Yöntem makalesi

Geleneksel Çin Tıp formülü ile bağırsak rekombinant adeno-ilişkili virüs emiliminin artırılması

130 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/70413

⸱

24 Nisan 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Traditional Chinese Medicine, Naval Medical University, 2Oncology Department of Traditional Chinese Medicine, Changhai Hospital, Naval Medical University, 3State Key Laboratory of Genetics and Development of Complex Phenotypes, School of Life Sciences, Zhongshan Hospital, Fudan University, 4Shanghai Key Laboratory of Gene Editing and Cell Therapy for Rare Diseases, Engineering Research Center of Gene Technology (Ministry of Education), Fudan University, 5Institutes of Integrative Medicine, Fudan University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, bağırsak emilimi sırasında geleneksel Çin Tıbbı (TCM) ile rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAV) arasındaki etkileşimleri değerlendirmek için bir egilmiş bağırsak kesesi modeli kurmak için bir protokol sunuyoruz; bu da oral gen dağıtım stratejilerini optimize etmek için ex vivo bir platform sağlıyor.

Özet

Oral rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAV) teslimatı önemli terapötik potansiyele sahiptir ancak verimsiz bağırsak emilimiyle sınırlıdır. Geleneksel Çin Tıbbı (TCM), ağız formülasyonlarında yaygın olarak kullanılır ve emilim artırıcı için umut verici bir kaynağıdır. Ancak, rAAV alımı ve transdüksiyonu üzerindeki potansiyel etkileri büyük ölçüde keşfedilmemiştir. Egilmiş bağırsak kesesi modeli, bu etkileşimleri araştırmak için nicel bir ex vivo platform sağlar. Burada, adeno-ilişkili virüs (rAAV) translokasyonunun bağırsak epiteli boyunca translokasyonunu ve ardından gen transdüksiyonunu kontrollü deneysel koşullarda kantitatif olarak değerlendirmek için everted bağırsak kesesi modelini kullanan ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Temel adımlar, laboratuvar kemirgenlerinden küçük bağırsak segmentlerinin toplanması, segmentlerin keseler oluşturacak şekilde değiştirilmesi ve her kesenin oksijenli tampon ile doldurulmasını içerir. Egilmiş keseler, rAAV parçacıklarını içeren oksijenli bir tampona daldırılır ve ışık alımı ile vektör taşınımına olanak tanımak için 37 °C'de kuluçka altına alınır. Son nokta analizleri, epitelden geçen rAAV parçacıklarının ölçülmesi için iç (serosal) sıvının örneklenmesini ve transdüksiyon verimliliğini belirlemek için kese dokusunun transgen ekspresyonu için analiz edilmesini içerir. Birden fazla bağırsak bölgesini test ederek, protokol rAAV alımındaki segment spesifik farklara dair içgörü sağlar. Ayrıca, kuluçka sırasında klasik bir TCM formülü olan GZNG'nin vektör alımı ve transdüksiyonu üzerindeki etkisinin değerlendirilmesini sağlar. Everted bağırsak kesesi yaklaşımı, rAAV serotiplerini, teslimat güçlendiricilerini ve rAAV vektörleri ile TCM bileşenleri arasındaki etkileşimleri taramak için değerli bir platform sağlar. Basit ve paralelleştirilebilir tasarımı, preklinik çalışmalarda yüksek verimli tarama imkanı sağlar.

Giriş

Rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAV), sistemik gen tedavisi için umut verici bir platformu temsil etmektedir ve şu anda üç ana doğum yolu araştırılmaktadır: intravenöz enjeksiyon1, intraperitonealenjeksiyon 2 ve oral uygulama3. Damar içi ve intraperitoneal enjeksiyon yolları kapsamlı şekilde incelenmiş olsa da, invaziv olmayan bir yaklaşım olan ağız yoluyla uygulama nispeten az araştırılmıştır. Oral rAAV ilminin uygulanabilirliği ilk olarak Xin ve ark.4 tarafından gösterilmiştir; onlar oral rAAV2 uygulamasının ardından bağırsak mukozasının başarılı bir transdüksiyonu ve anti-HIV bağışıklık yanıtının indüksiyonunu bildirmiştir. Benzer şekilde, Hara ve ark.3,5, oral rAAV/Aβ'nun gastrointestinal mukozayı transdükte edip beyin amiloid birikimini azaltabileceğini göstermişken, Steel ve ark.6 ağızdan aşılanmanın intramusküler enjeksiyona kıyasla daha iyi sağlanma ve anti-tümör bağışıklığı gösterdiğini bulmuştur. Aynı çalışma, rAAV6'nın rAAV5'e göre daha güçlü bağırsak tropizmi gösterdiğini bildirmiştir. Aşı uygulamalarının ötesinde, terapötik potansiyel diğer hastalık modellerinde de elde edilmiştir. Ma ve ark.7 ve Hao ve ark.8, ağızdan alınan rAAV'nin gastrointestinal transdüksiyon sonrası sırasıyla karaciğer ve midede tümör baskısı ve anti-fibrotik tedaviye yol açtığını kanıtlamıştır. Huang ve ark.9, mühendislik yapımı Rec2'nin oral uygulamadan sonra eslah yağ dokusunu seçici olarak transdüksiyon ettiğini, intravenöz doğumda gözlemlenen yaygın karaciğer tropizminin aksine, tanımlamıştır10. Bu öncü bulgulara rağmen, oral rAAV teslimatı üzerine araştırmalar sınırlı kalmaktadır; bunun bir nedeni büyük ölçekli değerlendirme için in vitro tarama sistemlerinin eksikliğidir.

Wilson ve Wiseman tarafından 1954-11'de geliştirilen everted bağırsak kesesi modeli, bağırsak ilaç emilim mekanizmalarını araştırmak için değerli bir in vitro platform olmaya devam etmektedir. Diğer emilim simülatör cihazlarının aksine, bu sistem basit pasif difüzyon12'nin ötesinde birden fazla fizyolojik süreci benzersiz şekilde açıklar. Bu özellik, TCM13'ün incelenmesi için özellikle avantajlı hale gelir. Bu sistem kullanılarak, TCM bileşiklerinin gastrointestinal sistemde segmente bağlı bağırsak emilim desenleri sergilediği belgelenmiştir. Örneğin, bir çalışma, Wuwei Qingzhuo San'dan gelen birden fazla alkaloidin farklı bağırsak segmentlerinde seçici olarak emildiğini, jejunum ve ileumun en aktifalımı gösterdiğini göstermiştir 14. Ayrıca, TCM bileşenlerinin birlikte uygulanması bağırsak emilimini modüle edebilir. Liao ve ark.15, Radix Angelicae dahuricae ekstraktı ile birlikte uygulanmasın, puerarinin bağırsak emilimini önemli ölçüde artırdığını ve TCM etkileşimlerinin segmental alım üzerindeki etkisini vurguladığını bildirdi. Bu nedenle, everted bağırsak kesesi modeli, TCM formülasyonları ve diğer ilaçlarda bulunan karmaşık emilim davranışlarını ve sinergistik etkileşimleri aydınlatmak için ideal bir araç olarak hizmet vermektedir.

rAAV emilim araştırması için uygun bir model seçmek, fizyolojik doğruluk, teknik karmaşıklık ve veri verimliliği arasındaki dengelerin incelikli bir şekilde anlaşılmasını gerektirir. Aşağıdaki tablo, bağırsak emilimini incelemek için kullanılan birincil deneysel modelleri özetlemektedir.

Bu çalışma, everted bağırsak kesesi modelinin rekombinant adeno-ilişkili virüs (rAAV) vektörlerinin bağırsak emilimini araştırmak için kullanılabileceğine dair bir kanıt sunmaktadır. TCM'nin birlikte uygulanmasının rAAV vektörlerinin bağırsak emilimini nasıl etkilediğine dair değerli bilgiler sunar ve fizyolojik olarak ilgili koşullarda mekanistik etkileşimlerinin daha fazla karakterizasyonuna ihtiyaç olduğunu vurgular. Bu yaklaşımla TCM ile güçlendirilmiş ağız teslimat stratejilerinin optimize edilmesi, invaziv olmayan rAAV tedavilerinin geliştirilmesini kolaylaştırarak hasta uyumunu ve tedavi erişilebilirliğini artırabilir.

Araştırmacılar, everted bağırsak kesesi modelini deneysel hedefleriyle uyumlu olduğundan emin olmak için aşağıdaki kriterlere göre değerlendirmelidir. Uygun uygulamalar arasında serotiplerin hızlı taraması, adjuvan/güçlendirici değerlendirmesi ve bölgesel kinetik bulunurken, uygunsuz uygulamalar ve sınırlamalar arasında uzun vadeli ekspresyon çalışmaları (>48 saat) ve sistemik farmakoloji yer alır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Deniz Tıp Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi onaylı yönergelere (onay CHEC (A.E)-2025011) sıkı şekilde uygulamıştır.

1. Tyrode çözeltisi ve viral çözeltinin hazırlanması

  1. Tyrode'un çözüm ön koşullandırması:
    1. Tyrode çözeltisinden iki adet 500 mL aliquot hazırlayın (pH 7.4) ( Bkz. Malzemeler Tablosu).
    2. Bir aliquotu 4 °C'ye soğutun, diğerini 37 °C'ye ısıtın.
    3. Her aliquot'u %95 O₂/%5 CO₂ ile kabarıtın.
  2. Viral çözelti hazırlığı:
    1. 37 °C Tyrode çözeltisine rekombinant AAV9-CMV-EGFP ekleyerek nihai konsantrasyon 1 x 1011 vg/mL (kontrol durumu) elde edilir.
    2. Deneysel durum için, AAV9-CMV-EGFP preparatını, aracın içinde çözünmüş TCM formülü GZNG (Tablo 2) ile takviye ederek nihai konsantrasyon 200 mg/mL'ye ulaştırın.
    3. Sadece GZNG kontrolü için, AAV9 CMV-EGFP olmadan Tyrode çözeltisine GZNG (200 mg/mL) ekleyin.
      NOT: Enfektifliği korumak için hemen kullanımdan önce viral seyreltmeler hazırlayın. GZNG çözeltinin pH değeri yaklaşık 5.0–6.0'dır.

2. Hayvan hazırlığı ve bağırsak dokusu hasadı

  1. Oruç: 8 haftalık Sprague–Dawley farelerini ameliyattan önce 24 saat oruç tutun. Bu süre zarfında su tüketimini korumak için serbest suya erişimi garanti edin.
    NOT: Oruç, bağırsak içeriğini en aza indirmeye yardımcı olur ve ex vivo deneyler sırasında bağırsak emiliminin doğru ölçülmesini sağlar.
  2. Oruç tutmadan önce hayvan sağlığını kontrol edin ve iyi durumda olduklarından emin olun. Sıkıntı veya hastalık belirtisi olan hayvanları çalışmadan çıkarın.
  3. Derin anestezi indüklemek için sodyum pentobarbital (200 mg/kg, intraperitoneal) uygulanır. Hayvanın tam anestezi altında olduğunu refleks eksikliği ve düzenli solunum kontrolü ile kontrol edin.
    DIKKAT: Pentobarbital tehlikeli bir kontrol edilen maddedir; cilt temasını/solumasını önlemek ve güvenli bertaraf ile acil müdahale için kurumsal yönergelere uymak için eldiven ve PPE ile buharlı bir davlumon içinde bulundurun.
  4. Derin anestezi doğrulandıktan sonra servikal dislokasyon yoluyla ötenazi yapın.
  5. Ameliyat sırasında deriyi dezenfekte etmek ve mikrobiyal kontaminasyonu azaltmak için karın ve göğüs bölgelerini %75 etanol ile süpürün.
  6. Karın bölgesi boyunca steril cerrahi makasla orta hat kesimi yaparak periton boşluğunu açığa çıkar.
  7. Mide ve bağırsakları nazikçe ayırın ve açığa çıkarın. İşlem sırasında çevresindeki dokuları ve organları korumak için steril bir örtü kullanın.
  8. Pilor sfinkterini dikkatlice keserek mideyi proksimal onikili kodenumdan ayırın. Sonraki işlemler için onikili kodenumun sağlam kaldığından emin olun.
  9. Çevredeki dokulara zarar vermeden rekto-anal birleşimdeki distal kolonu disseksiye.
  10. İnce penseps veya makasla mezenterik bağlantıları ince bağırsaktan nazikçe çıkarın. Mezenteriyi esnetmemeye veya yırtmamaya dikkat edin.
  11. Sağlam ince bağırsağı hemen oksijenli Krebs-Ringer Buffer (Tyrode çözeltisi, 4 °C) buz soğukluğu çözeltisine aktarın.

3. Ex vivo everted bağırsak kesesi hazırlığı

  1. Bağırsak segmentleri şu şekilde seçilir: pilorus'un 10 cm distalında bulunan 8 cm uzunluğundaki bir segment onikili ikiparı segmenti olarak adlandırılmıştır.
  2. Onikili kesimin 16 cm distalında başlayan 8 cm jejunal segmenti toplayın.
  3. Jejunal segmentin 16 cm distal bir kısmından başlayarak 8 cm uzunluğunda bir ileal segment elde edin.
  4. Kolon için, çekal kör uca 5 cm proksimal konumda bulunan 8 cm uzunluğunda bir segment toplayın.
    NOT: Dokunun elastik ve sağlam olduğundan ve hazırlık sırasında ters çevrilmeye uygun olduğundan emin olun.
  5. Bağırsak lümenini buz gibi soğuk, oksijenli Tyrode solüsyonuyla doldurulmuş 2 mL bir şırınga ile durulayın.
  6. Atık su, sterilliği korumak ve kontaminasyonu önlemek için kurumsal biyolojik tehlike atık protokollerine uygun şekilde bertaraf etmelidir.
    DIKKAT: Biyolojik atıkları potansiyel olarak enlaşıcı maddelere maruz kalmamak için eldiven ve uygun koruyucu ekipmanla ele alın. Tüm biyolojik atık ve atıkları kurumsal biyolojik tehlike güvenlik yönergelerine uygun olarak bertaraf ederek çevresel kirliliği önleyin.
  7. Bağırsak segmentinin proksimal ucunu 4 mm cilalı bir cam çubuk üzerine yerleştirin. Mukoza yırtılmasını önlemek için çubuk yüzeyinin düzgün olduğundan emin olun.
  8. Segmentin distal ucunu 2-0 ipek dikiş ile bağlayarak dokuyu çubuğa sabitleyin. Dokunun inversiyon sırasında stabil kalmasını doğrulayın.
  9. Bağırsak segmentini, dokuyu çubuk boyunca kaydırarak mukoza tamamen açığa çıkana kadar nazikçe aldırın. Doku bütünlüğünü korumak için aşırı germe veya burulmadan kaçının.
  10. Sızıntıyı kontrol etmek için lümenin içine 2 mL buz gibi soğuk Tyrode çözeltisi yerleştirin. Kabul edilebilir kaçak 1 dakika içinde %<5 olmalıdır. Sızıntı tespit edilirse, dikişleri ayarlayın ve mukozal yüzeyin tam ters çevrildiğini doğrulayın.
    NOT: Enzimatik bozulmayı en aza indirmek ve doku canlılığını korumak için eversiyonu soğuk bir ortamda gerçekleştirin.
  11. Perfüzyon girişi olarak hizmet etmek üzere eğilmiş segmentin açık ucuna 5 cm uzunluğunda 3 mm cam kapiller yerleştirin. Mukoza yırtılmasını önlemek için kanülü nazikçe ilerlet.
  12. Kanülü 2-0 ipek dikişlerle sabitleyin. Kanülün yerinde sabit kaldığından emin olun, çökme veya sıvı akışını engellemeden.
  13. Bağırsak kesesinin doğru şeklini korumak için dikişlere nazik bir gerginlik uygulayın. Bükülme veya burulmayı önleyin, çünkü bunlar perfüzyonu bozabilir ve emilim sonuçlarını etkileyebilir.
  14. Aşırı sıkışmadan kaçının, çünkü bu dokuya zarar verebilir veya keseye zarar verebilir. Deney boyunca eşit gerilimi koruyun. Eğik bağırsak kesesini düzenli olarak sızıntı veya yapısal hasar açısından inceleyin. Eğer kaçak %5'i geçerse, devam etmeden önce segmenti tamir edin veya değiştirin.

4. AAV transdüksiyonu ve kuluçka

  1. Her bir eğilmiş kisayı, 4 mL 37 °C oksijenli Tyrode çözeltisi içeren 7 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin.
  2. Aşağıdaki gibi viral çözelti ekleyin: Kontrol: Sadece AAV9-CMV-EGFP; Deneysel: AAV9-CMV-EGFP + GZNG.
  3. 37 °C'de 2 saat boyunca statik bir şekilde kuluçka yapın; bu süre zarfında %95 O2/%5 CO2 gaz karışımı sürekli olarak çözeltiye kabarcıklandı.

5. Örnekleme, uç nokta işleme ve analiz

  1. Zaman yüzü örnekleme
    1. Her bağırsak kesesinden 0, 30, 60, 90 ve 120 dakika içinde kalibre edilmiş bir mikroşırınga ile 50 μL serosal sıvı çekin. Hava kabarcıkları girmeden doğru numune alındığından emin olun.
    2. Çekilen sıvıyı hemen 50 μL önceden ısıtılmış (37 °C) Tyrode çözeltisi ile değiştirin, böylece osmotik denge ve iç hacmi koruyun. Çekim ile değişim arasındaki süreyi tutarlı deneysel koşulları korumak için en aza indirin.
      NOT: Mikro şırınga (örneğin Hamilton şırıngası) kullanılırken, sterilliği koruyun ve bağırsak kesesi zarına zarar vermesini önlemek için nazikçe kullanın.
    3. Kuluçka ortamının bozulmasını en aza indirmek için her zaman noktasında hızlıca örnekleme alın.
  2. Virüs titre belirleme
    1. Üreticinin talimatlarına göre ticari olarak mevcut Hayvan Genomik DNA Çıkarma Kiti kullanarak serosal sıvıdan toplam DNA çıkarın.
    2. rAAV vektör genom kopya sayısının mutlak nicelenmesini qPCR ile gerçekleştirin. ITR primerleriyle birlikte bir SYBR Yeşil Kit kullanın. Standart 96 kuyu plakasında termal döngü cihazıyla qPCR amplifikasyonunu aşağıdaki döngü koşullarıyla gerçekleştirin: İlk denatürasyon: 10 dakika 95°C; Denatürasyon: 15 saniye 95°C; Tavlama ve uzatma: 1 dakika 60°C; Toplamda 40 döngü
    3. Genom kopya sayısını nicelendirmek için, plazmid rAAV-CMVp-gfp'nin seri seyreltmelerini kullanarak standart bir eğri oluşturun (1 ng, 0.1 ng ve 0.01 ng). Bu seyreltmeleri, karşılık gelen döngü eşik (Ct) değerlerine göre viral genom kopya sayısını hesaplamak için kullanın.
    4. Toplanan serozal sıvıdaki vektör genom kopya sayısını standart eğri kullanarak belirleyin. Sonuçlar, çıkarılan DNA'nın 100 ng başına genom kopyaları olarak bildirildi.
      NOT: DNA çıkarımı ve qPCR analizi sırasında kontaminasyonu önlemek için tüm reaktif ve ekipmanların steril olduğundan emin olun. QPCR doğruluğunu doğrulamak için uygun kontroller kullanın; bunlara şablonsuz kontroller (NTC) ve plazmid standartları dahil.
    5. Sonuçların tekrarlanabilirliğini ve güvenilirliğini sağlamak için her örnek için üç adet qPCR yapın.
  3. Terminal doku işleme
    1. Her bağırsak kesesinden kalan tüm ışık sıvısını steril pipet kullanarak aspire edin. Dokunun yırtılmasını önlemek için nazikçe kullanın.
    2. Her kese, kalıntı ortam, bakteriler ve safsızlıkları çıkarmak için %1 penisillin-streptomisin (P/S) içeren fosfatlı tuzlu (PBS) ile üç kez durulayın. Sonraki uygulamalar için sterilliği korumak için kapsamlı yıkamaya dikkat edin.
    3. Bağırsak dokusunu steril cerrahi makas veya bıçak kullanarak 2mm 3 (2 mm * 2 mm * 0,5 mm) parçalara kesin. Parçaları tutarlı kuluçka için eşit boyutta tutun.
    4. Doku parçalarını, %10 FBS ve %10 (v/v) P/S ile desteklenen 10 mL DMEM'de, %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir kuluçka içinde, 37 °C'de 48 saat boyunca kuluçka yapın. Kultura ortamı kuluçka sırasında her 12 saatte bir yenilenmelidir.
      NOT: Bu adım, doku canlılığını korur ve deney sonrası hücrenin toparlanmasını sağlar. Kesme ve yıkama sırasında mukozanın sağlam kalmasını sağlar. Döküntü ve mikrobiyal kirleticileri ortadan kaldırmak için üç tam PBS yıkaması yapın. Metabolik aktivite ve doku sağlığını desteklemek için sabit sıcaklık (37 °C) ve yüksek nem korun.
      DIKKAT: Doku parçalarını steril aletlerle ele alın ve epitel bütünlüğünü korumak için mekanik stresten kaçının.
  4. Kuluçka sonrası analizler
    1. Aliquot A (Histolojik analiz):
      1. Hücresel mimariyi korumak için doku örneklerini %4 paraformaldehit (PFA) ile 24 saat boyunca 4 °C'de sabitleyin.
      2. Fiksasyondan sonra, dokuları OCT bileşiğine gömüp Hematoxylin ve Eosin (H&E) boyama işlemleri yapılarak doku bütünlüğü ve morfolojisi değerlendirilir.
        DIKKAT: Paraformaldehit tehlikeli bir fiksanttir; uygun kişisel koruyucu ekipmanla bir duman kaputu içinde kullanın
    2. Aliquot B (Floresans analizi ve genom nicelenmesi):
      1. Kalan dokuyu sıvı azotta snap-dondurun ve -80 °C'de depolayın, daha fazla işlem yapılana kadar.
      2. Dondurulmuş örnekleri floresan mikroskopisi için kullanarak EGFP ekspresyonunu tespit edin, transfeksiyon verimliliği veya viral alım değerlendirin.
      3. DNA çıkarımı ve ardından qPCR uygulayarak viral genom kopya sayısını veya transgen ifadesini belirleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokol, AAV9 aracılı gen teslimatının ince bağırsaktaki farklı segmentlerde verimliliğini ve GZNG tedavisinin gen transferi ve ifadesini artırma üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanıldı. Protokolün başarılı uygulanmasını ve belirli koşullarda ortaya çıkabilecek bazı değişkenlikleri gösteren birkaç önemli sonuç gözlemlendi.

AAV9 aracılı EGFP ekspresyonunun histolojik (H&E boyama) ve floresan (EGFP) analizleriyle incelik bağırsak (onikizi, jejunum...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, klasik everted bağırsak kesesi modelini uyarlayarak bağırsak rAAV emilimini değerlendirmek için yeni bir in vitro yaklaşım oluşturuldu. Bu yöntem, kontrollü koşullarda ince bağırsak boyunca AAV transdüksiyon etkinliğinin segment spesifik analizini ve TCM ile rAAV arasındaki sinerji etkilerinin değerlendirilmesini sağlar. Burada, kritik adımlar, sorun giderme ve değişiklikler, sınırlamalar ve gen tedavisi ile ilaç teslimatındaki geniş uygulamaları tartışılır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, bu çalışma boyunca değerli tartışmalar ve teknik destek sağlayan tüm meslektaşlarına ve işbirlikçilerine teşekkür etmek ister. Bu çalışmayı mümkün kılan kurumsal desteği de takdir ediyoruz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (CL'ye) #82474349 hibe ile maddi olarak desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DMEMWISENT319-005-CL4,5 g/L D-Glikoz içeren sıvı, L-Glutamin, fenol kırmızı ve sodyum piruvat içeren
EGFP CDS bölgesi qPCR primerleriTSINGKEF: 5'-ACTTCTTCAAGTCCGCCATG-3'; R: 5'-TGTCGGCCATGATATAGACG-3'
Fetal Sığır SerumuWISENT086-550Üstün kalite, birincil hücre kültürü derecesi
Penisillin-Streptomisin (P/S)WISENT450-201-ELBu çözelti 10.000 birim/mL penisilin ve 10.000 & mikro içerir; g/mL streptomisin.
PrimeScript RT Master Mix (Mükemmel Gerçek Zaman)TaKaRaRR036A
TaKaRa MiniBEST Evrensel RNA Çıkarma KitiTaKaRa9767
TSINGKE TSE401 ArtiCanCEO SYBR qPCR MixTSINGKETSE401Bu ürün, SYBR Yeşil boya yöntemiyle floresans nicel deneyleri için uygundur ve çeşitli gerçek zamanlı floresans nicel PCR cihazlarıyla uyumludur.
TSINGKE TSP202-200 Rahatlık  Saf Hayvan Genomik DNA KitiTSINGKETSP202-200
Tyrode'un çözümüYuan YeR20268-500mlEsas olarak sodyum klorür, potasyum klorür, magnezyum klorür, fosfatlar, kalsiyum klorür, glikoz ve HEPES'ten oluşur.

Kaynaklar

  1. Wang, J. H., et al. Adeno-associated virus as a delivery vector for gene therapy of human diseases. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 78(2024).
  2. Durbacz, M. Z., et al. Optimized genomic editing of a common Duchenne muscular dystrophy mutation in patient-derived muscle cells and a new humanized mouse model. Mol Ther Nucleic Acids. 36 (2), 102569(2025).
  3. Hara, H., et al. An oral Aβ vaccine using a recombinant adeno-associated virus vector in aged monkeys: reduction in plaque amyloid and increase in Aβ oligomers. J Alzheimers Dis. 54 (3), 1047-1059 (2016).
  4. Xin, K. Q., et al. Oral administration of recombinant adeno-associated virus elicits human immunodeficiency virus-specific immune responses. Hum Gene Ther. 13 (13), 1571-1581 (2002).
  5. Hara, H., et al. Development of a safe oral Abeta vaccine using recombinant adeno-associated virus vector for Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 6 (5), 483-488 (2004).
  6. Steel, J. C., et al. Oral vaccination with adeno-associated virus vectors expressing the neu oncogene inhibits the growth of murine breast cancer. Mol Ther. 21 (3), 680-687 (2013).
  7. Ma, H., et al. Oral adeno-associated virus-sTRAIL gene therapy suppresses human hepatocellular carcinoma growth in mice. Hepatology. 42 (6), 1355-1363 (2005).
  8. Hao, Z. M., et al. Oral administration of recombinant adeno-associated virus-mediated bone morphogenetic protein-7 suppresses CCl4-induced hepatic fibrosis in mice. Mol Ther. 20 (11), 2043-2051 (2012).
  9. Huang, W., et al. Genetic manipulation of brown fat via oral administration of an engineered recombinant adeno-associated viral serotype vector. Mol Ther. 24 (6), 1062-1069 (2016).
  10. Liu, X., et al. Adipose tissue insulin receptor knockdown via a new primate-derived hybrid recombinant AAV serotype. Mol Ther Methods Clin Dev. 1, 8(2014).
  11. Alam, M. A., Al-Jenoobi, F. I., Al-Mohizea, A. M. Everted gut sac model as a tool in pharmaceutical research: limitations and applications. J Pharm Pharmacol. 64 (3), 326-336 (2012).
  12. Lassoued, M. A., Khemiss, F., Sfar, S. Comparative study of two in vitro methods for assessing drug absorption: Sartorius SM 16750 apparatus versus everted gut sac. J Pharm Pharm Sci. 14 (1), 117-127 (2011).
  13. Yang, Y. N., Zhan, J. G., Cao, Y., Wu, C. M. From ancient wisdom to modern science: Gut microbiota sheds light on property theory of traditional Chinese medicine. J. Integr. Med. 22 (4), 413-444 (2024).
  14. Liao, C. P., et al. Intestinal absorption components and absorption characteristics of Wuwei Qingzhuo San by everted intestinal sac models. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 49 (2), 509-517 (2024).
  15. Liao, Z. G., et al. Transport properties of puerarin and effect of extract of Radix Angelicae Dahuricae on puerarin intestinal absorption using in situ and in vitro models. Phytother Res. 28 (9), 1288-1294 (2014).
  16. During, M. J., Xu, R., Young, D., Kaplitt, M. G., Sherwin, R. S., et al. Peroral gene therapy of lactose intolerance using an adeno-associated virus vector. Nat. Med. 4 (10), 1131-1135 (1998).
  17. Hao, Z., Yang, X., Lv, Y., Li, S., Purbey, B. K., et al. Intracolonically administered adeno-associated virus-bone morphogenetic protein-7 ameliorates dextran sulphate sodium-induced acute colitis in rats. J. Gene Med. 14 (7), 482-490 (2012).
  18. Meng, J. S., et al. Melittin analog p5RHH enhances recombinant adeno-associated virus transduction efficiency. J. Integr. Med. 22 (1), 72-82 (2024).
  19. Sun, H., et al. The Caco-2 cell monolayer: usefulness and limitations. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 4 (4), 395-411 (2008).
  20. Meneses, A. M. C., et al. Intestinal organoids—current and future applications. Vet Sci. 3 (4), 31(2016).
  21. Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterol. 19 (1), 98(2019).
  22. Caldeira, T. G., et al. Determination of intestinal permeability using in situ perfusion model in rats: challenges and advantages to BCS classification applied to digoxin. Int J Pharm. 551 (1-2), 148-157 (2018).
  23. Dahlgren, D., Lennernäs, H. Intestinal permeability and drug absorption: predictive experimental, computational and in vivo approaches. Pharmaceutics. 11 (8), 411(2019).
  24. Mateer, S. W., et al. Ex vivo intestinal sacs to assess mucosal permeability in models of gastrointestinal disease. J Vis Exp. (108), e53250(2016).
  25. Liu, W., et al. Developments in methods for measuring the intestinal absorption of nanoparticle-bound drugs. Int J Mol Sci. 17 (7), 1171(2016).
  26. Lengler, J., et al. Crucial aspects for maintaining rAAV stability. Sci Rep. 14, 27923(2024).
  27. Benskey, M. J., et al. Targeted gene delivery to the enteric nervous system using AAV: a comparison across serotypes and capsid mutants. Mol Ther. 23 (3), 488-500 (2015).
  28. Polyak, S., et al. Gene delivery to intestinal epithelial cells in vitro and in vivo with recombinant adeno-associated virus types 1, 2, and 5. Dig Dis Sci. 53 (5), 1261-1270 (2008).
  29. Dudhatra, G. B., et al. A comprehensive review on pharmacotherapeutics of herbal bioenhancers. Scientific World Journal. 2012, 637953(2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Ba rsak EmilimiTers evrilmi Ba rsak KesesiOral rAAV UygulamasGen Transd ksiyonuBa rsak EpiteliVekt r Al mTransgen EkspresyonuUygulama Art r c lar

İlgili makaleler