Floresan Füzyon Protein Tabanlı Raporlayıcı Kullanılarak Genotoksin Kaynaklı PARP1/PARP2 Aktivasyonunun Hücrelerde Görselleştirmesi ve Nicel Analizi

Summary

Burada, sabit memeli hücrelerinde hücre tabanlı görselleştirme, hücre altı lokalizasyonu ve poli(ADP-riboz) (PAR) zenginleştirilmiş odakların nicel analizini tanımlıyoruz. Bu test, genotoksine maruz kalan hücrelerin çekirdeklerinde, baz eksizyon onarımı veya tek zincirli kırılma onarımı ile ilişkili DNA hasarı kaynaklı PARP aktivasyonunun noktalarının nicelendirilmesini sağlar.

Abstract

Poli(ADP-riboz) (PAR), ADP-riboz polimeraz enzim ailesinin dört üyesi tarafından sentezlenen bir ADP-riboz polimeridir—PARP1, PARP2, PARP5a ve PARP5b. Ancak, sadece PARP1 ve PARP2, DNA kırmalarına yanıt olarak PAR'ı sentezler. PAR, proteinin translasyon sonrası modifikasyonu olarak tanımlanır, ancak aynı zamanda DNA veya RNA modifikasyonu olarak da var olduğu gösterilmiştir. PAR seviyeleri, PARP1 ve PARP2 ile birlikte DNA hasarı kaynaklı PAR'ın hücresel seviyesini modüle eden bir PAR glikohidrolazı olan PURG ile daha da düzenlenir. PAR'ın dinamik sentezi ve bozulması, DNA onarımındaki düzenleyici rolü ve DNA hasar yanıtı için kritik öneme sahiptir; bu da kromatin yeniden organizasyonu, çoğaltma, transkripsiyon ve hücre ölümünü etkiler. PARP1/PARP2 aktivasyonu ve PAR birikimi devam eden baz eksizyon onarımı veya DNA tek zincirli kırma onarımının yerleri olarak kabul edilebilir; ancak birçok PARP1/PARP2 aktivatörü aynı zamanda replikasyon stresi ve diğer DNA metabolik süreçleriyle de ilişkilidir. Oluştuktan sonra, PAR zincirleri DNA onarım ve DNA hasar yanıtı (DDR) faktörlerinin PAR bağlanma alanları (PBD) aracılığıyla DNA hasarı veya genomik hakaret bölgelerine çekilmesini kolaylaştırır. On farklı PBD, PAR bağlama motifi, PAR bağlayan Çinko parmak, WWE alanı ve makroalan gibi diğer PBD'ler dahil olmak üzere PAR molekülünün çeşitli bölgelerini tanır. PAR dinamiklerinin hücresel analizini kolaylaştırmak için, PAR odaklarının hücre tabanlı nicelenmesini optimize etmek için geliştirilmiş yeşil floresan protein (EGFP) ile birleştirilmiş PBD'ler kullandık. PBD/WWE alanını kodlayan bir parça kullanan, EGFP ile bağlantılı RNF146 parçasını kullanarak genomik hakaret ve devam eden BER veya SSBR bölgelerinde PAR birikimini görselleştirip niceleyen bir testi tanımlıyoruz. Lentiviral parçacıklarının üretimi, hedef hücre hattının transdüksiyonu, memeli hücrelerinin genomik DNA hasarını indüklemek için tedavisi, konfokal floresan mikrograflarının edinilmesi ve verilerin yarı otomatik nicelendirilmesi gibi deneysel adımları tanımlıyoruz.

Introduction

Bu protokol, memeli hücrelerinde esas olarak baz eksizyon onarımı (BER) veya tek iplikli kırma onarımı (SSBR) ile ilişkili genomik hasar bölgelerinde poly(ADP-riboz) (PAR) görselleştirilmesi ve nicel analizini sağlayan LivePAR^{testini tanımlar. 1,2,3}. BER, DNA'dan hasar görmüş veya değiştirilmiş bazları çıkaran kritik bir DNA onarım yoludur (BER ve PARilasyon üzerine incelemeler için^bkz. 4,5,6,7). BER, modifiye^{bazlar 4'ü} tanıyan ve çıkaran DNA glikozilazlarıyla başlar; bu da apurinik/apirimidinik (AP) bir bölge bırakır; örneğin, metilen pürin glikozilaz (MPG), metilen ^8,9 bazlarını çıkarır veya 8-oksoguanin glikozilaz (OGG1), 8-oksoguanin glikozilaza (OGG1), 8-oksoguanin glikozilaza (8-oksoG ^9,10) çıkarır. AP bölgeleri daha sonra AP endonükleaz 1 (APE1)^11,12,13 tarafından bölünür ve DNA omurgasında bir kesik oluşur. Bir polimeraz olan DNA polimeraz β (Polβ^)14,15, hasar görmedik ipliği şablon olarak kullanarak boşluğu şekillendirir ve doldurur; son olarak, DNA ligazları onarılmış^zincir 16,17'yi mühürler; örneğin DNA ligazı I veya DNA ligazası III.

BER ve SSBR'deki önemli oyuncular, BER veya SSBR sırasında DNA ipliği kopmalarını hızla tespit eden poli(ADP-riboz) polimerazlar 1 ve 2 (PARP1/PARP2)18,19,20 enzimleridir. Bu kırılmaları tespit ettikten sonra, PARP1/PARP2, ADP-riboz polimerlerinin kendisine ve diğer proteinlere eklenmesini katalize eder—bu süreç PARilasyon olarak adlandırılır (inceleme için^{bkz. 6})—^NAD+'yı hidrolize eder. Bu, hasar bölgesine diğer DNA onarım faktörlerini dahil eden ve DNA onarımının isayetini artıran dinamik bir protein iskelesi (PAR) oluşturur. Bu dinamik PAR iskelesini yönetmek için, ADP-riboz-alıcı hidrolaz 3 (ARH3), terminal ADP-riboz glikozil hidrolaza 1 (TARG1), mono-ADP-ribozil hidrolaza 1/2 (MacroD1/2) ve poli(ADP-riboz) glikohidrolaza (PARG) dahil olmak üzere birkaç protein PAR zincirlerinin hidrolizi ve çıkarılmasına katkıda bulunur; bunlar arasında ADP-riboz-alıcı hidrolaz 3 (ARH3), terminal ADP-riboz glikozilaz 1 (TARG1), mono-ADP-ribozil hidrolaza 1/2 (MacroD1/2) ve poli(ADP-riboz) glikohidrolaza (PARG)6,21,22,23,24,25,26 bulunur . Ancak, bu süreçten esas olarak PARG^{sorumludur 21,27} ve DNA hasar yanıtında (DDR)^28,29 kritik bir rol oynar.

Bu nedenle PARG, PARP1 ve PARP2'nin işleviyle kritik bir şekilde bağlantılıdır. PARP1 ve PARP2 PAR polimerlerini oluştururken, PARG bir "temizleyici" enzim olarak bu polimerleri hidrolize eder ve PARilasyonu 30,31'i etkili bir şekilde tersine çevirir. Bu süreç, hem BER hem de SSBR'nin tamamlanması ve PARP1/PARP2'nin yeni DNA hasarına yanıt vermek için geri dönüştürülmesine olanak sağlamak için gereklidir. Sonuç olarak, PARP1, PARP2, PARilasyon ve PARG koordineli şekilde çalışır ve BER ile SSBR ^4,6 üzerinden verimli ve geri döndürülebilir DNA onarımını sağlar.

PARilasyonun kapsamı çeşitli faktörler tarafından etkilenebilir ve genel DNA hasar^{yanıtında önemli rol oynar 32}. Bu faktörler arasında, DNA bazlarına adduktlar ekleyen genotoksinlere maruz kalma da bulunur; örneğin N-metil-N'-nitro-N-nitrozoguanidin (MNNG), metil metansülfonat (MMS), hidrojen peroksit (H₂O₂) veya tert-bütil hidroperoksit (tBuOOH). Ayrıca, PARilasyonun kapsamı, NAD+ seviyelerini artırarak PARP-aktivasyonunu artıran NAD⁺'nın öncüsü olan dihidronikotinamid ribozid (NRH) veya NAD⁺ seviyelerini düşüren ve PARP-aktivasyonunu olumsuz düzenleyebilen NAMPT inhibitörü FK866 gibi moleküller tarafından etkilenebilir. Son olarak, PARP1/PARP2, PARG gibi enzimlerin genetik mutasyonları veya küçük moleküllü inhibisyonu, örneğin BER'deki kusurlar veya BRCA1/BRCA2 gibi homolog rekombinasyon faktörleri, PARP aktivasyonunu 33,34,35,36 değiştirebilir.

LivePAR testi, yüzük parmağı proteini 146'nın (RNF146) bir parçasını kullanır; bu parça, geliştirilmiş yeşil floresan proteini (EGFP)3 ile bağlantılı bir WWE domainini (amino asitler 100–182) ^kodlar. WWE domaini, bağlanma bölgesi^37'deki korunan kalıntılar triptofan (W) ve glutamat (E) adıyla adlandırılan küresel bir domaindir. WWE alanları, PAR zincirlerindeki en küçük iç yapısal birim olan iso-ADP-riboza^{bağlanır 38,39}. RNF146, iso-ADP-riboz 38,40'ı tanıyan ve BER'de yer alan proteinleri (XRCC1, DNA ligazı III ve PARP1) proteazomal^{bozunma 41} için hedef aldığı bildirilen bir E3 ubiquitin ligazıdır. Bu WWE alanını EGFP ile bağlamak, memeli hücrelerinde genotoksin kaynaklı PARilasyon bölgelerinin görselleştirilmesini ve tespit edilmesini sağlar. Bu protokolde, LivePAR raporlayıcısını ifade eden kararlı hücre hatlarının oluşumunu (Şekil 1A), PARP1/PARP2'yi aktive etmek için DNA hasarının indüksiyonunu, PAR'ın üretimini ve konfokal floresan mikroskopi verilerinin toplanıp analiz edilmesini (Şekil 1) tanımlıyoruz.

pMD2.g(VSVG) plazmidi, virüsün enfekte edebileceği hücre yelpazesini doğal lentivirüs zarf proteinine kıyasla genişleten viral zarf glikoproteinini (VSVG) sağlar. pRSV-REV plazmidi, viral RNA'ya bağlanan ve viral genlerin transkripsiyonunu aktive eden kritik bir transaktivatör olan düzenleyici element (REV) proteinini sağlar; Verimli viral çoğaltma için gereklidir. pMDLg/pRRE plazmidi, matris (MA), kapsid (CA) ve nukleokapsid (NC) proteinlerini kodlayan gag, viral çoğaltma ve konak hücre genomuna entegrasyonu için gerekli enzimleri kodlayan pol ve viral RNA çevirisinin ve genomik RNA paketlemenin verimliliğini artıran RNA düzenleyici eleman (RRE) olmak üzere birkaç önemli iç paketleme bileşeni sağlar. pLV-EF1A-LivePAR-Hygro plazmidi (Şekil 1A), RNF146'nın WWE alanının C-terminaline (amino asitler 100–182) kaynamış geliştirilmiş yeşil floresan proteini (EGFP) için cDNA kodlar; bu protein alanı poli(ADP-riboz) zincirlerine bağlanır ve vektör ayrıca bir higromisin direnç kaseti kodlar. Virüs, hücre kültüründen izole edilir ve -80 °C'de depolanabilir veya hemen transdüksiyon için kullanılabilir (Şekil 1B).

Protocol

1. Lentivirüs üretimi

NOT: Bu protokol, genetik olarak kodlanmış bir PAR raporlayıcısını ifade eden hücreler oluşturmak için üçüncü nesil lentiviral^{paketleme sistemi 42,43} kullanır. Lentiviral parçacıklar, zarf, düzenleyici ve paketleme bileşenlerinden oluşan dört plazmidli sistem ile birlikte 293FT hücrelerinde, poly(ADP-riboz) zincirlerini bağlayan RNF146'nın EGFP etiketli WWE alanını kodlayan pLV-EF1A-LivePAR-Hygro yapısı ile üretilir. Ortaya çıkan virüs, PAR birikiminin görselleştirilmesi ve nicelendirilmesi için kararlı hücre hatları oluşturmak için kullanılır.

1. Nemli atmosferde 37 °C ve %5_CO2 içeren %10 FBS ve %1 Pen/Strep içeren DMEM'deki düşük 293FT hücreleri kültürleyin. 293FT hücrelerinin 3 haftadan fazla kültüre alınmadığından emin olun.
   NOT: Düzenli olarak 3 ile 10 arasında geçiş sayısında 293FT hücreleri kullanıyoruz. 293FT hücreleri, SV40 büyük T antijeni tarafından dönüştürülüp ölümsüzleştirildi. Bu hücrelerin yüksek transfeksiyon etkinliği vardır ve bu, rekombinant protein üretimi ve gen ifade çalışmaları için gereklidir. Hem lipid tabanlı transfeksiyon hem de viral transdüksiyon yöntemlerine iyi yanıt veriyorlar.
2. 1.7 plaka, 1. ×günde 10⁵ 293FT hücresini, 1. günde 5,5 mL kültür ortamında 60 mm doku kültürü kabına yerleştirin. Hücreleri 24 saat boyunca kuluçka kutusuna geri gönderin.
3. 2. günde (transfeksiyon günü), 1.5 mL steril mikrosantrifüjasyon tüpüne 375 μL FBS ve Pen/Streptokok içermeyen DMEM ortamı ekleyin. Sonra, 10 μL lipid bazlı transfeksiyon reaktifi, 4 μg pLV-EF1A-LivePAR-Hygro plazmidi, 2 μg pMD2.g(VSVG) plazmidi, 2 μg pRSV-REV plazmidi ve 2 μg pMDLg/pRRE plazmidi eklenin. Mikrosantrifüj tüpünü nazikçe dokunarak ortam, transfeksiyon reaktifi ve plazmid DNA'sını karıştırın (vorteksden kaçının). DNA/transfeksiyon reaktif kompleksi oluşumunu sağlamak için oda sıcaklığında 15–30 dakika kuluçka yapın.
4. Plazmid/transfeksiyon reaktif karışımını, 293FT hücreleri içeren 60 mm kabına damla olarak ekleyin. Hücreleri 48 saat boyunca kuluçka makinesine geri gönderin.
   NOT: Bu dönem, lentiviral parçacıklarının büyüme ortamına üretimi ve salınmasına olanak tanır.
5. 4. günde, transfekte edilen 293FT hücrelerden kültür ortamı toplanarak lentivirüs parçacıklarını izole edin. Steril bir 0,45 μm filtreden geçirerek hücre kalıntılarını lentiviral parçacıklardan ayırın.
6. Lentivirüs titresini mevcut reaktiflerle (isteğe bağlı) belirleyin.
   NOT: Bu yöntem genellikle 10⁵ ila^{10 6} bulaşıcı birim (IFU/mL) elde eder; bu da aşağıdaki transdüksiyon adımında belirtildiği gibi yaklaşık olarak ~5 enfeksiyon çarpanlığı (MOI) ile ilişkilidir.
7. Lentivirüs parçacıklarını içeren ortamı dört steril kriyoviale (tüp başına 1.0 mL) alıp -80 °C'de depolayın.

2. Transdüksiyon

NOT: Bu bölüm, hücre hatlarına transgen sokmak için kullanılan lentiviral transdüksiyon protokolünü özetlemektedir (Şekil 1B). ^{Laboratuvarımızda} 1,3,33,37,44,45 sayısında sürekli etkili olmuştur.

1. Uygun ortamda, nemlendirilmiş ortamda, 37 °C ve %5_CO2 ile tercih edilen bir hücre hattı (düşük geçiş sayısı) kültürlendirin.
   NOT: Gerekli hücre türünün erken bir geçişiyle başlayın. Yeni bir hücre şişesi, transdüksiyon için tohumlanmadan önce en az bir kez çözülmeli ve geçirilmelidir.
2. 1. günde, tohum 1 10^{adet 5}–1.5 × 10,5 hücre ×, 2 mL büyüme ortamında 6 kuyu plakasının her kuyusuna yerleştirilir. Hücreleri 24 saat kuluçka makinesine geri getirin.
3. 2. gün (transdüksiyon günü) hücrelerin %20 ile %40 arasında birleştiğinden emin olun. 15 mL konik bir tüpe 1 mL virüs, 1 mL büyüme ortamı ve 2 μL polibren (2 mg/mL stok) ekleyin ve inversiyon yoluyla nazikçe karıştırın (vorteksleri önleyin).
   NOT: Polibren, lentivirüs transdüksiyonu sırasında virüs parçacıkları ile hücre zarı arasındaki elektrostatik itmeyi önlemek için kullanılır. Polibren pozitif yüklü olduğundan, negatif yüklü viral glikoproteinlerle etkileşime girerek yüklerini nötralize eder. Ayrıca, polibren hücre kültür ortamında glikozaminoglikanlara bağlanır ve bu da onların virüsle etkileşimini engeller. Bu nedenle polibren transdüksiyon verimliliğini büyük ölçüde artırır.
4. 6 kuyu tabakasından büyüme ortamını çıkarın ve her kuyuyuya virüs/ortam/polibren karışımını ekleyin. Transdüksiyon karışımıyla hücreleri, 32 ^°C ve %5_CO2 sıcaklığında nemlendirilmiş bir kuluçka makinesine 16–18 saat boyunca yerleştirin.
   NOT: Lentiviral transdüksiyon sırasında hücreleri gece boyunca 32 °C'de kuluçka altına almak, yaygın ama zorunlu olmayan bir uygulamadır ve viral enfeksiyon etkinliğini önemli ölçüde artırır. Sıcaklığın düşürülmesi hücresel metabolizmayı yavaşlatır, böylece hücresel savunmalar azalır ve viral enfeksiyona karşı duyarlılığı artırır.
5. 3. günde, virüs ile dönüştürülmüş hücrelerin ortamını taze ortamla değiştirin ve bunları 37 °C inkübatöre taşıyın. 48 saat kuluçka yapın.
   NOT: Bu 2 gün, hücrelerin RNF146(100–182)-EGFP transgenini üretmesi ve higromisine dirençli hale gelmesi için yeterlidir.
6. RNF146(100–182)-EGFP transgenini ifade eden ortaya çıkan poliklonal stabil hücre hatlarını geliştirmek için, 2.5. adımda belirtildiği gibi 2 günlük kuluçkadan sonra higromisin seçimine başlanır.
   1. Alternatif olarak, higromisin yokluğunda bu transdüksiyon hücre popülasyonunu genişletmek ve önümüzdeki 10–14 gün boyunca PAR analizi için kullanmak (geçici transdüksiyon) daha önce^{belirtildiği gibi.}
7. Hücreler higromisin varken büyüdükten sonra 100 mm bir plakaya aktarın ve gerektiği kadar genişleyin.
8. Transdüze edilen hücrelerin kriyo stoklarını gelecekte kullanmak üzere hazırlayın.
9. RNF146(100–182)-EGFP transgeninin ifadesini konfokal mikroskopiyle doğrulayın, bölüm 3'te belirtildiği gibi. RNF146(100–182)-EGFP transgeni hücre genelinde eksprese edilir.
10. RNF146(100–182)-EGFP transgeninin ifadesini, başka bir yerde tanımlandığı gibi immünoblotlama ile^{doğrulayın 1,37}.

3. Konfokal mikroskopi ve analiz

NOT: Protokolün bu bölümü, örtü kağıtlarının hazırlanmasını, LivePAR eksprese eden hücrelerin tohumlanmasını detaylandırır, tedavilere (tBuOOH, MNNG, PARGi, PARPi ve/veya NRH) maruz kalır ve sabit hücrelerin konfokal görüntüleme ve PAR odak analizi için mikroskop slaytlarında hazırlanması (Şekil 1C). Ayrıca PAR odaklarının yarı otomatik nicel olarak tanımlanması için ImageJ yazılımının ve özel bir makronun kullanımını da açıklar. Bu protokol, çeşitli faktörlerin (örneğin küçük moleküller, BER protein nakavtları) DNA hasarına bağlı PARilasyon üzerindeki etkisini incelemek için kullanılabilir ve^{laboratuvarımızda başarıyla kullanılmıştır 34,37}.

1. Coverslip hazırlığı
   1. 20 × 20 mm örtükleri cam bir kapta 20 dakika boyunca dietil eterde duman başlıkta islatın.
      NOT: Dietil eter ile çalışırken yanıcılığı ve potansiyel tehlikeleri nedeniyle bir duman davlumbağı kullanın.
   2. Dietil eteri çıkarın ve kapak kapaklarını azalan etanol konsantrasyonlarında yıkayın [%100, %70, %50, sonra %0 (_{ddH 2}O)].
   3. Suyu çıkarın ve örtükleri 1 N HCL ile hafifçe çalkalayarak 20 dakika bekletin.
   4. HCL'yi çıkarın ve kapak kapaklarını ddH_{2 0}ile 3 kez yıkayın.
   5. Kaplamaları %70 etanolde 4 °C'de kullanana kadar saklayın.
2. Hücrelerin kaplaması
   1. İki adet 20 × 20 mm steril örtü kapaklarını yan yana 60 mm'lik bir hücre kültürü kabına yerleştirin. Deney için gereken kadar çok yemek hazırlayın. Örtülü kapaklara hücreler eklemeden önce tüm etanolün buharlaştığından emin olun. Kalan etanolü steril PBS ekleyerek 10–15 dakika boyunca yıkayın; Hücreleri tohumlamadan önce PBS'yi çıkarın.
   2. Hücre kültürü kabı başına 200.000 LivePAR eksprese hücresi tohum. Hücrelerin 24–36 saat içinde örtü kapaklarına yapışmasına izin verin, ortamı kondisyonlandırın ve çoğaltmaya (büyümeye) başlayın.
3. PAR odaklarının indüksiyonu
   1. LivePAR eksprese eden hücreleri 100 μM NRH, 10 μM PARGi ve 10 μM MNNG veya 40 μM tBuOOH'a maruz bırakın. Ayrıca, PARP1/PARP2'ye bağlı PAR oluşumunu test etmek için 10 μM PARPi ekleyerek PARP1/PARP2 inhibe edilir. Hücreleri içeren ortama doğrudan örtü kapları ekleyin ve bileşenleri dağıtmak için hücre kültür kablarında medyayı nazikçe karıştırın. 60 mm çanakları 37 °C'de 60–90 dakika boyunca kuluçka edin.
      NOT: NRH, optimal PARP1/PARP2 aracılı PARilasyon 33,46,47 için yeterli hücresel NAD⁺ seviyelerinin mevcut olmasını sağlamak için kullanılır. PARGi, PARP1/PARP2 tarafından sentezlenen PAR zincirlerinin PURG tarafından parçalanmasını önlemek için kullanılır. MNNG veya tBuOOH, BER'i başlatmak için DNA baz modifikasyonlarını başlatmak için kullanılır; bu da PARP1/PARP2'nin aktivasyonuna yol açar. PARPi, sinyalin (odakların) PARP1/PARP2 aktivasyonundan kaynaklandığını doğrulamak için kullanılır.
4. Hücrelerin sabitlenmesi ve kapak kıymalarının montajı
   1. Ortamı çıkarın ve PBS ile yıkayın.
      NOT: Hücrelerin kültürlenmesinde kullanılan ortamda yüksek konsantrasyonda serum proteinleri bulunduğundan, bir veya iki kez PBS ile yıkamak önemlidir. PBS ile yıkamak, medyada kalan MNNG veya tBuOOH'u da çıkarır.
   2. PBS'de %4 formaldehit ile oda sıcaklığında 15 dakika preek. Hücreleri PBS ile 3 kez yıkayın.
   3. Hücrelere 3 ml soğuk (-20 ^°C) metanol (aseton) ekleyerek düzeltmeyi sağlar. Tabakları -20 ^°C'ye 9 dakika boyunca koyun.
   4. Metanolü (aseton) çıkarın. PBS ile 3 kez yıkayın.
   5. Cam slaytlara DAPI içeren 15 μL anti-fade ortamı pipet koyun. Kaplama kapaklarını montaj ortamının yerine hücreler içe bakacak şekilde nazikçe monte edin, böylece kabarcıkları en aza indirin.
   6. Kaplama yüzeyinin yanlarını cam sürgüye doğru ortalayın, sabitleyin ve az miktarda şeffaf üst kat tırnak minesi uygulayarak örtü sürgüsünün yanlarına yerleştirin. Slaytları karanlığa koyun, üst kat tırnak minesinin kuruması için (~10 dakika). Slaytları karanlıkta 4 °C'de saklamak, görüntü almak için hazır olana kadar.
5. Görüntüleme hücreleri
   1. Tüm slaytlar en az 10 kat, 63× büyütme ile konfokal mikroskop kullanılarak görüntülenir. 488 nm lazer ile PAR odaklarını tespit edin ve 405 nm lazer ile nükleer boyama (DAPI) tespit edin (örneğin, Şekil 2'ye bakınız).
6. Konfokal görüntülerin analizi
   1. Aşağıdaki metni içeren bir metin dosyası oluşturun ve ona "LivePAR_Macro" adını verin. Bu makro, LivePAR eksprese eden hücrelerin çekirdeklerinde PAR odaklarının "otomatik" nicelendirilmesini kolaylaştırır:
      macro "DAPI pozitif boyama [1]" {
      tit=getTitle();
      run("Çoğalt...", "başlık=DAPI kopyası");
      selectWindow("DAPI")
      run("8-bit");
      run("Split Channels")
      selectWindow("C2-"+"DAPI");
      close();
      selectWindow("C1-"+"DAPI");
      run("Gauss bulanıklığı...", "Sigma=3");
      setAutoThreshold("Varsayılan");
      run("İkili Oluştur");
      run("Invert"
      run("Delikleri Doldur")
      run("Havza")
      run("Parçacıkları Analiz Et...", "size=50.00-Infinity dairesellik=0.00-1.00 göster=Taslaklar eklenen hariç in_situ");
      yeniden adlandır("DAPI_"+tit);
      selectWindow("DAPI_"+tit);
      close();
      }
      macro "PAR [2]" {
      setBatchMode(true);
      run("8-bit");
      t=getTitle();
      run("Kopyala...", "başlık=GB1 kopyala");
      run("Kopyala...", "başlık=GB20 kopyala");
      selectWindow("GB20")
      run("Gauss bulanıklığı...", "yarıçap=20 yığın");
      selectWindow("GB1");
      run("Gauss bulanıklığı...", "radius=1 yığın");
      imageCalculator("Çıkar oluştur yığını", "GB1", "GB20");
      selectWindow("GB1");
      close();
      selectWindow("GB20");
      close();
      selectWindow("GB1'in Sonucu");
      yeniden adlandır("Blank_GB1-GB20_"+t);
      title = getTitle();
      run("Split Channels")
      selectWindow("C1-"+title);
      close();
      selectWindow("C2-"+title);
      setThreshold(90,255) //90 değeri deneysel değişkenliği hesaba katacak şekilde değiştirilebilir
      run("Parçacıkları Analiz Et...", "size=0.00-200 dairesellik=0.00-1.00 göster=Maskeler özetle");
      close ("C2-"+başlık);
      selectWindow("C2-"+başlık maskesi);
      close ();
      setBatchMode(yanlış);
      }
   2. ImageJ'yi bilgisayara indirip kur (https://imagej.net/ij/download.html).
   3. ImageJ'yi açın ve makroyu (metin dosyası: LivePAR_Macro) Eklentiler | Makrolar | Kurulum.
   4. Tüm konfokal dosyaları ImageJ'de açın ve orijinal dosyaları korumak için *.tif dosyası olarak kaydedin.
   5. Bir tablo belgesini açın ve [date]_[Cell Line]_Foci Analizi olarak kaydedin.
   6. Bir dosyayı tek tek *.tif analiz edin. Çekirdekleri bulmak için 1'e basın; ROI Manager başlıklı bir pencere açıldığında, penceredeki tüm girişleri seçin ve çekirdek alanını orijinal görüntünün üzerine koymak için ekle tuşuna basın. Yanlış tanımlanmış çekirdekleri silin. Çekirdeği serbest el seçim aracıyla çizin ve PAR odaklarını nicelikle ölçmek için 2 tuşuna basın.
      NOT: Çerçeve içinde tamamen olmayan çekirdekleri dahil etmeyin.
   7. ROI yöneticisindeki her çekirdeği tek tek seçin ve 2'ye basın. Seçilen çekirdek içindeki odak sayısını gösteren bir sayım belirir. Dosyanın tüm çekirdeklerindeki odaklar puanlandıktan sonra, bilgileri açık tablo belgesine kopyalayıp yapıştırın.
   8. Tüm *.tif dosyalarıyla 3.6.6 ve 3.6.7 adımlarını tekrarlayın.
   9. Tercih edilen yazılımda çekirdek başına PAR odaklarını çizin (örneğin, Şekil 3'e bakınız).

Results

LivePAR probunu ifade eden hücreler, RNF146(100-182)-EGFP füzyon proteinini kodlayan bir lentivirüs üretilerek üretilebilir (Şekil 1A). Hücreler, transdüksiyondan sonraki iki haftaya kadar geçici ekspresyondan sonra veya higromisin seçimi sonrası stabil hücre hatları olarak değerlendirilebilir (Şekil 1B⁾¹. Genotoksin tedavisinin ardından, DNA hasarı kaynaklı PAR odakları çekirdek içinde görselleştirilebil...

Discussion

LivePAR testi, PARP1/PARP2'nin aktif olarak PAR zincirlerini sentezlediği nükleer genomik DNA hasar alanlarını tespit etmek için geliştirilmiştir. Bunu başarmak için, WWE domenini (amino asitler 100–182) kodlayan RNF146 parçası EGFP 1,2,3,37 ile birleştirildi. Tarif ettiğimiz ek PAR probları, DTX4'ün 1-166 amino asit kalıntılarına birleşmiş EGFP, PARP11'in 22-1...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifler, Kimyasallar ve Peptitler
0.45 & mikro; m Durapore steriflip filters	Sigma-Aldrich	Cat# SE1M003M00
20 x 20 mm Mikroskop kapak kapakları	Thermo Fisher Scientific	Cat# 22-170-371
Aseton	Thermo Fisher Scientific	Cat# A18-1
Hücre kültürü çanakları, 100 mm	VWR	Cat# 25382-166
Hücre kültürü çanakları, 60 mm	Fisher Scientific	Cat# 430166
Hücre kültür plakaları, 6-kuyu	VWR	Cat# 62406-161
Kryovialler, 2 mL	VWR	Cat# 89499-722
Dietil eter	Thermo Fisher Scientific	Cat# 60-29-7
Dimetil sülfoksit	Thermo Fisher Scientific	Cat# BP231-1
Tek kullanımlık steril filtreler, 0.45 & mikro; m	Sigma-Aldrich	Cat# SE1M003M00
DMEM	Corning	Cat# 15-017-CV
Etanol, 200 kanıt	Decon Labs	Cat# 2701
Cam mikroskop slaytları	Thermo Fisher Scientific	Cat# 12-544-4
Isıya inaktive edilmiş fetal sığır serumu	Atlanta Biologics	Cat# S11150
Hidroklorik asit	Thermo Fisher Scientific	Cat# A144-212
Higromisin	Thermo Fisher Scientific	Cat# 10687010
Büyük Kim Mendilleri	Kimberly-Clark	Cat# 34256
Lenti-X GoStix Plus Kiti	Takara	Cat# 631280
Metanol	Thermo Fisher Scientific	Cat# A452SK-4
MNNG	Molport	Cat# N493990
NRH (1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-Dihidroksi-5-(hidroksimetil) tetrahidrofuran-2-il]-4H-piridin-3-karboksamid)	Marie Migaud ve  NuChem Sciences Inc
PARG inhibitörü (PDD00017273)	Sigma-Aldrich	Cat# SML1781
PARPi inhibitörü (Veliparib, ABT-888)	MedChemExpress	Cat# HY-10129
Penisillin/streptomisin	Gibco	Cat# 15140-122
Polybrene	Sigma-Aldrich	Cat# TR-1003-G
tBuOOH	Thermo Fisher Scientific	Cat# 180345000
TransIT-x2 (Transfeksiyon reaktifi)	Mirus	Cat# MIR-6006
Triton-X100	VWR	Cat# 0694
Tripsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	Cat# 25200-056
Vectashield (H-1000) anti-fade montaj ortamı	Thermo Fisher Scientific	Cat# NC1695563
hücre hatları
293-FT	Thermo Fisher Scientific	Cat# R70007
(SV40 büyük T antijeniyle transforme edilmiş insan embriyonal böbrek hücrelerinden türetilmiştir)	Thermo Fisher Scientific	Cat# R70007
LN428	Cömert bir hediye	Yok
(İnsan glioblastoma tümör hücre hattı)	Dr. Ian Pollack (Pittsburgh Üniversitesi)	Yok
RPE-1	ATCC	Cat# CRL-4000
(insan hTERT tarafından ölümsüzleştirilmiş retinal pigment epitel hücreleri)	ATCC	Cat# CRL-4000
U2OS	ATCC	Cat# HTB-96
(İnsan osteosarkom hücre hattı)	ATCC	Cat# HTB-96
Rekombinant DNA
pMDLg/pRRE	Laboratuvar stok# 253	Addgene, Cat# 12251
pRSV-Rev	Laboratuvar stok#254	Addgene, Cat# 12253
pMD2.G	Laboratuvar stok#252	Addgene, Cat# 12259
pLV-EF1A-LivePAR-Hygro (LivePAR, RNF146'nın WWE alanıdır, amino asit kalıntıları 100-182, EGFP ile birleşmiştir; Hygromycin direnç kaseti içerir)	Laboratuvar stok# 1727	Addgene, Cat# 176063
Yazılım ve Algoritmalar
Adobe Illustrator (figürlerin hazırlanması için)	Adobe Systems	Sürüm 2024
GraphPad Prizması	GraphPad	Sürüm 10.5.0  (Mac OS X)
ImageJ	NIH	https://imagej.net/ij/download.html