Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İlaç tedavisinden sonra hepatosellüler karsinom organoidlerinin oluşumu ve tek hücreli transkriptomik analizi

495 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/70511

⸱

26 Mayıs 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Basic Medical Science, Guangzhou Medical University, 2Guangzhou Municipal and Guangdong Provincial Key Laboratory of Protein Modification and Degradation, Guangzhou Medical University, 3Affiliated Cancer Hospital and Institute, Guangzhou Medical University, 4The First Clinical School of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University, 5Department of Obstetrics, Guangzhou Eighth People's Hospital, Guangzhou Medical University, 6Department of Pediatric Surgery, Guangzhou Institute of Pediatrics, Guangzhou Women and Children's Medical Center, Guangzhou Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, hepatosellüler karsinom organoidlerinin üretilmesi, ilaç tedavisi uygulanması ve tedavi öncesi ve sonrası tek hücreli RNA dizilenmesi için uygulanan sade bir yöntemi ortaya koyarak tedaviyle ilişkili transkripsiyonel değişiklikleri karakterize eder.

Özet

Hepatosellüler karsinom, dünya genelinde kanserle ilişkili ölümlerin başlıca nedenlerinden biridir ve belirgin intratümör heterojenliğiyle karakterize edilir; bu da değişken tedavi yanıtlarına, tümör tekrarına ve hastalık ilerlemesine katkıda bulunur. Bu nedenle, ilaç tedavisinden önce ve sonra tümör hücrelerinin transkripsiyonel düzeyde nasıl değiştiğine dair daha derin bir anlayış, terapötik stratejilerin iyileştirilmesi için gereklidir. Ancak, organoid tabanlı ilaç tedavisini aşağı yönlü tek hücreli transkriptomik profilleme ile bağlayan pratik deneysel iş akışları sınırlı kalmaktadır. Bu çalışmada, hepatosellüler karsinom organoidlerinin üretilmesi, tanımlanmış ilaç tedavisi uygulanması ve tedavi öncesi ve sonrası toplanan örneklerde tek hücreli RNA dizileme yapılması için standartlaştırılmış bir iş akışı geliştirilmiştir. Protokol, organoid canlandırma ve genişletme, tedavi öncesi kalite değerlendirmesi, ilaç maruziyeti, tek hücre ayrışması için organoid hazırlığı, kütüphane yapımı ve tek hücreli transkriptomik verilerin temel karşılaştırmalı analizini içerir. Tekrarlanabilirliği ve örnek kalitesini artırmak için kritik teknik önlemler sağlanır. Bu iş akışı, hepatosellüler karsinom organoidlerinde ilaç tedavisiyle ilişkili hücresel bileşim ve transkripsiyon değişikliklerinin yan yana karakterizasyonunu sağlar. Protokol, farklı organoid sistemler arasında sağlam, ölçeklenebilir ve uyarlanabilir olup, tek hücre çözünürlükte tedaviyle ilişkili gen ifade değişikliklerini araştırmak için pratik bir platform sağlar.

Giriş

Hepatosellüler karsinom (HCC), yetişkinlerde en yaygın birincil karaciğer kanseridir ve dünya genelinde kanserle ilişkili ölümlerin başlıcanedenidir 1,2,3. Kötü klinik sonuçları, tedavi direnci ve tekrara yol açan önemli intratümör heterojenliktenkaynaklanmaktadır 4. Yakın tarihli bir çalışma, FOXM1/CEBPB ekseni gibi temel transkripsiyonel programların yönlendirdiği gelişimsel çeşitlilik ve hücre-durum plastisitesinin HCC5'te terapötik direnci artırdığını göstermektedir. Bu bulgular, tümör hücre popülasyonlarının sürekli tedavi baskısı altında nasıl uyum sağladığını ve durumlar arasında geçiş yaptığını anlamanın gerekliliğini vurgulamaktadır. Ancak, çoğu preklinik model, bu tedaviyle ilişkili durum geçişlerinin dinamik ve sürekli doğasını yeterince yakalayamıyor; bu da tümör adaptasyonu ve terapötik başarısızlığın mekanik araştırmasını sınırlamaktadır.

Hasta kaynaklı organoidler (PDO'lar), orijinal tümörün önemli genomik değişikliklerini ve hücresel heterojenliğini korudukları için bu amaçla faydalı bir platformsağlar 6. HCC organoidleri, uzun vadeli kültürde temel doku özelliklerinikoruyarak sürdürülebilir hale getirilebilir ve bu da onları tedavi-yanıt çalışmaları için özellikle uygun kılar. Ayrıca, organoid tabanlı çalışmalar, karaciğer kanseri organoidlerinin ilaç testi ve tedavi hassasiyetindeki hastalar arası ile intratümörsel farklılıkları yakalamak için kullanılmasının uygulanabilirliğini göstermiş olup, tedavi-yanıt araştırmalarında preklinik modeller olarakdeğerini desteklemiştir 8,9. Ancak, organoid tabanlı ilaç çalışmalarının çoğu hâlâ öncelikle son nokta yaşama ölçümlerine dayanır veya ağırlıklı olarak toplu fenotipik yanıtlara odaklanır; böylece heterojen hücresel yanıtlar ve tedaviyle ilişkili transkripsiyonel değişiklikler hakkında sınırlı bilgi sağlar. Paralel olarak, HCC için RNA tabanlı terapötik stratejilerin hızlı gelişimi, tek hücre çözünürlükte tedavi yanıtlarını doğru şekilde tahmin edip mekanik olarak inceleyebilecek preklinik sistemlere olan ihtiyacıdaha da vurgulamaktadır.

Tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq), organoid modellerde hücresel bileşim ve transkripsiyon durumlarının yüksek çözünürlüklü karakterizasyonunu sağlar11. Tedavi öncesi ve sonrası toplanan organoidlere uygulandığında, scRNA-seq gen ifade değişikliklerini, hücre popülasyonlarındaki değişimleri ve toplu testlerle yakalanmayan heterojen yanıtları ortaya çıkarabilir. Bu yaklaşım, HCC organoidlerinde tedaviyle ilişkili transkripsiyonel yeniden modellemenin araştırılması için pratik ve güçlü bir stratejiyi temsil etmektedir. Ancak, HCC organoid kültürü, ilaç tedavisi ve tedavi öncesi ve sonrası tek hücreli RNA dizilemesini entegre eden pratik, tekrarlanabilir bir iş akışı hâlâ eksik olarak bulunmaktadır. Böyle bir iş akışı en etkili, ilaç maruziyeti sırasında organoid bütünlüğü korunduğunda ve yeterli canlı hücre elde edildiğinde ve sonraki tek hücre profilleme için sağlanır. Diğer organoid tabanlı yaklaşımlarda olduğu gibi, önemli sınırlamalar arasında tümör mikro ortamının stromal, damar ve bağışıklık bileşenlerinin eksik temsil edilmesi ile uzun süreli in vitro kültür sırasında potansiyel seçim yanlılığı yer alır.

HCC organoidlerinin üredilmesi, tanımlanmış ilaç tedavisinin uygulanması ve tek hücreli RNA dizileme için organoid örneklerinin tedavi öncesi ve sonrası işlemesi için entegre deneysel bir iş akışı tanımlanır. Bu iş akışı, organoid canlandırma ve genişleme, tedavi öncesi kalite değerlendirmesi, kontrollü ilaç maruziyeti ve eşleşen örneklerin tek hücreli RNA dizilenmesini kapsar. Bu yaklaşım, HCC organoidlerinde hücresel bileşim ve gen ifade programlarındaki tedaviyle ilişkili değişiklikleri tek hücre çözünürlüğinde karşılaştırmak için pratik bir çerçeve sunar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

İnsan dokuları kullanılarak yapılan çalışmalar, Guangzhou Tıp Üniversitesi Etik Araştırma Komiteleri tarafından incelenip onaylandı (onay no. GYZL-2024-KY31). İnsan örnekleriyle ilgili tüm prosedürler, insan araştırmaları için kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm hastalardan tıbbi araştırmalar için klinik örneklerinin kullanımı için yazılı bilgilendirilmiş onay alındı. Kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

Bu iş akışı, kriyokonserif hepatosellüler karsinom organoidlerinin geri kazanılması ve genişletilmesini içerir; ayrıca aşağı akış terapötik pertürbasyonu ve tek hücreli RNA dizileme için küçük adaptasyonlar içerir. Amaç, sonraki ilaç tedavisi deneyleri için yeterli kalite ve tutarlılığa sahip organoid kültürlerüretmektir 12.

1. HCC hasta kaynaklı organoidlerin kurulması ve yayılması

  1. Kriyokonserve Organoidlerin Erimesi ve Kurtarılması
    1. Eritme öncesi hazırlık
      1. Su banyosunu 37 °C'ye kadar önceden ısıtın. 24 kuyululukta bir plakayı 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde en az 1 saat önceden dengeleyin.
      2. Önceden tam bir organoid kültür ortamı hazırlayın ve bazal membran ekstraktını (BME) kullanıma kadar buzda tutun. Tam organoid kültür ortamının bileşimi Ek Tablo 1'de verilmiştir.
    2. Organoitlerin erimesi
      1. Donmuş HCC organoidleri içeren kriyovialleri sıvı azot deposundan çıkarın ve hemen 37 °C su banyosuna yerleştirin.
      2. Şişeni nazikçe karıştırın ve geriye sadece küçük bir buz kristali kaldığında eritmeyi durdurun.
    3. Kriyoprotektantın çıkarılması
      1. Erimiş süspansiyonu nazikçe bir kez pipetle içindekileri tekrar askıya alın.
      2. Süspansiyon, 3–5 mL tam organoid kültür ortamı içeren 15 mL'lik konik bir tüpe aktarılır.
      3. Santrifüj 300 × g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca koyun. Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve pelleti rahatsız etmeden atın.
  2. Organoidlerin Gömülmesi ve Yeniden Kaplaması
    1. Geri kazanım karışımının hazırlanması
      1. Organoid pelleti tam organoid kültür ortamında yeniden askıya alın. Tam organoid kültür ortamının bileşimi Ek Tablo 1'de verilmiştir.
      2. Kaplama karışımını oluşturmak için eşit hacimde buz gibi soğuk BME ile nazikçe karıştırın.
        NOT: Erken polimerleşmeyi önlemek için karışımı buz üzerinde tutun.
    2. Organoid kubbelerin kaplaması
      1. Organoid-matriks karışımından 50 μL önceden ısıtılmış 24 kuyruklu bir plakanın her kuyusuna dağıtılır.
      2. Matris katılaşması için 37 °C'de 30 dakika kuluçka yapın.
      3. Kuyu duvarı boyunca her kuyuya 500 μL tam organoid kültür ortamı eklenerek 20 μM Y-27632 ile takviye edilir.
        NOT: Y-27632 kullanımını eritme veya geçişten sonraki ilk 2–3 gün ile sınırlayın. Her kubbenin kuyunun dibine sıkışık ve bağlı kaldığından emin olun, dışa doğru yayılmadan.
  3. Organoid kültürü ve genişleme
    1. İyileşme kültürü koşulları
      1. Organoidleri %5CO2 ile 37 °C'de tutun.
      2. Çözülmeden sonraki ilk 2–3 gün içinde 20 μM Y-27632 içeren ortam kullanın.
    2. Orta seviye değişimi
      1. Her 3–4 günde bir hafif aspirasyon kullanarak kültür ortamını değiştirin.
      2. Her kuyunun duvarına taze bir ortam ekleyin, böylece matris kubbeleri bozulmasın.
      3. Aynı deney içindeki tüm kuyular için aynı ortam değişim programını koruyun.
    3. Büyüme izleme
      1. Organoid iyileşme ve genişleme ile parlak alan mikroskobu ile tutarlı görüntüleme ayarlarını takip edin.
      2. Kurtarma ve genişletme sırasında belirli zaman noktalarında temsilci görüntüler kaydedin.
      3. Yapıların çoğunluğu sağlam kaldığında, organoidler yuvarlak ve oval morfolojiye ve düzgün kenarlara sahip olduğunda, zamanla ilerleyici genişleme gözlemlendiğinde ve minimum miktarda çökmüş yapı bulunduğunda başarılı iyileşme doğrulanır.
      4. 10'dan az sağlam organoid içeren kuyuları aşağı akış nicel analizinden hariç tutun.
    4. Geçiş ve genişleme kriterleri
      1. Stabil genleşmeden sonra geçiş organoidleri gözlemlenir.
      2. Korunmuş morfolojiyle organoid boyut veya toplam alanda tekrarlanabilir artışlarla stabil genişlemeyi doğrulayın.
      3. Deneyler arasında tutarlı görüntüleme aralığı, büyütme ve dahil etme kriterleri kullanın.
      4. Stabiliteyi doğrulamak için organoid alan veya sayımlara dayalı temsilci büyüme eğrileri oluşturun.
    5. Aşağı akış deneyleri için kriterler
      1. Stabil üç boyutlu büyüme gösteren, hiç kontaminasyon veya geniş çöküş göstermeyen ve paralel deneysel koşullar için yeterli verim sağlayan organoid hatlar kullanın.
      2. Kültürleri eritmeden sonra veya iyileşme ve bir genleşme döngüsü tamamlanana kadar en az 7–10 gün boyunca korumak.
      3. Replikasyon kuyularında tutarlı morfolojiye sahip sadece organoid çizgileri ilerletmek.

2. Terapötik bozulma için organoidlerin hazırlanması

  1. Tedavi öncesi kalite değerlendirmesi
    1. Morfolojiye dayalı değerlendirme
      1. Organoidlerin morfolojide yuvarlak ila oval olduğunu doğrulayın.
      2. Organoitlerin düzgün ve iyi tanımlanmış sınırlar gösterdiğini doğrulayın.
      3. Kubbe içinde minimum hücresel kalıntı olduğunu doğrulayın.
      4. Yoğun parçalanma, kararmış lümenler, yaygın çöküş veya belirgin kontaminasyona sahip kültürleri dışlayın.
    2. Genişleme durumu değerlendirmesi
      1. Sadece iyileşmeyi tamamlamış ve stabil genişlemeye girmiş organoid kültürler kullanın.
      2. Zamanla ilerleyen büyümeyi doğrulayın.
      3. Replikasyon kuyuları arasında tutarlı morfolojiyi doğrulayın.
  2. İlaç tedavisi için organoidlerin yeniden kaplaması
    1. Organoidlerin matriksden kurtarılması
      1. Organoid kubbeleri her kuyu başına 1 mL buz soğukluğu hücre geri kazanım çözeltisi kullanarak 15–20 dakika boyunca buz üzerinde çözüp çözürün.
      2. İnkubasyon sırasında her 5 dakikada bir nazikçe pipet yapın.
      3. Geri kazanılan süspansiyonu 300 × g'de 5 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj edin.
      4. Pelleti tam organoid kültür ortamında yeniden askıya alın.
    2. Yeniden kaplama öncesi standartlaştırma
      1. İlaç tedavisinden önce kuyular arasında başlangıç organoid yükünü standartlaştırın.
      2. Kısmi ayrışmadan sonra mümkün olduğunda canlı hücre sayısını belirleyin.
      3. Örnekleri kuyu başına aynı sayıda giriş hücresi olarak normalize edin.
      4. 24 kuyu formatında yaklaşık 1.000–5.000 canlı hücre plaka yapın.
      5. Doğrudan hücre sayımı yapılmazsa, kuyu başına morfolojik olarak sağlam organoidlerin karşılaştırılabilir sayısı ve gruplar arasında benzer boyut dağılımı sağlayarak normalleştirin.
      6. Her biri için tedaviden çok önce başlangıç organoid sayısını ve başlangıç morfolojisini kaydedin.
      7. Aynı deneydeki tüm kuyular için aynı dahil etme kriterleri ve kaplama stratejisi kullanın.
    3. İlaç tedavisi için yeniden kaplama
      1. Geri kazanılan organoidleri buz gibi soğuk bazal zar matrisi ile %30–%50 nihai konsantrasyonda karıştırın.
      2. 24 kuyuluğa ait bir plakanın her kuyusuna 50 μL kubbe dağıtın.
      3. Polimerleşmeye izin vermek için 37 °C'de 30 dakika kuluçka yapın.
      4. Kuyu duvarı boyunca her kuyu başına 500 μL tam organoid kültürü ekleyin.
        NOT: Her kubbe kompakt ve kuyunun dibine bağlı kaldığından, dışa doğru yayılmadan devam etmesini sağla. Aynı deneydeki tüm kuyular için aynı kubbe hacmi ve matris konsantrasyonu kullanın.
  3. İlaç tedavisinden önce iyileşme
    1. Yeniden kaplama sonrası kurtarma
      1. Organoitlerin standart kültür koşullarında gece boyunca iyileşmesine izin verin.
      2. Tedaviye ancak yeniden kaplamalı kubbelerde sağlam morfoloji yeniden kurulduktan sonra başlatılır.
    2. İlaç tedavisi için giriş kriterleri
      1. İlaç tedavisine ancak organoidler yeniden kaplamadan sonra sağlam kaldığında, yaygın bir çökme veya aşırı kalıntı olmadığında ve organoid yükü kuyular arasında karşılaştırılabilir olduğunda başlatılır.
      2. Tedaviden önce tüm deneysel gruplar için temel parlak alan görüntülerini kaydedin.
      3. Tüm kontrol ve tedavi edilen kuyularda başlangıç organoid yükü, yeniden kaplama sonrası iyileşme süresi ve tedavi başlatma süresi aynı şekilde korun.
  4. Güvenlik endişeleri
    1. İnsan kaynaklı organoidlerle ilgili tüm işlemleri uygun kişisel koruyucu ekipman ve biyogüvenlik uygulamaları kullanılarak gerçekleştirin.
    2. Cilt veya göz maruziyetini önlemek için enzimatik dissosiyasyon reaktiflerini dikkatlice kullanın.
    3. Sıvı ve katı biyolojik atıkları kurumsal biyogüvenlik düzenlemelerine göre bertaraf etmelidir.

3. HCC organoidlerinin ilaç tedavisi

  1. İlaç hazırlığı ve tedavisi
    1. İlaç hazırlığı
      1. Üreticinin talimatlarına göre DMSO'da lenvatinib stok çözeltisi hazırlayın.
      2. Stok çözeltiyi kullanımdan hemen önce önceden ısıtılmış kültür ortamında önceden tanımlanmış çalışma konsantrasyonuna kadar seyreltin.
      3. Tüm kuyular için aynı nihai DMSO konsantrasyonunu koruyun (≤ %0,1).
      4. Her kuyunun nihai işlem hacminin eşit olması için yeterli hacim hazırlayın.
    2. İlaç tedavisi
      1. Her kuyunun duvarına lenvatinib içeren ortam (20 μM) ekleyin, böylece matris kubbeleri rahatsız edilmesin.
      2. Aynı nihai DMSO yoğunluğuna sahip bir araç kontrolü ekleyin.
      3. Organoidleri önceden belirlenmiş tedavi süresi için standart kültür koşullarında kuluçka altına alın.
      4. İlaç içeren ortamı her 48–72 saatte bir değiştirin, tedavi süreleri 72 saatten uzun süredir.
      5. Deneydeki tüm kuyular için aynı ortam değiştirme programını kullanın.
      6. Tedaviden önce temel parlak alan görüntülerini kaydedin.
      7. Aynı mikroskop ayarları, büyütme ve alan pozisyonları kullanılarak işlem sırasında sabit aralıklarla görüntüler alın.
  2. Tedavi yanıtının değerlendirilmesi
    1. Morfolojiye dayalı değerlendirme
      1. Aşağıdaki görüntü tabanlı okumalarla tedavi yanıtını değerlendirin: organoid alan büyüme eğrisi, ortalama organoid çapı ve hayatta kalan organoid sayısı.
      2. Tüm görüntüler için aynı pozlama ayarları, büyütme ve analiz eşikleri kullanın.
      3. Her zaman noktasında kuyu veya alan başına toplam organoid alanı hesaplayarak organoid alan büyüme eğrisini ölçerek ve başlangıç seviyesine normalleştirerek ölçün.
      4. Bireysel sağlam organoidlerin çapını belirleyip kuyu başına ortalama değeri hesaplayarak ortalama organoid çapını ölçün.
      5. Morfolojik olarak tanımlanabilir sağlam organoidleri sayarak ve enkaz ile çökmüş parçaları hariç tutarak hayatta kalan organoid sayısını belirleyin.
    2. Isteğe bağlı kullanılabilirlik ölçümü
      1. Ek hacim canlılık değerlendirmesi gerekirse, tedavi noktasında üç boyutlu bir lülümensans canlılık testi yapılabilir.
      2. Analiz işlemi için üreticinin talimatlarını takip edin.
  3. Veri analizi
    1. Organoid alan büyüme eğrilerini zaman içinde çizin.
    2. Araç ile işlenmiş ve lenvatinib ile işlenmiş gruplar arasında ortalama organoid çapını karşılaştırın.
    3. Tedavi grupları arasında hayatta kalan organoid sayılarını karşılaştırın.
    4. Tüm gruplarda aynı görüntü alım programlarını, organoid dahil etme kriterlerini ve analiz parametrelerini uygulayarak tekrarlanabilirliği garanti edin.

4. Tek hücreli RNA dizileme için organoidlerin hazırlanması

  1. Organoidlerin seçilimi ve kurtarılması
    1. Dissosiyasyon öncesi değerlendirme
      1. Yaygın çöküş olmadan sağlam üç boyutlu morfoloji sergileyen, aşağı akış tek hücre yakalama için yeterli materyal içeren ve belirgin bir kontaminasyon göstermeyen organoid kuyuları seç.
      2. Organoidleri kontrol ve işlenmiş örnekler arasında eşleşen deneysel zaman noktalarında toplayın.
      3. Örnekler arasında aynı kaplama yoğunluğu, işlem programı ve ortam değişim koşullarını koruyun.
      4. Seçilmiş her birinin parlak alan görüntülerini ayrışmadan çok önce aynı mikroskop ayarları, büyütme ve alan seçme kriterleri kullanılarak kaydedin.
    2. Matrisin kaldırılması
      1. Her kuyunun tamamen aspirasyon kültürü ortamı yapın.
      2. Her kuyuyu buz gibi PBS ile iki kez yıkayarak kalan ortam ve kalıntıları temizleyin.
      3. Her kuyuya 1 mL buz soğukluğu hücre geri kazanım çözeltisi ekleyin.
      4. 20–30 dakika boyunca buzda kuluçka yapın.
      5. İnkubasyon sırasında her 5–7 dakikada bir nazikçe pipet yapın, böylece matriks çözünürlüğü sağlanır.
      6. Çözülmüş malzemeyi geniş delikli veya kesilmiş pipet ucu kullanarak önceden soğutulan tüplere aktararak kesme gerginliğini en aza indirin.
      7. Enzimatik ayrışmaya ancak matris büyük ölçüde çözüldükten ve minimal görünür jel kalıntısı kaldıktan sonra devam edin.
  2. Enzimatik ayrışma ve tek hücreli süspansiyon hazırlığı
    1. Enzimatik ayrışma
      1. Geri kazanılan organoid süspansiyonu 300 × g sıcaklığında 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.
      2. Süpernatantı peleti rahatsız etmeden dikkatlice çıkarın.
      3. Pelleti 1 mL rekombinant hücre ayrıştırma enziminde yeniden süzülür.
      4. 37 °C'de 5–10 dakika kuluçka yapın.
      5. Dissosiyasyonu teşvik etmek için geniş delikli P1000 ucu kullanarak her 2–3 dakikada 8–10 kez nazikçe pipet yapın.
      6. Çoğu organoid parça tek hücreye dağılmışken ve sadece küçük kalıntı kümeleri kaldığında sindirimi durdurun.
      7. Hücre canlılığının azalması, stresle ilişkili transkripsiyonel artefaktlar ve artan çevresel RNA kontaminasyonunu önlemek için uzun süreli sindirimden kaçının.
    2. Söndürme ve filtreleme
      1. Sindirimi durdurmak için %2 fetal sığır serumu içeren 4 mL buz gibi soğuk PBS ekleyin.
      2. Süspansiyonu 40 μm hücre süzülcüsünden filtreleyin.
      3. Kalan enzim, agrega ve kalıntıları çıkarmak için PBS ile bir kez yıkayın.
      4. Eritrosit kontaminasyonu varsa, üreticinin talimatlarına uygun olarak kırmızı kan hücresi lizisi yapılsın.
    3. Hücre hazırlığı ve kalite kontrolü
      1. Hücreleri trypan blue hariç tutarak say.
      2. Kütüphane hazırlığından önce hücre yaşamlılığını belirleyin.
      3. Sadece %85 ≥ olan örnekler kullanın.
      4. Son hücre konsantrasyonunu 700–1.200 hücre/μL olarak ayarlayın.
      5. Aşırı döküntü, bol ölü hücreler, büyük görünür agregalar veya eksik ayrışma içeren örnekleri dışlayın.
      6. Agregalar varsa yüklemeden önce filtreleme tekrarlanın.
      7. Aynı koşullarda işlem kontrolü ve işlenmiş örnekler, bunlar arasında dissosiyasyon enzimi, sindirim süresi, pipetleme sıklığı, filtrasyon yöntemi, hücre konsantrasyonu ve yükleme stratejisi dahil.
  3. Tek hücreli kütüphane hazırlama ve dizileme
    1. Tek hücre yakalama ve kütüphane hazırlığı
      1. Hazırlanan tek hücreli süspansiyonu, üreticinin talimatlarına göre damla tabanlı tek hücreli yakalama platformuna yükleyin.
      2. Karşılık gelen tek hücreli 3′ iş akışını kullanarak ters transkripsiyon, cDNA amplifikasyonu ve kütüphane yapımını gerçekleştirin.
    2. Dizileme parametreleri
      1. Hücre başına en az 50.000 okuma derinliğinde dizis kütüphaneleri.
      2. Yük hücreleri, kütüphane başına yaklaşık 6.000–10.000 hücre kurtarımı sağlar.
      3. Dizileme kimyası, okuma yapısı ve enstrüman ayarlarını kaydedin.
  4. Aşağı akış analizi için kalite kriterleri
    1. Son hazırlıkın yüksek hücre canlılığı, minimum kalıntı ve düşük agregat yükü olduğundan emin olun.
    2. Hücresel heterojenlik ve hücre-durum geçişlerinin aşağı akış tek hücreli transkriptomik analizi için uygunluğu doğrulayın.

5. Tek hücreli RNA dizileme verilerinin temel işlemesi ve kalite kontrolü

  1. Birincil işlem
    1. Sayma matrisinin oluşturulması
      1. Seçilen platform için önerilen boru hattını kullanarak ham dizileme verilerini işleyin.
      2. Gen bazında hücre sayı matrisi oluşturun.
      3. Yazılım sürümünü kaydet, referans genom derlemesi ve transkripsiyon açıklaması yayınını yap.
    2. İlk kütüphane düzeyinde kalite değerlendirmesi
      1. Her kütüphane için toplam okuma, tahmini kurtarılan hücre sayısı, hücre başına medyan genler, hücre başına medyan UMI'ler ve dizileme doygunluğu (varsa) dahil olmak üzere dizileme metriklerini özetleyin.
      2. Tüm örneklerde aynı referans genom ve açıklama ayarları kullanın.
  2. Hücre düzeyinde kalite kontrolü
    1. Düşük kaliteli hücrelerin filtrelenmesi
      1. Her hücre için tespit edilen gen sayısını, toplam UMI sayısını, mitokondriyal transkriptlerin oranını ve çift veya çoklu çift olduğunu değerlendirin.
      2. Son derece düşük gen sayıları, son derece düşük UMI sayısı veya anormal derecede yüksek mitokondriyal transkript fraksiyonları olan hücreleri hariç tutun.
      3. Veri seti dağılımına göre filtreleme eşiklerini tanımlayın.
      4. Eşleşen tedavi grupları arasında aynı eşikleri uygulayın.
    2. Muhtemel çiftlerin çıkarılması
      1. Uygun bir hesaplama yöntemiyle olası çiftleri belirleyin.
      2. Platform uyumlu bir tespit iş akışı kullanarak çiftleri kaldırın.
      3. Tüm örneklerde aynı dublet tespit stratejisini uygulayın.
  3. Normalizasyon, kümeleme ve açıklama
    1. Veri normalizasyonu
      1. Filtrelenmiş sayım matrisini standart tek hücreli RNA-seq iş akışı kullanarak normalleştirin.
      2. Tüm örneklerde aynı normalizasyon prosedürlerini uygulayın.
    2. Boyutluluk küçültme ve kümeleme
      1. Boyutsal küçültme gerçekleştirin.
      2. Başlıca transkripsiyonel popülasyonları belirlemek için denetimsiz kümeleme yapılabilir.
      3. UMAP gibi düşük boyutlu bir göme yöntemiyle hücre durumlarını görselleştirin.
    3. Belirteç gen tanımı
      1. Kümeler arasında farklı ifade analizleriyle belirtici genleri tanımlayın.
      2. Belirteç ifadesine dayalı olarak ana epitel hücre durumlarına biyolojik yorum atan.
  4. Tedavi koşullarının karşılaştırmalı analizi
    1. Meta veri entegrasyonu
      1. Her hücreyi tedavi koşulları, hastadan kaynaklı organoid hattı ve işlem partisi ile nota edin.
      2. Tüm örneklerde tutarlı meta veri yapısı korun.
    2. Tedaviyle ilişkili değişikliklerin analizi
      1. Kontrol ve işlenmiş örnekleri karşılaştırın.
      2. Tedaviyle ilişkili transkripsiyonel yeniden yapılandırmayı tespit edin.
      3. Hücre durumu bileşimindeki değişimleri tespit edin.
      4. Terapötik adaptasyonla ilişkili aday hücre popülasyonlarını belirlemek.
      5. Sonuçları morfoloji tabanlı ve kullanılabilirlik okumalarıyla birlikte yorumlayın.
  5. Veri analizi çıktısı
    1. Kalite kontrollü bir gen sayısı matrisi oluşturun.
    2. Transkripsiyonel olarak farklı popülasyonların düşük boyutlu görselleştirmelerini oluşturun.
    3. Büyük kümeler için işaretleyici genleri belirleyin.
    4. Referans genom, ön işleme iş akışı, filtreleme kriterleri, küme stratejisi ve açıklama kriterlerindeki tüm örneklerde tutarlılık sağlanır.
    5. Standart iş akışından örneklere özgü sapmaları belgeleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1, hepatosellüler karsinomi (HCC) organoidlerinin oluşumu ve karakterizasyonunu özetlemektedir. Şekil 1A'da, hastadan türetilen tümör dokuları, histolojik analiz ve tedavi çalışmaları için organoid kültürler oluşturmak amacıyla kullanılmıştır. Şekil 1B , iyileşme sonrası 1. ve 6. günlerde organoidlerin parlak alan görüntülerini göstermekte, standart üç boyutlu kültür koşullarında hayatta kalma...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Tekrarlanabilirlik, verimlilik ve yüksek kaliteli tek hücreli transkriptomik analiz sağlamak için, bu iş akışında birkaç teknik adım dikkatli kontrol gerektirir. Hastadan kaynaklanan HCC organoidlerin canlandırılması ve genleşmesi sırasında tutarlılık önemlidir; çünkü tohumlama yoğunluğu, bazaz membran matris bileşimi ve kültür zamanlamasındaki değişiklikler organoid morfolojisini, büyümesini ve sonraki tedavi yanıtlarını etkileyebilir13,14

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklamak zorunda kalacak bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82303022; 82122048; 82372714; 82203380), Guangdong Temel ve Uygulamalı Temel Araştırma Vakfı (2023A1515011416) ve Guangzhou Temel ve Uygulamalı Temel Araştırma Vakfı (2024A04J6575) tarafından desteklenmiştir. Bazı şematik unsurlar Home for Researchers (https://www.home-for-researchers.com) kullanılarak oluşturulmuş ve yazarlar tarafından uyarlanmıştır. Şematik illüstrasyonlar Figdraw (https://www.figdraw.com) kullanılarak oluşturulmuş ve yazarlar tarafından uyarlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
[Leu15]-gastrin I insanMerckG9145
1.5 mL MikrotüplerMerckAXYMCT150LC
1X RBC Lizis TamponuThermo Fisher Scientific00-4333-57
2.0ml İç İplikli Kriyojenik ŞişelerYuva607001
A8301 (TGFb inhibitörü)Tocris Bioscience2939
AFP Poliklonal antikorProteintech14550-1-AP
Anti-Albümin antikor [ALB/2144]abcamab236492
Anti-HNF-4-alfa antikor [EPR16885] - ChIP SınıfıabcamAB181604
Anti-Prealbumin antikor [EPR3219]abcamab92469
Anti-SOX9 antikor [EPR14335-78]abcamAB185966
B27 Takviyesi (503), A vitamini hariçThermo Fisher Scientific12587010
Hücre Kurtarma Çözeltisi, 100 mLCorning354253Bazaz zar matrisini çözmek ve organoidleri yeniden kaplamadan veya sonraki işlemeden önce geri kazanmak için kullanılan reaktif
CellTiter-Glo®   3D Hücre Yaşam TestiPromegaG9681
CHIR99021MerckSML1046
Chromium Next GEM Tek Hücreli 3' GEM, Kütüphane & Gel Bead Kit v3.110x GenomikCG000227
Corning Hücre Süzgüsü, 40 ve mu; m, Mavi, S, IND, 1/50Corning431750
Costar 24 kuyuyla şeffaf düz tabanlı ultra düşük bağlantı çoklu kuyu plakaları, ayrı ayrı sarılmış, sterilCorning3473
Cultrex Azaltılmış Büyüme Faktörü BME, Tip 2 PathClear (BME)Merck3533-005-02Üç boyutlu organoid kültürü ve kubbe oluşumunu desteklemek için kullanılan ekstrasellüler matriks
DMSOMerckC6164İlaç stok çözeltileri ve araç kontrolü için kullanılan çözücü
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium/Ham F-12'siThermo Fisher Scientific12634028İleri DMEM/F-12
E7080 (Lenvatinib)SelleckS1164Organoid tedavi ve terapötik bozulma için kullanılan tirozin kinaz inhibitörü
Fetal Bovine Serum Değeri FBSGibcoA5256701
ForskolinTocris Bioscience1099
GlutaMAX takviyesiThermo Fisher Scientific35050061
Hematoksilin ve Eozin Boyama KitiBeyotimeC0105S
HEPES, 1 MThermo Fisher Scientific15630080
Leica DM6 B Flüoresans Motorlu MikroskobuLeicaYok
N2 eki (1003)Thermo Fisher Scientific17502048
N-asetilsisteinMerckA0737-5MG
NikotinamidMerckN0636
Nunc 15 mL Konik Steril Polipropilen Santrifüj TüpleriThermo Fisher Scientific339651
Penisilin/streptomisin (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Fosfatla tamponlu tuzlu suGENOM BIYOGRAFISIGNM20012Organoid yıkamak ve numunelerin sonraki işleme için hazırlanması için kullanılan tampon
Rekombinant insan EGF'siPeprotechAF-100-15
Rekombinant insan FGF10Peprotech100-26
Rekombinant insan HGFPeprotech100-39
Rekombinant insan NogginPeprotech120-10C
Rho kinaz inhibitörü Y-27632 dihidroklorürMerckY0503Organoid eritme veya geçiş sonrası hayatta kalmayı artırmak için kullanılan ROCK inhibitörü
R-spodin1-koşullu ortam(Broutier ve diğerleri)YokHücre hatlarının salgılanması
Trypan Blue Boya, %0,4 membran filtreli, %0,85 salin içinde hazırlanmışGibco15250061
TrypLE Ekspres Enzimi (1x), fenol kırmızı içermeyenThermo Fisher Scientific12604013Tripsin ikamesi
Wnt-3a ile koşullandırılmış ortam(Broutier ve diğerleri)YokHücre hatlarının salgılanması

Kaynaklar

  1. Villanueva, A. Hepatocellular carcinoma. N Engl J Med. 380 (15), 1450-1462 (2019).
  2. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 68 (6), 394-424 (2018).
  3. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  4. Safri, F., et al. Heterogeneity of hepatocellular carcinoma: from mechanisms to clinical implications. Cancer Gene Ther. 31 (8), 1105-1112 (2024).
  5. Zhang, X. F., et al. Targeting cell-state plasticity driven by FOXM1/CEBPB axis disrupts developmental heterogeneity and therapeutic resistance in hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 84 (2), 370-384 (2026).
  6. Thorel, L., et al. Patient-derived tumor organoids: a new avenue for preclinical research and precision medicine in oncology. Exp Mol Med. 56 (7), 1531-1551 (2024).
  7. Liu, Y., et al. A decade of liver organoids: advances in disease modeling. Clin Mol Hepatol. 29 (3), 643-669 (2023).
  8. Li, L., et al. Human primary liver cancer organoids reveal intratumor and interpatient drug response heterogeneity. JCI Insight. 4 (2), e121490 (2019).
  9. Yang, H., et al. Pharmacogenomic profiling of intra-tumor heterogeneity using a large organoid biobank of liver cancer. Cancer Cell. 42 (4), 535-551.e8 (2024).
  10. Xing, L., et al. RNA-based therapies in hepatocellular carcinoma: state of the art and clinical perspectives. Hepatoma Res. 10, 24 (2024).
  11. Aissa, A. F., et al. Single-cell transcriptional changes associated with drug tolerance and response to combination therapies in cancer. Nat Commun. 12 (1), 1628 (2021).
  12. Zhang, C. Y., et al. Development and optimization of a human hepatocellular carcinoma patient-derived organoid model for potential target identification and drug discovery. J Vis Exp. (198), e65785 (2023).
  13. Wang, Q., et al. Breakthroughs and challenges of organoid models for assessing cancer immunotherapy: a cutting-edge tool for advancing personalised treatments. Cell Death Discov. 11 (1), 222 (2025).
  14. Yang, C., et al. Modeling methods of different tumor organoids and their application in tumor drug resistance research. Cancer Drug Resist. 8, 32 (2025).
  15. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).
  16. Yip, S., et al. Give them vasculature and immune cells: how to fill the gap of organoids. Cells Tissues Organs. 212 (5), 369-382 (2023).
  17. Zhou, C., et al. Standardization of organoid culture in cancer research. Cancer Med. 12 (13), 14375-14386 (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Tek Hücreli RNA Dizilemeİlaç Tedavi YanıtıOrganoid İlaç TaramasıOrganoid DisosiyasyonuHücre Canlılığı AnaliziOrganoid Morfoloji AnaliziGen Ekspresyon Profili ÇıkarmaTümör HeterojenitesiYolak Zenginleştirme Analizi
İlaç tedavisinden sonra hepatosellüler karsinom organoidlerinin oluşumu ve tek hücreli transkriptomik analizi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.