı renk elde etmek için sıvı PDMS ile %1 Nil Kırmızısı iyice karıştırılarak hazırlanmıştır. RT kürleme işlemi yukarıda açıklandığı gibi tekrarlandı. Boyalı harç ile membranlar parafine gömülüp mikrotom kullanılarak kesitlenmiştir. Zar dilimleri cam slaytlara monte edilip ışık mikroskobu kullanılarak görüntülendi (Şekil 4). PDMS'nin toluen ile harca inceltilmesi ve PDMS'nin membran gözeneklerine girmesi için vakum uygulanması gerekliliğini doğrulamak için, bu yöntemlerle ve olmadan zarların karşılaştırılması Ek Şekil 3'te görülebilir.

Hücre Yaşam Testi
Önceki bir çalışmada, cihazların yapımında toluen kullanımından kaynaklanan potansiyel kimyasal toksisite test edildi. Çipler, PDMS harcında toluenle ve toluen olmadan hazırlandı, insan akciğer adenokarsinomu epitelyal Calu-3 hücreleri 2 gün boyunca birleşimle yetiştirildi ve daha önce tanımlandığı gibi çiplerde 1 günkültürlendi. 8. Hücre ölümü, Trypan mavisi boyama ile değerlendirildi; cihazdan tüm hücreler çıkarıldı ve ölü hücreler (mavi) lekelenmemiş canlı hücrelere karşı sayıldı. Yayılma, reaktiflerin çip ortamında inkubasyonu yapılarak ve ardından AlamarBlue testi yapılarak değerlendirildi; plaka okuyucu aracılığıyla floresan emilimi okundu ve bu proliferasyonu yansıtıyor (Şekil 5)8.

ECM Bazal Membran Bağlanması
Bu prosedürün çeşitli zarlarla güçlü ve esnek bağlanma sağlamada genel uygulanabilirliğini göstermek için, protokol tamamen ekstrasellüler matriks (ECM) tabanlı bir zarla tekrarlandı (Şekil 6). ECM içeren bazal zar,17'den önce tarif edildiği gibi domuz idrar mesanelerinden hazırlanmıştır. Kısa bir süreliğine, 4 ila 8 aylık dişi hayvanlardan alınan domuz idrar keseleri, yerel bir mezbahaneden (Kroon Vlees b.v., Groningen, Hollanda) alındı ve toplandıktan sonra 3 saat içinde işlendi. Mesaneden bağ dokusu ve yağ çıkarıldı, mesane ters çevrildi ve epitel tabakası küt şekilde diseksiye edildi, doku oda sıcaklığında PBS olarak tutuldu. ECM iskeleleri, membran tutması prosedürü için dehidratlandırılmıştır17. Hazırlanan iskeleler, yukarıdaki protokolde açıklandığı gibi kesilip PDMS çip yarılarına bağlandı. Cihaz içinde membran esnemesi için ekstra odalar bulunan yeni bir kalıp üretildi; bu da vakumlanan silikon bağların yatay mekanik gerilime dayanabildiğini gösterdi (Ek Dosya 2).

ECM Zar Bütünlüğü Testi
Membran mühürü bütünlük testi yukarıda belirtildiği gibi yapıldı. Sonrasında, esneme çipi şırınga pompalarına bağlandı ve cihazın yan odalarında vakum çekerek ECM membranında gece boyunca 1 mm yatay gerilme oluştu (Şekil 7).

Standart Hava Yolu Çipte PET membranında epitel hücrelerinin ve Fibroblast ortak kültürünün farklılaşması
Sağlanan çipin ALI hücresi için Hava Yolu Çip olarak performansını doğrulamak amacıyla, önceki bir çalışmada insan akciğer adenokarsinomu epitelyal Calu-3 hücreleri (ATCC, Manassas, VA, ABD) birleşim noktasına yetiştirildi ve cihazda havaya maruz kaldı. 8. 10 gün süren apikal hava maruziyetinden sonra, Calu-3 epitel hücrelerinin mukus üreten hücrelere ayrıldığı görülebilir; bu, Alcian mavisi boyama ile ölçülen mukus üretimiyle gösterilir (Şekil 8)8.

Uzun süreli sızıntısız akış ve ortak kültür prosedürümüzü doğrulamak için, önceki bir yayından bir örnek görülebilir; Tam hücre kültürü metodolojisi için bumakaleye bakınız 8. İnsan hava yolu epitel hücreleri, çipin apikal kültür odasında sürekli hava akışı altında 21 gün boyunca kültürlendi; primer hava yolu fibroblastları ise zarın karşı tarafında ters olarak kültürlendi. Kısacası, birincil hava yolu epitel hücreleri proteaz tedavisi (HBSS'de 0,2 mg/mL, 2 saat, 37 °C), hücre kazıması ve daha fazla bilgi bulunmayan 3 sağlıklı akciğer bağışçısından kalan trakeobronşial dokudan alınan hücrelerin kriyokonservasıyla izole edildi. İnsan hava yolu fibroblastları (AF'ler), tek bir donörden nakledilen KOAH akciğer dokusunun bronşiyal dokusundan aynı şekilde izole edildi.

Şekil 9'da, çipin ve yukarıda bahsedilen hücrelerin cihazın odalarından nasıl geçtiğinin bir grafiği görülebilir.

ECM zarında Fibroblastlarla birlikte kültürde epitel hücrelerinin kültürü
Bazal zar içeren iskele, epitel ve mezenkimal hücre kültürünü kolaylaştırır. Ölümsüzleştirilmiş insan keratinositleri (HaCaT hücreleri), zarın epitel (iç) tarafında 60 x 103 hücre/cm2 yoğunlukta tohumlanmış, 24 saat sonra canlılık %95 iken, plastik hücre kültür şişesinde %91 olmuştur (Şekil 10A). Sonrasında, normal insan akciğer MRC-5 fibroblastları, stromal (dış) tarafa 60 x 103 hücre/cm2 yoğunlukta tohumlanarak HaCat hücreleriyle birlikte 14 gün boyunca birlikte kültür içinde yetiştirildi (Şekil 10D). Epitel hücreleri, zarın iç tarafında birleşen bir monotabaka oluştururken, fibroblastlar ECM zarının dış yüzeyinde daha az yoğun dağılımla ancak karakteristik iğne benzeri morfolojilerini korudular (Şekil 10C). 3D yeniden yapılandırma videosu Ek Dosya 417'de görülebilir.

Mevcut çalışma, çipin manuel işlenmesinden kaynaklanan bozulmalara direnç gösterebilen ve 0.7 Pa'ya kadar basınçlarla akış altında uzun süreli kültür sağlayan güçlü bir PDMS-membran bağlantısı üreten geliştirilmiş bir membran sızdırmazlık prosedürü sundu. Bu zarların, kültür membranlarını gözeneklerinden geçerken silikon ile bağlandığını gösterdik; bu da iki çip yarısı ile vakumlanmış PDMS harç arasında kovalent silan bağlarının oluşmasını sağladı. Ayrıca, sunulan prosedür, doğru şekilde uygulandığı sürece sitotoksisiteyi oluşturmaz. Ayrıca, üretilen çipler uzun vadeli epitelyal mono- ve epitelyal-mezenkimal ko-kültürlerin oluşmasını kolaylaştırmıştır. Bu işlem yalnızca gözenekli zarlar için geçerli olsa da, güvenilir ve hücre kültürüne hazır ALI-çiplerinin üretimi için düşük girdili bir prosedür olmaya devam etmektedir.

figure-results-1
Şekil 1. PDMS çip-yarı üretimi ve membran hazırlığı grafikleri. PDMS çip-yarı üretimi için (adım 1.2), çip kalıpları geniş bir nozullu şırıngalı sıvı PDMS ile doldurulur; üst kalıbda 4.4 mL, alt kalıpta ise 2.4 mL. PDMS yarıları 65 °C'de 2 saat boyunca kürlenir, ardından üst çip yarısındaki 4 giriş odanın uçlarında ve kalıpta belirtilen noktalarda delinir. Membran hazırlama için (adım 1.3) baskılı zar şablonu zar yüzeyine sıkıca tutulur. Yeni bir bıçak kullanılarak, şablonun etrafını kesip çevredeki parça membranı çıkarılır. Zarlar hücre kültürü için kaplanabilir veya doğrudan 2. adımda kullanılabilir. BioRender'da oluşturuldu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2. Zar bağlama prosedürü. PDMS harç kullanımdan hemen önce yukarıda açıklandığı gibi karıştırılır. Harç, kültür odasının dört köşesine damlatılır ve pipetin açılı ucuyla zar bağlanma noktasının etrafına nazikçe yayılır. Zarın bir ucu harmanın üzerine yerleştirilir, ardından kültür odasıyla hizalandıktan sonra nazikçe yerine oturmasına izin verilir. Harç damlalı olarak tekrar uygulanır ve membranın kenarlarına büyük özenle boyanır; kültür alanındaki membran yüzeyine silikon dokunmaması büyük özen gösterilir. Çipli yarı bağlı membranlar, mikro kabarcıkları temizlemek, yüzeye ve gözeneklere silikon invazını sağlamak ve zara kimyasal saldırıyı en aza indirmek için tolueni çıkarmak için hemen vakum odasına yerleştirilir. BioRender'da oluşturuldu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3. Zar yerleştirme örnekleri. (A) Başarılı bir şekilde membran yerleştirilmesi, RT hızında kürlenme. (B) Membran bağlanması fırında (RT yerine 65 °C'de, ısıtıldıktan sonra silikon kasılırken membranın odaya doğru genişlediği görülebilir. (C) Doğru PET ve PC membran yerleşimiyle tam çipler. (D) Yanlış membran yerleşimi, çipin her iki tarafının hacminin zar hareketiyle değişmesine neden olur; bu da değişken akışa yol açar ve çip içindeki hücrelere ve çipe bağlı pompalara stres uygular. BioRender'da oluşturuldu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4. Dilimlenmiş ve monte edilmiş PET ve PC zarlarının ışık mikroskobu görüntüleri. Vakumlu RT kürleme işlemimiz sonucunda silikon sızıntısı membran gözeneklerine sızıyor. (A) Aynı membranın PDMS uygulanmamış görüntüleri, şeffaf gözenekler ve polarize görüntüde temiz bir yüzey görülebilir. (B) PDMS Harcı Nil Kırmızısı ile boyanmıştır ve silikonun magenta renginde gözenekleri başarıyla işgal ettiği ve vakumda yüzeyi ince bir şekilde kapladığı görülebilir. Beyaz/magenta renklerle vurgulanmış. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5. Çip cihazlarındaki hücre canlılığı, PDMS harcında inceltici madde olarak toluen olup olmadan yapılması nedeniyle değişmemiştir. Calu-3 hücreleri, çip başına 6,5 × 10-4 hücre arasında tohumlanmış, birleşmeye ulaştıktan sonra gece boyunca kuluçka edilmiş, ardından süpernatan üzerinde AlamarBlue testi ve hücrelerde TrypanBlue testi yapılmış. Toluenle ve toluensiz (n=4) gruplar arasındaki farklar, eşleşmemiş Öğrenci t testi ile test edildi, p > 0.05 = ns (anlamlı değil)8. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6. Taban zar çipleri. (A) PDMS/toluen harcı yeterince hızlı vakumlanamadığı için zar bütünlüğü bozuldu; Bu durum matris proteinlerine zarar vermiş ve çip kapamasını bozmuştur. (B) Membran ve yonga sızdırmazlığı başarılı olmuştur, ancak zar gevşek bir durumda kapatılmıştır. (C) Başarılı membran ve yonga sızdırmazlığı, çip akış ve gerilme için işlevseldir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7. ECM çipinin gerildiği iki görüntü. (A) Hareketsiz halde çip. (B) 1,2 mm yatay gerilme altında parça. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 8. Alcian Blue (Çekirdekler magenta, mukoz mavi) insan akciğer Calu-3 epitel hücrelerinin boyaması, cihazda hava maruziyetinden sonra çiplerde yetiştirilmiştir. Calu-3 hücreleri birleşmeye kadar yetiştirildi ve bazal bölmede 150 μL/s sürekli akış hızı altında 10 gün boyunca kültürlendi ve apikal taraftan orta veya hava ile maruz kaldı. Akış, 37 °C ve %5CO2 sıcaklıkta bir kuluçka makinesi içinde peristaltik pompa ile üretildi. Kültürün sonunda zarlar çıkarılıp boyandı. 10 gün boyunca suyun altında yetiştirilen Calu-3 hücrelerinin Alcian Mavisi boyamasının enine görünümü (A) ve havaya maruz kalan (B)8. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-9
Şekil 9. Cihaz içinde genişletilmiş ortak kültürde birincil insan epitel hücreleri ve fibroblastların görselleştirilmesi. Hava yolu fibroblastları cihaza tohumlanarak gece boyunca tutunmasına izin verildi, ardından cihaz ters çevrildi ve zarın diğer tarafına epitel hücreleri tohumlandı. Hücreler, 37 °C ve %5CO2 sıcaklıkta bir inkübatör içinde peristaltik pompa ile üretilen 150 μL/s sürekli akış hızı altında birleşerek yetiştirildi, havaya maruz kaldı ve 21 gün boyunca kültürlendi. Membranlar kültür sonrası çıkarıldı, sabitlendi, gömüldü ve boyamadan önce slaytlara monte edildi. Epitel hücreleri, mukusun bir bileşeni olan Mucin 5AC (MUC5AC)18 ve kirpik üretimi için sinyal iletiminde rol alan forkhead box proteini J1 (FOXJ1)19 için boyandı. Fibroblastlar, hücresel fosfolipid çift katmanlarını görselleştirmek için buğday tohumu agglutinin (WGA) ile boyandı. Hücreler, HBSS'de 5 μg/mL ile 15 dakika kuluçka edildi ve görüntülemeden önce PBS ile üç kez yıkandı. Tüm hücre çekirdekleri DAPI ile görselleştirildi. (A) Kesit görünümü: (B) ve (C)'nin Z-yığını projeksiyonundan üretilir. (B) Chip membranında epitelyal MUC5AC/FOXJ1/DAPI boyaması. (C) Bazal odadaki fibroblast tabakasının tam dış yapısı8. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-10
Şekil 10. Bazaz zar iskelesi üzerinde hücre canlılığı ve kokültür. (A) EPITEL TARAFINA TOHUMLANAN HaCaT hücrelerinin canlı/ölü canlılığı, 3 bağımsız örnek test edildi, her örnekten 3 rastgele alan alındı (n = 3). Tavaline tek yönlü ANOVA testi ve Tukey düzeltmesi yapıldı. Grafik, ortalama ve standart sapmayı gösterir. Epitel tarafında (B) HaCaT hücrelerinin ve bazal zarın stromal tarafında MRC-5 akciğer fibroblastlarının kokültürü ve kollajen lifleriyle çevrili iskele, ölçek çubukları 50 μm'dir. (D) Üst ve alt izometrik görünümlerden kokültürün 3D görünümü, ölçek çubukları 100 μm, animasyonlu görselleştirme Ek Şekil 4'te bulunabilir. (E) Decellularizasyon öncesi ve sonrası bazaz zar iskelesinin kalınlığı, 14 mukoza ölçüldü ve bunlardan 6'sı (üçgenlerle gösterilen) decellularizasyon için alındı. Her örnekte üç rastgele alan taranmış ve her alan için en az 10 puanölçülmüş 17. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1. Standart PET/PC çipinin üst ve alt yarısı için çip kalıp tasarımları. (A) Çipin alt kalıbının görüntüsü, bu parçadan üretilebilen . STL Ek Dosya 1'de. (B) Çipin üst kalıbının görüntüsü, bu parçadan üretilebiliyor. STL Ek Dosya 2'de. (C) Çip için membran kesim için zar şablonunun görüntüsü, bu çip için üretilebilen . STL Ek Dosya 3'te. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2. Esneklik ECM membran çipinin üst ve alt yarıları için yonga kalıp tasarımları. (A) Çipin alt kalıbının görüntüsü, bu parçadan üretilebilen . STL Ek Dosya 4'te. (B) Çipin üst kalıbının görüntüsü, bu parçadan üretilebiliyor. STL Ek Dosya 5'te. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3. Sızdırmazlık prosedürünün doğrulanması: PDMS'nin toluen olmadan gözeneklere girmesinin karşılaştırılması, harcın viskozitesini düşürmek ve vakumsuz RT'de kürlenmek. Tüm koşullar PET membranlarıyla (0,4 μm gözenekler) ilgilidir; PDMS (Nil Kırmızısı %1) tedavisinden sonra membranlar parafine gömülmüştür, montaj ve ışık mikroskobu görüntülemesi yapılır. (A) İnceltilmemiş PDMS'ler bir PET membranına vakumlanmış. Membranın yüzeyinde kalın bir PDMS tabakası görülürken, gözeneklere giren (beyaz kutularla vurgulanmış) hiçbir PDMS tabakası gözlemlenmemektedir. (B) İnceltilmiş PDMS harcı bir PET membranına süpürülmüştür. Membranın yüzeyinde bir PDMS tabakası görülürken, gözeneklere (beyaz kutularla vurgulanmış) herhangi bir PDMS girdiği gözlemlenmemektedir. (C) İnceltilmiş PDMS harcı PET membranına vakumlanmış. Zarın yüzeyinde ince bir PDMS tabakası ve membran boyunca gözeneklere girme görülebilir (beyaz kutularla vurgulanmıştır). Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 4. 3D Domuz ECM iskelesinde HaCat (epitelyal) ve MRC-5 (stromal) hücrelerinin görselleştirilmesi. Üst ve alt izometrik görünümlerden cokültürün animasyonlu 3D görünümü, görüntüleri Şekil 10D'de görülebilir, ölçek çubukları 100 μm'dir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1. 3D. Alt kalıbın STL dosyası. Kalıp, standart çipin alt yarısını 3D baskı veya eşdeğer bir üretim yöntemiyle üretmek için kullanılabilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2. 3D. Üst kalıpın STL dosyası. Kalıp, standart çipin üst yarısını 3D baskı veya eşdeğer bir üretim yöntemiyle üretmek için kullanılabilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3. 3D. Membran şablonunun STL dosyası. Şablon, sağlanan çip için doğru boyutta membranlar üretmek için kullanılabilir ve 3D baskı veya eşdeğer bir üretim yöntemiyle üretilebilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 4. 3D . Streç çipin alt kalıbının STL dosyası. Kalıp, esneğe alınan çipin alt yarısını 3D baskı veya eşdeğer bir üretim yöntemiyle üretmek için kullanılabilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 5. 3D. STL dosyası, streç çipin üst kalıbından. Kalıp, esnebilir çipin üst yarısını 3D baskı veya eşdeğer bir üretim yöntemiyle üretmek için kullanılabilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Burada sunduğumuz çip sızdırmazlık protokolü, uzun süreli akış altında kültür için uygun, sınırlı ekipmanla üretilebilen ve yaklaşmak için özel beceri gerektirmeyen su geçirmez PDMS membran çip contaları üretmenin yeni bir yolunu temsil ediyor. Silikon harç ile yüzeye bağlanmış membranlarla (PET, PC, ECM) çip waferleri üretim prosedürünü gösteriyoruz ve vakumun hızlı uygulanmasının PDMS'nin gözeneklere ve plastik zarların yüzeyine girmesini kolaylaştırdığını gösteriyoruz. Ayrıca ortaya çıkan çiplerin iyi kapalı ve çok çeşitli kültür uygulamaları yapabildiğini gösteriyoruz.

PDMS-plastik bağlanmaya yaklaşmanın birkaç farklı yolu vardır; bu, PDMS'nin hücre kültürü için gaz geçirgenliği veya desenlenebilirliği gibi faydalı özellikleri nedeniyle yaygın bir bağlanma stratejisi ve hücre kültürünün yaşamalılığı için plastikzarlar 7. Bunlar arasında, silikon veya cam20 arasında kovalent bağların oluşmasını kolaylaştıran O2 plazmasıyla yüzey aktivasyonu, Korona veya Ozon tedavisi bulunur. Bunun dışında, APTES ((3-aminopropil)trietoksisilan) veya MPTMS ((3-merkaptopropil)trimetoksisilan) gibi organosilanlar kullanılarak kimyasal yapıştırma teknikleri, iki malzemenin yüzeyini işlevselleştirmek için reaktifgruplar 21 eklenmiştir. Alternatif olarak, PDMS ve plastik substratlar epoksi veya diğer yapıştırıcılarla yapıştırılabilir22. Yüzey aktivasyonu ile kimyasal yapıştırma arasında bir hibrit sunuyoruz; gözenekli membranlar ve vakum kullanılarak membran üzerinden fiziksel bir bağlantı oluşturulur ve bu bağlantı yalnızca O2 plazma yüzey aktivasyonuyla bağlanabilir. PDMS'yi toluen ile incelterek, vakum altındaki bir membranın gözeneklerinden PDMS'nin invazisine izin veririz; bu da farklı zarların çip yarıları ve harç gömülü membran boyunca PDMS-PDMS bağlarıyla kovalent olarak bağlanmasına olanak tanır. Bu gözenekler aracılığıyla fiziksel bir silikon ağı üreterek, yüzey kimyasal muamelesi veya sıcak kabartma makinesinin sağladığı ısı ve basınç ihtiyacını ortadan kaldırırız; bu da genellikle bu tekniklere yardımcıolur 23.

Mevcut çalışmada, çeşitli işlevlere sahip olabilen büyük ölçekli iki odalı bir çip (Ek Dosya 1) sağlanmıştır. İkinci olarak, döngüsel yatay esneme yapabilen bir çip (Ek Dosya 2). Bu cihazlar Airway-on-Chip olarak çalışırken, model aynı zamanda daha önce gösterildiği gibi gut-on-chip olarak da kullanılabilir. 13. Öncelikle, araştırmacıların istediği uygulamaya göre ek yeni çip platformlarına uygulanabilecek kalıp üretimi, membran hazırlığı ve çip yapımı için adım adım bir rehber sunulmaktadır. Son mühürleme içinO2 plazma fırını kullanılması önerilir. Buna rağmen, elde taşınan plazma cihazı veya PDMS havanla manuel sıkıştırmanın da buaşamada başarılı olduğu görülmüştür. Bu mühürleme prosedürü için bu protokolde, her noktada temel engeller ve özellikler vurgulanmıştır. Bunlar arasında zarların önceden kaplama seçeneği, PDMS/toluen harcının hemen kullanılmasının önemi, harcın kültür alanına girmemesi ve harç ile bağlantı kurulduktan sonra zarın hareket etmemesinin ne kadar önemli olduğu yer alır.

Bu mühürleme prosedürünün tekrarı araştırmacılar tarafından yazılı bir protokolle defalarca gerçekleştirilmiştir; İkinci denemede başarılı bir mühürleme için yalnızca aşağıdaki açıklamalar gerekli olmuştur. Stres testi veya genişletilmiş hücre kültürü sırasında sızıntı meydana geldiğinde, birkaç seçenek araştırılabilir. İlk olarak, araştırmacı, harcın henüz kürlenmeye başlamamış PDMS sıvısından taze yapıldığını ve toluenle iyice karıştırıldığından emin olmalıdır. Harcın düşük viskozitesi, hava vakumlanırken zar gözeneklerine ince ve pürüzsüz bir tabaka akmasını sağlar. İkincisi, zarın alt ve üst kısmını tamamen kaplayacak kadar harç uygulanmalıdır; çok fazla harç kompresyon sırasında kültür alanına akarken, çok az harç oda arası sızıntı için boşluklar bırakır. Üçüncüsü, membranlar yapışmadan önce ve sırasında düz olmalıdır. Son olarak, manuel çabaya rağmen, çiplerin büyük ölçüde kirden arınmış kalması gerekir ki nihai bağlanma sağlansın, bu yüzden hızlı ve temiz çalışmak çok önemlidir.

Bu makalede üç farklı gözenekli membran türünün bağlanmasını göstermiş olsak da, bu yöntemin diğer membranlar için işlevi öngörülemez. Bunun nedeni, toluene karşı farklı kimyasal dirençlerin yanı sıra gözenek yoğunluğu ve boyutlarının bu sızdırmazlık sürecinin sonucunu etkilemesidir. Ancak, protokolün yüksek yönlülüğünü gösteren ilk gerilebilir tam ECM tabanlı membran bağlanmasını gösteriyoruz. Ancak, esneme performansının tutarlılığı güvenilir şekilde kontrol edilmemiştir; çünkü farklı bazaz zar bölgeleri, organlar ve kaynaklar mekanik farklılıklar yaratacaktır. Ayrıca, ECM zarlarının hücre kültürünün uygulanabilirliği hem kültürde hem de depoda zamanla değişmeyeyatkındır. 19. Bu prosedür farklı membranlar ve çip kurulumları için işe yarasa da, harcın manuel boyanmasının etkili olması gerekir; bu nispeten az zaman alır ancak sunduğumuz gibi daha büyük ölçekli modellerde daha sık başarılı olur. Son olarak, zar bağlanma süreci yalnızca PDMS, toluen, bir zar ve vakum odası gerektirirken, çipin nihai mühürlenmesi evrensel olarak mevcut olmayan O2 plazmasının uygulanmasına bağlıdır.

Sınırlamalara rağmen, sunulan protokol yenidir ve yaklaşmak için özel bir beceri gerektirmez. Bildiğimiz kadarıyla, düşük viskoziteli PDMS harcının vakumlanmasıyla membran gözeneklerinden silikon ağları üretimi, türünün ilk örneğidir. Fonksiyonel bir çipin altında yer alan farklı malzemeler arasındaki diğer kimyasal veya mekanik fonksiyonel köprülerin aksine, bu çözüm çoğu laboratuvar ortamında mümkündür.

Açıklamalar

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Precision Medicine for More Oxygen (P4O2) konsorsiyumu tarafından desteklendi ve ayrıca Stichting Proefdiervrij'den finansman aldı. Silikon ağların görselleştirilmesi için PDMS ile karışan Nil Kırmızı leke fikri için Isadora Kraguljac'a ve zarların ustalıkla dilimleyip montajı için Marjan Reinders-Luinge'ye en derin teşekkürlerimi sunuyorum. Yazarlar, Oksijen Plazma Fırınına erişim sağladıkları için İlaç Analizi departmanına ve Sabeth Verpoorte'ye en derin teşekkürlerini sunarlar; bu süreç onsuz mümkün olmazdı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2mL genişlikli burunlu şırıngaBD Emereld307727
2mm Biyopsi PunchKAI tıbbiBP-20F
Calu-3 Hücre HattıATCCHTB-55RRID:  CVCL_0609
HBSS (Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi)Gibco14170112
O2 Plazma FırınıHarrick PlasmaPDC-002
PC İzi Aşındırılmış Hücre Kültürü ZarlarıipCELLCULTURE1000M25/620N403/47
PET İzi Aşındırılmış Hücre Kültürü ZarlarıipCELLCULTURE2000M23/610N403/47
Polidimetilsiloksan/Sylgard 184 Silikon Elastomer baz ve kürleyici maddeDow CorningDOWC25100445
Polimetil metakrilat (8mm)ColltecYok
Standart Fotopolimer Reçine (Gri)(1kg)ElegooYok
ToluenMerck 1,08,325
Vakum OdasıFisherScientific12080253

Kaynaklar

  1. Ugodnikov, A., Persson, H., Simmons, C. A. Bridging barriers: advances and challenges in modeling biological barriers and measuring barrier integrity in organ-on-chip systems. Lab Chip. 24 (13), 3199-3225 (2024).
  2. Singer, M., Akhtar, A. With What Should We Replace Nonhuman Animals in Biomedical Research Protocols. AMA J Ethics. 26 (9), E701-E708 (2024).
  3. Reardon, S. Beyond lab animals. Science. 389 (6761), 676-679 (2025).
  4. Qiu, J., Li, J., Guo, Z., Zhang, Y., Nie, B., Qi, G., et al. 3D Printing of Individualized Microfluidic Chips with DLP-Based Printer. Materials (Basel). 16 (21), 6984(2023).
  5. Survey on reliability of microfluidics-based devices and components. , The Microfluidics Association. https://microfluidics-association.org (2025).
  6. Silverio, V., Guha, S., Keiser, A., Natu, R., Reyes, D. R., van Heeren, H., et al. Overcoming technological barriers in microfluidics: Leakage testing. Front Bioeng Biotechnol. , (2022).
  7. Nahak, B. K., Mishra, A., Preetam, S., Tiwari, A. Advances in organ-on-a-chip materials and devices. ACS applied bio materials. 5 (8), 3576-3607 (2008).
  8. Rae, B., Vasse, G. F., Mosayebi, J., van den Berge, M., Pouwels, S. D., Heijink, I. H. Development of a Widely Accessible, Advanced Large-Scale Microfluidic Airway-on-Chip. Bioengineering (Basel). 12 (2), 182(2025).
  9. Nizamoglu, M., Joglekar, M. M., Almeida, C. R., Larsson Callerfelt, A. K., Dupin, I., et al. Innovative three-dimensional models for understanding mechanisms underlying lung diseases: powerful tools for translational research. Eur Respir Rev. 32 (169), 230042(2023).
  10. Piergiovanni, M., Leite, S. B., Corvi, R., Whelan, M. Standardisation needs for organ on chip devices. Lab Chip. 21 (15), 2857-2868 (2021).
  11. Silverio, V., Guha, S., Keiser, A., Natu, R., Reyes, D. R., van Heeren, H., et al. Overcoming technological barriers in microfluidics: Leakage testing. Front Bioeng Biotechnol. 10, 958582(2022).
  12. Cameron, T. C., Randhawa, A., Grist, S. M., Bennet, T., Hua, J., Alde, L. G., et al. PDMS Organ-On-Chip Design and Fabrication: Strategies for Improving Fluidic Integration and Chip Robustness of Rapidly Prototyped Microfluidic In Vitro Models. Micromachines (Basel). 13 (10), 1573(2022).
  13. Rae, B., Bood, V., Dijk, H. J., Vasse, G. F., Melgert, B. N., Nagelkerke, A., et al. Interorgan Communication Between Lung and Colorectal Epithelial Cells Studied Using a Novel Multi-Organ-On-Chip System. Compr Physiol. 15 (5), e70051(2025).
  14. van der Helm, M. W., Odijk, M., Frimat, J. P., van der Meer, A. D., Eijkel, J. C. T., van den Berg, A., et al. Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance. J Vis Exp. (127), e56334(2017).
  15. Salimbeigi, G., Vrana, N. E., Ghaemmaghami, A. M., Huri, P. Y., McGuinness, G. B. Basement membrane properties and their recapitulation in organ-on-chip applications. Mater Today Bio. , (2022).
  16. Nawroth, J. C., et al. Breathing on chip: Dynamic flow and stretch accelerate mucociliary maturation of airway epithelium in vitro. Materials Today Bio. 21, 100713(2023).
  17. Ramirez, J. A., Estrada, S., Harmsen, M. C., Sharma, P. K. Development of an in vitro platform for epithelial-stromal interactions: A basement membrane-containing scaffold from decellularized porcine bladders. Matrix Biol Plus. 26, (2025).
  18. Bonser, L. R., Erle, D. J. Airway mucus and asthma: the role of MUC5AC and MUC5B. Journal of clinical medicine. 6 (12), 112(2017).
  19. Yu, X., et al. Foxj1 transcription factors are master regulators of the motile ciliogenic program. Nature genetics. 40 (12), 1445-1453 (2008).
  20. Lu, C. Surface modification of polyimide fibers for high-performance composite by using oxygen plasma and silane coupling agent treatment. Textile Research Journal. 92 (23-24), 4899-4911 (2022).
  21. Shakeri, A., Khan, S., Didar, T. F. Conventional and emerging strategies for the fabrication and functionalization of PDMS-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 21 (16), 3053-3075 (2021).
  22. Borók, A., Kristóf, L., Attila, B. PDMS bonding technologies for microfluidic applications: A review. Biosensors. 11 (8), 292(2021).
  23. Tang, L., Nae, Y. L. A facile route for irreversible bonding of plastic-PDMS hybrid microdevices at room temperature. Lab on a Chip. 10, 1274-1280 (2010).
  24. Young, A. T., et al. Simple design for membrane-free microphysiological systems to model the blood-tissue barriers. Organs-on-a-Chip. 5, 100032(2023).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

ip st OrganPDMS ip S zd rmazlSilikon Membran Ba lanmasHava S v Aray zG zenekli MembranEkstrasel ler Matris MembranOda S cakl nda K rlemeVakum S zd rmazlEpitel H cre K lt rEsnek ip Ba lanmas
Esnek ve Güvenilir Yapıştırma için Erişilebilir Silikon Çip-Membran Sızdırmazlık Prosedürü
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.