Method Article

İlaç tedavisinden sonra hepatosellüler karsinom organoidlerinin oluşumu ve tek hücreli transkriptomik analizi

DOI:

10.3791/70511

⸱

May 26th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Basic Medical Science, Guangzhou Medical University, 2Guangzhou Municipal and Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Modification and Degradation, Guangzhou Medical University, 3Affiliated Cancer Hospital and Institute, Guangzhou Medical University, 4The First Clinical School of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University, 5Department of Obstetrics, Guangzhou Eighth People's Hospital, Guangzhou Medical University, 6Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, Guangzhou Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, hepatosellüler karsinom organoidlerinin üretilmesi, ilaç tedavisi uygulanması ve tedavi öncesi ve sonrası tek hücreli RNA dizilenmesi için uygulanan sade bir yöntemi ortaya koyarak tedaviyle ilişkili transkripsiyonel değişiklikleri karakterize eder.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatosellüler karsinom, dünya genelinde kanserle ilişkili ölümlerin başlıca nedenlerinden biridir ve belirgin intratümör heterojenliğiyle karakterize edilir; bu da değişken tedavi yanıtlarına, tümör tekrarına ve hastalık ilerlemesine katkıda bulunur. Bu nedenle, ilaç tedavisinden önce ve sonra tümör hücrelerinin transkripsiyonel düzeyde nasıl değiştiğine dair daha derin bir anlayış, terapötik stratejilerin iyileştirilmesi için gereklidir. Ancak, organoid tabanlı ilaç tedavisini aşağı yönlü tek hücreli transkriptomik profilleme ile bağlayan pratik deneysel iş akışları sınırlı kalmaktadır. Bu çalışmada, hepatosellüler karsinom organoidlerinin üretilmesi, tanımlanmış ilaç tedavisi uygulanması ve tedavi öncesi ve sonrası toplanan örneklerde tek hücreli RNA dizileme yapılması için standartlaştırılmış bir iş akışı geliştirilmiştir. Protokol, organoid canlandırma ve genişletme, tedavi öncesi kalite değerlendirmesi, ilaç maruziyeti, tek hücre ayrışması için organoid hazırlığı, kütüphane yapımı ve tek hücreli transkriptomik verilerin temel karşılaştırmalı analizini içerir. Tekrarlanabilirliği ve örnek kalitesini artırmak için kritik teknik önlemler sağlanır. Bu iş akışı, hepatosellüler karsinom organoidlerinde ilaç tedavisiyle ilişkili hücresel bileşim ve transkripsiyon değişikliklerinin yan yana karakterizasyonunu sağlar. Protokol, farklı organoid sistemler arasında sağlam, ölçeklenebilir ve uyarlanabilir olup, tek hücre çözünürlükte tedaviyle ilişkili gen ifade değişikliklerini araştırmak için pratik bir platform sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepatosellüler karsinom (HCC), yetişkinlerde en yaygın birincil karaciğer kanseridir ve dünya genelinde kanserle ilişkili ölümlerin başlıcanedenidir 1,2,3. Kötü klinik sonuçları, tedavi direnci ve tekrara yol açan önemli intratümör heterojenliktenkaynaklanmaktadır 4. Yakın tarihli bir çalışma, FOXM1/CEBPB ekseni gibi temel transkripsiyonel programların yönlendirdiği gelişimsel çeşitlilik ve hücre-durum plastisitesinin HCC5'te terapötik direnci artırdığını göstermektedir. Bu bulgular, tümör hücre....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan dokuları kullanılarak yapılan çalışmalar, Guangzhou Tıp Üniversitesi Etik Araştırma Komiteleri tarafından incelenip onaylandı (onay no. GYZL-2024-KY31). İnsan örnekleriyle ilgili tüm prosedürler, insan araştırmaları için kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm hastalardan tıbbi araştırmalar için klinik örneklerinin kullanımı için yazılı bilgilendirilmiş onay alındı. Kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

Bu iş akışı, kriyokonserif hepatosellüler karsinom organoidlerinin geri kazanılması ve genişletilmesini içerir; ayrıca aşağı akış ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1, hepatosellüler karsinomi (HCC) organoidlerinin oluşumu ve karakterizasyonunu özetlemektedir. Şekil 1A'da, hastadan türetilen tümör dokuları, histolojik analiz ve tedavi çalışmaları için organoid kültürler oluşturmak amacıyla kullanılmıştır. Şekil 1B , iyileşme sonrası 1. ve 6. günlerde organoidlerin parlak alan görüntülerini göstermekte, standart üç boyutlu kültür koşullarında hayatta kalma.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tekrarlanabilirlik, verimlilik ve yüksek kaliteli tek hücreli transkriptomik analiz sağlamak için, bu iş akışında birkaç teknik adım dikkatli kontrol gerektirir. Hastadan kaynaklanan HCC organoidlerin canlandırılması ve genleşmesi sırasında tutarlılık önemlidir; çünkü tohumlama yoğunluğu, bazaz membran matris bileşimi ve kültür zamanlamasındaki değişiklikler organoid morfolojisini, büyümesini ve sonraki tedavi yanıtlarını etkileyebilir13,14

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklamak zorunda kalacak bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82303022; 82122048; 82372714; 82203380), Guangdong Temel ve Uygulamalı Temel Araştırma Vakfı (2023A1515011416) ve Guangzhou Temel ve Uygulamalı Temel Araştırma Vakfı (2024A04J6575) tarafından desteklenmiştir. Bazı şematik unsurlar Home for Researchers (https://www.home-for-researchers.com) kullanılarak oluşturulmuş ve yazarlar tarafından uyarlanmıştır. Şematik illüstrasyonlar Figdraw (https://www.figdraw.com) kullanılarak oluşturulmuş ve yazarlar tarafından uyarlanmıştır.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
[Leu15]-gastrin I insanMerckG9145
1.5 mL MikrotüplerMerckAXYMCT150LC
1X RBC Lizis TamponuThermo Fisher Scientific00-4333-57
2.0ml İç İplikli Kriyojenik ŞişelerYuva607001
A8301 (TGFb inhibitörü)Tocris Bioscience2939
AFP Poliklonal antikorProteintech14550-1-AP
Anti-Albümin antikor [ALB/2144]abcamab236492
Anti-HNF-4-alfa antikor [EPR16885] - ChIP SınıfıabcamAB181604
Anti-Prealbumin antikor [EPR3219]abcamab92469
Anti-SOX9 antikor [EPR14335-78]abcamAB185966
B27 Takviyesi (503), A vitamini hariçThermo Fisher Scientific12587010
Hücre Kurtarma Çözeltisi, 100 mLCorning354253Bazaz zar matrisini çözmek ve organoidleri yeniden kaplamadan veya sonraki işlemeden önce geri kazanmak için kullanılan reaktif
CellTiter-Glo®   3D Hücre Yaşam TestiPromegaG9681
CHIR99021MerckSML1046
Chromium Next GEM Tek Hücreli 3' GEM, Kütüphane & Gel Bead Kit v3.110x GenomikCG000227
Corning Hücre Süzgüsü, 40 ve mu; m, Mavi, S, IND, 1/50Corning431750
Costar 24 kuyuyla şeffaf düz tabanlı ultra düşük bağlantı çoklu kuyu plakaları, ayrı ayrı sarılmış, sterilCorning3473
Cultrex Azaltılmış Büyüme Faktörü BME, Tip 2 PathClear (BME)Merck3533-005-02Üç boyutlu organoid kültürü ve kubbe oluşumunu desteklemek için kullanılan ekstrasellüler matriks
DMSOMerckC6164İlaç stok çözeltileri ve araç kontrolü için kullanılan çözücü
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium/Ham F-12'siThermo Fisher Scientific12634028İleri DMEM/F-12
E7080 (Lenvatinib)SelleckS1164Organoid tedavi ve terapötik bozulma için kullanılan tirozin kinaz inhibitörü
Fetal Bovine Serum Değeri FBSGibcoA5256701
ForskolinTocris Bioscience1099
GlutaMAX takviyesiThermo Fisher Scientific35050061
Hematoksilin ve Eozin Boyama KitiBeyotimeC0105S
HEPES, 1 MThermo Fisher Scientific15630080
Leica DM6 B Flüoresans Motorlu MikroskobuLeicaYok
N2 eki (1003)Thermo Fisher Scientific17502048
N-asetilsisteinMerckA0737-5MG
NikotinamidMerckN0636
Nunc 15 mL Konik Steril Polipropilen Santrifüj TüpleriThermo Fisher Scientific339651
Penisilin/streptomisin (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Fosfatla tamponlu tuzlu suGENOM BIYOGRAFISIGNM20012Organoid yıkamak ve numunelerin sonraki işleme için hazırlanması için kullanılan tampon
Rekombinant insan EGF'siPeprotechAF-100-15
Rekombinant insan FGF10Peprotech100-26
Rekombinant insan HGFPeprotech100-39
Rekombinant insan NogginPeprotech120-10C
Rho kinaz inhibitörü Y-27632 dihidroklorürMerckY0503Organoid eritme veya geçiş sonrası hayatta kalmayı artırmak için kullanılan ROCK inhibitörü
R-spodin1-koşullu ortam(Broutier ve diğerleri)YokHücre hatlarının salgılanması
Trypan Blue Boya, %0,4 membran filtreli, %0,85 salin içinde hazırlanmışGibco15250061
TrypLE Ekspres Enzimi (1x), fenol kırmızı içermeyenThermo Fisher Scientific12604013Tripsin ikamesi
Wnt-3a ile koşullandırılmış ortam(Broutier ve diğerleri)YokHücre hatlarının salgılanması

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hepatocellular Carcinoma OrganoidsSingle Cell RNA SequencingDrug Treatment ResponseOrganoid Drug ScreeningOrganoid DissociationCell Viability AssayOrganoid Morphology AnalysisGene Expression ProfilingTumor HeterogeneityPathway Enrichment Analysis

Related Articles