Yöntem makalesi

Biyomoleküler yoğunlaşmaları iki fazlı koşullarda karakterize etmek için çözelti NMR kullanımı

DOI:

10.3791/70530

⸱

17 Nisan 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Institute of Biochemistry, ETH Zurich

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, NMR metodolojileri için protokolleri sunuyoruz; bu protokoller, SEmi-katı Manyetizasyon Transferi (CONDENSE-MT) ile GÖRÜNMEZ Türlerin REstricted DIFfüzyonu (REDIFINE) ve SEmi-solid Magnetization Transfer (CONDENSE-MT) ile CONdensate DEtectioN (CONdensate DEtectioN) için protokoller sunuyoruz; bu protokoller, biyomoleküler kondensatların iki fazlı koşullarda etiketsiz, nicel karakterizasyonunu mümkün kılarak moleküler bölünme, değişim dinamikleri, kondensata hidratasyonu ve damla yapısını sedimentasyon veya etiketleme olmadan ortaya koymaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sıvı-sıvı faz ayrımı (LLPS) ile oluşan biyomoleküler kondensatlar, hücre içi ortamı düzenler ve çeşitli biyokimyasal süreçleri düzenler. Önemlerine rağmen, yoğunlaşma bileşimi, değişim dinamikleri ve iç organizasyonu incelemek, özellikle dış etiketler olmadan zordur. Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, bu mezoscale montajlara benzersiz ve etiketsiz bir pencere sunabilir; hem moleküler hareketi hem de çevresel heterojenliği yakalayabilir. İki tamamlayıcı NMR metodolojisi, kondensatların doğrudan bifazik durumları içinde kapsamlı bir şekilde karakterize edilmesini sağlar. NMR ile gözlemlenebilecek kadar dinamik olan kondensatlar için, difüzyon değişim yaklaşımı olan REstricted DIffusion of INvisible türleri (kısaltma olarak REDIFINE), kimyasal değişimle difüzyon kontrastını kullanarak yoğunlaşmış ve seyreltilmiş fazlar arasında bölünen moleküllerin oranını nicelikletir, damlacık boyutunu ve arayüz geçirgenliğini belirler ve faz sınırı boyunca moleküler değişim oranlarını çıkarır. NMR ile görünmez olan daha sert kondensatlar için, su algılanan yarı katı manyetizasyon-transfer yöntemi olan SEmi-katı manyetizasyon transferi ile CONdensate DEtectioN veya kısaca CONDENSE-MT, yoğun biyomoleküller ile seyreltilmiş faz çözücü arasındaki gevşeme kontrastı ve proton değişimini kullanarak yoğun su protonlarına kondensatları izleyerek göreceli bölünme, moleküler yuvarlanma hızları, hidratasyon dinamikleri ve bağlı su içeriğine erişim sağlar. Bu yaklaşımlar birlikte, floresan veya algılama etiketleri olmadan neredeyse doğal bifazik koşullarda yoğunlaşma yapısı ve dinamiklerinin çok boyutlu, nicel bir görünümünü sunar. Entegrasyonları, biyomoleküler faz ayrımı incelemek için NMR araç kutularını genişletir ve kondensat fizikokimyasal özelliklerini biyolojik işlevleri ve patolojik yanlış düzenlemeleriyle bağlamak için temel oluşturur.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücreler, olağanüstü mekansal ve zamansal organizasyonlarını biyokimyasal reaksiyonları bölümlereayırarak elde eder 1,2,3. Membrana bağlı organellerin yanı sıra, proteinler ve nükleik asitlerin sıvı–sıvı faz ayrılmasıyla (LLPS) oluşan membransız bölmelerde birçok kritik hücreselsüreç gerçekleşir. Bu dinamik yapımlar, genellikle biyomoleküler kondensatlar olarak adlandırılır ve nükleolus, stres granülleri, nükleer noktalar ve işleme cisimlerini içerir; bunlar örneğin RNA metabolizması, transkripsiyon düzenlemesi veya sinyal iletimi 5,6 gibi önemli rolleri oynar. Çevresel ipuçlarına yanıt olarak bileşenleri oluşturma, çözme ve değiştirme yetenekleri, hücrelere lipid zarlarına ihtiyaç duymadan biyokimyasal aktiviteleri organize etmek için çok yönlü bir mekanizma sağlar.

Biyomoleküler kondensatların büyük bir alt kümesi, içsel olarak düzensiz bölgeler (IDR'ler) ve RNA bağlayıcı alanlar (RBD'ler) içeren RNA bağlayıcı proteinlerden (RBP'ler) kaynaklanır7,8. Bu proteinler tek başına veya RNA ile karmaşık olarak faz ayrılarak çeşitli madde özelliklerine ve biyolojik işlevlere sahip kondensatlar ortaya çıkarır. Örneğin, SARS-CoV-2 nükleokapsid proteini (N), viral genom paketleme ve montajında rol oynayan RNA'ya bağımlı biyomolekülerkondensatlar 9'u oluştururken, polipirimidin yol bağlama proteini 1 (PTBP1) ise gen susturulmasına katkıda bulunan nükleerkondensatlar oluşturur 10. Ayrıca, FUS ve DDX4 gibi proteinler, düzensiz bölgeleri tarafından yönlendirilen LLPS'ye uğrar ve RNA metabolizmasını ve stres granülleri oluşumunuetkiler 11,12. Bu süreçlerin düzensizliği, amiyotrofik lateral skleroz (ALS) ve frontotemporal demans gibi nörodejeneratif hastalıklarla bağlantılıdır; burada anormal faz geçişleri agregasyona ve fonksiyonkaybına yol açabilir 13.

Yoğuşma sadece proteinler ve protein-RNA kompleksleriyle sınırlı değildir. Tek başına RNA, özellikle birkaç nörodejeneratif bozuklukla ilişkili tekrar-genişleme dizileri bağlamında LLPS geçirebilir(14,15). Huntington hastalığında CAG veya miyotonik distrofiside CUG gibi trinükleotid ve heksanükleotid tekrar genişlemeleri, hem in vitro hem de hücrelerde damla benzeri kondensatlaroluşturabilir. RNA yoğuşmasının fiziksel temelini ve protein ve protein-RNA kaynaklı yoğunlaşmalardan nasıl farklı olduğunu anlamak, tekrarlanan genleşme hastalıklarının altında yatan moleküler mekanizmaları aydınlatmak için çok önemlidir.

Biyolojik önemlerine rağmen, biyomoleküler yoğunlaştırmaların nicel ve etiketsiz karakterizasyonu hâlâ zorlu bir zorluk16. Geleneksel floresan mikroskopisi ve spektroskopi teknikleri, biyomolekül yapısını, dinamiklerini veya faz davranışını bozabilecek dış etiketleredayanır 17,18. Ayrıca, bazı kondensatlar kısıtlı moleküler hareket ve geniş çizgi şekilleri nedeniyle NMR-görünmez olur ve bu da geleneksel NMR yaklaşımlarıyla erişilebilen bilgiyi sınırlar. Sonuç olarak, yoğunlaştırmaları etiketlemeden doğrudan iki fazlı, doğrağa benzer hallerinde inceleyebilen deneysel stratejilere acil ihtiyaç vardır. Damla faz sınırının değişim süreçlerinde ve kondensat olgunlaşmasında önemli rolü göz önüne alındığında, biyomoleküler damlaların belirli bir örnek hacmi içinde stabilize edilmesi de aynı derecede önemlidir; böylece yoğun fazın sedimentasyonu önlenir. Bu, sitoskeleti taklit eden agaroz hidrojelleri kullanılarak kolayca gerçekleştirilebilir.

NMR tabanlı metodolojilerdeki son gelişmeler böyle bir çözüm sunmaktadır. REDIFINE (REstricted DIffusion of INvisible speciEs)yaklaşımı 19 , difüzyon NMR'yi kimyasal değişim analiziyle birleştirerek protein ve protein-RNA kondensatlarında moleküler bölünme, değişim kinetiği ve damla boyutunu nicelikle ölçüyor. Tamamlayıcı olarak, CONDENSE-MT (SEmi-solid Magnetization Transfer ile CONdensate DEtectioN)tekniği 20 , su manyetizasyonu transferiyle NMR-görünmez kondensatları tespit eder; böylece belirli koşullarda yoğunlaşmış madde miktarının nicelendirilmesini sağlar ve kondensat içindeki hidrasyon dinamiği ile moleküler yuvarlanma hızlarını daha da ortaya çıkarır. Bu yöntemler birlikte, denge iki fazlı koşullarında çeşitli kondensat türleri, sadece protein, protein-RNA ve sadece RNA içeren kondensatların etiketsiz, invaziv olmayan incelemelerini mümkün kılar. NMR araç kutusunu genişleterek, kondensat yapısı, dinamikleri ve bunların biyolojik fonksiyon ile hastalıkla bağlantılarının sistematik, nicel olarak keşfedilmesine kapı açıyorlar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Numune hazırlama

  1. Tampon seçimi: Biyomoleküllerin en stabil olduğu test edilmiş tamponları kullanın.
    NOT: NMR sinyalleri genellikle düşük pH'larda daha güçlüdür. Teknik bir gereklilik olarak, tüm NMR örneklerine (son v/v) alan kilidi olarak %5 D2Oekleyin.
  2. Bifazik örneği, ortam olarak sitoskelet taklit eden agaroz hidrojel kullanarak stabilize edin. Aynı tamponda %1,5 (w/v) agaroz stoku hazırlamak için agaroz tozunu tartın. Daha yüksek sıcaklıklara dayanabilen doğası bozuk proteinler (IDP) ve RNA'lar tarafından oluşturulan biyomoleküler kondensatlar için daha ucuz bir alternatif olarak normal agaroz kullanın. Katlanmış domenler içeren hassas kondensatlar hazırlanırken düşük eriyen agarozkullanın 19.
  3. Agaroz stokunun hazırlanması: Süspansiyonu yaklaşık 80 °C'ye kadar 10 dakika boyunca ısıtın ve agarozu karıştırarak veya vorteksle tamamen çözürün.
    DIKKAT: Erimiş agaroz sıcaktır ve yanabilir; Isıya dayanıklı eldivenlerle tutun.
    NOT: Erimiş agarozu (örneğin, normal agaroz için 55 °C, düşük eriyen agaroz için 37 °C) su banyosunda sıcak tutun ve biyolojik numuneyle karışmadan önce sıvı kalmasını sağlar.
    Erimiş agaroz birkaç onlarca dakika sıcaktutulabilir 19,21.
  4. Son bifazli numuneyi hazırlayın:
    1. Agararoz hidrojel ile stabilize edilmiş bifazik bir örnek hazırlamak için, protein (ve/veya RNA) stoklarını ilgili sıcak agaroz tamponu ile 1,5 ml'lik bir mikrosantrifüj tüpünde karıştırın.
      NOT: NMR tespiti için nihai protein/RNA konsantrasyonu genellikle 50-500 μM'dir.
    2. Karışımı hemen uzun bir cam pipet kullanarak 3 mm NMR tüpüne aktarın. Agarozun transferden kısa süre sonra katılaşmasına izin verin.
      NOT: Agararoz olmadan, bifazik örnek zamanla birikir, bu da NMR veri toplama ve analizini zorlaştırır çünkü örnek deneyin zaman ölçeğinde fiziksel olarak değişir.
  5. Görsel inceleme yapın: Örneği görsel olarak inceleyin. Faz ayrımı gerçekleşirse, numune hemen bulanık görünür ve öyle kalır. Bu, iki fazlı numunenin agarozda başarıyla stabilize edildiğini gösterir.
  6. CONDENSE-MT çalıştırmayı planlarken, aynı adımları uygulayarak ek bir agaroz referans örneği hazırlayın, sadece biyomolekül eklemeyi bırakın. Aynı örnek hacmini elde etmek için tampon ekleyin. Bu örneği, kondensat örneğini hazırladıktan ve agaroz referans örneğinin uzun süre kuluçka edilmediğinden emin olmak için üzerindeki tüm verileri ölçtükten sonra hazırlayın.

2. REDIFINE deneylerinin kaydedilmesi

  1. Her zamanki gibi 1H kanalını kilitle, shim, eşleştirme ve ayarla. Genel prosedürünüzle 1H boyunca 90° darbe uzunluğunu kalibre edin.
  2. 1D su bastırılmış bir spektrum kaydedin. İdeal olarak güçlü biyomoleküler sinyal gözlemlenir (Ek Şekil 1A).
    1. Eğer sinyal gözlemlenmezse veya çok az sinyal gözlemlenmiyorsa, yoğunlaşmış protein/RNA'nın NMR olarak gözlemlenebilir olmadığını ve yoğunlaşmış faza bölünmenin yüksek olduğunu varsayın. Bu durumda, bu yöntem gözlemlenebilir bir biyomoleküler sinyale dayandığı için REDIFINE'e devam etmeyin.
    2. Bu durumda, prensipte CONDENSE-MT deneyleri çok iyi çalışmalı, bu yüzden hemen 4. Adıma (CONDENSE-MT deneylerinin kaydedilmesi) geçin.
  3. Bipolar gradyanlar (Bruker darbe dizisi: stebpgp1s19) kullanılarak geleneksel 2D Uyarılmış-Yankı prosedürüne dayanan geleneksel Difüzyon Sıralı Spektroskopi (DOSY) deneyini yükleyin. Daha fazla detay için Bruker DOSY ve Diffusion kullanım kılavuzlarına bakabilirsiniz.
  4. P0, P1 ve P27'yi kalibre edilmiş 90° darbe uzunluğuna ayarlayın. Genel kural olarak, NS 32 taramaya, DS 16, TD1 ile 16 tarama ve TD2 ile SW2 ayarları ile alınma süresi AQ 80-100 ms elde edilir. d1'i 1.5 saniyeye ayarlayın.
    NOT: Eğimler doğru şekilde kalibre edilmelidir.
  5. Manyetik alanınıza göre Watergate d19 gecikmesini her zamanki gibi optimize edin, aromatiklerde (yaklaşık 7 ppm) veya alifatiklerde (yaklaşık 1 ppm) maksimum uyarılma elde edersiniz. d20'yi 75 ms'ye ayarlayın. p30 seçimi protein/RNA boyutuna bağlıdır. Proteinler için >20 kDa, 5 ms kullanın; Daha küçük proteinler için ise genel kural olarak 3,5 ms kullanın.
  6. 'xau dosy 2 95 16 l y y' komutuyla bir DOSY deneyi kaydedin; bu deney, difüzyon gradyanı gücünü %2'den %95'e kadar 16 adımda doğrusal bir şekilde dizilir.
    1. İdeal olarak, sinyalin ilk çöküşü seyreltilmiş fazdan kaynaklanırken, yoğunlaşmış faz sinyalinin çöküşü sabit kalmalıdır (Şekil 1A ve Ek Şekil 1B).
  7. Tam REDIFINE seti için veri toplamaya devam etmek için, az önce çalıştırdığınız ilk setin parametrelerini kopyalayarak 9 yeni stebpgp1s19 oluşturun. Her ardışık deneyde, yalnızca d20 difüzyon gecikmesini değişken adımlarla değiştirerek 100–1000 ms aralığını (yani 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 700, 1.000 ms) kapsayabilir.
  8. Bu deneylerin her birini 'xau dosy 2 95 16 l y n' komutuyla çalıştırın. Son "n", alıcı kazancının 10 deney boyunca korunmasını sağlar.

3. REDIFINE veri setlerinin işlenmesi ve sonuçların görselleştirilmesi

  1. Her deneyi (toplamda 10 tane) aşağıdaki şekilde işleyin:
    1. SSB 2'nin qsine pencere fonksiyonu olarak ayarlanır, 5. dilimi qsin ile çıkarır; FP, 1D'yi aşamaya geçirip faz parametrelerini 2B veri setine kaydeder.
    2. Sonra 2D'yi xf2 ile işlemin, temel düzeltme abs2 yapın ve bu 16 dilimi split2D ile çıkarın (açılır pencerede ek girişler: r – 16 – 11). Bu, farklı gradyan güçleriyle elde edilen 16 spektrumu çıkaracak ve bunları aynı veri setinde 11'den 26'ya kadar 1B işlenmiş deneyler olarak kaydedecektir.
    3. Kalan 9 deney için de aynı şeyi tekrarlayın. Bazen en az ilk 4-5 dilimi kontrol etmek ve faz ve temel düzeltmenin doğru olduğundan emin olmak çok önemlidir. Gerekirse, manuel olarak düzeltme yapın – iyi bir faz ve temel belirleme doğru nicelik için ön koşullardır (Şekil 1B).
  2. Analiz için sağlanan Matlab kodunu LLPS_REDIFINE_fit kullanın (Ek Şekil 2A). Kodda, deneylerinize göre şunları ayarlayın: 'Delta' (difüzyon çarpı d20), 'P.d' (toplam gradyan süresi 2*p30), exp(1,:)'den exp(10,:)'e, yaptığınız deneylerin # değerine göre değişir. Sonra prob gradyan güçlerine göre P.g'yi ayarlayın (TopSpin deney klasöründe "difflist" dosyasının altında erişilebilir).
  3. 'Klasör' ve 'yol' seçeneklerini veri konumunuza göre ayarlayın. Kodu 40. satıra kadar çalıştır. Bu size 1D dilimi verir – buradan entegrasyon bölgelerini seçin; Bunlar aromatikleri veya alifatikleri kapsaymalı ve bölgeyi mümkün olduğunca dar seçmelidir; amidler gibi farklı moleküler grupları hesaba katmamak gerekir.
  4. Entegrasyon sınırlarını 'sol' ve 'sağ' değişkenlerindeki noktalarla buna göre girin (Ek Şekil 2A). Bu, nicel analiz için verileri entegre etmek için yapılmıştır (Şekil 1C). Matris adını örneklemenize, çalışma tarihinize ve bazı deneysel ayrıntılara göre seçin.
  5. Tüm kodu çalıştır. 'fit0' bölümünde, optimizasyon fonksiyonunun küçültmeyi başlatmak için kullanacağı başlangıç parametrelerini seçebilirsiniz. Varsayılan değerlerle başlayın, eğer yakınsama sağlanmazsa, ikinci fit0 değerini (yoğunlaştırılmış fazdaki popülasyon) 0.1 adımlarla 0.1'den 1'e değiştirin.
    NOT: Bazen veri setinin birkaç yerel minimumu vardır ve daha küresel minimuma yaklaşmak için başlangıç parametrelerini kapsamlı şekilde değiştirmek gerekir.
  6. Tatmin edici uyum sağlandığında, uyum değerleri şekil içinde yazılır (Şekil 1D ve Ek Şekil 2B) ve değişken 'uyum'da erişilebilir. Daha iyi görselleştirme için bu parametreleri istatistik grafiki olarak daha da çizin.

4. CONDENSE-MT deneylerinin kaydedilmesi

NOT: Deneyin amacı, protondeğişimi 20 aracılığıyla çözücü su sinyalinde dendensatları dolaylı olarak tespit etmektir. CONDENSE-MT deneyinde, bir parmak izi TT profili alınır ve analiz edilir (Şekil 2A)20.

  1. Favori 1D su bastırılmış spektrumu kaydedin. Çok az sinyal gözlemlenirse, CONDENSE-MT deneyinin çok iyi çalışması çok muhtemeldir.
  2. Nicel CONDENSE-MT analizi, suyun R1 oranının önceden belirlenmesini gerektirir. T1 ters geri kazanma ile R1 hızını belirleyin. Verilen darbe dizisini, Bruker parametre setini ve vd listesini ilgili klasörlere kopyalayın. "T1_inversion_recovery" parametre setini yükleyin ve güç ile frekansları NMR spektrometrenize göre ayarlayın ("edprosol"a göre).
    1. 1H 90° darbesini (p1) kalibre edin, NS 2, DS 0, d1 20 s, SW 10 ppm, TD2 16k ve TD1 24 (ayarlanmış vd listenizin uzunluğu üzerine) ayarlayın. Radyasyon sönümleme etkilerini önlemek için Z boyunca zayıf bir gradyanı etkinleştirin (GPZ0 = %0,1).
  3. CONDENSE-MT deneyi için,
    1. Verilen Bruker parametre setini, sırasını ve frekans listesini Bruker'a özgü klasörlere kopyalayın, "CONDENSE-MT" parametre setini yükleyin ve frekansları ve güçleri spektrometrenize göre ayarlayın.
    2. Radyasyon sönümünü önlemek için P1'i kalibre edilmiş 90° darbe uzunluğuna, P4'ü ise uyarılma darbesi için 1 μs olarak ayarlayın. NS 2, DS 16, d1 4 s, SW2 20 ppm, TD2 8k ve TD1 frekans listesinin uzunluğu (genellikle 46) olarak ayarlanır. SPNAM10 Squa100.1000 olarak ayarlanır ve süresi p10 ile 5 saniye arasında olur.
    3. 100 Hz ışın sağlamak için SP10 gücünü bulun ('darbe 100 Hz' komutu gücünü hem watt hem dB olarak hesaplar). SP10 radyasyon darbesinin gücünü buna göre ayarlayın ve 'zg' komutunu kullanarak bu sözde 2D deneyi yürütün.
      NOT: Deney, su sinyalini farklı radyasyon ofsetlerinde tespit etmek için su ile açık rezonansa (100000 Hz) kadar uzanan ışık değişimlerini kapsayan ışık değişimlerini kapsayan frekans listesini kullanacaktır (Şekil 2B). Su integrallerinin bir grafigi (spektrumların doğru fazalmasını sağlar; Şekil 2C) Işıtım ofseti açısından Şekil 2A'da gösterilen CONDENSE-MT profili elde edilir.
  4. 7 yeni deney oluşturun ve her ardışık deneyde, sadece ışın gücünü artırarak 170 Hz'den 1000 Hz'e kadar olan aralığı kaplayın (yani 170, 250, 330, 500, 650, 780, 1.000 Hz). Her deneyde, önceki noktadaki komutu kullanın. Her doygunluk gücü için tüm ofset listesi elde edilir (Şekil 2D).
    NOT: YOĞUNLAŞMA-MT uyumu yalnızca agaroz içeren örnekte (biyomoleküler kondensatlar içermeyen ortam) elde edilen referans verilerini gerektirir. Örnek hazırlama ile veri toplama arasında aynı zaman aralığını sağlamak ve bir agaroz referans örnek üzerinde 8 deneyden oluşan aynı veri setini elde etmek. Bu, hem agarose referansının hem de iki fazlı örneğin aynı süre kuluçka içinde bulunmasını sağlamak içindir.

5. CONDENSE-MT veri setlerinin işlenmesi ve sonuçların görselleştirilmesi

  1. Her CONDENSE-MT deneyini (toplam 8 tane, Ek Şekil 3A) aşağıdaki şekilde işleyin.
    1. SSB 2'nin qsine pencere fonksiyonu olarak ayarlanır, 46. dilimi qsin ile çıkarır; FP, su zirvesini 1D olarak fazlayın ve faz parametrelerini 2D veri setine kaydeder, ardından 2D'yi xf2 ile işler ve bu 46 dilimi split2D ile çıkarır (açılır pencerede ek girdiler: r – 46 – 11).
      NOT: Bu, farklı ışın ofsetleriyle elde edilen 46 1D spektrumu çıkaracak ve bunları aynı veri setinde 11'den 56'ya kadar 1D işlenmiş deneyler olarak kaydedecektir (Ek Şekil 3A, 1000 Hz CONDENSE-MT deneyi için gösterilmiştir).
    2. Kalan 7 deney için de aynı işlemi tekrarlayın. Her deneyden birkaç dilim kontrol edilince faz ve temel çizginin doğru olduğundan emin olun (Şekil 2C). Gerekirse, manuel olarak düzeltin – iyi bir faz ve temel hesaplama doğru nicelik için ön koşullardır!
  2. Agaroz referans örneği kullanılarak elde edilen verilerde ve ters dönme geri dönüş deneylerinde aynı adımları tekrarlayın; faz için 24. dilimi çıkarıp split2D (r – 24 – 11) kullanın.
  3. Elde edilen verileri sağlanan Matlab koduyla uyarlayın. Senaryodaki özel talimatları takip edin.
  4. Yoğunlaşma yokken arka plan parametrelerini elde etmek için önce agaroz referans örneği için uyum analizi yapılmalıdır. read_CONDENSE_MT_data kodu önce işlenen NMR verilerini okur ve su rezonans sinyalini split2D komutuyla oluşturulan 1D dilimlere entegre eder (Ek Şekil 3B).
  5. Entegrasyon sınırlarını bireysel olarak belirleyin; entegrasyon sınırlarını değerlendirmek için Matlab'da referans 1B spektrum çizilecektir (Ek Şekil 3C). Kod, verileri daha da normalleştirecek ve suyun normalleştirilmiş integrallerini ışınlanma ofseti ve güç fonksiyonu olarak CONDENSE-MTmodel 20'ye uyduracaktır. read_CONDENSE_MT_data , normalize edilmiş integralleri değişken integral_water_real_all'de saklar, bu da sonraki montaj için kullanılır.
  6. CONDENSE-MT verilerini takmadan önce agaroz veya yoğunlaşma varlığında suyun R1 gevşeme oranını belirleyin.
    NOT: Su tersine geri kazanma deneyinin uydurulması, CONDENSE-MT_full Matlab bebesinin (veya agarose referans verisi durumunda CONDENSE_MT_referenceMTpool scriptinin) ilk bölümünde yapılabilir. Deneyin dosya adı ve yolu ile deneyin deney kimliği girilerek Inversion_Recovery Matlab betikleri çalıştırılabilir (Ek Şekil 4A, bölüm 1). Gerekirse, 1D dilim sayısı ve entegrasyon sınırları bu betikte ayarlanabilir; ikincisi, TopSpin'de kullanılan işlem parametrelerine bağlıdır. Bu bölüm, suyun R1 oranını belirleyecek ve CONDENSE-MT verilerinin sonraki uydurulması için gerekli olan P.R1w değişkeninde depolayacaktır.
  7. Agaroz verileri için, CONDENSE_MT_referenceMTpool bebesini kullanarak ( function_1MT fonksiyonunu çağıran) normalize integralleri kullanın.
  8. Yoğunlaşmış örnek üzerinde elde edilen verilerin küresel uyumu için agarozun uyarlanmış parametrelerini kullanın (Ek Şekil 4A). Bu, agaroz örgüsünün fiziksel özelliklerini uyuma sabit değerler olarak sabitleyerek, agaroz örgüsüne gömülü kondensat ile yapılan ek etkinin nicelendirilmesine olanak tanır (Şekil 2E).
  9. Yoğunlaştırma nicelileştirmesini, function_2MT Matlab fonksiyonunu çağıran CONDENSE-MT_full bebeğiyle yapın. Hesaplamalı optimizasyon için başlangıç parametreleri fit0 üzerinden verilir (Ek Şekil 4B). Uyumun parametre belirsizliği, varyans-kovaryans matrisi türetilecek Jacobian matris ile hesaplanır (Ek Şekil 4B).
  10. Uyumun kalitesini, deneysel verilerden model tahmininin kalıntı sapmasına benzer uyum sapmasına göre değerlendirin. Daha fazla kalite kontrolü için, uyumu deneysel verilerle birlikte çizin (Ek Şekil 4C).

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada tanımlanan LLPS REDIFINE protokolü, FUS N-terminal alanına (NTD) uygulanmıştır. FUS NTD, ortam koşullarında mikromolarkonsantrasyonları 19,21'de kolayca faz ayrılır. Bu özel örnek, pH 7,5'te 200 mM KCl içeren 30 mM HEPES tamponu içinde 200 μM konsantrasyonda hazırlanmış, %0,5 düzenli agaroz içermektedir. Faz ayrıldığında, FUS NTD sinyalleri yoğunlaşmış fazda gözlemlenebilir kalır (Şekil 1A,B). Bu da LLPS REDIFINE için mükemmel bir aday olmasını sağlar. Yani, LLPS'ye yatkın olan proteinlerin çoğu, genellikle yoğunlaşmış fazda gözlemlenebilir kalan uzun ve içsel olarak düzensiz bölgeler içerir; ancak daha yapılandırılmış proteinlerde durum böyle değildir.

REDIFINE uyumu (Şekil 1D ve Şekil 3A,B) bu FUS NTD örneği için birden fazla benzersiz parametre ortaya koydu. Özellikle, seyreltilmiş ve yoğunlaşmış fazdaki difüzyon katsayılarını (Ddil ve Dcond), yoğunlaşmış fazdaki protein popülasyonunu (νcond), ortalama damla boyutu R'yi ve fazlarsı geçirgenliği p'yi belirlemiştir. Damla boyutu ve geçirgenlik, yoğunlaştırılmış faz kcd=3p/R arasındaki faz değişim kurunu tanımlar; böylece değişim dinamiklerihakkında bilgi edinebiliriz 19.

Bu sonuçlar farklı şekillerde görselleştirilebilir (Şekil 3B). Örümcek grafiki kullanılarak, farklı koşullar veya örnekler arasında sonuçlar karşılaştırılabilir. Öte yandan, modelde REDIFINE parametrelerini en etkili şekilde görselleştirmek için resimsel olarak temsil edilebilir. REDIFINE'ın tüm bu sonuçları etiketsiz sadece birkaç saat içinde sadece bir örnekle sağladığını unutmayın.

FUS NTD'nin NMR sinyali yoğunlaşmış fazda algılanabilir kaldığı için (Şekil 3C), CONDENSE-MT muhtemelen gevşeme kontrastının olmaması nedeniyle uygulanamayacak. CONDENSE-MT veri setini FUS NTD üzerinde kaydettik ve gerçekten de, agaroz referansı ile FUS NTD bifazik örneklemi arasında MT profilinde herhangi bir fark gözlemlenmemiştir (Şekil 3C). Bu durum, CONDENSE-MT metodolojisini bu özel FUS NTD örneği için uygulanamaz hale getirir.

Ancak CONDENSE-MT, tekrar genişleme RNA kondensatlarının dinamik karakterizasyonunu sağlar (Şekil 3C,D)20. CONDENSE-MT'nin, sinyalinin geleneksel NMR'de gözlemlenememesine rağmen, yoğunlaşmış fazda RNA'yı benzersiz şekilde karakterize eden birden fazla parametre sağlayabileceğini (Şekil 3C) not edin. Elde edilen parametreler, yoğunlaşma ile toplu su arasındaki proton değişim kinetikleri (kkondensat, H2O ve kH2O, kondensat), yoğuşma sırasında biyomoleküllerin dinamik tutulma derecesini yansıtan kondensatın T2 gevşeme hızı (T2, kondensat) ve toplu suyun görünen R2 oranıdır (R2, su).). Bu son parametre, hacimli su, seyreltilmiş su ve yavaş dönen yoğunlaşmış suyun yuvarlanma hızının doğrusal bir kombinasyonudur. Daha yüksek R2, su değerleri, kondensatta daha yüksek su popülasyonunu gösterir ve bu da görünen toplam su R2 oranını20 artırır (Şekil 2E ve Şekil 3D).

VERI VE KOD ERIŞILEBILIRLIĞI

LLPS REDIFINE ham veri ve işleme kodları Zenodo deposunda mevcuttur: https://doi.org/10.5281/zenodo.15228787 . CONDENSE-MT ham veri ve işleme kodları Zenodo deposu https://doi.org/10.5281/zenodo.15789697'a depo olarak depolanmıştır. İşlem için MATLAB gereklidir. Ayrıca bu makalede (Ek Kodlama Dosyaları) sunulmaktadır.

figure-results-1
Şekil 1: REDIFINE iş akışı. (A) Difüzyon ölçümleri, yoğunlaşmış örneklerde karmaşık bifazik difüzyon bozunma eğrileri verir. Ortaya çıkan çürüme, türlerin yoğunlaşmış ve seyreltilmiş fazdaki difüzyon katsayılarını, popülasyonlarını, damla boyutlarını ve fazlar arası değişim oranını tanımlayan dekonvolved parametreler içerir. (B) Bu izole parametreleri çözmek için, sadece gradyan gücünü değil, difüzyon gecikmelerini de değiştirerek bir pseudo-3B veri seti kaydedilmesi gerekir. Bu ölçümlerden alınan her dilimin doğru şekilde aşamalandırılması ve temel düzeltme yapılması nicelik için kesinlikle gereklidir. (C) Ölçülen ve işlenen verilerin kalitesi kontrol edildikten sonra, bu 1B dilimler analiz ve nihai grafik için MATLAB koduna beslenir. (D) Veriler daha sonra doğrusal olmayan bir programlama çözücüsü tarafından uyarlanır. Uyum ve ortaya çıkan parametreler, bifazik FUS NTD örneği için gösterilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: CONDENSE-MT iş akışı (A) Su rezonansında gözlemlenen benzersiz bir CONDENSE-MT profili, yoğunlaşmış biyomoleküller ve su varlığından kaynaklanan genişlemeyi gösterir. (B) Her ışın ofseti için su gözlemlenir. (C) Nicel ölçüm için, tüm spektrumların doğru şekilde faz alması şarttır. (D) Farklı ışıklandırma ofsetlerinde su rezonansı alındıktan sonra, deney farklı radyasyon güçlerinde tekrarlanır. Bu, hem ışınlanma ofseti hem de radyasyon gücü (E) fonksiyonu olarak göreceli su sinyalinin veri setini elde eder. Veriler daha sonra doğrusal olmayan bir programlama çözücüsü tarafından uyarlanır. Uyum ve ortaya çıkan parametreler, bifazlı 31xCAG RNA örneği için gösterilmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: REDIFINE ve CONDENSE MT sonuçlarının sunumu. (A) Örnekler veya koşullar arasında karşılaştırmalı analiz için REDIFINE parametrelerinin örümcek grafik temsili. (B) Difüzyon katsayıları, damla yarıçapı, bölme ve fazlar değişim kuru gibi REDIFINE türevinden türetilmiş parametreleri gösteren şematik model. (C) 500 Hz ışınımda agarozda agaroz referansı ve bifazik FUS NTD için elde edilen CONDENSE-MT profillerinin karşılaştırılması.
(D) 31xCAG tekrar-genleşme RNA kondensatlarının CONDENSE-MT analizi, parametre çıkarımı ve kondensatla ilişkili manyetizasyon transfer etkilerinin görselleştirilmesini gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: REDIFINE kurulumu. (A) FUS N-terminal domain, iki fazlı yoğunlaştırılmış örnek hazırlandığında gözlemlenebilir kalır. Güçlü bir amid/amino ve aromatik proton sinyali gözlemlenir. (B) Difüzyon DOSY deneyinde gözlemlenen sinyal bozunması, seyreltilmiş faz protein popülasyonunun daha hızlı bozulmasını ve yoğunlaştırılmış fazda proteinin daha yavaş parçalanmasını gösterir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: REDIFINE işleme. (A) REDIFINE uyumu için kullanılan Matlab kodu, belirli girdi gerektiği yerlerde vurgulanmış parametrelerle. İnset, entegrasyon alanının nasıl seçildiğini gösterir. (B) Uyum fonksiyonunun en aza indirilmesi ve bunun sonucunda ortaya çıkan sonuçlar. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: YOĞUNLAŞMA-MT kurulumu. (A) CONDENSE-MT analizi için gereken NMR deneylerinin genel özeti; bunlar arasında su tersine çevirme-geri kazanım deneyi (expno. 5) ve farklı radyasyon güçlerinde CONDENSE-MT deneyleri (expno 11-18) yer alır. (B), (C) CONDENSE-MT veri setleri için su 1D spektrumlarını okumak ve entegre etmek için Matlab scriptinin genel özetleri. CONDENSE-MT deneyleri ana – ana olarak verilir. Entegrasyon sınırları water_left ve water_right olarak girilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 4: YOĞUNLAŞTIRMA-MT işleme. (A) CONDENSE-MT uyum senaryosunun ilk bölümü, su tersine geri kazanma uyumunu (bölüm 1) ve önceden belirlenmiş agaroz arka plan parametrelerinin girişini içerir. (B) CONDENSE-MT veri setlerinin uyum ve parametre belirsizliği belirlemesi. Uyum için başlangıç parametreleri fit0 içinde ayarlanabilir. (C) CONDENSE-MT uyum sonucunun çizim bölümü. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Kodlama Dosyaları: REDIFINE ve CONDENSE-MT Analizi için MATLAB Scriptleri. Bruker Topspin kodları, CONDENSE-MT deneyini ve REDIFINE difüzyon veri setlerini işlemek ve uydurmak için kullanılan MATLAB betiklerini ve CONDENSE-MT manyetizasyon-transfer veri setlerini kurmak için kullandı; veri entegrasyonu, gevşemasyon analizi ve küresel model uyum rutinleri dahil. Scriptleri çalıştırmak için MATLAB gereklidir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, iki fazlı biyomoleküler kondensatların etiketsiz, NMR karakterizasyonu için ayrıntılı protokoller sunduk. Bunlar, LLPS REDIFINE ve tamamlayıcı ama ortogonal bir deney olan CONDENSE-MT adlı iki yeni metodolojiyi içerir. Genel olarak uygulanabilir olsa da, LLPS REDIFINE biyomoleküler algılamaya dayanır ve doğru analiz için faz ayrımı sırasında gözlemlenebilir bir sinyal gerektirir. Bu durum REDIFINE'in uygulanabilirliğini sınırlayabilir, ancak kondensatların çoğu, genellikle NMR ile gözlemlenebilen içsel olarak düzensiz bölgelere sahip proteinler içerir. Özellikle, protein:RNA ve sadece RNA içeren kondensatlar için, yoğunlaşmış fazdaki biyomoleküllerin sinyali faz ayrımı sırasında tespit sınırlarının ötesine genişler. Yoğunlaştırılmış faza bölünme katsayısı yüksekse, geleneksel NMR ile neredeyse hiçbir sinyal gözlemlenmez. CONDENSE-MT, suda gözlemlenen ve seyreltilmiş fazlarda moleküler türler arasında önemli bir gevşemasyon farkına dayanan bir su gözlem tekniği olarak bu algılama sınırlamasını aşmaktadır.

Doğru örnek hazırlanması, hem REDIFINE hem de CONDENSE-MT'nin başarılı uygulanması için anahtardır. Bu nedenle, agarozun karışıma aktarmadan önce tamamen erimiş olduğundan emin olmak, transfer sırasında yoğun hava kabarcıkları oluşumunu önlemek ve NMR tüpünü ilk başta cam duvara yapışan bifazik karışımlarla güvenilir şekilde doldurmak için yeterli malzeme sağlamak önemlidir. CONDENSE-MT için, belirli bir agaroz hacmini tekrarlanabilir şekilde aktarmak çok önemlidir, çünkü agaroz arka planı ayrı olarak nicelendirilecektir. Biyomoleküllerin yoğunlaşmış ve seyreltilmiş fazlar arasında bölünmesi oldukça çarpıksa, ya da fazlar arası değişim çok yavaş veya hızlıysa, REDIFINE veya CONDENSE-MT etkileri yok olabilir veya güvenilir nicelik için çok zayıf olabilir. Bu, bu tekniklerin temel bir sınırlaması gibi görünebilir. Ancak böyle bir durumda, sıcaklığın artırılması veya düşürülmesi yardımcı olabilir, çünkü sıcaklık moleküler bölünme ve kimyasal değişim oranlarının güçlü bir modülatörüdür. Veri setleri edinildikten sonra, optimal uyum sonuçları genellikle ilk veya önceki uyumdan en iyi uyum parametreleri giriş değerleri olarak kullanılarak hesaplamalı optimizasyonun tekrarlanmasıyla yinelemeli olarak elde edilir.

Güçlü REDIFINE ve CONDENSE-MT etkileri veren sistemler için, bu deneyler diğer etiketsiz yöntemlerle elde edilmesi zor olan moleküler bölünme, döviz kurları ve moleküler dinamikler hakkında etiketsiz içgörüler sağlayabilir. Ayrıca, NMR tabanlı yöntemler genellikle invaziv değildir; örneklerin birden fazla kez analiz edilmesini veya uzun süre saklanmasını sağlar; böylece kondensat özellikleri zamanla izlenebilir. Bu özellikle, fibrilizasyonun patolojik kondensatla olgunlaşması bağlamında ilgi çekicidir; bu durum, çok uzun zaman dilimlerinde tamamlayıcı yöntemlerle incelenmesi zordur.

Membransız hücresel organellerin genellikle karmaşık mimariye sahip çok bileşenli yapılar olduğu göz önüne alındığında, bu tekniğin gelecekteki uygulamaları giderek daha gelişmiş çok bileşenli kondensat model sistemlerinin tespiti ve karakterizasyonunu ile hücre içi NMR aracılığıyla hücresel bağlamda kondensat analizlerini içerecektir. Ancak bu, REDIFINE veya CONDENSE-MT'nin bu karmaşık sistemlere uyarlanmasını gerektirir ve bunu başarmak için çabalar devam etmektedir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (SNSF) 310030-215555 (F.H.-T.A.), 4078P0_198253 (F.H.-T.A.), CRSII5_205922 (F.H.-T.A.), 205321_204920 (F.H.-T.A.) ve NCCR RNA ve Hastalık hibesi 51NF40-182880 (F.H.-T.A.) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
700 Mhz Avance NEO NMR spektrometresiBruker Biospinhttps://www.bruker.com/en.htmlVeriler 700 MHz NMR spektrometresinde elde edilir.
TopspinBruekr Biospinhttps://www.bruker.com/en.htmlVeriler bu yazılım kullanılarak işlenir.
FUS NTD proteiniYokBu protein laboratuvarımızda ifade edilip arıtılır
31xCAG RNAYokRNA laboratuvarımızda üretilir ve arındırılır
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.htmlVeriler bu yazılım kullanılarak işlenir ve görselleştirilir.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18 (5), 285-298 (2017).
  2. Alberti, S. Phase separation in biology. Curr. Biol. 27, R1097-R1102 (2017).
  3. Mehta, S., Zhang, J. Liquid–liquid phase separation drives cellular function and dysfunction in cancer. Nat. Rev. Cancer. 22 (4), 239-252 (2022).
  4. Boeynaems, S., et al. Protein phase separation: a new phase in cell biology. Trends Cell Biol. 28 (6), 420-435 (2018).
  5. Mitrea, D. M., Kriwacki, R. W. Phase separation in biology; functional organization of a higher order. Cell Commun. Signal. 14 (1), 1(2016).
  6. Brangwynne, C. P., Mitchison, T. J., Hyman, A. A. Active liquid-like behavior of nucleoli determines their size and shape in Xenopus laevis oocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (11), 4334-4339 (2011).
  7. Borcherds, W., Bremer, A., Borgia, M. B., Mittag, T. How do intrinsically disordered protein regions encode a driving force for liquid–liquid phase separation. Curr. Opin. Struct. Biol. 67, 41-50 (2021).
  8. Langdon, E. M., Gladfelter, A. S. A new lens for RNA localization: liquid-liquid phase separation. Annu. Rev. Microbiol. 72 (1), 255-271 (2018).
  9. Perdikari, T. M., et al. SARS-CoV-2 nucleocapsid protein phase-separates with RNA and with human hnRNPs. EMBO J. 39 (24), e106478(2020).
  10. Sola, I., et al. The polypyrimidine tract-binding protein affects coronavirus RNA accumulation levels and relocalizes viral RNAs to novel cytoplasmic domains different from replication-transcription sites. J. Virol. 85 (10), 5136-5149 (2011).
  11. Murthy, A. C., et al. Molecular interactions underlying liquid–liquid phase separation of the FUS low-complexity domain. Nat. Struct. Mol. Biol. 26 (7), 637-648 (2019).
  12. Yuwen, T., Brady, J. P., Kay, L. E. Probing conformational exchange in weakly interacting, slowly exchanging protein systems via off-resonance R1ρ experiments: application to studies of protein phase separation. J. Am. Chem. Soc. 140 (6), 2115-2126 (2018).
  13. Patel, A., et al. A liquid-to-solid phase transition of the ALS protein FUS accelerated by disease mutation. Cell. 162 (5), 1066-1077 (2015).
  14. Jain, A., Vale, R. D. RNA phase transitions in repeat expansion disorders. Nature. 546 (7657), 243-247 (2017).
  15. Wadsworth, G. M., et al. RNAs undergo phase transitions with lower critical solution temperatures. Nat. Chem. 15 (12), 1693-1704 (2023).
  16. Alberti, S., Gladfelter, A., Mittag, T. Considerations and challenges in studying liquid–liquid phase separation and biomolecular condensates. Cell. 176 (3), 419-434 (2019).
  17. Dörner, K., et al. Fluorescent protein and peptide tags alter condensate formation and dynamics in vivo and in vitro. EMBO Rep. 27, 89-121 (2026).
  18. Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. Choose your label wisely: water-soluble fluorophores often interact with lipid bilayers. PLoS One. 9 (2), e87649(2014).
  19. Novakovic, M., et al. LLPS REDIFINE allows the biophysical characterization of multicomponent condensates without tags or labels. Nat. Commun. 16 (1), 4628(2025).
  20. Schmoll, J., Novakovic, M., Allain, F. H. T. Water-detected NMR allows dynamic observations of repeat-expansion RNA condensates. Nat. Chem. 17 (11), 1785-1794 (2025).
  21. Emmanouilidis, L., et al. NMR and EPR reveal a compaction of the RNA-binding protein FUS upon droplet formation. Nat. Chem. Biol. 17 (5), 608-614 (2021).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

S v S v Faz Ayr masDif zyon De i imiREDIFINE Y ntemiCONDENSE MTMolek ler De i im H zlarFaz S n rHidrasyon Dinamikleri

İlgili makaleler