In Vitro Düzenleyici T Hücrelerinin Fonksiyonel Analizi: Proliferasyon ve Farklılaşmaya Odaklanma

Özet

Bu protokol, düzenleyici T hücrelerinin efektör T hücre çoğalması ve farklılaşması üzerindeki etkilerini araştırmak için in vitro bir ortak kültür stratejisi sunar.

Özet

Düzenleyici T (Treg) hücreleri, bağışıklık homeostazının korunmasında kilit roller oynar. Treg hücre fonksiyonundaki anormallikler, otoimmün hastalıklar, organ nakli reddedilmesi, enfeksiyon ve kanser gibi çeşitli hastalıklarla ilişkilidir. Treg hücrelerinin manipüle edilmesi, otoimmün hastalıklar, katı organ nakli reddi, greft-konak hastalığı ve alerjik hastalıklar dahil olmak üzere iltihap hastalıkların tedavisinde potansiyel bir terapötik strateji olarak kabul edilmektedir. Klasik in vitro Treg hücre baskılama testleri, ağırlıklı olarak Treg hücrelerinin efektör T (Teff) hücre çoğalması üzerindeki inhibitör etkisini değerlendirir. Ancak, çorak artımının yanı sıra, T hücrelerinin bağışıklık işlevlerini yerine getirebilmesi için T hücresi farklılaşması önemlidir. Bu nedenle, bu protokol, Treg hücrelerinin Teff hücrelerinin çoğalması ve farklılaşması üzerindeki etkilerini araştırmak için modifiye edilmiş in vitro Treg hücre baskılama testi sağlar. Bu protokolde, önce fare Treg hücrelerinin ve naif T hücrelerinin hazırlanması tanıtılır, ardından Treg hücrelerinin Teff hücrelerinin çoğalması ve farklılaşması üzerindeki düzenleyici etkilerini, Th1 ve Th17 hücrelerini de dahil olmak üzere, birlikte kültür stratejisi ve son olarak, ko-kültür sonrası akış sitometrisi için boyama stratejisi sunulur. Bu in vitro fonksiyonel Treg hücreleri analizi, Treg hücrelerinin T hücre çoğalması ve polarizasyonu üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir.

Giriş

CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ düzenleyici T (Treg) hücreleri, bağışıklık^{homeostazı 1'in önemli aracılarıdır.} Treg hücreleri aşırı bağışıklık yanıtlarını aktif olarak bastırır ve kendi kendine bağışıklık toleransını korur; böylece bağışıklık reaksiyonlarının normal dokulara ve organlara zarar vermesini engeller². Treg hücrelerinin manipüle edilmesi, otoimmün hastalıklar, katı organ nakli reddi, greft-konak hastalığı ve alerjik hastalıklar gibi inflamatuar hastalıkların tedavisinde potansiyel bir terapötik strateji^{olarak kabul edilir 3,4,5}. Bu arada, Treg hücrelerinin fonksiyonunu inhibe etmek, anti-tümör bağışıklığını^{aktive etmek için etkili bir strateji olarak kabul edilmektedir 6,7}. Klinisel çalışmalar, otoimmün hastalıklar, katı organ nakli ve greft-konak hastalığı ^8,9,10 için benimseyen düzenleyici T hücresi tedavisi veya düşük dozlu IL-2 tedavisini araştırmıştır. Ayrıca, kimerik antijen reseptörü (CAR)-Treg hücreleri ve T-hücre reseptörü (TCR)-Treg hücreleri dahil olmak üzere mühendislik yapımı Treg hücreleri üzerinde yapılan çalışmalar da giderek daha fazla ilgi görüyor^11,12.

Bugüne kadar Treg hücre tedavisi rutin klinik tedavide yaygın olarak yerleşmemiştir. Treg hücre tedavisinin klinik uygulamasını desteklemek için sistematik araştırma ve işlevlerinin değerlendirilmesi önemlidir. Düzenleyici T hücrelerinin in vitro işlevlerini değerlendirmek için yaygın bir strateji, Treg hücrelerinin efektör T (Teff) hücre çoğalması üzerindeki baskılayıcı işlevini tespit edebilen in vitro Treg baskılama testi^13'tür. Ancak, standart in vitro Treg baskılama testi Teff hücrelerinin farklılaşmasını değerlendirmez. Efektör T hücrelerinin çoğaltması ve farklılaşması aynı anda değerlendirilebilirse, düzenleyici T hücrelerinin işlevi hakkında daha fazla bilgi elde edilebilir.

Burada, "in vitro Treg hücrelerinin fonksiyonel analizi" olarak adlandırılan modifiye edilmiş in vitro Treg hücre baskılama testi sunuyoruz (Şekil 1). Bu protokol, Treg hücrelerinin Teff hücrelerinin çoğalması ve farklılaşması üzerindeki etkilerini araştırmak için in vitro ortak kültür stratejisi sağlar.

Protokol

Tüm fare deneyleri, Sichuan Üniversitesi Batı Çin Hastanesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı (Onay No. 20250814006, 20211212A). Bu deneyde kullanılan tüm fareler C57BL/6 genetik altyapıya sahipti.

1. Çözeltilerin hazırlanması

1. Floresansla aktive hücre ayırma (FACS) tamponu hazırlayın: %0,5 sığır serum albümini (BSA) içeren 1× PBS.
2. Manyetik aktifle aktif hücre ayırma (MACS) tamponu hazırlayın: %0,5 BSA ve 2 mM etilenediamin tetraasetik asit (EDTA) içeren 1× PBS.
3. Hücre kültürü ortamı hazırlayın: %10 fetal sığır serumu (FBS), 1 mM sodyum piruvat, 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, 55 μM β-merkaptoetanol, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin içeren RPMI 1640 ortamı.

2. C57BL/6 fare lenfositlerinin hazırlanması

1. 6–8 haftalık C57BL/6 faresinin (erkek ya da dişi) dalak ve periferik lenf düğümlerini steril koşullarda alın ve 50 mL santrifüj tüpüne 5 mL FACS tamponu yerleştirilin.
   NOT: Dalak ve LN'lerin diseksiyonu standart prosedürlere uygun olarak yapılmalıdır.
2. 70 μm hücre süzgecini 50 mL'lik bir santrifüj tüpünün üzerine yerleştirin, ardından dalak ve LN'leri süzgecin üzerine yerleştirin ve 5 mL bir şırınga pistonu kullanarak dokuyu 1 dakika boyunca nazikçe öğütürün. Öğütme sırasında süzgeçi FACS tamponu ile 3 kez durulayın. Tüm dokuları tamamen öğüttün ve hücreleri santrifüj tüpüne sulan. Öğüttün sonra süzgeci çıkarın.
3. Santrifüj 4 °C'de, 350 × g 7 dakika boyunca kullanın.
4. Süspansiyonu çıkarın, hücre pelletini 3 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponunda yeniden süspansiyona bırakın ve süspansiyonu oda sıcaklığında 3–5 dakika boyunca bırakın.
5. Hemen santrifüj tüpüne FACS tamponu ekleyin, lizisi sonlandırmak için 15–20 mL hacmde ve 4 °C'de, 350 × g'de 7 dakika boyunca santrifüj yapın.
6. Üst malzemeyi çıkarın, 10 mL FACS tamponu ekleyin ve hücre pelletini nazikçe tekrar süzüldürün.
7. 10 μL hücre süspansiyonu alın ve toplam canlı lenfositleri saymak için trypan mavisi boyama kullanın.
   NOT: Bu hücreler CD45.2⁺ lenfositlerdir.

3. CD45.1 fare lenfositlerinin hazırlanması

1. 6–8 haftalık CD45.1 faresinin (erkek ya da dişi) dalak ve LN'lerini steril koşullarda alın ve 50 mL santrifüj tüpüne 5 mL FACS tamponu yerleştirilin.
2. CD45.1 faresinden lenfositleri yukarıda açıklanan adımları izleyerek hazırlayın.
   NOT: Bu hücreler CD45.1⁺ lenfositlerdir.

4. CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ naif T hücrelerinin hazırlanması

NOT: Tüm süreç MACS için CD4⁺CD62L⁺ T Hücre İzolasyon Kitini kullanır. MACS tamponu 4 °C'de önceden soğutulur ve tüm santrifüj koşulları 4 °C, 350 × g 7 dakika boyunca değişir.

1. C57BL/6 farelerinden hücre süspansiyonunu toplayın, santrifüj yapın ve süpernatantı atın, 1 × 10,8 başlangıç toplam hücre başına santrifüj tüpüne 400 μL MACS tamponu ve 100 μL CD4⁺ T Hücre Biotin-Antikor Kokteyli ekleyin. Nazikçe karıştırın ve 4 °C'de karanlıkta 5 dakika kuluçka yapın.
2. Santrifüj tüpüne 1^{× 108} başlangıç hücresi başına 4.1 adımdan 300 μL MACS tamponu ve 200 μL Anti-Biotin Mikroboncuk ekleyin. Nazikçe karıştırın ve 4 °C'de karanlıkta 10 dakika kuluçka yapın.
3. 10 mL MACS tampon, santrifüj ekleyin ve süpernatantı atın. Hücre pelletini 2 mL MACS tamponunda yeniden askıya alın.
4. LS kolonunu uygun MACS ayırma manyetik ayırıcısına yerleştirin. Kolonu durulamak için 3 mL MACS tamponu kullanın. Bir sonraki adıma geçmeden önce kolondaki tampon tamamen boşalana kadar bekleyin.
   NOT: LS kolonunun maksimum hücre yükleme kapasitesi 2 × 10⁹ hücredir; hem pozitif hem de negatif hücreler dahildir ve yakalayabildiği maksimum pozitif hücre sayısı 1 × 10^8'dir. Genellikle, burada tek bir fare sadece bir LS sütunu gerektirir.
5. 4.3. adımdan itibaren hücre askısını LS kolonuna yükleyin. Hücre süspansiyonu tamamen kolona akarken, kolonu yıkamak için 3 mL MACS tamponu kullanın. Tüm akış sıvısını yeni bir 15 mL'lik santrifüj tüpünde toplayın.
   NOT: Bunlar toplam CD4⁺CD25^– T hücreleridir.
6. 4.5. adımda elde edilen toplam CD4⁺CD25^– T hücrelerini santrifüjlen, süpernatantı atın ve hücre pelletini elde edinin.
7. Hücre pelletine 1 ×^10.8 başlangıç hücresi başına 800 μL MACS tamponu ve 200 μL CD62L Mikroboncuk ekleyin. Nazikçe karıştırın ve 4 °C'de karanlıkta 10 dakika kuluçka yapın.
8. Santrifüj tüpüne 10 mL MACS tamponu ekleyin, santrifüj yapın ve süpernatantı atın, hücre pelletini 500 μL MACS tamponuna yeniden süskü altına alın.
9. MS kolonunu uygun MACS ayırma manyetik ayırıcısına yerleştirin ve kolonu 1 mL MACS tamponu ile durulayın.
10. Hücre süspansiyonunu MS kolonuna yükleyin. Askı tamamen kolona aktığında, kolonu 2 kez yıkamak için 1 mL MACS tamponu kullanın.
11. MS kolonunu manyetik ayırıcıdan çıkarın ve yeni bir 15 mL'lik santrifüj tüpünün üzerine yerleştirin. Kolona 1 mL MACS tamponu ekleyin ve manyetik boncuklarla işaretlenmiş hücreleri elülasyon etmek için pistonu hemen sıkıca basın.
12. Hücreleri sayın, santrifüj yapın ve üstten atın, hücreleri uygun bir hacimdeki kültür ortamında yeniden süspansiyona yerleştirin ve tüpü buz üzerinde tutun.
    NOT: Bu hücreler CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ naif T hücreleridir. Genellikle, yaklaşık 8 × 10⁶ ila 1 × 10⁷ CD4⁺CD25^–CD62L⁺ naif T hücresi bir fareden arındırılabilir; Periferik lenf düğümlerinin dahil edilmesi verimi artırabilir.
13. İzole edilen hücrelerin saflığını belirleyin: 5 × 10⁴ izole CD4⁺CD62L⁺ T hücresini alın ve bunları 1,5 mL santrifüj tüpünde 50 μL antikor çözeltisine yeniden süzülür.
    NOT: Antikor çözeltisini FACS tamponuna 1:100 oranında anti-fare CD4 PerCP-Cy5.5 antikor, anti-fare CD62L FITC antikoru ve anti-fare CD25 PE antikoru ekleyerek hazırlayın.
14. Karanlıkta 4 °C sıcaklıkta 20 dakikalık kuluçkadan sonra, hücreleri yıkamak için 1 mL FACS tamponu ekleyin. Hücreleri santrifüjleyin, süpernatantı çıkarın ve peleti 200 μL FACS tamponunda yeniden süzülür.
15. Numunelerin saflığını akış sitometrisiyle tespit edin.
    NOT: Akış sitometre analizinin detayları için, cihazın kullanıcı kılavuzuna veya daha önce bildirilen^{protokol 14'e} bakınız. CD4⁺CD25^–CD62L⁺ saf T hücrelerinin saflığı, izole T hücresi örneğinde %95'ten fazla olmalıdır (Şekil 2).

5. CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ Treg ile zenginleştirilmiş hücrelerin ve antijen sunan hücre zenginleştirilmiş CD4⁺ olmayan hücrelerin hazırlanması

NOT: Tüm süreç, MACS için CD4⁺CD25⁺ Düzenleyici T Hücre İzolasyon Kiti kullanılmakta ve kitteki talimatlar, antijen sunan hücre (APC) ile zenginleştirilmiş CD4⁺ olmayan hücreler ile CD4⁺CD25⁺ Treg zenginleştirilmiş hücreleri aynı anda elde edecek şekilde optimize edilmiştir. MACS tamponu 4 °C'de önceden soğutuluyor ve tüm santrifüj koşulları 4 °C, 350 × g 7 dakika boyunca.

1. CD45.1 farelerinden hücre süspansiyonunu toplayın, santrifüj yapın ve süpernatantı atın, 1 × 10,8 başlangıç toplam hücre başına santrifüj tüpüne 400 μL önceden soğutmalı MACS tamponu ve 100 μL CD4⁺CD25⁺ Düzenleyici T Hücresi Biotin-Antikor Kokteyli ekleyin. Nazikçe karıştırın ve 4 °C'de karanlıkta 10 dakika kuluçka yapın.
2. Yıkamadan, santrifüj tüpüne 1 × 10⁸ başlangıç hücresi başına doğrudan 380 μL önceden soğutmalı MACS tamponu, 200 μL Anti-Biotin Mikroboncuk ve 20 μL CD25-PE antikoru eklenin. Nazikçe karıştırın ve 4 °C'de karanlıkta 15 dakika kuluçka yapın.
3. Santrifüj tüpüne 10 mL MACS tamponu ekleyin, santrifüj yapın ve üst paneli atın, ardından hücre pelletini 1 × 10-8 başlangıç hücresi için 500 μL MACS tamponunda yeniden süzülür.
4. LD kolonunu uygun MACS ayırma manyetik ayırıcısına yerleştirin ve kolonu 2 mL MACS tamponu ile durulayın. Bir sonraki adıma geçmeden önce kolondaki tampon tamamen boşalana kadar bekleyin.
5. 5.3. adımdan itibaren hücre süspansiyonunu yavaşça LD kolonuna yükleyin. Hücre süspansiyonu tamamen kolona aktığında, kolonu 2 mL MACS tamponu ile 2 kez yıkayın. Tüm akış sıvısını yeni bir 15 mL'lik santrifüj tüpünde toplayın.
6. LD kolonunu manyetik ayırıcıdan çıkarın ve yeni bir 15 mL'lik santrifüj tüpüne yerleştirin. LD kolonuna 3 mL MACS tamponu ekleyin, hemen pistonu sıkıca iterek Microbeads etiketli CD4⁺ olmayan hücreleri dışarı çıkarın. Hücreleri sayın, santrifüj yapın, hücreleri uygun bir hücre kültürü ortamında yeniden süspansiyona yerleştirerek 1 ×^10-7 hücre/mL hücre konsantrasyonu elde edin ve tüpü buz üzerinde tutun.
   NOT: Bu CD4⁺ olmayan hücreler esas olarak makrofajlar, dendritik hücreler ve B hücreleri gibi APC'lerden oluşur. Bu protokolde, bu hücreler APC ile zenginleştirilmiş CD4⁺ olmayan bir fraksiyon olarak kullanılır.
7. 5.5. adımdan toplanan toplam CD4⁺ T hücrelerini santrifüj edin, süpernatantı atın ve hücre pelletini elde edinin.
8. Hücre pelletine 1^{× 10} 8 başlangıç hücresi başına 900 μL MACS tamponu ve 100 μL Anti-PE Mikroboncuk ekleyin. Nazikçe karıştırın ve 4 °C'de karanlıkta 15 dakika kuluçka yapın.
9. MS kolonunu uygun MACS ayırma manyetik ayırıcısına yerleştirin ve kolonu 500 μL önceden soğutmalı MACS tamponuyla durulayın. Bir sonraki adıma geçmeden önce kolondaki tampon tamamen boşalana kadar bekleyin.
10. 5.8. adımdan itibaren hücre süspansiyonunu MS kolonuna yavaşça yükleyin. Hücre süspansiyonu tamamen kolona aktığında, kolonu 1 mL MACS tamponu ile 2 kez yıkayın. Akış sıvısını yeni bir 15 mL'lik santrifüj tüpünde toplayın.
    NOT: Şu anda akış sıvısındaki hücreler CD4⁺CD25^– T hücreleridir.
11. MS kolonunu manyetik ayırıcıdan ayırın ve yeni bir 15 mL'lik santrifüj tüpünün üzerine yerleştirin. Sütuna 1 mL MACS tamponu ekleyin, ardından pistonu hemen bastırarak manyetik boncuk etiketli CD4⁺CD25⁺ Treg zenginleştirilmiş hücreleri geri alın.
12. Hücreleri saydıktan sonra süspansiyonu santrifüjle edin ve üst süspansiyonu çıkarın. Peleti yeterince kültür ortamında tekrar askıya alın, böylece son konsantrasyon 2 ×^{10 6} hücre/mL elde edilir ve tüpü buz üzerinde tutun.
    NOT: Bu hücreler CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ Treg zenginleştirilmiş hücrelerdir. Genellikle, bir fareden yaklaşık 8 × 10⁵ ila 1 × 10⁶ CD4⁺CD25⁺ hücresi arındırılabilir; Periferik lenf düğümlerinin dahil edilmesi verimi artırabilir.
13. İzole CD4⁺CD25⁺ Treg zenginleştirilmiş hücrelerin saflığını belirleyin: Sırasıyla 5 ×^{10 4} izole CD4⁺CD25⁺ Treg zenginleştirilmiş hücre ve 5 × 10⁴ izole APC zenginleştirilmiş CD4⁺ olmayan hücre alın ve bunları 50 μL antikor çözeltisine yeniden süzültün.
    NOT: Antikor çözeltisini, anti-fare CD4 PerCP-Cy5.5 antikoru ve anti-fare CD25 PE antikorunu FACS tamponuna 1:100 oranında ekleyerek hazırlayın. Burada aynı anti-fare CD25 PE antikorunu kullanarak CD4⁺CD25⁺ hücrelerinin yeterince etiketlendiğini ve ^CD4+ olmayan fraksiyonda CD4⁺CD25⁺ T hücresi olmadığını doğrulayabilirsiniz. Treg hücrelerinin daha sıkı tanımlanması için, anti-fare Foxp3 PB antikoru ile hücre içi boyama da yapılabilir.
14. Karanlıkta 4 °C'de 20 dakikalık kuluçkadan sonra, hücreleri yıkamak için 2 mL FACS tamponu ekleyin. Hücreleri santrifüjleyin, süpernatantı çıkarın ve peleti 200 μL FACS tamponunda yeniden süzülür.
15. Numunelerin saflığını akış sitometrisiyle tespit edin.
    NOT: CD4⁺CD25⁺ hücrelerinin sıklığı, Treg ile zenginleştirilmiş hücre popülasyonunun saflığının deneysel gereksinimleri karşılamasını sağlamak için %95 ≥ olmalıdır (Şekil 2). APC ile zenginleştirilmiş fraksiyon olarak kullanılan CD4⁺ olmayan hücreler, %5'ten fazla CD4⁺ T hücresi içermemelidir (Şekil 2).

6. Naif CD4⁺ T hücrelerinin hücre proliferasyon boyası ile etiketlenmesi

NOT: Tüm santrifüj koşulları 4 °C, 350 × g 7 dakika boyunca. PBS tamponu, kullanımdan önce oda sıcaklığına önceden dengelenir. Etiketleme işlemi, boya söndürülmesini önlemek için ışık koruması altında yapılır.

1. Naif CD4⁺ T hücre süspansiyonunu alın, santrifüj yapın, süpernatantı atın ve hücre pelletini elde edin.
2. Hücre Proliferasyon Boya eFluor 450'yi PBS içinde seyreltirerek oda sıcaklığında 20 μM konsantrasyon elde edin.
3. 1 ×^{7 hücre başına} 0,5 mL PBS ekleyin. Tüpü yaklaşık 45° eğik tutun ve hücreleri yukarı aşağı pipetle 50 kat nazikçe yeniden süzül.
4. Hücre süspansiyonuna hızlıca eşit hacimde hücre proliferasyon boyası çözeltisi ekleyin, böylece hücre çoğalma boyasının nihai konsantrasyonu 10 μM olsun. Tüpü yaklaşık 45° eğik tutun ve hücreler ile hücre çorak boyası arasında tam temas sağlamak için 50 kez yukarı ve aşağı pipet ile karıştırın.
5. Aydın maruziyetini önlemek için santrifüj borusunu hemen alüminyum folyo ile sarın. Oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka yapın. Hücrelerin toplanmasını önlemek için her 5 dakikada bir nazikçe girdabla vurularak hücreleri çalıştırın.
6. Santrifüj tüpüne 10 mL önceden soğutulmuş hücre kültürü ortamı ekleyin, boyamayı sonlandırmak için nazikçe girdabla hareket ettirin, sonra santrifüj yapın ve süpernatantı atın.
7. Hücre pelletine 5 mL önceden soğutulmuş hücre kültürü ortamı ekleyin, santrifüj edin ve süpernatantı atarak hücreleri yıkayın.
8. Hücre pelletine tekrar 5 mL önceden soğutulmuş hücre kültürü ortamı ekleyin ve hücreleri yeniden süzülür.
9. Hücreleri sayın, santrifüjle yapın ve süpernatantı atın, hücreleri uygun hacimde kültür ortamında tekrar askıya alın, böylece hücre konsantrasyonu 2 ×^{10 6} hücre/mL elde edilir ve tüpü buz üzerinde tutarsınız.

7. Treg hücrelerinin in vitro fonksiyonel analizinin kurulması

1. Hücre kültürü için gereken örnek sayısını hesaplayın, 2,5 μg/mL anti-fare CD3 antikoru veya belirtilen indüksiyon sitokinleri içeren uygun miktarda hücre kültürü ortamı hazırlayın ve hazırlanan CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ naif T hücrelerini, CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ Treg zenginleştirilmiş hücreleri ve APC zenginleştirilmiş CD4⁺ olmayan hücreleri nazikçe girdabla girdabla yerleştirin.
   NOT: CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ naif T hücrelerini yanıt veren T (Tresp) hücreleri olarak kullanın. Bu örnek deney, Treg hücrelerinin Th1 ve Th17 hücrelerinin farklılaşması ve çoğalması üzerindeki etkisini inceler. Bu nedenle, hücre kültürü için toplam dört örnek vardır: Treg zenginleştirilmiş hücrelerin yokluğunda veya varlığında Th1 veya Th17 indüksiyon koşullarında kültürlenen Tresp hücreleri.
2. 48 kuyuluğa 100 μL CD45.2⁺CD4⁺ naif T hücresi (2 × 10,5 hücre) ekleyin.
3. 48 kuyu plakasına 100 μL APC ile zenginleştirilmiş CD44+ olmayan CD4⁺ hücre (1 × 10⁶ hücre) 48 kuyu plakasına ekleyin.
4. Deneysel kuyulara 100 μL CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ Treg ile zenginleştirilmiş hücreler (2 × 10⁵ hücre) deneysel kuyulara eklenin ve kontrol kuyularına 100 μL hücre kültürü ortamı eklenin. Deneysel örneklerde Treg ile zenginleştirilmiş hücre:Tresp oranı 1:1'dir.
   NOT: Treg hücrelerinin Tresp hücrelerine oranı gerektiğinde ayarlanabilir veya birden fazla orandan oluşan bir panel tasarlanabilir. Tresp hücre sayısı ortak kültürde sabit olurken, Treg hücre sayısı gerektiğinde değiştirilebilir. Genellikle, deneysel örneklerdeki Treg ile Tresp oranları 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 ve 0:1 olarak değişir. Ayrıca, her deneysel koşul rastgele deneysel hataları en aza indirmek için üç kat halinde hazırlanabilir. Burada, netlik için, önceki araştırma^{deneyimine 15,16} dayanarak, örnek olarak 1:1 oranı kullanılmıştır.
5. Her kuyuyuya 2,5 μg/mL anti-fare CD3 antikoru içeren 100 μL hücre kültürü ortamı ekleyin.
   NOT: Anti-fare CD3 antikorunun nihai konsantrasyonu 0,5 μg/mL'dir. Deneysel örneklere ek olarak, anti-fare CD3 antikoru olmayan boş kontrol örneği ayarlayın. Bu örnekte, proliferlenen olmayan T hücrelerinin floresans yoğunluğunu veya zirve 0 yoğunluğunu belirlemek için anti-fare CD3 antikoru olmayan 100 μL T hücresi kültür ortamı eklenir. Bu, yayılma dağılımının doğru kalibrasyonunu sağlar.
6. Her kuyuya belirtilen sitokinleri içeren 100 μL hücre kültür ortamı ekleyerek her kuyunun son hacmi 500 μL olur.
   NOT: Bu deneyde, Th1 hücrelerini indüklemek için son konsantrasyon 10 ng/mL olan rekombinant fare IL-12 p70 kullanılır ve Th17 hücrelerini indüklemek için 2 ng/mL nihai konsantrasyonda rekombinant insan TGF-β1 ve 50 ng/mL rekombinant fare IL-6 kullanılır.
7. Kalan boş kuyulara PBS (500 μL/kuyyu) ekleyin, böylece plakanın nemi korunur ve kenar etkileri azalır.
8. 48 kuyu plakasını %5_CO2 inkubatörde 37 °C'de 3 gün boyunca kuluçka yapın.
   NOT: Bu ortak kültür sisteminde, çözünür anti-fare CD3 antikoru T hücresi aktivasyonu için birincil T hücresi reseptörü (TCR) sinyalini sağlarken, APC ile zenginleştirilmiş CD4⁺ olmayan hücreler T hücrelerini tam olarak aktive etmek için kostimulyatör sinyaller sağlar. TCR ve kostimulyatör sinyaller ayrıca plaka kaplı anti-fare CD3 antikoru ve çözünür anti-fare CD28 antikoru tarafından da tetiklenebilir. Araştırmacılar ihtiyaç duydukça uyarma yöntemini seçebilirler.

8. Treg hücrelerinin in vitro fonksiyonel analizi

NOT: Tüm santrifüj koşulları 4 °C, 350 × g 7 dakika boyunca.

1. Kültürlenen hücreleri nazikçe pipetleyin, yeniden süspansiyon ve süspansiyonu 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri santrifüjle yapın ve süpernatantı çıkarın.
2. Her tüpte 5 ng/mL PMA, 1 μg/mL iyonomisin ve 1:1.000 seyreltilmiş GolgiPlug Protein Taşıma İnhibitörü içeren 500 μL hücre kültür ortamı ekleyin, hücreleri nazikçe girdabla yeniden süzülerek yerleştirin ve 37 °C'de %5_CO2 kuluçka makinesinde 3 saat boyunca kuluçka yapın.
3. Santrifüj yapın, süpernatantı atın, her numuneye bir test Zombie Yellow boya ve 1:100 seyreltilmiş anti-fare CD16/32 antikoru içeren 50 μL PBS ekleyin, girdablar ve oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika kuluçka yapın, ölü hücreleri etiketlemek ve Fc reseptörlerini bloklamak için.
4. Santrifüj, üst yüzeyi at, 50 μL yüzey antikor kokteyli ve vortex ekleyin ve 4 °C'de karanlıkta 20 dakika inkübe edin.
   NOT: Yüzey antikor kokteyli hazırlanmak için FACS tamponuna 1:200 oranında anti-CD4 PerCP-Cy5.5 antikor, anti-CD45.1 FITC antikor ve anti-CD45.2 APC-eFluor 780 antikor ekleyin.
5. Her santrifüj tüpüne 1 mL FACS tamponu ekleyin ve süpernatantı atın.
6. Her santrifüj tüpüne, girdava 300 μL Fiksasyon ve Permeabilizasyon Çözeltisi ekleyin ve 4 °C'de karanlıkta 20 dakika kuluçka yapın.
7. Her santrifüj tüpüne, santrifüje 1 mL 1× Permeabilizasyon/Yıkama (Perm/Yıkama) Tamponu ekleyin ve üst tamponu atın; Sonra bu yıkama adımını bir kez tekrarlayarak kalan fiksantörün tamamen çıkarıldığından emin olun.
8. 50 μL sitokin antikor kokteyli ve vortex ekleyin ve 4 °C'de karanlıkta 40 dakika inkübe yapın.
   NOT: Sitokin antikor kokteylini hazırlamak için perm/yıkama tamponu içine 1:100 oranında anti-IFN-γ PE antikor ve anti-IL-17A PE-Cy7 antikoru ekleyin.
9. Her örneği 1 mL Perm/Wash tamponu ile yıkayın, hücreleri santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. Pelleti 300 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın.
10. Tresp hücrelerinin proliferasyonunu ve farklılaşmasını akış sitometrisi ile ölçmek. Aşağıdaki kapı stratejisini kullanın (Şekil 3): öncelikle, toplam hücreler arasında lenfosit popülasyonunu kapta alın ve hücre kalıntıları ile safsızlıkları dışlayın; ikincisi, saçılma sinyallerine göre lenfositler arasındaki tek hücreli popülasyonu kapitlemek; üçüncüsü, canlı hücre popülasyonunu tek hücreler arasında kapaj etmektir; dördüncüsü, canlı hücreler arasında CD4⁺ T hücre popülasyonunu kapatır; beşincisi, CD45.1⁺ Treg zenginleştirilmiş hücre popülasyonunu ve CD45.2⁺ Teff hücre popülasyonunu CD4⁺ T hücreleri arasında kapatır; altıncı olarak, kapı CD45.2⁺CD4⁺IFN-γ⁺ Th1 hücreleri, CD45.2⁺CD4⁺IL-17A⁺ Th17 hücreleri ve CD45.2⁺ T hücreleri arasında üremeyen CD45.2⁺CD4⁺ T hücreleri bulunur.
11. Akış sitometrisi veri toplama işlemlerini gerçekleştirin ve akış sitometri verilerini analiz edin.
    1. Hücre proliferasyon boyası eFluor 450 ile etiketlenmiş kültürlenmiş T hücrelerini hücre çoğalma boyası tek boyalı kontrol olarak kullanın. Zombie Yellow boya tek boyalı kontrolü, hücre proliferasyon boyası ile etiketlenmemiş kültürlenmiş T hücreleriyle hazırlayın. Diğer tek boyalı kontrolleri, kullanılan her florofor için kompensasyon boncuklarıyla hazırlayın.
    2. Çoğalmayan hücrelerin kapısını tanımlamak için eFluor 450 hücre proliferasyon boyası eFluor 450 ile etiketlenmiş ve anti-fare CD3 antikoru olmadan kültürlenmiş T hücreleri kullanılır.
    3. IFN-γ⁺CD4⁺ ve IL-17A⁺CD4⁺ T hücrelerinin kapılarını tanımlamak için hücre proliferasyon boyası ile etiketlenmiş ve Zombie Yellow boyasıyla boyanmış kültürlenmiş T hücreleri, tüm hücre yüzeyi antikorları ve fare karşıtı IFN-γ PE antikoru ile anti-fare IL-17A PE-Cy7 antikorlarının izotip kontrollerini kullanın.

Sonuçlar

Temsilci deneyde, Treg ile zenginleştirilmiş hücrelerin Th1 ve Th17 hücrelerinin çoğalması ve farklılaşması üzerindeki etkilerini incelemek için naif T hücreleri Tresp hücreleri olarak kullanıldı. Bu deneyde, Tresp hücreleri anti-fare CD3 ve APC ile zenginleştirilmiş CD4⁺ olmayan hücreler tarafından aktive edildi ve ardından IL-12 p70 indüksiyonu altında Th1 hücrelerine veya TGF-β1 ve IL-6 indüksiyonu altında Th17 hücrelerine farklılaştı. Bu iki indüksiyon koşullarında, Tresp hücrelerinin çoğalma ve farklılaşm...

Tartışma

Bu çalışmada, Th1 indüksiyon koşullarında yapılan ortak kültür sonuçları, Treg hücrelerinin Th1 hücre çoğalmasını ve farklılaşmasını baskılayabildiğine dair önceki raporlarla^{tutarlıdır 17,18}. Treg ile zenginleştirilmiş hücreler ayrıca Th17 indüksiyon koşullarında Tresp hücrelerinin çoğalmasını da engellemiştir. Ancak, burada kullanılan Th17-polarize koşullarında, Treg ile zenginleştirilmiş hücrelerin varlığında IL-17A⁺...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1.5 mL centrifuge tube	Thermo Fisher Scientific	3457IW	veya eşdeğeri
12.5 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420043	veya eşdeğeri
1250 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420813	veya eşdeğeri
15 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339650	veya eşdeğeri
200 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420318	veya eşdeğeri
48-well plates	Corning Incorporated	3548	veya eşdeğeri
5 mL syringe piston	Shifeng Medical	SB2-061(A)	veya eşdeğeri
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	339652	veya eşdeğeri
50 μL Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	94420258	veya eşdeğeri
70 μm cell strainer	Biosharp Life Sciences	BS-70-CS	veya eşdeğeri
Anti-mouse CD28 antibody	BioXcell	BE0015-1	veya eşdeğeri
Anti-mouse CD3 antibody	BioXcell	BE0001-1	veya eşdeğeri
Anti-mouse Foxp3 PB (FJK-16s)	Thermo Fisher Scientific	48-5773-82	veya eşdeğeri
Anti-mouse IFN-gamma PE (XMG1.2)	BioLegend	505808	veya eşdeğeri
Anti-mouse IL-17A PE-Cy7 (eBio17B7)	Thermo Fisher Scientific	25-7177-82	veya eşdeğeri
Beckman CytoFLEX S Flow Cytometer	Beckman Coulter	N/A	immune cell samples için akış sitometre veri toplama
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	B2064	veya eşdeğeri
C57BL/6 mice	Shanghai Model Organisms Center, Inc	SM-001	primary lymphocytes ve T cell subsets izole etmek için
CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE	Thermo Fisher Scientific	12-0251-83	veya eşdeğeri
CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-091-041	hücre sıralama için
CD4+CD62L+ T Cell Isolation Kit, mouse	Miltenyi Biotec	130-106-643	hücre sıralama için
CD45.1 mice	Shanghai Model Organisms Center, Inc	NM-KI-210226	primary lymphocytes ve T cell subsets izole etmek için
CD45.1 Monoclonal Antibody (A20), FITC	Thermo Fisher Scientific	11-0453-85	veya eşdeğeri
CD45.2 Monoclonal Antibody (104), APC-eFluor 780	Thermo Fisher Scientific	47-0454-82	veya eşdeğeri
CD62L (L-Selectin) Monoclonal Antibody (MEL-14), FITC	Thermo Fisher Scientific	11-0621-85	veya eşdeğeri
Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit	BD Biosciences	554714	veya eşdeğeri
eBioscience Cell Proliferation Dye eFluor 450	Thermo Fisher Scientific	65-0842-90	veya eşdeğeri
ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	Solarbio Life Sciences	E1170	veya eşdeğeri
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	A5669701	veya eşdeğeri
FlowJo 10.6.2	BD Biosciences	N/A	akış sitometre veri analizi için yazılım
Golgi-Plug Protein Transport Inhibitor	BD Biosciences	555029	veya eşdeğeri
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15630080	veya eşdeğeri
Human TGF-beta1	PEPROTECH	100-21C	veya eşdeğeri
Ionomycin calcium salt	Millipore Sigma	I3909	veya eşdeğeri
LD Columns	Miltenyi Biotec	130-042-901	hücre sıralama için
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	veya eşdeğeri
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401	hücre sıralama için
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	hücre sıralama için
MS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-201	hücre sıralama için
OctoMACS Separators	Miltenyi Biotec	130-042-109	hücre sıralama için
PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010049	veya eşdeğeri
PE Rat IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400408	veya eşdeğeri
PE/Cyanine7 Rat IgG2a kappa Isotype Control Antibody	Thermo Fisher Scientific	25-4321-82	veya eşdeğeri
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	veya eşdeğeri
PMA	Millipore Sigma	P8139	veya eşdeğeri
Purified anti-mouse CD16/32 Antibody	BioLegend	101302	veya eşdeğeri
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976	hücre sıralama için
Recombinant mouse IL-12 p70	PEPROTECH	210-12	veya eşdeğeri
Recombinant Mouse IL-6	R&D Systems	406-ML	veya eşdeğeri
Red Blood Cell Lysis Buffer (ACK Lysing Buffer)	Thermo Fisher Scientific	A1049201	veya eşdeğeri
RPMI 1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875093	veya eşdeğeri
Sodium Pyruvate (10