Yöntem makalesi

Tüm yenilenen zebrafish ventriküllerinin metabolik aktivitesinin ex vivo olarak değerlendirilmesi ve ekstraselüler akı testi kullanılarak

538 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/70459

⸱

17 Nisan 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford, 2Institute of Developmental and Regenerative Medicine, University of Oxford, 3King Faisal Specialist Hospital & Research Centre, 4Department of Chemistry, University of Oxford

Bu makalede

Özet

Bu makalede, ex vivo yetişkin zebrafish ventriküllerinin oksijen tüketim oranı ve hücre dışı asitlenme oranını niceltmek için ayrıntılı bir protokol tanımlıyoruz; böylece oksidatif ve glikolitik metabolik kapasitelerini karakterize ediyoruz.

Özet

Zebra balıklarının yetişkinlik boyunca kalplerini yenileme yeteneği kısmen metabolik adaptasyonlara bağlanır. Balık kalbinin glikolize önemli ölçüde dayandığı varsayılsa da, son çalışmalar, oksidatif metabolizmanın kardiyomiyosit rediferansiyesi ve başarılı geç evre kalp rejenerasyonu için temel bir bileşen olarak ortaya çıktığı daha karmaşık bir metabolik profil ortaya çıkarmıştır. 2025 yılında, Seahorse testi (ekstrahücre akışı testi) kullanılarak tam zebrafish ventriküllerinin metabolik profilini ex vivo değerlendirmek için yüksek verimli bir yöntem uyguladık. Bu yöntem, Seahorse XFe24 analizöründe XF Mito Stres testi kullanılarak bazal ve maksimum oksijen tüketim oranı (OCR) ile hücre dışı asitleşme oranının (ECAR) hızlı ve gerçek zamanlı olarak değerlendirilmesini sağlar. Bu makalede, tüm zebrafish ventriküllerinde ekstraselüler akı analizi yapmak için ayrıntılı bir protokolü anlatıyoruz. OCR ve ECAR'ı canlı tam kalpte ex vivo olarak niceltme yeteneği, gelişim, hastalık ilerlemesi ve yenilenme sürecinde kritik zaman noktalarında kalp metabolizmasını aydınlatma fırsatı sunacaktır.

Giriş

İnsanların aksine, zebrabalıklar (Danio rerio) yetişkinlik yaşamları boyunca kaybedilen kalp dokusunu yenileme kapasitesinikorur 1. Kalp hasarı sırasında, yara sınır bölgesindeki kardiyomiyositler ayrılır ve hücredöngüsü 2,3'e yeniden girerek kardiyomiyositsayısı 4'ü geri kazanır ve yarayı yeniden doldurur. Son zamanlarda, rejeneratif süreçte kardiyomiyositlerin yeniden diferansiyesinin önemi kabuledilmiştir 5. Her iki süreç de zebrafish kalbinde metabolik değişikliklerle sıkı bir şekilde düzenlenir; glikolizproliferasyonu 6,7, oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) ise yeniden diferansiyasyonuteşvik eder 8. Metabolizmayı manipüle etmek için farmakolojik ve genetik yöntemler rejenerasyonalanında yaygın olsa da, bu bozulmaların metabolik etkilerinin doğrulanması zebrafish kalbinin küçük boyutu nedeniyle zordur; bu durum,kanülasyon 9,10,11 veya kütle spektrometrisi12 veya NMR spektroskopisi8 için birden fazla kalbin toplanmasını gerektiren karmaşık ve özelleştirilmiş bir kurulum gerektirir. 13.

Bu sınırlamaları aşmak için, yakın zamanda Seahorse XFe24 Analyzer'ın tüm zebrafish ventriküllerinin yüksek verimli metabolik profillenmesi için kullanımını tarif ettik. Hücre dışı akı testi, hücrelerin, pankreas adacıklarının ve sferoidlerin oksijen tüketim oranını (OCR) ve hücre dışı asitleşme oranını (ECAR) ölçmek için tasarlanmıştır. Bu, sırasıyla oksijen ve glikolize bağımlı laktat üretiminin solunum elektron taşıma zinciri kullanımından kaynaklanan ortamdaki oksijen ve proton konsantrasyonu (pH) değişikliklerini tespit eden katı hal sensörleriyle sağlanır (Şekil 1A)14.

Hücredışı akı analizi, 96 kuyululuk plaka düzeni (XFe96 ve XF Pro), 8 kuyu mini plakalar veya 24 kuyu plakaların çeşitli versiyonları (XFe24) üzerinde yapılabilir. 96 kuyu plakaları daha yüksek veri verimliliği sağlasa da, sensör ile kuyunun altı arasındaki çalışma mesafesi tüm bir zebrafish ventrikülünü barındırmak için uygun değildir. Ayrıca, 96 kuyululu plaka formatında, ventrikülün kuyunun dibinde sabitlenmesi ve ortamda yüzmesini ve sensörleri engellemesi için bir düzenleme yoktur. Öte yandan, XFe24 adacığı yakalama mikroplakası başlangıçta birincil pankreas adacıklarının metabolik karakterizasyonu için tasarlanmıştı ve bunun sonucunda dokunun kuyunun dibine birikmesine olanak tanır; bu doku bir ekran (ızgara) ile sabitlenir. Zebrafish kalbinin küçük boyutu nedeniyle, adacığı yakalama mikroplakasını zebrafish ventriküllerinde kullanılacak şekilde uyarlayabildik; bu ventriküller test süresince ızgara altında sabitlenmiş kalır.

Mitokondriyal solunum kapasitesini değerlendirmek için, elektron taşıma zincirinin dört inhibitörü ve adenozin trifosfat (ATP) sentazı kullanıldığı Mito Stres testini kullandık (Şekil 1A). İlk olarak, OCR'nin temel ölçümleri alınır (Şekil 1B, magenta). Sonra, kompleks bir V inhibitörü olan oligomisin enjekte edilir. Oligomisin, ATP sentaz aktivitesini inhibe eder ve böylece ATP üretimine atfedilen OCR'de azalmaya yol açar (Şekil 1B, yeşil). Kalan oksijen tüketimi, ayrılmış solunum ve mitokondriyal olmayan oksijen tüketiminin sonucudur (Şekil 1B, sırasıyla turuncu ve gri)15. Oligomisin sonrası, proton gradyanını mitokondriyal membran boyunca dağıtan FCCP enjekte edilir (Şekil 1A). Proton gradyanını geri kazandırmak için mitokondriler oksijen tüketimini maksimum kapasiteye kadar artırıyor (Şekil 1B, mavi). Son olarak, sırasıyla I ve III komplekslerini inhibe eden rotenon ve antimisin A karışımı kullanılır (Şekil 1A). Bu ilaç kombinasyonu, kompleks I ve III'ten kompleks IV15'e elektron akışının olmaması nedeniyle mitokondriyal solunum elektron taşıma zinciri aktivitesinin tamamen kapanmasına yol açar. Bu, mitokondriyal olmayan oksijen tüketiminin ölçülmesine olanak tanır (Şekil 1B, gri).

Genel olarak, Mito Stres testiyle adacık yakalama mikroplakasını kullanarak, tüm zebrafish ventriküllerinin oksidatif ve glikolitik metabolik kapasitesini ex vivo hızlı ve tekrarlanabilir şekilde değerlendirebildik. Bu prosedür için ayrıntılı protokolü aşağıda anlatıyoruz. Son olarak, ekstraselüler akı analizöründe yaralanmamış, vahşi tipli izole ventriküllerin ex vivo hayatta kalmasını gösteriyoruz ve kriyoyaralanma sonrası 14 gün (dpci) transgenik zebrafish ventriküllerinde Mito Strestestini doğruluyoruz 8.

Protokol

Aşağıda tanımlanan tüm hayvanları içeren prosedürler, Birleşik Krallık'ta revize edilmiş Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası 1986 ve Avrupa'da 2010/63/EU Direktifi ile uyumlu olarak gerçekleştirilmiş ve Oxford Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Etik İnceleme Merkezi Komitesi tarafından onaylanmıştır.

NOT: Bu protokol, fenol kırmızı ve bikarbonat içermeyen Seahorse XFe24 analizörü ve Seahorse DMEM ortamı kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

1. Zebrafish kalp kriyoyaralanması (isteğe bağlı)

  1. Deneye başlamadan önce yerel kurumdan ve ulusal otoritelerden uygun etik onay alın.
  2. Daha önce belirtildiği gibi zebrafish kalpleri üzerinde kriyoinjuryyapın 16,17,18.

2. Sensör kartuşunun nemlendirilmesi

  1. Ekstraselüler akı test setini açın ve 24 kuyulu yardımcı plakayı (Şekil 2A) her kuyu başına 500 μL kalibrant çözeltisi pipetleyerek yükleyin.
  2. Sensör kartuşu ve hidro güçlendirici ile elektrik plakasını kapatın (Şekil 2A).
  3. Kartuş ve yardımcı plakayı nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde, 37 °C'de gece boyunca (18–72 saat) inkübe edin. İnkubasyon boyunca kapağı sensör kartuşunun üzerinde tutun.

3. İlaç çözeltilerinin ve medyanın hazırlanması

  1. İlaçların stok çözeltileri alın: oligomisini dimetil sülfoksitte (DMSO) 10 mM konsantrasyona çözün, DMSO'daki karbonil siyanür 4-(triflurometoksi)fenilhidrazon (FCCP) 5 mM konsantrasyona çözün, DMSO'daki rotenonu 10 mM konsantrasyona ve antimisin A'yı etanolde 10 mM konsantrasyona çözündürür ve hemen kullanılmazsa -20 °C'de depola.
    NOT: Her 2–3 ayda bir taze oligomisin, rotenon ve antimisin çözeltileri, ayrıca her testten önce FCCP çözeltisi hazırlanması önerilir.
  2. İlaçların çalışma konsantrasyonunu (500 μM oligomisin, 300 μM FCCP, 450 μM her biri rotenon/antimisin A karışımı) stok çözeltiyi DMEM ortamında seyreltileyerek hazırlayın. Çalışma konsantrasyonları için nihai hacimin oligomisin için 1,5 mL, FCCP için 1,65 mL ve rotenon/antimisin A için 1,8 mL olduğundan emin olun; böylece 30 port yüklenebilir (kartuşta inhibitör başına 24 port ve pipet hatalarını düzeltmek için ilaç başına 6 ek port).
    NOT: Rotenon/antimisin A'da biraz çöktü oluşacak, ancak iyi karıştırıldığında bu en aza indirilir. 3.2'de belirtilen konsantrasyonların, ilaçların kuyulara enjekte edileceği zaman nihai konsantrasyonunun 10 katı olduğunu unutmayın.
  3. DMEM ortamını (pH 7.4) 10 mM glikoz, 1 mM piruvat ve 2 mM glutamin içerecek şekilde hazırlayın ve kullanıma kadar -20 °C'de depolayın.

4. Ekstraselülük akı analizörünün açılması

  1. Testten önce yan düğmeden analizörü gece boyunca açın, böylece ortamla sıcaklık dengesi sağlanabilir.
  2. Bilgisayarı açın ve Wave yazılımını açın.
  3. Yazılımda Mito Stres testini seçin.
  4. Yazılımın sol alt köşesindeki ısıtıcıyı kapatarak analizördeki sıcaklığın 37 °C'nin altına düşüp 28–29 °C'ye ulaşmasını sağlayarak zebrabalık yetiştiriciliğinin standartsıcaklığına yaklaşın. 19.
  5. Enjeksiyon stratejisini, bileşik kataloğundan her porta yerleştirilecek bileşikleri ekleyerek Grup tanımları sayfasında (enjeksiyon stratejileri sekmesi altında) belirleyin. Mito stres testi için port A'ya oligomisin, port B'ye FCCP ve C portuna rotenon/antimisin ekleyin. Port D'de bir ilaç daha eklenme kapasitesi vardır ve bu protokolde kullanılmamaktadır.
  6. Deneysel strateji tanımlandıktan sonra enjeksiyon stratejileri sekmesinde var olan diğer önceden tasarlanmış tüm stratejileri silin. Gruplar sayfasının Gruplar tarafında deneysel grupları (örneğin, vahşi tip ve mutant) belirtin ve alacakları enjeksiyon stratejisini (4.5. adımda tanımlanan) belirtin. Enjeksiyon stratejilerinin gruplar arasında ve ayrıca tasarlanan enjeksiyon stratejisiyle uyumlu olduğundan emin olun.
  7. Levha haritası sayfasında, her bir grubun üzerine tıklayarak ve ardından örnekleri barındıracak kuyulara tıklayarak her örneğin 24 kuyu plakasındaki konumunu belirtin.
    1. Kuyulardan dördü örnek biriktirme için uygun değildir (Şekil 2B) ve arka plan düzeltmesi için kullanılacak boşluklar olarak kullanılır. Her gruptaki örneklerin plaka boyunca eşit şekilde dağıtıldığından emin olun, böylece ölçümlerde veya çevresel koşullarda olası konumsal yanlılığı dengeleyin.
  8. Protokol sayfasında, yukarıda belirtilenlerin dışında başka bir inhibitör kullanılmadıysa Kontrol veya Deneysel sekmesini kaldırın ve yazılım portlarının kartuştaki ilaçların konumlarıyla uyumlu olduğundan emin olun.
  9. Yazılım, her koşul için 3 karıştırma, bekleme ve ölçüm döngüsü otomatik olarak ayarlar. Döngü sayısını 10 temel (tedavi edilmemiş), 3 oligomisin, 7 FCCP ve 9 rotenon/antimisin A ölçümüne göre değiştirerek stabil izler oluşabilir ve inhibitörlerin 3D doku üzerinde etki göstermesini sağlar. Her döngünün 3 dakika karıştırma, 2 dakika bekleme ve 3 dakika ölçümden oluşduğundan emin olun.

5. Analizör kalibrasyonu

  1. Kartuş ve yardımcı plakayı nemlendirilmiş kuluçka makinesinden çıkarın (bkz. 2.1–2.3. adımlar).
  2. Hidro güçlendiriciyi ve kapağı (Şekil 2A) kartuştan çıkarın ve sensör kartuşunu kalibrasyonu içeren elektrik plakasına yerleştirin.
  3. Inhibitörleri portun yan duvarına pipet ucu ile dokunarak nazikçe pipetleyin; böylece sıvının düzgün akışını sağlayın: A portunda 50 μL oligomisin, port B'de 55 μL FCCP ve C portunda 60 μL rotenon/antimisin A (Şekil 2C).
    1. Sıvının sadece portun deliğinde yüzey gerilimiyle tutulduğunu unutmayın, bu yüzden bu adımdan itibaren ani pipetleme veya kartuşun bantlanmasından kaçının. Sensör portuna sıvı girmediğinden emin olun (Şekil 2C), çünkü bu analizörü zarar verir.
  4. Yazılımda başlat çalıştır tuşuna tıklayın, koşuya ad verin ve bilgisayara kaydedin. Bu noktada, analizörün tepsisi açılarak kartuş ve yardımcı plaka yerleştirilir.
  5. İlaçlarla dolu kartuşu ve kalibrantı içeren yardımcı plakayı, tepsideki plaka haritasına göre (sol üstte A1 yuvası) analizör tepsisine yerleştirin ve düzgün oturduğundan emin olun. Tepsiye yüklemeden önce hidrant güçlendiricisini ve kapağı (Şekil 2A) plakadan çıkarın. Bunu yapmamak analizörü zarar görür.
  6. Hazır oluncu, yazılıma ' Çalıştır testi' tuşuna basarak testi başlatmasını talimat verin. Bu noktada, analizör yüklenen tepsiyi alır ve kalibrasyonu başlatır.
  7. Kalp izolasyonuna başlayın (bkz. 6.1–6.12. adımlar). Kalibrasyon yaklaşık 40 dakika sürer, ancak plaka, kalpleri izole edip adacığı yakalama mikroplakasına yerleştirmek için gerekli süre analizörde tutulabilir (Şekil 2B,D).

6. Balık kalplerinin izole edilmesi ve 24 kuyu Adacığı plakasına yüklenmesi

  1. Adacık yakalama mikroplakasını açın ve 24 kuyruklu adacığı oda sıcaklığında 500 μL DMEM (10 mM glikoz, 1 mM piruvat, 2 mM glutamin) ile doldurun.
  2. Tüm ızgaraları, oda sıcaklığında DMEM ortamı içeren 35 mm Petri kabına yerleştirin; böylece tamamen daldırılmış ve büyük kabarcıklardan arınmış olduklarından emin olun.
  3. Oda sıcaklığında DMEM (10 mM glikoz, 1 mM piruvat, 2 mM glutamin) içeren ek 35 mm Petri kabı hazırlayın. Bu, kalplerin toplandığında durulmasına ve ventrikülün atrium ile bulbus arteriosus'tan ayrılmasına yardımcı olur.
  4. 5 g/L MS-222 içinde bir balık kesin ve reflekslerin yokluğunu kontrol edin.
  5. Balığı, 92 mm'lik bir Petri kabına sabitlenmiş bir süngerin üzerine yerleştirin, kalp boşluğunu açın ve kalbi daha önce tarif edildiği gibidispeksiyona alın 16,20.
  6. Kalp kalbini DMEM (10 mM glikoz, 1 mM piruvat, 2 mM glutamin) içeren 35 mm Petri kabında oda sıcaklığında durulayın.
  7. 35 mm Petri kabındaki forsepsle atrium ve bulbus arteriosus'u çıkarın.
  8. Ventrikülü nazikçe sallayıp sıkın ki kanın lümeninden boşalmasını sağlasın. Kalbi yıkarken ventriküler duvara zarar vermeyin.
  9. Kalbi, adacığı yakalama mikroplakasındaki belirlenmiş kuyusuna aktarın ve plaka haritasına göre uygun kuyunun merkezine batmasına izin verin. Plakayı oda sıcaklığında tutun. Tüm ventrikülleri teste dahil edin, gözle görülür şekilde atmayı bıraksalar bile.
  10. Tüm mevcut balıklar için bu işlemi tekrarlayın. Farklı deneysel grupların metabolik aktivitelerini karşılaştırırsanız, bir gruptan tüm kalpleri değil, her grup başına bir kalp izole etmenizi öneririz, sonra bir sonraki grupa geçebilirsiniz. Kalpler analizörde en az 180 dakika hayatta kalabilse de (Şekil 3A), izolasyonun en iyi uygulama olarak her grup başına bir kalp yapılmasını öneriyoruz; böylece ortamda zamanın gruplar arasında eşit dağılımı sağlanır.
  11. Tüm kalpler izole edildikten sonra (20 kalpli bir plaka için yaklaşık 60 dakika), onları adacığı yakalama mikroplaka kuyruklarının dibine yerleştirin (Şekil 2B) ve ince forseps kullanarak kuyunun ortasına yerleştirin (Şekil 2D,E).
  12. Onları ızgara ile kapatmak için bir forseps kullanın (yaklaşık 20 dakika) (Şekil 2D). Izgaranın doğru konumda olduğundan (ağın kalbe doğru baktığı) olduğundan ve büyük kabarcıklar içermediğinden emin olun, çünkü bu ölçümlere müdahale edebilir (Şekil 2E).
    1. Izgara yerine oturduğunda, kenarlardan yerinde hafif bir tık sesi duyulana kadar forsepsle itin. Pensepsle kalbi ızgaradan çarpmadığınızdan emin olun.

7. Örneklerin analizöre yüklenmesi ve ölçümlerin alınması

  1. Kalpler adacığı yakalama mikroplakasına yerleştirildikten sonra, bilgisayar ekranındaki yeşil işaretlerle belirtildiği gibi, tüm kuyulardan başarıyla kalibre edildiğini yazılımda kontrol edin. Şimdi açık tepsiye basarak yardımcı plakayı çıkarın.
    NOT: Bu noktada kartuş atılmayacak ve sadece kalibranı içeren yardımcı plaka görünecektir.
  2. Yardımcı plakayı, analizör tepsisindeki örnekleri içeren adacığı mikroplakası ile değiştirin. Adacık mikroplakasının doğru konumlandırıldığından (sol üst köşede A1) ve kapağın çıkarıldığından emin olun. Kapağın çıkarılmaması analizöre zarar verir.
  3. Adacık plakası konumlandırıldıktan sonra, yazılıma yük hücresi plakasına basarak deneyi başlatmasını talimat verin. Yaklaşık ilk 10 dakika boyunca sensörler bir dengeleme adımı gerçekleştirir ve ardından ölçümler başlar.
  4. Deney tamamlandıktan sonra (yaklaşık 4 saat), tepsinin açılması ve adacık mikroplakası ile kartuşun atılması için fırlatma kartuşuna basın.
  5. Adacığı mikroplaka ve kartuşu çıkarın, tepsi kapanması için tamamlanmış tuşuna basın. Bu noktada, toplanan verileri görmek için sonuçları görüntüle basın.
  6. Ölçümleri kaydedin, analizör bilgisayarından dışa aktarın ve daha fazla analiz ve işlem için analitik arayüzüne yükleyin. Bu, adacığı plakası ve kartuşun analizörden çıkarılmasını tetikler.
  7. İstik plakasını ve kartuşu analizörden çıkarın ve kapağıyla kartuşu kapatın.
  8. Adacık plakasını kuru buzda dondurun veya kalpleri kuyulardan çıkarın (bkz. adım 8.2) ve eğer protein izolasyonu (adım 8) hemen yapılmazsa -20 °C'de saklayın.
  9. Veri kaydedildikten sonra yazılımı, analizörü ve bilgisayarı kapatın.
  10. Verileri analiz arayüzüne yükleyin ve standart görünümler seçeneğinden OCR grafiğini seçerek görselleştirin. Arayüzde, verileri OCR ve ECAR seviyesi veya oranı olarak görüntüleyin, boş kuyular üzerinden arka planı düzeltin ve plaka haritasına tıklayarak kuyrukları görünmek veya kaybetmek için seçebilirsiniz.

8. Protein izolasyonu ve normalizasyon için nicelendirilmesi

  1. Proteaz inhibitörü içeren radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA) tamponu hazırlanın; bir proteaz inhibitörü tabletini 10 mL RIPA tamponunda çözüp iyi karıştırın.
  2. Henüz yapılmadıysa (adım 7.8), adacığı yakalama ekranı ekleme aracını kullanarak (Şekil 2F), adacık levhasından ızgaraları çıkararak kalpleri serbest bırakın. Kupları dikkatlice çıkarın, çünkü ızgarada sıkışmış olabilirler. Eğer durum buysa, onları bırakmak için forseps kullanın. Eğer ızgara ekran yerleştirme aracıyla çıkarılamazsa, plakayı stereoskopun altına taşıyın ve mikrodiseksiyon makası ile ızgarası dikkatlice keserek kalbi serbest bırakın.
  3. Her ventrikül, buz üzerinde proteaz inhibitörüyle zenginleştirilmiş 200 μL RIPA tamponu içeren 1,5 mL tüpe yerleştirin.
  4. Bir homojenizer ile kalbi, buz üzerinde tek kullanımlık havacılarla homojenleştirin.
  5. Standartları, sağlanan sığır serum albümini (BSA) RIPA tamponunda aşağıdaki konsantrasyonlarda seyreltilerek hazırlayın: 2000 μg/mL, 1500 μg/mL, 1000 μg/mL, 750 μg/mL, 500 μg/mL, 125 μg/mL, 25 μg/mL, 0 μg/mL.
  6. Pierce BCA çalışma çözümünü hazırlayın (50:1, reaktif A: reaktif B, üreticinin talimatlarına göre). Aşağıdaki formülü kullanarak gereken çalışma reaktifinin hacmini hesaplayın:
    (standart sayısı + örnek sayısı) × 2 × 200 μL
    NOT: Bu hacim, örnek ve standart başına 200 μL çalışma çözeltisi kullanılmasına olanak tanır ve örnek ile standart başına tekrarlanan ölçümlerin alınmasına olanak tanır.
  7. 96 kuyu bir plakada, her standart ve her kuyu için her numuneyi 25 μL kopya halinde ekleyin.
  8. Her kuyu başına 200 μL çalışan çözelti ekleyin.
  9. Plakayı 37 °C'de 30 dakika boyunca inkübe edin.
  10. Plakayı 10 dakika oda sıcaklığına kadar soğutun ve plaka sızdırmazlayıcı ile mühürleyin. Kuyruklarda baloncuk olmadığından emin olun, çünkü bu plaka okuyucuyu engelleyebilir. Sınırlı sayıda baloncuk oluşursa, uç veya ince forseps kullanarak patlatın.
  11. Bir plaka okuyucu kullanarak 562 nm'de absorbansı ölçün.
  12. Standartların emilimine dayalı standart bir eğri oluşturun ve örneklerin protein konsantrasyonunu hesaplayın.
  13. Her kuyu için analiz arayüzünün normalizasyon sekmesine (Şekil 2G) protein konsantrasyonunu kaydedin.

9. Veri analizi

  1. Protein içeriğine göre normalleştirdikten sonra, analitik arayüzünden verileri Excel veya Prism dosyaları olarak aktarın; böylece grafiğin sağ üst köşesindeki bulut butonu ile daha fazla analiz yapılabilir.
  2. Normalize edilmiş verileri kullanarak, ilk üç alım hariç olarak temel OCR ve ECAR'ı hesaplayın, çünkü sinyal ilk ölçümlerde kararsız olabilir.
  3. Normalize edilmiş verileri kullanarak, maksimum OCR ve ECAR'ı belirtmek için FCCP tedavisinin ilk üç ediniminin ortalama ölçümlerini hesaplayın.

Sonuçlar

Bu protokol, tüm zebrafish ventriküllerinin OCR ve ECAR'ının nicelendirilmesini sağlar. Herhangi bir ilaç tedavisi olmadan, analizörde yaralanmamış vahşi tip KCL ventriküllerini inkubka ederek ventriküllerin ex vivo ortamda hayatta kalma durumunu doğruladık (Şekil 3A). Veriler, ventriküllerin stabil bir OCR ve ECAR'a sahip olduğunu ve boş kuyunun temel ölçümlerinden en az 180 dakika boyunca önemli ölçüde yükselttiğini göstermektedir (Şekil 3A). Bu veriler, ventriküllerin bu ex vivo ortamda normal solunum fonksiyonu ve hayatta kalma gösterdiğini göstermektedir.

Ventriküller için optimal dozu belirlemek amacıyla çeşitli ilaç konsantrasyonları ve ortam formülasyonları kullanılarak çeşitli OCR ölçümleri yaptık (Şekil 3B). [oligomisin] 10 μM, [FCCP] 8 μM ve [rotenon/antimisin] 25 μM kombinasyonları kullanıldığında OCR katlanma değişiminde (FCCP/bazal) hafif bir artış gözlemledik; [oligomisin] 50 μM, [FCCP] 30 μM ve [rotenon/antimisin] 45 μM kombinasyonlarında biraz daha büyük bir artış gözlemledik (Şekil 3B). Sonuç olarak, deneylerimiz için son konsantrasyonlara geçtik. Ventrikül 3D bir yapıya sahip olduğundan, ilaçların dokunun dış hücrelerine güçlü şekilde etki etmesi ve ventrikülün luminal tarafındaki hücrelere ulaşmaması mümkündür. Bunu çözmek için, DMEM'de kuluçkadan önce kalpleri %0,5 saponin ile 30 dakika boyunca tedavi ettik (10 mM galaktoz, 1 mM piruvat, 4 mM glutamin). Bu, FCCP enjeksiyonundan sonra OCR'de kalıcı bir azalma ve beklenen OCR artışının olmamasına yol açtı (Şekil 3C), bu da kalplerin metabolik olarak başarısız olduğunu düşündürdü. Sonuç olarak, deneylerimiz için ventrikülleri geçirimsiz hale getirmedik.

Ayrıca, burada orijinaldeneyimiz 8'den normalize edilmiş izleri sunuyoruz. Yedi vahşi tip zebrafish suşunun doğal rejeneratif potansiyelindeki çeşitliliği kullanarak mdh1ab'nin, sitozolik malatın dehidrojenaz 1Ab'nin, kardiyomiyosit rediferansiyesi yoluyla rejenerasyon üzerinde faydalı bir etkisi olduğunu tespit ettik. Bu bulguyu doğrulamak için, kardiyomiyositlere özgü bir şekilde mdh1ab'yi aşırı eksprese eden transgenik zebrabalıklar (mdh1ab cOE) ve kontrol balığı aşırı eksprese edilen yeşil floresan protein (GFP cOE) ürettik. Ventriküllerini kriyoyaralanma yaptık, 14 dpci hızında topladık ve metabolizmalarını Mito Stres testi ile inceledik (Şekil 3D). Oligomisin tedavisi OCR'yi anlamlı şekilde değiştirmedi, ancak ECAR'da hafif bir artış gözlemlendi. FCCP'nin medyaya enjekte edilmesi, mdh1ab cOE örneklerinin en yüksek maksimum solunum kapasitesini koruması ile OCR ve ECAR'da beklenen artışa yol açtı (Şekil 3D). Son olarak, rotenon/antimisin her iki grupta da metabolizmanın tamamen durmasına yol açtı. Genel olarak, bu yöntem mdh1ab'yi aşırı eksprese eden ventriküllerin metabolik kapasitesinde ve yedi farklı vahşi tip zebrafish sırtı arasında önemli farklılıkları belirlememizeolanak sağladı 8.

figure-results-1
Şekil 1: Mito Stres testi sırasında glikoz metabolizması. (A) Glikoz metabolizmasının şematik temsili. Glikoz, GLUT taşıyıcıları aracılığıyla hücreye girer ve glikoliz yoluyla piruvaya dönüşür. Laktat dehidrojenaz (LDH), piruvatı laktata dönüştürür ve ortaya çıkan protonlar hücreden salgılanır. Piruvat asetil-CoA'ya dönüşür ve mitokondri ile TCA döngüsüne girerek iç mitokondriyal membrandaki solunum elektron taşıma zincirini besler. Kompleksler I, III ve V'nin inhibitörleri ile ayrıcı FCCP kırmızı renkle belirtilmiştir. Solunum elektron taşıma zincirinden geçen elektronlar, sonunda oksijen ve protonların suya dönüşmesine yol açan mavi oklarla işaretlenir. (B) Mito Stres testi sonuçları şeması. Bazal solunum magenta renginde gözlemlenir. Oligomisin enjeksiyonunda, OCR düşer ve ATP bağlantılı solunum (yeşil) ile proton kaçağı (turuncu) hesaplanmasına olanak tanır. FCCP, OCR'yi hücrelerin maksimum solunum kapasitesine (mavi) çıkarır. Rotenon ve antimisin A enjeksiyonu, mitokondriyal solunumun durmasına yol açar ve sadece mitokondriyal olmayan solunumun gerçekleşmesine izin verir (gri). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Sensör kartuşu ve adacığı yakalama mikroplaka düzeni. (A) Kapak-sensör kartuş-hidro güçlendirici-yardımcı plaka kompleksi (üstte) ve ters sensör kartuşunun (altta) görüntüsü. Ölçek çubuğu: 1cm. (B) Zebrafish ventrikülleriyle yüklü bir adacığı mikroplaka yakalama görüntüsü. Kırmızı daireler, ventrikül içermeyen boş kuyrukları gösterir ve analiz sırasında arka plan düzeltmesi olarak hizmet eder. Ölçek çubuğu: 1cm. (C) XFe24 sensör kartuşunda port düzeninin şematik temsili. Port A oligomisin, B FCCP içerir ve C rotenon/antimisin karışımını içerir. Port D boş bırakılabilir veya ekstra bir ilaç eklenebilir. S, sensör portunu ifade eder ve analizörün zarar görmemesi için sıvı içermemelidir. (D) Kuyunun dibinde, ızgara ile çevrili (solda) ve ızgarasız (sağda) bir zebrafish ventrikülünün temsil ihali. Ölçek çubuğu: 5mm. (E) Bir ventrikül, ızgara (sarı) ve sensör kartuşunu (yeşil) içeren adacığı yakalama mikroplakasının şematik kesiti. P portları, S ise sensörü gösterir. Dalgalı çizgi ortamı temsil eder. (F) Adacı yakalama ekranı ekleme aracı. Scalebar: 1 cm. (G) Analitik arayüzünde normalizasyon sekmesi simgesi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Zebrafish ventriküllerinin temsil OCR ve ECAR ölçümleri. (A) Testte kullanılan inhibitörlerle tedavi edilmemiş yaralanmamış yabani tip zebrafish ventriküllerinin (KCL suşu) temsil OCR ve ECAR izleri (n = 2, kırmızı çizgi). Biyolojik materyal içermeyen boş kuyulardan çıkan izler gri renkte sunulur (n = 4); OCR, iki yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA, zaman faktörü P = 0.0200, kuyu etkileşimi × zaman P = 0.0196, kuyu faktörü P < 0.0001, grup faktörü P < 0.0001; ECAR iki yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA, zaman faktörü P = 0.1323, kuyu etkileşimi × zaman P = 0.0216, kuyu faktörü P = 0.0009, grup faktörü P<0.0001; ortalama SEM ± olarak sunulan veriler. (B) Çeşitli ilaç konsantrasyonları ve kullanılan ortamlarda OCR katlama değişimi. Tek yönlü ANOVA (P = 0.0032) ve Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi. [O] 5 μM, [F] 4 μM, [RA] 2 μM, n = 6; [O] 10 μM, [F] 8 μM, [RA] 25 μM, n = 8; [O] 25 μM, [F] 16 μM, [RA] 45 μM, n = 8; [O] 50 μM, [F] 30 μM, [RA] 45 μM, n = 8; [O] 100 μM, [F] 60 μM, [RA] 90 μM, n = 8. O, oligomisin; F, FCCP; RA, rotenon/antimisin. (C) Saponin geçirimli ventriküllerin izi (kırmızı, n = 4) ve tedavi edilmemiş ventriküllere (gri, n = 4); iki yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA, zaman faktörü P < 0.0001, zaman × örnek etkileşimi P < 0.0001, tedavi faktörü P < 0.0001, örnek faktörü P = 0.824; veriler ortalama ± SEM olarak sunuldu. Saponinle işlenmiş ventriküllerin OCRmax ve tedavi edilmemiş ventriküllere karşılaştırılması; eşleşmemiş öğrencinin t-testi (P = 0.0850). (D) Mdh1ab cOE (kırmızı, n = 8) ve GFP cOE (gri, n = 8) 14dpci ventriküllerinden temsil OCR ve ECAR izleri. OCR, iki yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA, zaman faktörü P < 0.0001, örnek etkileşimi × zaman P < 0.0001, genotip faktörü P < 0.0001, örnek faktörü P = 0.1098; ECAR, iki yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA zaman faktörü P < 0.0001, örnek etkileşimi × zaman P = 0.7507, örnek faktörü P = 0.2154, genotip faktörü P < 0.0001. Veriler Lekkos ve ark., 20258'den uyarlanmış ve ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Burada, Seahorse XFe24 analizörü ve Mito Stres testi kullanılarak ex vivo zebrafish ventriküllerinin OCR ve ECAR analizi protokolünü ayrıntılı olarak anlatıyoruz. Kardiyomiyosit metabolizması, kalp yenilenmesinde hayati bir roloynar 21,22,23,24. Ancak, yenilenen zebrafish kalbinin metabolik fenotipinin doğrulanması zordur ve genellikleyayınlarda eksik kalmaktadır. Zebrafish kalbinin küçük boyutu nedeniyle, NMR spektroskopisi veya kütle spektrometrisi gibi teknikler, yeterlisinyal almak için birkaç ventrikülün toplanmasını gerektirir 8,12,13. Buna karşılık, burada anlattığımız yöntem, birden fazla bireysel ventrikülten OCR ve ECAR ölçümlerinin alınmasına olanak tanır ve böylece istatistiksel güç artırılır.

Metabolomik gibi klasik metabolik profilleme yöntemleri, dokunun toplandığı anki metabolik profilinin anlık görüntüsünü sağlar. Mito Stres testi sayesinde, ventriküllerin çeşitli metabolik zorluklara nasıl uyum sağladığına, özellikle diğer metodolojilerle kullanıldığında belirgin olmayan maksimum solunum kapasitesine dair gerçek zamanlı ve canlı veri toplayabildik. Zebrafish ventriküllerinin canlı fenotiplenmesini sağlamak için zebrafish kalbinin perfüzyonudenenmiştir 9,10,11. Bu, düşük verimlilikli bir yöntem olarak kalmak için karmaşık özelleştirilmiş ekipman ve yüksek vasıflı teknisyenler gerektirir. Analizör, ticari olarak mevcut olan ve yüksek verimli (aynı anda 20 ventrikül) ventriküllerin fenotiplenmesi için daha basit bir alternatif sunar. Bildiğimiz kadarıyla, bu makalede tanımlanan yöntemin Clark tipi elektrot gibi diğer canlı oksimetri teknikleriyle doğrudan karşılaştırılması yapılmamıştır.

Önemli olarak, tarif ettiğimiz yöntem araştırma sorusuna göre uyarlanabilir. Bu test, daha önce tüm zebrafish embriyolarını karakterize etmekiçin kullanılmıştır 25,26. Burada açıklanan Mito Stres testine ek olarak, Mito Yakıt Flex testi insan kalp dilimlerinin metabolik yakıtkullanımını değerlendirmek için optimize edilmiştir 27. Ayrıca, Hücre Enerjisi Fenotipi testi, Astyanax mexicanus kalplerinin yenilenmesinin glikolitikkapasitesini karakterize etmek için uyarlanmıştır 28. Bu protokolün kalp organoidleri gibi diğer 3D yapılar için de kullanılacağını ve yaralanmamış zebrafish kalplerinde metabolik yolların genetik bozulmasının doğrulanması için faydalı olacağını öngörüyoruz.

Bu tekniğin bazı sınırlamaları olduğunu kabul ediyoruz. Teknik zorluklar açısından, izolasyon aşamasında kalpler oda sıcaklığında ve 28 °C'de tutulmayan DMEM ortamında işlendi; bu sıcaklık zebrafish19 için optimal sıcaklıktır. Su sıcaklığını 18 °C'ye düşürmek, zebrafish kalbinin in situ 29,30 fonksiyonu üzerinde önemli etkiler yaratabilir. Ancak, kısa süreli oda sıcaklığına maruz kalmanın izole ventriküllerin fizyolojisi üzerinde önemli bir etkisi olmasını beklemiyoruz, çünkü ventriküller hızla 28 °C analizörüne geri döner. Elimizde, atriumun diseksiyonunda ventriküllerin çoğu gözle görülür şekilde atmayı bıraktı; bu da kalp pili uyarıcısının eksikliğinin kasılmamanın etiyolojisi olduğunu gösteriyor. Ayrıca, izolasyon döneminde ortam oksijenlenmemiş, bu da hafif hipoksiye yol açabilir; bu hipoksi ilk ölçümden önce analizörle karıştırıldığında normal oksijen seviyelerine geri döner.

Kalp sıcaklığıyla ilgili ek pratik bir husus, ısıtıcının analizörde kapanmasıyla ilgili olarak da sıcaklığın 37 °C'den 28–29 °C'ye düşmesine yol açar. Analizör, ısıtıcı gücünün istenen sıcaklığa düşürülmesine izin vermez. Buna rağmen, analizör çalışırken, tepsi içindeki sıcaklık oda sıcaklığından 6–7 °C daha yüksektir. Bu sıcaklık aralığı, optimum zebrafish yetiştirmesıcaklığı 19 ile örtüşür.

Bu test, toptan zebrafish ventrikülleri üzerinde yapılır. Sonuç olarak, OCR ve ECAR'da gözlemlenen değişikliklere bireysel hücre tiplerinin katkılarını ayırt etmek imkansızdır. Bu, erken rejeneratif zaman noktalarının metabolik hızlarını araştırırken önemli olabilir; çünkü yüksek bağışıklık hücresiakınının31 kardiyomiyositlerin OCR değişikliklerini gizleyebileceği durumlarda. Ayrıca, ventriküler lümende kalan kan metabolik gösterileri etkileyebilir. Heparin 7 varlığında kalplerin kanamasına izin vermek, kalpteki kan hücrelerinin pıhtılaşma etkisini daha da azaltabilir. Ayrıca, ventrikülün iç hücrelerine doğru kullanılan inhibitörlerin difüzyonunu artırmak için saponin kullanarak bir permeabilizasyon adımı denedik. Saponin geçirimliliği, test boyunca OCR'de kalıcı bir düşüşe yol açtı ve ventriküllerde solunum yetmezliğine yol açtı. Bu sınırlamalar, izole kardiyomiyositlerin izolasyonu, kültürü ve analiziyle önlenebilir; ancak bu yaklaşım, rejeneratif ortam için optimal olmayabilecek32 hücre kültürünün uzun sürmesini gerektirir.

Yaralı doku, kullanılan normalizasyon yöntemini etkileyebilir. Bu çalışmada, BCA testini kullanarak μg protein/mL ile OCR'yi normalleştiriyoruz. BCA testi, hidroksiprolin ve prolin açısından zengin bileşimleri nedeniyle kolajen proteinleriyle güçlü bir reaksiyona girmese de, bu proteinler koper kullanılarak kötü tespit edilemiyor, ancak hücre içermeyen diğer yaralı bileşenlerin varlığı normalleşmeyi etkileyebilir. Gelecekteki çalışmalar, canlı hücrelerin ventriküldeki doğru yansıması olarak toplamDNA 33'ün kullanımını düşünebilir.

Ayrıca, kompleks V15'in oligomisin bağımlı inhibisyonunun neden olduğu beklenen OCR azalmasını tekrarlayamadık. Bazı çalışmalar, izole kardiyomiyositlerde oligomisin tedavisiyleOCR'de azalma olduğunu gösterse de (32,34,35), buradaki veriler, izole yetişkin fare kardiyomiyositleri üzerinde yapılan yakın tarihli bir çalışmada bildirilen yanıteksikliğine benziyor 36. Kullandığımız oligomisin konsantrasyonu, yukarıda bahsedilen çalışmalarda bildirilenden anlamlı şekilde daha yüksek olduğundan, nihai konsantrasyonun 50 μM'nin üzerine çıkarılmasının etkisi olup olmayacağı belirsizdir.

Son olarak, oksijen tüketimi öncelikle solunuma bağlı olsa da, hücre dışı asitleşme yalnızca glikoliz tarafından üretilen laktat tarafından değil, aynı zamanda karbondioksitin karbon asite dönüşmesiyle de gerçekleşir. Glikozla beslenen miyoblastlarda, hücre dışı asitleşmenin üçte birinin temel koşullarda karbondioksittenkaynaklandığı bildirilmiştir 37. Bu nedenle, Seahorse analizöründen elde edilen ECAR ölçümlerinin yorumunda uyarı yapılmasında temkinli olmamızı tavsiye ediyoruz; eğer solunum kaynaklı asitleşmenin oranıiçin herhangi bir düzeltme yapılmadıysa 38.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını belirtmektedir.

Teşekkürler

Bu yöntemin geliştirilmesi sırasında destek ve eleştirel tartışmalar için Nick Howe (Agilent Technologies) ve Thomas Nicol'a (Oxford Üniversitesi) minnettarız. Zebra balığını korumak ve transfer etmek için Oxford Üniversitesi Seviye 1'deki hayvan tesisimizdeki ve Oxford Üniversitesi Gelişimsel ve Rejeneratif Tıp Enstitüsü'ndeki personele teşekkür etmek isteriz. Bu çalışma, Tıbbi Araştırma Konseyi (MR/W006731/1'den KL'ye), King Faisal Uzman Hastanesi ve Araştırma Merkezi (RA'ya doktora sonrası burs), Wellcome Kurumsal Stratejik Destek Fonu (204826/Z/16/Z'den JSOM'a), British Heart Foundation IBSRF (FS//17/58/33072 to LCH), Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) tarafından desteklenmiştir; Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programı kapsamında (715895, CAVEHEART, ERC-2016-STG to MTMM), British Heart Foundation proje hibeleri (PG/15/111/31939 ve PG/23/11189 MTMM'ye), MTMM, BHF Oxford Araştırma Mükemmeliyet Merkezi, Oxford Üniversitesi (RE/24/130024) ve BHF Rejeneratif Tıp Merkezi'nden (RM/13/3/30159) destek almaktadır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5ml Eppendorf tüpleri StarlabS1615-5550
96-kuyu plakası ThermoFisherAB-0800
Antimisin AChemCruz sc-202467A
DMEM ortamıÇevik1035755-100
DMSOSigma-Aldrich D2650-100mL
Kuru buz  
EtanolSupelco1.00983.2500
Ekstraselüler Flux Assay Kiti  Çevik103518-100Pakette yardımcı plaka, hidro güçlendirici, sensör kartuşu, kapak (adacığı plakalarıyla birlikte gelir) bulunur.
FCCPSigma-Aldrich C2920
GlikozÇevik103577-100
GlütamineÇevik103579-100
Kuluçka makinesi
Adacığı yakalama mikroplakasıÇevik101122-100Pakette 25 grid yer alıyor
Adacığı yakalama ekran inster aracıÇevik101135-100
mikrodiseksiyon forsepsleriideal-tek31317605-S boyutu (ventrikülü bulbus arteriosus ve atriyumdan izole etmek için 2x gereklidir)
mikrodiseksiyon makasıFST15009-08
MS-222Sigma-Aldrich E10521
OligomisinMP 151786
Pestle mottor homojenizici VWR431-0100
PestlesVWR431-0094
Petri kabı 35mmGreiner Bio-One627102
Petri kabı 92mmStarstedt82.1473
Pierce BCA Test KitiTermo Bilimsel23227
Pierce Proteaz ve Fosfataz İnhibörü Mini Tabletler, EDTA içermeyenTermo BilimselA32961
PiruvatÇevik103578-100
RIPA liz tamponuSanta-CrusSC-364162
RotenoneMP 02150154-CF
Seahorse Analytics Agilent interphaseÇevikhttps://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/agilent-seahorse-analytics-787485
Seahorse XFe24 AnalizörüÇevikhttps://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-analyzers/seahorse-xfe24-analyzer-740878
MühürleyiciTermo BilimselAB-0558
SPECTROstar NanoMG LABTECH GmbH601-0298
SüngerBalığın ventral tarafını yukarıya doğru sığdıracak kadar uzun ve derin bir kesi yapın
Wave (sürüm 2.6.1.56)Çevikhttps://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop
XF kalibre/nbsp;Çevik100840-000

Kaynaklar

  1. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science (1979). 298 (5601), 2188-2190 (2002).
  2. Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
  3. Kikuchi, K., et al. Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4+ cardiomyocytes. Nature. 464 (7288), 601-605 (2010).
  4. Bertozzi, A., et al. Is zebrafish heart regeneration "complete"? Lineage-restricted cardiomyocytes proliferate to pre-injury numbers but some fail to differentiate in fibrotic hearts. Dev Biol. 471, 106-118 (2021).
  5. Nguyen, P. D., et al. Interplay between calcium and sarcomeres directs cardiomyocyte maturation during regeneration. Science (1979). 380 (6646), 758-764 (2023).
  6. Fukuda, R., et al. Stimulation of glycolysis promotes cardiomyocyte proliferation after injury in adult zebrafish. EMBO Rep. 21 (8), e49752(2020).
  7. Honkoop, H., et al. Single-cell analysis uncovers that metabolic reprogramming by ErbB2 signaling is essential for cardiomyocyte proliferation in the regenerating heart. Elife. 8, e50163(2019).
  8. Lekkos, K., et al. Oxidative phosphorylation is required for cardiomyocyte redifferentiation and long-term fish heart regeneration. Nat Cardiovasc Res. 4 (10), 1363-1380 (2025).
  9. Zhang, H., et al. A Langendorff-like system to quantify cardiac pump function in adult zebrafish. Dis Model Mech. 11 (9), dmm034819(2018).
  10. Zhang, P. C., Llach, A., Sheng, X. Y., Hove-Madsen, L., Tibbits, G. F. Calcium handling in zebrafish ventricular myocytes. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 300, 56-66 (2011).
  11. Lin, E., et al. Construction and use of a zebrafish heart voltage and calcium optical mapping system, with integrated electrocardiogram and programmable electrical stimulation. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 308, R755-R768 (2015).
  12. Miklas, J. W., et al. Amino acid primed mTOR activity is essential for heart regeneration. iScience. 25 (1), 103574(2022).
  13. García-Poyatos, C., et al. Cox7a1 controls skeletal muscle physiology and heart regeneration through complex IV dimerization. Dev Cell. 59 (14), 1824-1841.e10 (2024).
  14. How Agilent Seahorse XF Analyzers Work. , Agilent. https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/how-seahorse -xf-analyzers-work?srsltid=AfmBOopkIZodH4uZO 5puXTOp1U5gdkky661L6TKluz5XgBWGqujHEzww (2026).
  15. Yoo, I., Ahn, I., Lee, J., Lee, N. Extracellular flux assay (Seahorse assay): Diverse applications in metabolic research across biological disciplines. Mol Cells. 47 (8), 100095(2024).
  16. Chablais, F., Jaźwińska, A. Induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury. J Vis Exp. (62), e3666(2012).
  17. González-Rosa, J. M., Mercader, N. Cryoinjury as a myocardial infarction model for the study of cardiac regeneration in the zebrafish. Nat Protoc. 7 (4), 782-788 (2012).
  18. Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), e18503(2011).
  19. Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2019).
  20. Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. J Vis Exp. (55), e3165(2011).
  21. Duan, X., Liu, X., Zhan, Z. Metabolic regulation of cardiac regeneration. Front Cardiovasc Med. 9, 933060(2022).
  22. Yu, F., Cong, S., Yap, E. P., Hausenloy, D. J., Ramachandra, C. J. Unravelling the interplay between cardiac metabolism and heart regeneration. Int J Mol Sci. 24 (12), 10300(2023).
  23. Cook, M., Lal, S., Hume, R. D. Transcriptional, proteomic and metabolic drivers of cardiac regeneration. Heart. 111 (18), 851-858 (2025).
  24. Chen, X., et al. Metabolic reprogramming: A byproduct or a driver of cardiomyocyte proliferation. Circulation. 149 (20), 1598-1610 (2024).
  25. Bond, S. T., McEwen, K. A., Yoganantharajah, P., Gibert, Y. Live metabolic profile analysis of zebrafish embryos using a seahorse XF 24 extracellular flux analyzer. Methods Mol Biol. 1797, 393-401 (2018).
  26. Gibert, Y., McGee, S. L., Ward, A. C. Metabolic profile analysis of zebrafish embryos. J Vis Exp. (71), e4300(2013).
  27. Trampel, K. A., et al. Seahorse metabolic analysis for human and mouse cardiac organotypic slices. bioRxiv. , (2025).
  28. Ruggiero, G., et al. A balanced circadian glycolytic rhythm drives cardiomyocyte cell cycle progression during fish heart regeneration. bioRxiv. , (2025).
  29. Lee, L., et al. Functional assessment of cardiac responses of adult zebrafish (Danio rerio) to acute and chronic temperature change using high-resolution echocardiography. PLoS One. 11 (1), e0145163(2016).
  30. Shaftoe, J. B., Geddes-McAlister, J., Gillis, T. E. Integrated cellular response of the zebrafish (Danio rerio) heart to temperature change. J Exp Biol. 227 (20), jeb247522(2024).
  31. Ryan, R., Moyse, B. R., Richardson, R. J. Zebrafish cardiac regeneration—looking beyond cardiomyocytes to a complex microenvironment. Histochem Cell Biol. 154 (5), 533-548 (2020).
  32. Angelini, A., Pi, X., Xie, L. Evaluation of long-chain fatty acid respiration in neonatal mouse cardiomyocytes using SeaHorse instrument. STAR Protoc. 3 (2), 101392(2022).
  33. Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Rodríguez Colman, M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protoc. 2 (1), 100386(2021).
  34. Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. J Mol Cell Cardiol. 74 (100), 340-352 (2014).
  35. Cheng, Y. Y., et al. Metabolic changes associated with cardiomyocyte dedifferentiation enable adult mammalian cardiac regeneration. Circulation. 146 (25), 1950-1967 (2022).
  36. Li, X., et al. Inhibition of fatty acid oxidation enables heart regeneration in adult mice. Nature. 622 (7983), 619-626 (2023).
  37. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochim Biophys Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  38. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and analysis of extracellular acid production to determine glycolytic rate. J Vis Exp. (106), e53464(2015).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Zebrafish Kalp RejenerasyonuSeahorse DeneyiOksidatif MetabolizmaGlikolizOksijen T ketim H zEkstrasel ler Asidifikasyon H zKardiyomiyosit Yeniden DiferansiyasyonuKalp Metabolizmas
Tüm yenilenen zebrafish ventriküllerinin metabolik aktivitesinin ex vivo olarak değerlendirilmesi ve ekstraselüler akı testi kullanılarak
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.