Akut Miyeloid Lösemide Kemoterapi Direnci İmzalarını Belirlemek İçin Kemik Iliği Örneklerinin Transkriptomik Profili ve Biyoinformatik Analizi

Özet

Bu protokol, akut miyeloid lösemi (AML) içindeki transkriptomik değişiklikleri analiz etmek için standartlaştırılmış bir biyoinformatik iş akışı sunar. Amaç, yeni teşhis edilen ve nüks kemik iliği örneklerini karşılaştırmak ve kemoterapi direnci ile hastalık ilerlemesiyle ilişkili moleküler imzaları sonraki araştırmalar için önceliklendirmektir.

Özet

Akut miyeloid lösemi (AML), nüks ve edinilmiş kemodirenç tedavisinin başarısızlığının başlıca nedenleri olarak kaldığı son derece heterojen bir hematolojik malignitedir. Bu makale, kemik iliği aspiratlarının transkriptomik analizi için biyoinformatik bir protokol sunmaktadır. Protokolün temel amacı, nüks AML'de hastalık ilerlemesi ve tedavi direnciyle ilişkili moleküler imzaları belirlemek için standart bir iş akışı sağlamaktır. Bu hatt, eşleşmemiş kemik iliği örneklerinin karşılaştırılması için yapılan hesaplama prosedürlerini detaylandırıyor; bu prosedürler beş yeni teşhis edilen vaka ve dört nüks vakadan alınan dizileme verileri kullanılarak gösteriliyor. Bu yöntem, RNA dizileme verilerinin işlemesi, farklı gen ekspresyonu analizi yapılması ve sonraki fonksiyonel değerlendirmelerin yapılması için temel adımları belirler. Bu iş akışının uygulanması, bu temsilci veri setinde nüks ile ilişkili aday transkriptler olarak FOXC1, HOXA11, HOXA11-AS ve AXL dahil olmak üzere 2.025 farklı şekilde ifade edilen gen (DEG) tespit edildi. Fonksiyonel ve ağ analizleri, küçük GTPaz sinyalizasyonu, inflamatuar sinyalleşme, hücre dışı matris etkileşimleri ve RNA biyosentetik süreçleriyle ilgili gen setlerini ve etkileşim merkezlerini daha da önceliklendirmiştir. Genel olarak, bu metodoloji, nüks AML ile ilişkili transkriptomik imzaların haritalanması ve sonraki deneysel doğrulama gerektiren hipotezlerin oluşturulması için tekrarlanabilir bir hesaplama boru hattı sağlar.

Giriş

Akut miyeloid lösemi (AML), hematopoietik kök/progenitör hücrelerden kaynaklanan klonal malign neoplazmalar grubudur ve kemik iliğinde olgunlaşmamış miyeloid hücrelerin anormal şekilde çoğalması ve hematopoietik farklılaşmanın^{baskılanması 1,2,3} ile karakterize edilir. Mevcut standart indüksiyon kemoterapisi (örneğin sitarabin ve antrasiklinlerin birleşimi) çoğu hastada tam remisyona yol açabilse de, nüks oranı %50–%70 arasında kalmaktadır ve nüks hastaların prognozu önemli ölçüde ^{düşmüştür 4,5,6}. Edinilmiş kemoterapi direnci, AML tedavi başarısızlığıyla ilişkilidir ve bu süreçle bağlantılı moleküler imzaların derinlemesine analiz edilmesini gerektirir; böylece tedavi stratejileri ve hasta sağ kalma oranları ^7,8.

Daha geniş literatürde, mevcut çalışmalar AML'de kemoterapi direncinin sadece ilaç akış pompalarının veya anormal ilaç metabolizmasının yukarı regülasyonu ile sınırlı olmadığını, aynı zamanda lösemi kök hücrelerinin (LSC) hayatta kalma koruması, hematolojik niş içinde epitelal-mezenkimal geçiş (EMT) benzeri fenotiplerin oluşumu ve kemik iliği mikroçevresiyle etkileşimlerle^{de bağlantılı olduğunu göstermektedir 9, 10,11}. Örneğin, LSC popülasyonları yüksek kendini yenileme kapasitesi ve sakinlik gösterir; bu da hücre döngüsüne özgü kemoterapötik ajanlara karşı doğuştan^{dirençle ilişkilidir 12}. Ayrıca, AXL gibi reseptör tirozin kinazların yukarı regülasyonu, FLT3-ITD+ AML'de dirençle ilişkilendirilmiştir; bu dirençle birlikte PI3K/AKT ve MAPK yollarının aktivasyonu ve anti-apoptotik yeteneklerin artmasıyla^{birlikte gerçekleşmiştir 13,14}. Metabolik yeniden programlama ve epigenetik yeniden modellenme de direnç oluşumunda önemli düzenleyici eksenler olarak kabul edilmiştir. Kanıtlar, AML hücrelerinin nüks sırasında kemoterapi kaynaklı oksidatif stres ve DNA hasarına gelişmiş oksidatif fosforilasyon (OXPHOS) aktivitesi, modüle edilmiş NAD⁺/NADH oranları ve değişen histon modifikasyon^durumları 15,16,17 yoluyla adapte olabileceğini göstermektedir. Kemik iliği mikroçevresindeki IL-6 ve CXCL8 gibi inflamatuar faktörler, genellikle STAT3/NF-κB sinyal yolları ^11,18'in aktivasyonuyla koordineli olarak gerçekleşen LSC sağ kalma ve kemoterapi direnciyle ilişkilidir.

Bu bilinen mekanizmalara rağmen, AML nüksü ve kemodirençle ilişkili transkriptomik değişiklikler, özellikle metabolik, epigenetik ve kemik iliği mikroçevre ile ilgili sinyaller klinik örneklerde birlikte değerlendirildiğinde, tam olarak karakterize edilmemiştir. Bu iş akışı, ilk tanıdan klinik nükse geçişle ilgili aday DEG'leri, yolları ve düzenleyici ağları önceliklendirerek bu ihtiyacı karşılar. Yaklaşım, sistem çapında transkripsiyonel yeniden programlamayı haritalamak ve sonraki mekanik doğrulama için adayları belirlemek için diferansiyel ifade analizi, gen seti zenginleştirme analizi (GSEA) ve protein-protein etkileşimi (PPI) ağ yapısını entegre eder.

Bu yöntemin genel amacı, yeni teşhis edilen ve nüks eden AML kemik iliği örneklerinin toplu transkriptomlarını karşılaştırmak için standartlaştırılmış, tekrarlanabilir bir biyoinformatik hattı sunmaktır. Bu in silico tekniğinin kullanılmasının gerekçesi, tarafsız, genom çapında transkripsiyon olaylarını yakalama kapasitesi, tek yol analizlerinin sınırlamalarını aşarak karmaşık, çok boyutlu düzenleyici ağları önceliklendirme kapasitesidir. Bu teknik, mikrodiziler veya hedefli çoklu qPCR panelleri gibi alternatif yöntemlere göre önemli avantajlar sunar; daha yüksek dinamik aralık, yeni transkriptleri tespit etme yeteneği ve önceden tasarlanmış probların sınırlamaları olmadan gen ifadesinin hassas nicelenmesi sağlar^19,20. Bu yöntemin uygulama için uygun olup olmadığını belirlemek için, okuyucular bu ürün hattının, doku aspiratları gibi çift veya eşleşmemiş klinik kohortlardan toplu RNA dizileme verilerini işleyen araştırmacılar için özel olarak tasarlandığını not etmelidir. Geniş dirençle ilişkili imzaları ve aday düzenleyici ağları tanımlamak için uygundur; iken, hücre tipine özgü veya mekansal çözünürlüğe ihtiyaç duyan araştırmacılar tamamlayıcı tek hücreli veya mekansal dizileme iş akışlarını kullanmak zorunda kalacaktır. Sonuç olarak, bu hesaplama protokolü, aday genlerin, yolların ve düzenleyici ağların sonraki deneysel araştırmalar için önceliklendirilmesini sağlar.

Protokol

İnsan dokusu örneklemesini içeren tüm yöntemler, kurumsal yönergeler ve Helsinki Bildirgesi'ne (2013'te revize edilen) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Klinik kemik iliği örnekleri, kurumsal etik komitesinin onayıyla alındı (Onay No. TY-ZKY2024-116-01 ve TY-ZKY2024-116-02).

1. Klinik Örnek Toplama ve Hasta Sınıflandırması

1. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) sınıflandırma kriterlerine göre resmi olarak akut miyeloid lösemi (AML) tanısı konmuş hastalardan kemik iliği aspirat örnekleri seçilin.
2. Hasta seçimi sırasında kohortun homojenliği ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için özel dahil etme ve dışlama kriterleri uygulanır. Birincil AML'li yetişkin hastaları dahil edin ve ikincil AML, akut promiyelositik lösemi veya önceki diğer kanser öyküsü olan hastaları hariç tutun (Tablo 1).
3. Hasta ilk klinik teşhis anında daha önce tedavi edilmemiş AML ile ortaya çıkarsa, toplanan örneği yeni teşhis edilen gruba atayın.
4. Hasta periferik kanda lökemik blastların yeniden ortaya çıktığını veya belgelenmiş tam remisyondan sonra kemik iliğinde %5'ten fazla blast ortaya çıkarsa, toplanan örneği nüks grubuna atanın.
5. Rutin klinik kemik iliği aspirasyon işleminin hemen ardından tanımlanmamış kalıntı kemik iliği örneklerini toplayın.
   NOT: Bu özel protokolün gösteriminde, Eylül 2024'ten Eylül 2025'e kadar ardışık dokuz örnek (beşi yeni teşhis edilmiş ve dördü tekrar nüks edilmiş) toplandı. Bu yöntem yalnızca kimliği belirsiz kalıntı klinik örnekleri kullandığı için etik komitesi yazılı bilgilendirilmiş onay gerekliliğini kaldırdı.
6. Topladığı kemik iliği aspirasyonunu standart fenol-guanidinyum lizisi^{yöntemi 21} kullanarak RNA koruması için hemen işleyin.
   1. Taze toplanan kemik iliği aspirasyonunu antikoagülant içeren bir toplama tüpüne aktarın. Tüpü sallayarak aspirat ve antikoagülantı iyice karıştırın.
   2. Antikoagüllenmiş numunenin ölçülen bir hacmini çıkarıp ticari fenol-guanidinyum lizisi reaktifine ekleyin. 3 parça lizis reaktifiyle 1 parça numune arasında hacim oranını koruyun.
      DIKKAT: Fenol-guanidinyum lizisi reaktifi, ciddi yanıklara ve doku hasarına yol açabilen toksik ve aşındırıcı kimyasallar içerir. Tüm reaktif kullanımını uygun kişisel koruyucu ekipman takarak kimyasal bir duman davlumbazında gerçekleştirin.
   3. Tüpü sertçe sallayarak numuneyi ve liz reaktifini tamamen homojenleştirin. Karışımın tamamen karıştığından emin olun ve çözeltide görünür pıhtı kalmadığından emin olun.
   4. Homojenleştirilmiş örneği hemen sıvı azota batırarak snap-freeze yapın.
      DIKKAT: Sıvı azot son derece soğuktur ve temas halinde şiddetli donma riskine neden olabilir. Sıvı azot kullanırken kriyojenik eldivenler ve tam yüz koruyucu kullanın.
7. Snap-dondurma örneklerini, aşağı akış RNA izolasyonu ve transkriptom dizileme boru hattı öncesinde uzun süreli depolama için -80 °C dondurucuya aktarın. Bu, deneyin duraklatılabilir ve daha sonra yeniden başlatılabileceği güvenli bir noktadır.
   NOT: Bu protokolde sunulan iş akışı tamamen hesaplamalı direnç imzaları üretmeye odaklanır. Bu özel ürün hattıyla tanımlanan anahtar farklı şekilde ifade edilen genler üzerinde gerçek zamanlı nicel PCR (RT-qPCR) gibi bağımsız deneysel doğrulama yapılmadı.

2. RNA Kalite Kontrolü ve Kütüphane Hazırlığı

1. Mikrofluidik kapiller elektroforez sistemi kullanarak RNA bütünlüğünü değerlendirin. Bu temsilci iş akışı için, RNA bütünlük numarası (RIN) 6.0, A260/280 oranı 1.8 ile 2.1 arasında ve görünür bozulma tepesi ≥olmayan RNA örnekleri ekleyin. Kütüphane hazırlığından önce her örnek için ölçülen RIN ve saflık oranlarını kaydedin.
2. Kütüphane hazırlığı için örnek başına 1 μg toplam RNA girin. PolyA kuyruk transkriptleri için zenginleştirmek amacıyla poly-T oligo-bağlı manyetik boncuklar kullanılarak toplam RNA'dan mRNA'yı arındırın.
3. Zenginleştirilmiş mRNA'yı iki valent katyonlarla parçalayın. Karışımı 94 °C'de 15 dakika boyunca 5X birinci iplik sentez reaksiyonu tamponu içinde kuluçka edin.
4. Rastgele heksamer primerleri ve RNase H aktivitesi olmayan bir ters transkriptaz kullanarak birinci zincir cDNA'sını sentezleyin.
5. RNA şablon zincirini RNaz H kullanarak bozun. İkinci zincirli cDNA'yı DNA Polimeraz I ve dNTP'ler kullanılarak 20 μL reaksiyon sisteminde sentezleyin.
6. İkinci zincir sentez reaksiyonunu 16 °C'de 1 saat kuluçka edin. Reaksiyon karışımını kısa bir süreliğine 2.000 x g ile santrifüjlenerek sıvıyı tüpün dibinde toplayın.
7. Kalan çıkıntıları ekzonükleaz ve polimeraz aktiviteleri kullanarak küt uçlara dönüştürün. DNA parçalarının 3' uçlarını adenilet ve hibritleşmeye hazırlık için saç tokası halka yapılarıyla ligat adaptörleri adenilet edilir.
8. Kütüphane parçalarını, 370–420 bp uzunluğundaki cDNA parçalarını tercihen seçmek için manyetik katı fazlı geri dönebilir immobilizasyon boncukları kullanarak arındırın.
9. Boncuk arıtma sırasında etanol yıkamaları yapın. Tüpleri 2.000 x g hassasiyetinde 30 saniye boyunca santrifüjlenerek toplanıp kalan etanol tamamen çıkarılır, son elüsyon öncesin.
10. Yüksek isabetli DNA polimeraz, evrensel PCR primerleri ve örnek spesifik indeks primerleri kullanılarak PCR amplifikasyonu gerçekleştirin.
11. PCR termal profilini 98 °C'de 30 saniye boyunca ilk denatürasyonla gerçekleştirin. Bunu 12 döngü boyunca 98 °C, 30 saniye 60 °C ve 30 saniye 72 °C ile takip edin; son olarak 72 °C'de 5 dakika uzatma ile tamamlanır.
12. PCR ürünlerini manyetik boncuklarla tekrar arındırın. Son kütüphaneyi elde etmek için 2.9. adımdan itibaren aynı santrifüj parametrelerini uygulayın.
13. Bir florometre kullanarak başlangıç kütüphane konsantrasyonunu nicelikle ölçün. Son kütüphaneyi 1.5 ng/μL konsantrasyonuna kadar seyreltin.
14. Sulandırılmış kütüphaneyi iyice karıştırın. Karışımı 10.000 x g sıcaklığında 1 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjlenerek kalan kalıntıları son analizden önce çıkarabilirsiniz.
15. Kütüphanenin insert boyutunu mikrofluidik kapiler elektroforez sistemi kullanarak değerlendirin.
16. Insert boyutunun beklentilere uyduğundan doğrulandığında, kütüphanenin etkin konsantrasyonunu gerçek zamanlı nicel PCR (qRT-PCR) ile doğru şekilde nicelikle ölçebilirsiniz. Konsantrasyonun 1,5 nM'den yüksek olduğundan emin olun, böylece kütüphane stabilitesi ve dizileme kalitesi garanti olun.
    NOT: Bu, deneyin duraklatılabilir güvenli bir noktayı temsil eder. Hazırlanan kütüphanelerdir, kümeleme ve dizileme işlemlerine kadar -20 °C'de saklanabilir.

3. Kümeleme ve Transkriptom Dizileme

1. Indeks kodlu örneklerin kümelenmesini otomatik bir küme oluşturma sisteminde gerçekleştirin. Üreticinin talimatlarına göre ticari eşleştirilmiş uçlu bir küme kiti kullanın.
2. Başarılı küme üretiminden sonra yüksek verimli bir dizileme platformunda kütüphane hazırlıklarını sıralayın. 150 baz çifti (bp) çiftli uç okuması oluşturun.

4. Veri Kalitesi Kontrolü ve Okuma Haritalaması

1. Ham okuma kalite kontrolü ve filtreleme için fastp v0.23.2 kullanarak ham veri kalitesini (FASTQ formatı) değerlendirin. Komut satırı parametrelerini analiz günlüğüne kaydedin. Bu iş akışında, temiz okumalar, adaptör içeren okumalar, poli-N dizilerini içeren okumalar ve örnekler arasında aynı filtreleme ayarları kullanılarak düşük kaliteli okumalar çıkarılarak oluşturuldu. Temsilci çiftli uç komutu Ek Dosya 1'de sağlanmıştır.
2. Ham okumaları otomatik bir ön işleme yazılımı aracılığıyla işleyin. Adaptör içeren okumaları, poli-N dizilerini içeren okumaları ve düşük kaliteli okumaları kaldırarak temiz okumalar elde edin. Tüm örnekler için aynı filtreleme parametreleri kullanın ve filtreleme sonrası kalan okuma sayısını, Q20, Q30 ve GC içeriğini kaydedin.
3. Temiz verilerin Q20, Q30 ve GC içeriğini hesaplayın. Numune toplama tarihi, RNA çıkarma tarihi, kütüphane hazırlık partisi, dizileme yolu ve dizileme çalışması dahil olmak üzere potansiyel parti değişkenlerini aşağı akış analizinden önce tanımlayın.
4. PCA ile parti etkilerini ve normalize ifade değerleriyle örneklemden örneklere korelasyon analiziyle değerlendirin. Örnekler klinik durum yerine teknik değişkenlere göre kümelenirse, etkilenen değişkeni belgeleyin ve onu diferansiyel ifade tasarım formülüne kovaryat olarak dahil edin veya aşağıya akış görselleştirmeden önce yerleşik bir parti ayarlama yöntemi uygulayın.
5. Referans genomunu (Homo sapiens, GRCh38) ve ilgili Ensembl release 109 gen açıklama dosyalarını okuma hizalanması için edinin.
6. HISAT2 v2.0.5 kullanarak referans genomun indeksini oluştur.
7. HISAT2 v2.0.5 kullanarak eşleştirilmiş uçlu temiz okumaları referans genomuna hizalayın. Bu splice-farkında hizalama yaklaşımını kullanarak gen modeli açıklama dosyasına dayalı bir bağlantı bağlantı veritabanı oluşturun.

5. Yeni Transkript Tahmini ve Gen İfadesi Niceliklendirmesi

1. Her örnekin eşlenmiş okumalarını StringTie v1.3.3b kullanarak referans tabanlı bir yaklaşımla birleştirin. Bu aracı, her gen lokusu için birden fazla splice varyantını temsil eden tam boy transkriptleri bir araya getirmek ve nicelendirmek için kullanın.
2. featureCounts v1.5.0-p3 ile her gene eşlenen okuma sayısını sayın. Ortaya çıkan ham tam sayı okuma sayısı matrisi, aşağı akış diferansiyel ifade analizi için giriş olarak kullanın.
3. Eşleştirilmiş uç dizileme verileri için featureCounts v1.5.0-p3'ü eşleştirilmiş uç seçeneğiyle (örneğin, -p) yapılandırın. Doğru genomik özellik sınırlarını tanımlamak için indirilmiş GRCh38 GTF açıklama dosyasını sağlayın.
4. Her gen için Milyon haritalanmış okuma başına transkript Kilobaz başına Fragments (FPKM) hesaplayın. FPKM değerlerini yalnızca betimleyici görselleştirme, PCA, ısı haritası gösterimi ve keşif ifade özetleri için kullanın; DESeq2 diferansiyel ifade testi için FPKM değerlerini giriş matrisi olarak kullanmazlar.

6. Diferansiyel Gen İfadesi Analizi

1. R v3.5.0 ve DESeq2 R paketi v1.20.0 kullanarak yeni teşhis edilen ve tekrar edilen gruplar arasında diferansiyel ifade analizi yapın. 5.2. adımda oluşturulan ham okuma sayısı matrisini R ortamına aktarın ve FPKM değerlerini yalnızca görselleştirme ve keşif analizleri için koruyun.
2. Analiz paketinin gerektirdiği özel veri seti nesnesini oluşturun. Belirli komutu (örneğin, DESeqDataSetFromMatrix()) çalıştırarak sayım veri matrisini ilgili örnek meta veri tablosuna bağlayın.
3. Yazılım nesnesi içinde deneysel tasarım formülünü tanımlayın. Karşılaştırma için birincil değişken olarak klinik durumu (yeni teşhis edilmiş ve tekrar nüks edilmiş durumda) belirtin (örneğin, tasarım = ~ durum). Eğer bir teknik parti değişkeni 4.3. adımda tanımlanıyorsa ve klinik durumla tamamen karıştırılmazsa, onu tasarım formülüne dahil edin (örneğin, tasarım = ~ parti + koşul).
4. Çekirdek diferansiyel ifade analiz fonksiyonunu (örneğin, DESeq()) çalıştırın. Yazılımın otomatik olarak boyut faktörü tahmini, dağılım tahmini ve negatif binom Wald test^{uyumu 22} yapmasına izin verin.
5. Sonuç çıkarma fonksiyonunu kullanarak sonuçlar tablosunu çıkarın (örneğin, results()). Tam karşılaştırmayı (nüks ve yeni teşhis edilmiş karşılaştırma) tanımlamak için kontrast argümanını belirtin.
6. Ortaya çıkan P-değerlerini yanlış keşif oranını kontrol etmek için ayarlayın. Yazılım^{paketi 23} tarafından otomatik olarak uygulanan entegre Benjamini ve Hochberg prosedürünü kullanın.
7. Çıkarılmış sonuçlar tablosunu filtreleyerek anlamlı farklılıkla ifade edilen genleri (DEG) izole edin. Ayarlanmış P-değeri 0.05 olan herhangi bir geni < 1 > mutlak_{log 2} kat değişimi anlamlı şekilde ifade edilen olarak atanın.

7. Gen Ontolojisi (GO) Zenginleştirme Analizi

1. ClusterProfiler v3.8.1 ve org kullanılarak tanımlanan DEG'lerin Gen Ontolojisi (GO) zenginleştirme analizini gerçekleştirin. Hs.eg.db v3.6.0. 6.7. adımda tanımlanan anlamlı DEG'lere karşılık gelen Entrez gen kimliklerinin listesini girin.
2. GO zenginleştirme fonksiyonunu çalıştırın (örneğin, enrichGO()). Gerekli parametreleri, uygun arka plan organizma veritabanı dahil olmak üzere belirtin (örneğin, OrgDb = org. Hs.eg.db), özgün ontoloji alanı (Biyolojik Süreç, Hücresel Bileşen veya Moleküler Fonksiyon) ve ayarlanmış P-değer kesim (0.05) ile belirlenmiştir.
3. Algoritmanın zenginleştirme hesaplaması sırasında gerekli düzeltmeleri uyguladığından emin olun. Yazılımın gen uzunluğu yanlılığını dahili olarak düzelttiğini ve Benjamini ve Hochberg^{yöntemi 24} ile P-değerlerini ayarladığını doğrulayın.
4. Düzeltilmiş P-değeri 0.05'ten küçük olan GO terimlerini önemli ölçüde zenginleştirilmiş olarak değerlendirin. Paketin entegre görselleştirme fonksiyonlarını kullanarak en zenginleştirilmiş GO terimlerini göstermek için nokta grafiki veya çubuk grafik oluşturun.

8. Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) Yol Zenginleştirme Analizi

1. Düzensiz yolları belirlemek için yüksek seviyeli biyolojik sistem fonksiyonlarını anlamaya adanmış kapsamlı bir veritabanı kaynağı kullanın. Adım 7.1'de kullanılan önemli DEG Entrez ID'lerinin aynı listesini hazırlayın.
2. Fonksiyonel açıklama R paketinde KEGG zenginleştirme fonksiyonunu (örneğin, zenginleştirmekKEGG()) çalıştırın.
3. Fonksiyon çağrısı içindeki kritik parametreleri tanımlayın. Organizma kodunu kesin olarak insan olarak ayarlayın (örneğin, organizma = 'var') ve P-değer ayarlama yöntemini tanımlayın (ör. pAdjustMethod = 'BH').
4. İstatistiksel olarak anlamlı KEGG yollarını çıkarın. Çıktıyı filtreleyin, yalnızca düzeltilmiş P-değeri 0.05'ten küçük olan yolları koruyun.
5. En zengin KEGG yollarını görselleştirin. Her yolla ilişkili istatistiksel anlamlılık ve gen sayılarını haritalamak için entegre grafik fonksiyonlarını (örneğin, dotplot()) kullanın.

9. Gen Seti Zenginleştirme Analizi (GSEA)

1. Analiz için gereken önceden sıralanmış gen listesini hazırlayın. Tüm ekspres genler için sıralama metriğini, diferansiyel ifade analizinden elde edilen log₂ kat değişim işaretiyle çarparak -log10(P-değeri) ile hesaplayın.
2. Broad Institute GSEA yazılımı v4.2.3'ün yerel kurulumunu başlatın. Yeni oluşturulmuş önceden sıralanmış gen listesini yazılım^{arayüzüne girin 25}.
3. Gerekli önceden tanımlanmış gen setlerini indirin. Moleküler İmzalar Veritabanı'ndan (MSigDB, sürüm 7.5.1) Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) veri setlerini ^edinin26.
4. Yazılım parametrelerini istatistiksel zenginleştirme testini gerçekleştirecek şekilde yapılandırın. Permütasyon sayısını 1.000'e ayarlayın ve permütasyon türünü 'gene_set' olarak seçin.
5. Analiz algoritmasını uygulayarak önceden tanımlanmış gen setlerinin yeni teşhis edilen ve tekrar nüks edilen biyolojik durumlar arasında istatistiksel olarak anlamlı, uyumlu bir fark gösterip göstermediğini belirleyin.
6. Oluşturulan zenginleştirme profillerinin istatistiksel anlamlılığını değerlendirin. Önemli gen setlerini katı eşikler kullanarak tanımlayın: normalize zenginleştirme skoru (NES) mutlak değeri 1.0 >, nominal P-değeri < 0.05 ve yanlış keşif oranı (FDR) q-değeri < 0.25.

10. Protein-Protein Etkileşimi (PPI) Ağ Analizi

1. Bilinen ve tahmin edilen protein-protein etkileşimleri için STRING veritabanına erişin. Bu iş akışında PPI analizi STRING v11.5²⁷ ile gerçekleştirildi.
2. Önemli farklılıkla ifade edilen genler için (adım 6.7'de tanımlanmış) Entrez gen kimliklerinin veya resmi gen sembollerinin listesini veritabanı arama arayüzüne girin. Hedef organizma olarak Homo sapiens'i seçin.
3. Yüksek kaliteli etkileşimlerin alınmasını sağlamak için ağ yapı parametrelerini yapılandırın. Minimum gerekli etkileşim puanını yüksek bir güven eşiğine (puan > 0.700) ayarlayın.
4. Ortaya çıkan etkileşim ağı verilerini yerel bir dizine aktarın. Etkileşim haritasını standart bir tablo dosyası olarak kaydedin (örneğin, TSV formatı).
5. Aktarılan etkileşim verilerini Cytoscape v3.9.1'e ağ görselleştirme ve analiz^{için aktarın 28}.
6. Oluşturulan ağı filtreleyerek görselleştirme netliğini artırın ve önemli düzenleyici merkezleri vurgulayın. Belirlenen güven eşiğini karşılayan sürekli etkileşimler göstermeyen bağlantısız düğümleri veya yetim genleri kaldırın.

Sonuçlar

Klinik Kohort ve Dizileme Doğrulaması

Yukarı akış RNA çıkarma ve kütüphane hazırlama protokolünün (Şekil 1) başarılı şekilde uygulanması, dizileme verimi ve kalite metrikleriyle doğrulandı. Bu temsilci veri setinde, beş yeni teşhis konan AML hastası ve dört nüks AML hastasından alınan kemik iliği örnekleri, örnek başına ortalama yaklaşık 6,0 GB ham veri sağladı. Kalite kontrol değerlendirmesi (Tablo 2), temel kalitesi ve okuma derinliğinin aşağı akış biyoinformatik analizi için gereken eşikleri karşıladığını doğruladı9. Düşük RNA bütünlüğü (örneğin, RIN < 6.0), düşük haritalama oranları veya yüksek transkript bozulma yanlılığı düşük giriş kalitesini temsil eder ve aşağı akış diferansiyel ifade analizinin güvenilirliğini zayıflatır.

Küresel Transkriptomik Varyans ve PCA

Küresel transkriptom varyansını değerlendirmek ve klinik gruplamayı incelemek için normalize edilmiş ifade verilerinde PCA gerçekleştirildi. Bu temsilci veri setinde, yeni teşhis edilen ve nüks eden gruplar iki boyutlu uzlukta (Şekil 2A⁾²⁰ ayrımını göstermiştir; PC1 ve PC2 toplam varyansın %23,82'si ve %18,75'ini oluşturmaktadır. Şekil 2B,C'deki Venn diyagramları, yeni teşhis edilen ve nüks gruplardaki örnekler arasında tespit edilen genlerin ek tanımlayıcı özetini sunar ve aşağıya giden diferansiyel ifade analizinden önce örnek düzeyinde tekrarlanabilirlik kontrollerini destekler. Kohort küçük ve eşleşmemiş olduğundan, PCA ayrımı, hastalık durumuna özgü biyolojinin kesin kanıtı değil, örnekleyici bir iş akışı çıktısı olarak yorumlandı.

Diferansiyel İfade Geni (DEG) Analizi

Belirlenmiş protokol eşikleri (|log₂FC| ≥ 1 ve ayarlanmış P-değeri ≤ 0.05) DESeq2 çıktısına uygulandığında, reksis grubunda 772 yukarı regülasyon ve 1.253 aşağı regülasyona edilmiş genden oluşan 2.025 DEG'yi tespit etti (Şekil 3A). Yüksek varyasyonlu aday transkriptler arasında FOXC1 (log₂FC = 7.55, P = 4.92 x ^10-5), HOXA11 (log₂FC = 7.76), HOXA11-AS (log₂FC = 7.23) ve AXL (log₂FC = 3.50) yer alıyor; ayrıca aşağı regülasyona sahip RHOB, PTX3 ve CXCL8 vardı. Mevcut literatür, bu genlerin birkaçını AML kök yapısı, sinyal veya terapi yanıtı^{ile ilişkilendirmektedir 13,29}; ancak mevcut iş akışı bunları yalnızca nüks ilişkili aday transkriptler olarak tanımlamaktadır. Klinik dirençte kesin mekanik rol için bağımsız fonksiyonel doğrulama gereklidir.

Fonksiyonel ve Yol Zenginleştirmesi (GO, KEGG ve GSEA)

Fonksiyonel açıklama protokolü, DEG'leri daha geniş biyolojik sistemlere eşledi. GO analizi, küçük GTPaz aracılı sinyal iletimi, metal iyon taşıması ve kromatin montajıyla ilgili terimlerin zenginleştirilmesini tespit etti (Şekil 4A–C). KEGG yol haritalaması, ECM-reseptör etkileşimleri ve sitokin-sitokin reseptör etkileşimleriyle ilişkileri tespit etti (Şekil 4D). GSEA, reks edilen grupta RNA biyosentetik süreçlerinin zenginleşmesini ve yeni teşhis edilen grupta enerji metabolizması yollarının zenginleşmesini gösterdi (Şekil 5A). Bu zenginleştirme sonuçları, değişen gen setlerinin tanımlayıcı bir yol haritası sunar ve nüks için kanıtlanmış sürücüler değil, hipotez üreten ilişkiler olarak yorumlanmalıdır.

Protein-Protein Etkileşimi (PPI) Ağ İnşası

İlk STRING ağı 56 düğüm ve 193 etkileşimden oluşuyordu. Bağlantısı kesilen veya yetim düğümler kaldırıldıktan sonra, gösterilen Cytoscape alt ağı 42 düğüm ve 136 etkileşim içeriyordu (Şekil 5B). Ağ modüler analizi, TP53, CCL2, CXCL8 ve IL6'yı en fazla etkileşime sahip merkezi matematiksel merkezler olarak önceliklendirdi. PPI ağı, veritabanı tarafından tahmin edilen etkileşim puanlarına (örneğin, ATF3 puanı: 0.982) dayandığı için, hub tanımlaması gelecekteki ampirik çalışmalar için hedef önceliklendirme olarak yorumlanmalıdır; p53 aracılı apoptozdan kaçınma veya diğer direnç mekanizmalarının doğrudan kanıtı değil.

Bu protokolte üretilen ham RNA dizileme verileri Figshare deposuna depolanmış ve aşağıdaki DOI aracılığıyla halka açık erişilebilir durumda: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.30655814. İşlenen veriler ve ilgili analiz dosyaları, makale ve ek materyallere dahil edilmiştir. Hesaplama iş akışını yeniden üretmek için kullanılan temsilci komut satırı parametreleri ve analiz ayarları Ek Dosya 1 olarak sağlanır. Bu çalışmanın bulgularını destekleyen tüm veriler kısıtlamasız olarak mevcuttur.

Hasta Kimliği	Yaş (Yıllar)	Cinsellik	Moleküler Mutasyonlar	Hayatta Kalma/Takip (Aylar)	Klinik Durum
R_AML_1	70	Erkek	FLT3-ITD (+)	22	Vefat
R_AML_2	29	Kadın	NPM1 (+)	11	Canlı
R_AML_3	40	Erkek	CEBPA (+)	17	Canlı
R_AML_4	55	Kadın	Üçlü Negatif*	24	Vefat

Tablo 1: Nüks AML (R_AML) grubundaki hastaların demografik ve klinik özellikleri. Tablo 1, temsil analizde kullanılan nüks AML kohortunun demografik ve klinik özelliklerini, transkriptomik iş akışının yorumlanmasıyla ilgili hasta düzeyindeki klinik özellikleri de dahil olmak üzere özetlemektedir.

Örnek	Kütüphane	Raw_reads	Raw_bases	Clean_reads	Clean_bases	Error_rate	Q20	Q30	GC_pct
AML_1	FRAS25 0244891-1r	48705066	7.31G	47807532	7.17G	0.01	99.35	97.48	47.48
AML_2	FRAS25 0244896-1r	42969940	6.45G	42237962	6.34G	0.01	99.35	97.44	46.74
AML_3	FRAS2502 44906-1R	48738386	7.31G	47744462	7.16G	0.01	99.36	97.48	47.28
AML_4	FRAS250 244915-1r	48723650	7.31G	47688240	7.15G	0.01	99.29	97.26	47.45
AML_5	FRAS2502 44920-1r	49508198	7.43G	47740308	7.16G	0.01	99.37	97.53	47.73
R_AML_1	FRAS2502 44892-1r	47879408	7.18G	46671584	7.0G	0.01	99.39	97.49	47.63
R_AML_2	FRAS2502 70005-1r	47657378	7.15G	46957882	7.04G	0.01	99.39	97.49	50.5
R_AML_3	FRAS250 405722-1r	58754766	8.81G	56867112	8.53G	0.01	99.38	97.42	46.52
R_AML_4	FRAS2502 44902-1r	48491122	7.27G	47469334	7.12G	0.01	99.23	97.21	46.43

Tablo 2: Veri kalitesinin özeti. Tablo 2, her örnek için okuma verimi, baz kalitesi, GC içeriği ve örneklerin aşağı akış analizine uygun olup olmadığını belirlemek için kullanılan haritalama ile ilgili kalite kontrol bilgileri dahil olmak üzere dizileme kalite metriklerini rapor eder.

Şekil 1: Protokolün iş akışı. İş akışı, klinik örnek toplama, RNA kalite kontrolü, kütüphane hazırlama ve dizileme, okuma işleme ve hizalama, transkript niceliklendirme, diferansiyel ifade analizi, GO/KEGG zenginleştirme, GSEA ve PPI ağ inşası gibi ana deneysel ve hesaplama aşamalarını özetlemektedir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Örneklerin nicel analizi. (A) Gruplar arası farkları ve grup içi örneklem tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için ana bileşen analizi (PCA) gerçekleştirildi. PCA, tüm örneklerde normalize edilmiş gen ekspresyonu değerlerine dayalı lineer cebirsel yöntemlerle gerçekleştirildi. (B, C) AML ve R_AML gruplarındaki örneklerde tespit edilen genleri gösteren Venn diyagramları. Örnek kısıtlı bölgeler bireysel örneklerde tespit edilen genleri gösterirken, örtüşen alanlar genellikle iki veya daha fazla örnekte tespit edilen genleri temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Diferansiyel gen ekspresyonu analizi. (A) Karşılaştırma grupları arasında farklı olarak ifade edilen genlerin (DEG) sayısını gösteren çubuk grafik, DESeq2 tarafından tanımlanmış, ayarlanmış P-değeri ≤ 0.05 ve |log₂FoldChange| ≥ 1. (B) DEG'lerin volkan karsayı. x ekseni log₂FoldChange değerini, y ekseni ise -log10(P-değeri) değerini temsil eder. Mavi kesik çizgiler, DEG seçimi için kullanılan eşik çizgilerini gösterir. (C) DEG'lerin hiyerarşik kümeleme ısı haritası. x ekseni örnek isimleri, y ekseni ise DEG'lerin normalize ifade değerlerini gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Farklı şekilde ifade edilen genlerin fonksiyonel zenginleştirme analizi. (A) GO zenginleştirme çubuğu arsası. x ekseni GO terimlerini temsil ederken, y ekseni zenginleştirme anlamını gösterir ve -log10(padj) olarak ifade edilir. Renkler BP (Biyolojik Süreç), CC (Hücresel Bileşen) ve MF (Moleküler Fonksiyon) anlamına gelir. (B) GO zenginleştirme balonu planı. x ekseni, her GO terimine yapılan açıklamalı DEG'lerin toplam DEG'lerin toplam sayısına göre oranını temsil eder ve y ekseni ise GO terimlerini gösterir. Balon boyutu, annotasyonlu genlerin sayısına karşılık gelir ve renk gradyanları zenginleşme anlamını temsil eder. (C) KEGG zenginleştirme çubuğu alanı. x ekseni KEGG yollarını, y ekseni ise zenginleşme anlamını gösterir. (D) KEGG zenginleştirme balonu alan. Balon boyutu, annotasyonlu genlerin sayısını, renk gradyanları ise zenginleşmenin önemini gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: GSEA zenginleştirme ve protein-protein etkileşimi (PPI) ağ analizi. (A) Seçilmiş anlamlı gen setleri için normalize zenginleşme skorlarını (NES) gösteren çubuk grafik. Pozitif NES değerleri R_AML grubunda zenginleşmeyi gösterirken, negatif NES değerleri yeni teşhis edilen AML grubunda zenginleşmeyi gösterir. (B) Protein–protein etkileşimi (PPI) ağı. Her düğüm bir proteini temsil eder ve her kenar bağlı proteinler arasındaki etkileşimi simgeler. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Protokolteki Kritik Adımlar

Bu biyobilişim iş akışının başarılı bir şekilde uygulanması birkaç kritik adıma dayanır. İlk olarak, kemik iliği aspiratının anında dondurulması ve doğru lizisi (Adım 1.6) çok önemlidir; çünkü kemik iliği mikro ortamı, transkriptomik bütünlüğü hızla bozabilen ribonükleazlarla^{zengindir 30}. Hesaplama aşamasında, DESeq2 paketi içindeki deneysel tasarım formülünün doğru konfigürasyonu (Adım 6.3), özellikle klinik durum (yeni teşhis edilmiş ve tekrar nüks) karşılaştırıldığında ve potansiyel karıştırıcı değişkenler dikkate alındığında, doğru diferansiyel ifade için kritiktir. Son olarak, Gen Seti Zenginleştirme Analizi (GSEA) sırasında (Adım 9.6) katı yanlış keşif oranı (FDR) eşiklerinin uygulanması, yanlış pozitif fonksiyonel ağların aşırı yorumlanmasını önlemek için kritik bir istatistiksel kontrol noktasıdır.

Modifikasyonlar ve Sorun Giderme

Bu yöntemdeki yaygın bir zorluk, klinik örneklerin toplanıp uzun zaman dilimleri boyunca sıralandığında sıklıkla ortaya çıkan parti etkilerinin olmasıdır. Toplu değişkenler, analiz öncesinde örnek toplama tarihi, RNA çıkarma tarihi, kütüphane hazırlık partisi, dizileme yolu ve dizileme çalışması dahil olmak üzere tanımlanmalıdır. PCA veya örnek korelasyon analizi, klinik fenotip yerine dizileme tarihi veya başka bir teknik değişkene dayalı kümeleme ortaya çıkarırsa, kullanıcılar protokolü değiştirmelidir; istatistiksel olarak mümkün olduğunda parti değişkenini diferansiyel ifade tasarım formülüne dahil eder veya görselleştirmeden önce ComBat veya SVA gibi toplu düzeltme algoritmaları uygulanmalıdır³¹. Bu protokol kemik iliği aspiratları yerine tam kana uygulanırsa, kütüphane hazırlığı sırasında çok bol globin transkriptlerinin dizileme okuma derinliğini tekel etmesini önlemek için globin mRNA tükenme adımının eklenmesi temel bir değişikliktir. Temsilci iş akışı için yazılım sürümleri ve ana parametreler şu şekilde desteklendi: fastp v0.23.2, HISAT2 v2.0.5, StringTie v1.3.3b, featureCounts v1.5.0-p3, R v3.5.0, DESeq2 v1.20.0, clusterProfiler v3.8.1, org. Hs.eg.db v3.6.0, eşleştirilmiş uçlu 150 bp dizileme, GSEA v4.2.3 ile 1.000 gen seti permutasyonu, MSigDB v7.5.1, STRING v11.5 yüksek güvenli etkileşimler ile ve Cytoscape v3.9.1. Temsilci komut satırı parametreleri ve analiz ayarları Ek Dosya 1'de sağlanmıştır.

Yöntemin Sınırlamaları

Kapsamlı olmasına rağmen, bu protokolün kendine özgü metodolojik sınırlamaları vardır. İlk olarak, tüm kemik iliği aspiratının ortalama transkriptomik profilini yakalayan ve tek hücreli uzamsal çözünürlüğe sahip olmayan toplu RNA dizileme kullanır. Bu nedenle, iş akışı, yukarı regülasyon nedeniyle nüks ilişkili imzanın lösemi kök hücrelerinden, stromal hücrelerden, bağışıklık hücrelerinden mi yoksa hücre tipi bileşimindeki değişikliklerden mi kaynaklandığını^{belirleyemez.} İkinci olarak, temsilci veri seti küçük (n = 9) ve eşleşmemiştir; bu da istatistiksel dayanıklılığı sınırlar ve kesin nedensel çıkarımı engeller. Üçüncüsü, iş akışı tamamen in silico. Aday düzenleyici merkezler ve sinyal yolları üretir, ancak kemodirençte fonksiyonel gerekliliklerini ortogonal in vitro veya in vivo deneysel doğrulama olmadan bağımsız olarak doğrulayamaz.

Son tek hücreli ve tek hücreli genomik çalışmalar, AML referans çerçevesini hücre-durum heterojenliği, klonal mimari ve terapiyle ilişkili evrimi daha yüksek^{çözünürlükte} 33,34,35,36 çözünürlükte çözerek genişletmiştir. Bu yaklaşımlar, burada tanımlanan toplu RNA-dizi iş akışını tamamlayıcıdır: toplu dizileme kohort düzeyindeki transkriptomik imzalar için pratik ve maliyet etkin bir tarama stratejisi sunarken, tek hücreli ve çoklu omik yöntemler, takip çalışmalarında belirli malign veya mikroçevresel hücre popülasyonlarına aday sinyaller atamak için kullanılabilir.

Mevcut Yöntemlerle Bağlamında Önemi

Bu sınırlamalara rağmen, bu transkriptomik hattı alternatif tanı ve analitik tekniklere göre avantajlar sunar. AML nüksü için geleneksel klinik değerlendirmeler genellikle hedeflenmiş çoklu qPCR panellerine veya standart akış sitometrisine dayanır. Hızlı tanı için faydalı olsa da, bu hedefli yöntemler önceden tanımlanmış problarla sınırlıdır ve yalnızca bilinen direnç belirteçlerini^{değerlendirebilir 19}. Tarafsız, genom çapında transkriptom dizileme ve ağ analizi kullanılarak, bu protokol mevcut hedeflenmiş yöntemlerin göz ardı edebileceği yeni transkriptler ve sistem çapında ilişkileri aday gösterebilir.

Önemi ve Potansiyel Uygulamaları

Bu protokolde belirtilen metodoloji, translasyonel hematoloji ve kişiselleştirilmiş tıp için önemlidir çünkü nüks ile ilişkili transkriptomik imzaları ek çalışmalar için önceliklendirebilir. Olası bir sonraki uygulama, nüks sırasında ortaya çıkan yüzey antijenlerinin veya bağışıklık kaçınma yollarının aday gösterilmesidir. Bu tür adaylar, gelecekteki doğrulama çalışmalarının tasarımını şekillendirebilir ve deneysel olarak doğrulanırsa, CAR-T veya CAR-NK hücre stratejileri dahil olmak üzere yeni nesil immünoterapilerin geliştirilmesine katkıda^{bulunabilirler.} Bu çeviri uygulamalar, mevcut veri setinden alınan sonuçlar yerine hipotez üreten bir şey olarak değerlendirilmelidir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA	RRID:SCR_019389	G2939BA
AMPure XP system	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	RRID:SCR_008452	A63881
cBot Cluster Generation System	Illumina, San Diego, CA, USA	-	SY-301-2002 or institution-specific system ID
clusterProfiler (Software)	Bioconductor	RRID:SCR_016884	v3.8.1
Cytoscape (Software)	Cytoscape Consortium	RRID:SCR_003032	v3.9.1
DESeq2 (Software)	Bioconductor	RRID:SCR_015687	v1.20.0
DNA Polymerase I	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	M0209L
dNTP Solution Mix	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	N0447L
edgeR (Software)	Bioconductor	RRID:SCR_012802	v3.22.5
fastp (Software)	OpenGene	RRID:SCR_016962	v0.23.2
featureCounts / Subread (Software)	The Walter and Eliza Hall Institute	RRID:SCR_012919	featureCounts v1.5.0-p3
GRCh38 reference genome	Genome Reference Consortium / Ensembl	-	GRCh38; Ensembl release 109
GSEA software	Broad Institute	RRID:SCR_003199	v4.2.3
HISAT2 (Software)	Johns Hopkins University	RRID:SCR_015530	v2.0.5
M-MuLV Reverse Transcriptase (RNase H-)	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	M0253L
MSigDB gene sets	Broad Institute	RRID:SCR_016863	v7.5.1
NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	E7760L/E7765L or laboratory-specific kit
NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	E7770L
NovaSeq sequencing platform	Illumina, San Diego, CA, USA	RRID:SCR_016387	NovaSeq system; service-provider instrument ID
org.Hs.eg.db (Annotation package)	Bioconductor	-	v3.6.0
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	RRID:AB_2756816	F530L
Qubit 2.0 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	RRID:SCR_018095	Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	-	Q32851
R software	R Foundation for Statistical Computing	RRID:SCR_001905	v3.5.0
Random Hexamer Primer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	-	SO142
RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA	-	5067-1511
RNase H	New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA	-	M0297L
RNA-seq Library Prep Kit / Sequencing Service	Novogene, Beijing, China	-	Project No. X101SC25054246-Z01-J003
STRING database	STRING Consortium	RRID:SCR_005223	v11.5
StringTie (Software)	Johns Hopkins University / Center for Computational Biology	RRID:SCR_016323	v1.3.3b
TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS	Illumina, San Diego, CA, USA	-	PE-401-3001