Akut Miyeloid Lösemi Ölçülebilir Kalıntı Hastalık İçin Çok Merkezli Akış Sitometrisi, LAIP/DfN ve CD34+CD38 ile Lökemik Kök Hücre Zenginleştirilmiş Popülasyonlar İçin

Özet

Bu protokol, lösemi ile ilişkili immünofenotip/normalden farklı (LAIP/DfN) analizi ve fenotipik olarak tanımlanmış CD34⁺CD38⁻ lökemik kök hücre zenginleştirilmiş popülasyonları kullanarak akut miyeloid lösemi ölçülebilir kalıntı hastalığın nicelendirilmesi için çok merkezli akış sitometrisi iş akışını tanımlar.

Özet

ELN 2025 yönergelerine göre akut miyeloid lösemi (AML) klinik denemelerinde tedavi yanıtı değerlendirmesi için ölçülebilir kalıntı hastalık (MRD) takibi önerilir. Bu çalışmanın amacı, AML klinik denemelerine katılan 30 Fransız hematoloji laboratuvarında uyumlu MRD akışı yaklaşımıyla hastaların standartlaştırılmış bir takimini uygulamaktı. Benzer sonuçlar elde etmek için ağ, ıslak laboratuvar prosedürlerinden klinik raporlara kadar öneriler oluşturdu. ELN önerilerine göre, tüp başına zorunlu 8 renkli ortak belirteçler içeren 3 tüplü bir panel tasarladık; böylece CD34⁺CD38⁻ fraksiyonunda toplu hücrelerde ve lökemik kök hücre (LSC) ile zenginleştirilmiş popülasyonlarda lösemi ile ilişkili immünofenotip/normalden farklı (LAIP/DfN) desenlerini tespit ettik. CD34/CD38/CD45/CD117 omurgası kullanıldı; birinci tüp için soy işaretleyicileri, ikinci tüp için LSC ile ilişkili işaretleyiciler ve üçüncü tüp için monositik ve farklılaşma belirteçleri eklendi. Bu panel 8, 10 ve 12 renkli formatlarda kullanılabilir ve birden fazla geleneksel akış sitometre platformunda uygulanabilir. Her platforma uyarlanmış akış sitometresi ayarları öneriyoruz.

Dört platform arasındaki hassasiyetin uyumlaştırılması, 8 zirveli gökkuşağı boncukları kullanılarak gerçekleştirildi. İmmünboyama toplu lizden sonra yapıldı. Platformlar arasındaki yanlılığı tespit etmek için, boyama indeksi dört platformda paralel olarak taze sağlıklı kemik iliği örnekleri kullanılarak test edildi. Protokolün tüm adımlarını doğrulamak için laboratuvarlar arasında düzenli kemik iliği kalite kontrol örnekleri paylaşıldı. Son olarak, merkezlerde elde edilen veri analiz stratejisinin standartlaştırılması, MRD FCS veri dosyalarının paylaşılmasıyla kuru EQA kullanılarak değerlendirildi. Bu çok merkezli yaklaşımın uygulanabilirliği, cihaz hassasiyeti ve örnek hazırlamanın uyumlaştırılmasını, ayrıca analitik operatörlerin eğitimi ve sistematik eğitimini gerektirir.

Giriş

Ölçülebilir kalıntı hastalık (MRD), tedavi sırasında veya sonrasında kalıcı olan ve morfoloji tarafından tespit edilemeyen az sayıda lökemik hücreyi ifade eder; özellikle kemik iliğinde %5'ten az blast ile tam remisyon durumunda. MRD izleme, ELN 2025 kılavuzlarına göre klinik akut miyeloid lösemi (AML) çalışmalarında tedavi yanıtı değerlendirmesi için önerilir¹. Moleküler biyoloji yöntemlerinin yanı sıra, ters transkriptaz PCR (RT-qPCR) ve yeni nesil dizileme (NGS) dahil, çok parametrik akış sitometrisi (MFC) yaygın kullanılan bir^{yaklaşımdır 2}.

Özellikle klinik denemelerde tutarlı MRD sonuçları elde etmek için iki strateji mümkündür: MRD ölçümünü tek bir laboratuvarda merkezileştirmek veya MRD belirlemede yer alan farklı laboratuvarlar arasında tekrarlanabilirliği sağlayan bir protokol uygulamak. Örnek sayısı, denemenin büyüklüğü ve laboratuvarların daha büyük veya küçük örnek hacimlerini işleme kapasitesi, bu stratejiler arasındaki seçimi belirleyebilir. Çoklu merkezli bir strateji seçilirse, sitometre platformları arasındaki farklar ve siteler arasında karşılaştırılabilir analiz ihtiyacı ele alınmalıdır.

Bu amaçla, ELN önerileri ve önceki raporlara dayanarak 30 Fransız hematoloji laboratuvarında uygulanan, lösemi ile ilişkili immünofenotip/normalden farklı (LAIP/DfN) analizini ve fenotipik olarak tanımlanmış CD34⁺CD38⁻ lökemik kök hücre (LSC) zenginleştirilmiş tespiti birleştiren standartlaştırılmış çok merkezli ve çok platformlu MRD akış^{yaklaşımını tanımlıyoruz 3,4}.

Akış sitometrisi, teşhis anında, hastanın blastlarında belirteçlerin spesifik ifadesini içeren lösemi "imzasının" tanımlanmasına olanak tanır: LAIP. Tedaviden sonra, MRD akışı teşhis sırasında tespit edilen LAIP'lerin izlenmesine olanak tanır. Lökemik blastlar, terapötik baskı altında evrimleşip immünofenotiplerini değiştirebildiğinden, ikinci bir strateji sistematik olarak uygulanmalıdır: DfN yaklaşımı; bu yaklaşım, hücreleri normal hematopoiezden ayıran özelliklere sahip hücreleri belirlemeye dayanır. Bu teknik, hastalık ve tedavi sürecinde blastlarda yeni belirteçlerin ortaya çıkmasını da tespit edebilir.

Fransız AML akış grubunda, panel tasarımı daha önce yayımlanmış HOVON lösemik hücre desen tanımına dayanmaktadır. Evrensel bir LSC veya LAIP belirtisi yoktur, bu yüzden LAIP, DfN ve CD34⁺CD38⁻ LSC zenginleştirilmiş popülasyonların eşzamanlı tanımlanmasını sağlayan 3 tüplü bir panel tasarladık. Tüm tüplerde CD34/CD38/CD45/CD117 temelli bir omurga kullanılmış, birinci tüpte soy işaretleyicileri, ikinci tüpte LSC ile ilişkili işaretleyiciler ve üçüncü tüpte monositik soy veya farklılaşma belirteçleri kullanılarak AML'de monositik blastlarla LAIP tanımını tamamlamıştır. Üç tüpün tamamı tanı sırasında ve takip örneklerinde alınır.

Lökemogenezin patofizyolojisi göz önüne alındığında, dikkat blast kütlesini incelemekten, en olgunlaşmamış fraksiyonun lökemik kök hücre zenginleştirilmiş popülasyonlar olarak tanımlanmasına kaydı. Dick ve meslektaşları, immün eksikliği olan farelerde lösemi oluşturma potansiyeline sahip CD34⁺CD38⁻ LSC'leri tanımlayarak löseminin heterojenliğini^{göstermiştir (5,6}). Tanı ve takip sırasında LSC nicelendirilmesinde, ELN DAVID çalışma grubu ^1,7 içinde antikor panelleri ve analiz stratejilerini standartlaştırmak için çabalar yürütülmektedir. Şu anda, HOVON ve ALFA panelleri, CD34⁺CD38^{− 8,9} alanındaki normal hematopoietik kök hücrelerden LSC ile zenginleştirilmiş popülasyonları ayırt etmek için ikili LSC belirteçleri kullanmaktadır.

Burada açıklanan yöntem, çok merkezli AML MRD akış izleme için standartlaştırılmış örnek hazırlığı, ortak antikor panel tasarımı, platforma uyarlanmış hassasiyet ayarları, LAIP/DfN ve CD34⁺CD38⁻ LSC ile zenginleştirilmiş analiz, dış kalite değerlendirmesi ve çok merkezli AML MRD akış izleme için uyumlu klinik raporlamayı birleştirir.

Protokol

Protokol, Fransız Üniversite Hastane Merkezleri etik komitelerinin önerileri ve yönergelerine uyar. Tüm hastalar Fransız yasalarına göre bilgilendirilmiş onay imzaladı. Çalışma protokolü, Helsinki Bildirgesi'ne (HDF-AML gözlemevi, CNIL 2214454v0) uygun olarak CHU Lyon İnsan Etik Komitesi ve Lille CHU Kurumsal İnceleme Kurulu Etik Komitesi tarafından onaylandı. Allograft için, bağışçılar Avrupa internet tabanlı ProMISE veritabanına dahil edildi ve kişisel verilerinin toplanması için bilgilendirilmiş onay verildi. Verilerin çıkarılması ve analizi, yerel Etik Komitesi (CNIL2093819) uyarınca gerçekleştirildi. Ağ incelemesi için kullanılan tüm FCS akış dosyaları tamamen Python betiği kullanılarak anonimleştirildi.

1. Sitometre ayarı

1. Her sitometreye uyarlanan hedef değerleri 8-zirveli gökkuşağı boncukları kullanarak belirleyin.
2. Her makineyi Tablo 1'de gösterilen hedef değerlere göre ayarlayın. Her kanalın hedef değerine %5± ulaştığından emin olun. Her platformun boylamasına hassasiyetini korumak için bu ayarı sistematik olarak doğrulayın.
3. Her antikor için tek boyalı tüpler kullanarak, her platforma göre telafi boncukları ve/veya hücreler kullanarak telafi matrisini oluşturun.
4. Ayar ve tazminat matrisini, MRD LAIP/DfN, LSC ve MonoGran (T1, T2, T3) olarak tanımlanan bir analiz veya protokol olarak kaydedin. AML MRD akışının nicelendirilmesi için bu testi veya protokolü alın.

2. Tıslak laboratuvar prosedürü

1. Kemik iliği aspiratı
   1. Teşhis anında ve izleme zaman noktalarında MRD1, MRD2, MRD3, MRD4 ve nüks dahil olmak üzere 1-2 ml EDTA kemik iliği toplayın.
   2. Tüpleri 24-48 saat içinde referans akış laboratuvarına gönderin.
2. Morfolojik muayene için kemik iliği smear hazırlığı
   1. Bir damla kemik iliği aspirasyonundan cam slayta koyun. Numuneyi bir coverslip veya başka bir slayt ile nazikçe yayın.
   2. 30 dakika kurutmadan sonra, yayımı May-Grünwald-Giemsa ile boyayın (Ek Dosya 1).
3. Toplu liz
   1. 1-2 ml kemik iliği örneğine 15 mL NH₄Cl lizleme çözeltisi ekleyin. Nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka yapın.
   2. Oda sıcaklığında 450 × g ile 5 dakika santrifüj yapın ve üst yüzeyi atın.
   3. Hücre pelletini 10 mL PBS/%0,1 BSA ile yeniden askıya alın. Oda sıcaklığında 450 × g sıcaklıkta 5 dakika santrifüj yapın ve üst yüzeyi atın.
   4. Hücre pelletini PBS'de 30 ×^{10 6} WBC/mL konsantrasyonda yeniden askıya alın.
4. Hücre süspansiyonunun immünbojinlenmesi
   1. Monoklonal antikorları platforma göre T1, T2 ve T3 tüplerinde dağıtın (Tablo 2). Her antikor için klon, hacim, katalog referansı ve tedarikçisini bir antikor tablosunda belirtin.
      NOT: Parlak menekşe boyalar kullanan her tüp için, antikorları eklemeden önce parlak leke tamponu kullanın.
   2. 100 μL hücre süspansiyonuna tüp başına 2-3 ×10⁶ lizlenmiş hücre ekleyin. Hücreleri antikorlarla oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika kuluçka yapın.
   3. Hücreleri 3 mL PBS ile yıkayın. 450 × g'de 5 dakika santrifüj yapın ve süpernatantı atın.
   4. Boyalı hücreleri 300 μL PBS ile yeniden süzülür.
      NOT: Önceden karıştırılmış antikor kokteylleri veya doğrulanmış kuru antikor tüpleri kullanılabilir.

3. Akış sitometre alımı

1. MRD LAIP/DfN ve LSC ölçümü için uyarlanmış ayar ve tazminat matrisi ile MRD testi veya satın alma protokolünü açın.
2. Teşhis anında her tüpte ve MRD takip örneklerinde en az 500.000 ila 1.000.000 WBC alınarak MRD hücrelerinin kümelenmesini ve düşük seviyeli MRD'ye güveni artırmak.
   NOT: LSC ölçümü için, LSC nicelendirmesi için yeterli hassasiyet elde etmek amacıyla Tüp 2'de en az 1.000.000 WBC alın (LOQ %0,002 ve LOD %0,001)^10,11.
3. Tanı ve MRD örneklerinden FCS veri dosyalarını kaydedin. Takip MRD ve LSC analizini kolaylaştırmak için alım tarihini ve hasta kimliğini kaydedin.

4. Analiz Stratejisi

1. Her merkezde kullanılan analiz yazılımına uyarlanmış önceden tanımlanmış uyumlu bir kapı stratejisi içeren ortak bir şablon ve ortak nokta-grafik dizisi kullanın.
2. CD34⁺CD38^- fraksiyonunda lökemik hücreleri üç yöntemle tanımlamak için kapı stratejisini uygulayın: LAIP, DfN ve LSC analizi.
3. Basofiller, plazmasitoid dendritik hücreler, hematogonlar, plazma hücreleri, eritroblastlar, trombosit kümeleri, kalıntılar ve lizsiz eritrositler dahil olmak üzere potansiyel spesifik olmayan olayları ve normal fizyolojik popülasyonları tespit edip dışlayın.

5. LAIP/DfN ve fizyolojik popülasyonların tanımı

1. LAIP'i toplu patlamalarda yakalamak için, FSC-W ile FSC-H karşılaştırmasına dayalı tek hücreli bir kapı çizin.
2. FSC ile SSC arasındaki canlı hücre kapısını çizin.
3. CD45^dim/SSC ile bir patlama kapısı çiz.
4. İlkel işaret kapısını CD34/CD117 kullanarak çizin.
5. İlgili LAIP kapılarını çizmek için sabit biparametrik nokta grafikleri kullanın; bunlar arasında LAIP1, LAIP2, LAIP3, LAIP4, LAIP5, LAIP6, LAIP7 ve LAIP8 dahil.
6. Fizyolojik popülasyonlar
   1. Gate hematogonları aşağıdaki dizileri kullanarak kullanın: canlı hücreler, FSC/SSC nokta grafikinde MNC, CD19/SSC nokta grafiki ve CD34/CD38 nokta grafiki. CD45/SSC kullanarak arka kapı.
   2. Kapı bazofilleri aşağıdaki dizisi kullanır: canlı hücreler, FSC/SSC nokta grafikinde MNC, CD123/CD45RA (CD123⁺⁺CD45RA^-), CD19⁺ hematogonlar hariç. CD45/SSC kullanarak arka kapı.
   3. Kapak plazmasitoid dendritik hücreler aşağıdaki dizileri kullanarak kullanılır: canlı hücreler, FSC/SSC nokta grafikinde MNC, CD123/CD45RA (CD123⁺⁺CD45RA⁺), CD19⁺ hematogonlar hariç. CD45/SSC kullanarak arka kapı.
   4. CD36/CD45 nokta grafiki kullanarak eritroblastları, trombosit kümelerini, kalıntıları ve lizsiz eritrositleri tanımlayın. CD45/SSC ve FSC/SSC kullanarak arka kapı.
7. LAIP yaklaşımı
   1. MDD'yi CD34⁺ VEYA CD117⁺ ilkel AML'de Boolean operatörleri kullanarak şu şekilde tanımlayın: LAIP1 VE LAIP2 VE LAIP3, LAIP4, LAIP5, LAIP6, LAIP7 VE LAIP8, NOT clean CD36^bright+/CD45 VE tek hücreler VE canlı hücreler VE CD34^+/CD117^+/ ilkel belirteçler VE (CD45/SSC patlama kapısı VEYA MNC CD34⁺) (Şekil 1).
   2. MDD'yi CD34-CD117^- AML'de Boolean operatörleri kullanarak şu şekilde tanımlayın: LAIP1 VE LAIP2, LAIP3, LAIP4, LAIP5, LAIP6, LAIP7 VE LAIP8, NOT clean CD36^bright+/CD45 VE tek hücreler, canlı hücreler VE CD34CD117 VE CD45/SSC patlama kapısı (Şekil 2).
8. DfN yaklaşımı
   1. LAIP yaklaşımıyla aynı şablonu kullanın ve referans kemik iliği örneklerinde tanımlanan boş alanı uygulayın (Tablo 3).
   2. Anormal popülasyonları, anormal hücreler kümesinin normal hücrelerden log ölçeğinde 0,5 on yıl ayrıldığında^{tanımlayın 12}.
   3. DfN'yi toplu patlamalar halinde yakalamak için, FSC/SSC kullanarak canlı hücreler çekin.
   4. FSC zirve/SSC alanına göre çiftleri çıkararak tek hücreler çizin.
   5. MNC kapısını FSC/SSC ile çizin.
   6. CD45/CD36/SSC kullanarak lenfositleri çıkarmak için bir temizlik kapısı uygulayın.
   7. CD45/CD36 kullanarak eritroblastları ve kalıntıları temizlemek için bir temizlik kapısı uygulayın.
   8. Boş kutuları önceki^{yayınlara göre} tanımlamak için CD34⁺/CD45/SSC ve CD117⁺/CD45/SSC olmak üzere iki giriş kapısı kullanın.
   9. Her DfN'yi iç kontrol popülasyonlarına göre çizin; çapraz soy belirteçleri için lenfositler ve kayıp, azalma veya aşırı ifade belirteçleri için normal miyeloid öncüller dahil.
   10. Boş kutuları, rejeneratör, iltihaplayıcı ve sağlıklı donör kemik iliği dahil olmak üzere referans kemik iliği örnekleriyle karşılaştırın.

6. LSC CD34⁺CD38^- popülasyonunun tanımı

1. Sağlıklı kemik iliğinden normal hematopoietik kök hücrelerde ikili ifadeye ve ekspresyonun olmamasına sahip LSC belirteçlerine dayanarak CD34⁺CD38^- alanında tanı sırasında LSC ile zenginleştirilmiş hücreleri tanımlayın.
2. LSC giriş kapısını aşağıdaki kapı dizisiyle MNC34⁺ olarak tanımlayın: canlı hücreler, tek hücreler, MNC ^ve CD45/CD34 nokta grafikinde.
3. CD34⁺CD38^- fraksiyonunu (P6) CD38 floresans-eksi bir (FMO) seviyesine dayalı katı bir eşik kullanarak tanımlayın.
4. P6 fraksiyonunda Tüp 1'deki LSC ile zenginleştirilmiş hücreleri Boolean operatörleri kullanarak aşağıdaki şekilde tanımlayın: P6CD7⁺ VEYA P6CD33⁺ VEYA P6CD19⁺ VEYA P6CD56⁺ VE TEMIZ NOT CD36^bright+ VE tek hücreler VE canlı hücreler VE MNC VE MNC CD34⁺.
5. P6 fraksiyonunda Tüp 2'deki LSC zenginleştirilmiş hücreleri Boolean operatörleri kullanarak aşağıdaki şekilde tanımlayın: P6CD45RA⁺ VEYA P6MIX⁺ VEYA P6CD123⁺ VE NOT CLEAN CD36^bright+ VE tek hücreler VE CANLI HÜCRELER VE MNC VE MNC CD34⁺.
6. Son MRD LSC kapısındaki belirsiz olayları temizlemek için CD36 kullanın (Şekil 3).

7. CD34⁺ popülasyonunda CD38^- eşiğinin tanımı

1. CD38 kanalını, CD38^- popülasyonlarını iyi çözünürlüklü CD38^+/ popülasyonlarından ayırt edecek kadar yüksek ayarlayın.
2. P6'yı CD34⁺CD38^-, P7'yi CD34⁺CD38^düşük ve P8'i CD34⁺CD38^yüksek olarak tanımlayın.
3. CD38 kanal ayarını CD38-parlak popülasyonlara dayandırın; plazma hücrelerini en parlak popülasyon olarak tanımlayın ve her platformun ölçüm aralığına göre hematogonları tanımlayın.
4. CD34⁺CD38^- popülasyonunu (P6) izoklonik CD38 kontrol yöntemiyle doğrulanmış CD38 FMO yaklaşımıyla tanımlayın.
5. Hematogon negatif seviyesi kullanılarak CD34⁺CD38^düşük popülasyonu (P7) tanımlayın.
6. CD34⁺CD38^yüksek popülasyonunu (P8) hematogon pozitiflik seviyesi ve plazma-hücre negatif seviyesi kullanarak tanımlayın (Şekil 4).
7. Uyumlu grup genelinde CD38^- eşik seviyesini, CD38-FMO veya izoklonik CD38 kontrolü gibi sağlam yöntemlerle kullanın.
8. LSC ile zenginleştirilmiş hücreleri tanımlamak için CD34⁺CD38^- fraksiyonunda en az bir anormal immünofenotip kullanın. CLL1/TIM3/CD97/CD45RA/CD123 gibi LSC belirteçleri veya CD7/CD19/CD56/CD33 gibi soy belirteçleri ekleyin.
9. Aşağıdaki eşikleri uygulayın: analiz hassasiyeti LOQ ^10-4 ve LOD ^10-5; Tanı sırasında LSC pozitifliği CD45/SSC blastlarının %1'i ≥; ve MRD takibinde LSC pozitifliği WBC'nin %0,01'ini ≥ oluşturdu.

8. Uyumlu klinik akış raporu

1. Her sonuçta şu bilgileri verin: kemik iliği kalitesi, MRD tanımlaması için kullanılan strateji, LAIP tanımı, LOD ve LOQ, eşikler ve sonuçların yorumlanması.
2. Hemodilasyon ve kemik iliği temsili
   1. Her MRD akışı klinik raporunda hemodilisyonu değerlendirerek sonucun sağlamlığını değerlendirin.
   2. Uygulanabilirse daha önce açıklanan hemodilisyon yöntemlerinden birini kullanın (Tablo 4)7,14,15,16,17,18,19,20,21.
   3. Tamamlayıcı bir yaklaşım olarak, gözlemlenen CD34/WBC45 oranı kullanılarak kemik iliği temsiliyetini, referans kemik iliği örneklerinde gözlemlenen oranla karşılaştırın, (Şekil 5) hesaplanın.
   4. Aşağıdaki formülü kullanın:
      P: saflık % = 100 × (n/L - s) / (m - s)
      s: normal periferik kandaki MNC CD34⁺ hücrelerinin oranı: 0.0005
      m: normal kemik iliğindeki MNC CD34⁺ hücrelerinin oranı: 0.035
      L: MRD hasta örneğindeki WBC45⁺ lökosit sayısı
      n: MRD hasta örneğindeki MNC CD34⁺ hücre sayısı
   5. Kemik iliği temsiliyetini örneklemin kalite değerlendirmesi olarak raporlayın. Bu değeri MRD sonuçlarını normalleştirmek için kullanmayın.
   6. Kemik iliği temsiliyetini şu şekilde yorumlayın: %100 ila %10, kemik iliğinden CD34⁺ hücrelerinin oranı üzerinde düşük etki; %10'dan %1'e MRD sonuçlarının yorumlanması için uyarı; ve < %1, yorumlanamaz sonuç.
3. Tanıda LSC niceliklendirmesi
   1. LSC ile zenginleştirilmiş hücreleri tanımlamak için kullanılan profili raporlayın, örneğin CD34⁺CD38-CD90-CD45RA⁺MIX⁺(CLL1/TIM3/CD97)CD7⁺CD56⁺.
   2. Teşhis sırasında LSC sonuçlarını CD45/SSC patlamalarından gözlemlenen yüzdeyle bildirin.
   3. Kötü prognoz için eşik olarak LSC ≥ toplam blastların %1'ini kullanın.
4. LAIP/DfN tarafından takip MRD
   1. MRD'yi tanımlamak için kullanılan LAIP profilini raporlayın, örneğin CD34⁺CD38^dim+CD13^+/-CD33⁺⁺CD117⁺CD7⁺.
   2. Analizin hassasiyetini, referans kemik iliği örneklerine kıyasla LAIP profilinde gözlemlenen teknik eşik ile sağlamlık değeri arasında en az hassas değer olarak bildirin.
   3. Nicel belirleme sınırı olarak edinilen WBC olayları arasında en az 50 hücrelik bir küme kullanın. Örneğin, 500.000 WBC hücresi ile LOQ %0,01 (1 × ^10-4) olur.
   4. LAIP/DfN sonuçlarını pozitif, olumsuz, tespit edilebilir ancak klinik eşiğin altında veya tespit edilemez olarak bildirin.
   5. LAIP/DfN pozitifliğini %0,1≥ olarak bildirin, toplam CD45⁺ lökositlerin yüzdesi olarak ifade edilmiştir.
   6. LAIP/DfN negatifliğini %0,1 < olarak bildirin.
   7. Tespit edilebilir ancak eşik altında sonuçlar için, temsil değeri ve hassasiyet eşiğini bildirin.
   8. Tespit edilemeyen sonuçlar için, sonucun analiz hassasiyet eşiğinden düşük olduğunu bildirin ve gerekirse hemodilution, düşük LAIP özgülüğü veya yetersiz teknik eşik gibi bir yorum ekleyin.
5. LSC tarafından takip MRD
   1. LSC ile zenginleştirilmiş hücreleri tanımlamak için kullanılan profili raporlayın, örneğin CD34⁺CD38-CD90-CD45RA⁺MIX⁺(CLL1/TIM3/CD97)CD7⁺CD56⁺.
   2. Nicel sınırı olarak edinilen WBC olayları arasında en az 20 hücrelik bir küme kullanın. Örneğin, 1.000.000 WBC hücresi ile LOQ %0.002 (2 × ^10-5) olur.
   3. LSC sonuçlarını pozitif, olumsuz, tespit edilebilir ama klinik eşik altında veya tespit edilemez olarak bildirin.
   4. LSC pozitifliğini %0,01 ≥ olarak raporlayın ve toplam CD45⁺ lökositlerin yüzdesi olarak ifade edilmiştir.
   5. LSC negatifliğini %0,01 < olarak bildirin.
   6. Tespit edilebilir ancak eşik altında sonuçlar için, temsil değeri ve hassasiyet eşiğini bildirin.
   7. Tespit edilemeyen sonuçlar için, sonucun analiz hassasiyet eşiğinden düşük olduğunu bildirin ve gerekirse hemodilution, düşük LSC özbaşdaklığı veya yetersiz teknik eşik gibi bir yorum ekleyin.
6. MRD akış yorumunu önceki izleme zaman noktalarıyla entegre edin. Tedavi sırasında fenotipik profilin modülasyonunu ve MRD akışının dinamiklerini, yeniden pozitiflik, artış, stabilite veya azalma dahil olmak üzere belirtin.
7. Sonuçları, referans akış laboratuvarının zaman dilimine göre klinik akış raporu kullanarak talep eden klinisyen ve araştırmacıya iletin.
8. Uyumlu klinik akış raporunu şu maddelerle özetleyin: kemik iliği kalitesi, MRD tanımlama stratejisi, LAIP tanımı, LOD ve LOQ, eşikler ve MRD pozitif, MRD negatif LOD değeri ile yorumlama veya MRD tespit edilebilir ancak ölçülemez olarak yorumlanması.

Sonuçlar

Platform aynalama

CANTO ve NAVIOS arasındaki ilk iki platformlu karşılaştırmada, gerilim ayarları önceden belirlenmiş hedef MFI değerlerine ulaşmak için dengesiz 8-zirveli gökkuşağı boncukları alınarak ayarlandı. Referans CANTO platformundan hedef değerler, aşağıdaki dönüşümle ikinci NAVIOS platformuna aktarıldı: yeni MFI hedefi = referans MFI hedefi/256²². Platformlar arasındaki önyargıyı tespit etmek için, paralel olarak 10 yeni EDTA rejeneratif kemik iliği örneği test edildi. Pozitif ve negatif popülasyonlar arasındaki boyama indeksi örnekler ve platformlar arasında karşılaştırılmış ve karşılaştırılabilir bir ayrım göstermiştir (Ek Dosya-Şekil S3).

Çalışma sırasında, platformlar kademeli olarak 8 ve 10 renkli konfigürasyonlardan LYRIC ve DxFLEX 12 ve 13 renkli konfigürasyonlara yükseltildi (Ek Dosya 1). Aynalama, 8 zirveli gökkuşağı boncukları ve aynı panelle elde edilen sağlıklı kemik iliği ile dört platforma uzatıldı. Tepe örtüşme, yalnızca temsilin logaritmik ölçekleri ayarlanarak kontrol edildi. Tanımlanmış ayarlar uygulandıktan sonra, hücre boyama desenleri üst üste bulaştı; ana fark hücre bulutlarının logaritmik ölçekler boyunca dönüşümü oldu (Şekil 6 ve Ek Dosya-Şekil S4 ve Şekil S5).

Akış laboratuvarlarında kalite değerlendirmesi ve tekrarlanabilirlik

İlk standart işletim prosedürü ve platform yükseltmeleri sırasında güncellendikten sonra, katılımcı merkezler arasında paylaşılan taze referans kemik iliği örnekleri kullanılarak ıslak dış kalite değerlendirmesi (EQA) düzenli olarak gerçekleştirildi. Islak EQA, ıslak laboratuvar prosedürü, platform ayarları ve yaygın kapı analiz stratejisini doğrulamak için kullanıldı. Bildirilen popülasyonlar arasında WBC CD45⁺ paydasında MNC CD34⁺ hücreleri ve WBC CD45⁺ paydasında P6 CD34⁺CD38⁻ hücreleri bulunuyordu. Sonuçlar z-puanı ve/veya grafiksel temsil ile analiz edildi (Şekil 7).

2017'den bu yana beş yaş EQA turu gerçekleştirildi ve sırasıyla 22, 15, 17, 26 ve 25 laboratuvar katıldı. WBC CD45⁺ içindeki %CD34⁺CD38⁻ hücreleri ve WBC CD45⁺ içindeki %MNC CD34⁺ hücreleri için sonuçlar şu şekildeydi: EQA1, ortalama değerler %0,015 ve %1,01 (SD %0,09 ve %0,24); EQA2, %0,09 ve %1,02 (SD %0,046 ve %0,36); EQA3, %0,097 ve %1,46 (SD %0,024 ve %0,32); EQA4, %0,024 ve %2,16 (SD %0,015 ve %0,59); ve EQA5, %0,027 ve %1,9 (SD %0,008 ve %0,45).

MRD analiz stratejisinin merkezler arasında standartlaştırılmasını ele almak için, ıslak EQA, tanı, MRD takibi ve referans kemik iliği için paylaşılan FCS dosyaları kullanılarak kuru EQA ile tamamlandı. Yerel olarak analiz edilen verilerin %90'ından fazlası, seri ortalaması 2 SD ± temelinde merkezi aralık içinde dahil edilmiştir: DryEQA2017 için %95,6 ve %91,3, 23 laboratuvardan 22'si katılmıştır; DryEQA2024 için ise %100 ve 25 laboratuvardan 24'ü (Şekil 8). WBC CD45⁺ içinde %MRD LAIP ve WBC CD45⁺ %MRD LSC CD34⁺CD38⁻ için iki tur kuru EQA uygulandı. DryEQA2017 ortalama LAIP değeri %11,9 (SD %1,35) ve ortalama LSC değeri %0,16 (SD %0,05) olarak gösterdi. DryEQA2024 ortalama MRD LAIP değeri %0,35 (SD %0,26) ve ortalama MRD LSC CD34⁺CD38⁻ değeri %0,18 (SD %0,06) olarak gösterildi.

LAIP/DfN ve LSC stratejileriyle çoklu modal AML MRD akış ölçümüne örnek

MRD'yi nicelendirmek için sistematik olarak üç yaklaşım kullanıldı. İlk yaklaşım, Boolean kapı tatımı kullanılarak lökemik blastların LAIP kartografisini tanı sırasında ortaya koymuş ve bu harita kemik iliği örneklerinin takip edilmesine uygulanmıştır (Şekil 9A). İkinci yaklaşım, normal miyeloid farklılaşmadan tanımlanan "boş kutu" alanlarda gözlemlenmeyen atipik ifade desenlerine sahip anormal ifadeye sahip hücreleri belirlemek için DfN analizini kullandı (Şekil 9B). Üçüncü yaklaşım, CD34⁺CD38⁻ fraksiyonunda LSC ile zenginleştirilmiş hücreleri dikotomik LSC belirteçleri ve Boolean kapıtma kullanarak nicelikle ölçmüştür (Şekil 10).

Referans kemik iliği örnekleri

Toplam 135 referans kemik iliği örneği incelendi; bunların arasında 25 sağlıklı donör kemik iliği örneği, 34 iltihap kemik iliği örneği ve 76 yenileyici kemik iliği örneği bulundu. Sağlıklı donör kemik iliği sağlıklı donörlerden alındı; medyan yaş 31 ve 21–49 yaş aralığı vardı. Anemi, nötropeni veya tromboni dahil olmak üzere sitopeni için yönlendirilen hastalardan inflamatuar kemik iliği alındı ve kemik iliği aspiratlarında hematolojik malignite bulunmamaktadır; Medyan yaş 52 idi ve 25–82 arasında değişiyordu. Kemik iliğinin rejenerasyonu, AML takibinde farklı kemoterapi zaman noktalarında, indüksiyon veya konsolidasyon sonrası da dahil olmak üzere, NPM1 veya CBF transkriptleri için moleküler MRD değerlendirmesinin negatif kalmasıyla elde edildi; Medyan yaş 54 olup, 18–65 yaş aralığı değişiyordu.

Bu örneklerin kalitesi mikroskobik incelemeyle doğrulandı. Sulandırılmamış kemik iliği örneklerindeki CD34⁺ hücrelerinin beklenen teorik yüzdesi de Brooimans formülü kullanılarak hesaplandı ve tüm örnekler için %>90 sonuç elde edildi. Bu örnekler, LAIP/DfN ve LSC analizi için eşikler belirlemek ve hemodilyusiyon ile saflık formülünün hesaplanmasını sağlamak için kullanıldı. Sağlıklı donör, iltihaplayıcı ve yenileyici kemik iliği örnekleri için kemik iliği durumuna göre belirteç ekspresyonu MFI varyasyonu incelenmiştir (Ek Dosya-Şekil S6). En ilgili parametreler için referans değerleri belirlendi; bunlar arasında %MNC CD34⁺ (WBC), %P6 CD34⁺CD38⁻ (MNC CD34⁺), %P7 CD34⁺CD38⁽dim) ve %P8 CD34⁺CD38 (MNC CD34^{+ için yüksek}) bulunur (Ek Dosya-Şekil S6).

Duyarlılık ve doğrusal değer değerlendirmesi

LAIP/DfN ve LSC-spesifik kapılar için hassasiyet, rejeneratör, iltihaplayıcı ve sağlıklı donor kemik iliği gibi referans kemik iliği örneklerindeki anormal olayların sayısı ölçülerek değerlendirildi. Sağlıklı kemik iliğinde bilinen sayıda blastın seri seyreltmesi, MRD ölçümünün sınırını ve doğrusal doğruluğunu doğrulamak için kullanılmıştır (Şekil 11 ve Şekil 12).

Şekil 1: AML'de primitif belirteçler (CD34⁺/CD117⁺) kullanılarak MRD LAIP analizi için Tüp 1'de geçiş stratejisi. İlk sıra: zamanın ardışık kapıları, FSC ile SSC karşılaştırmalı canlı hücreler, FSC-W ile FSSC-H tabanlı tek hücreler, CD45 ile SSC'deki WBC CD45⁺ hücreleri, CD45^dim/SSC'deki blastlar, FSC-A/SSC-A'da mononükleer hücreler (MNC), CD45 ile CD34 grafiklerinde MNC CD34⁺ hücreleri ve CD34 ile CD117 grafiklerinde ilkel işaretleyici kapısı. İkinci ve üçüncü satırlar: en ilgili LAIP kapılarını tanımlamak için kullanılan sabit biparametrik nokta grafikleri (LAIP1–LAIP8). MRD LAIP aşağıdaki Boolean stratejisiyle tanımlanmıştır: zaman VE canlı hücreler VE tek hücreler VE (blastlar VEYA MNC CD34⁺) VE ilkel belirteçler (CD34^+/−CD117^+/−) VE LAIP1, LAIP2, LAIP3, LAIP4, LAIP5, LAIP6, LAIP7 VE LAIP8. Resimlenen durumda, MRD, sağlıklı kemik iliğinde %0,04 ± 0,03 oranındayken WBC CD45⁺ oranının %6,8'ini oluşturdu. Sağda: Nicel için kullanılan son MRD kapısının arka kapısı, belirli olmayan olayların, eritroblastların ve enkazın temizlenmesine olanak tanır. Kısaltmalar: AML = akut miyeloid lösemi; MRD = ölçülebilir kalıntı hastalık; LAIP = lösemi ile ilişkili immünofenotip; FSC = ileri saçılım; SSC = yan dağılım; WBC = beyaz kan hücreleri; MNC = mononükleer hücreler; hBM = sağlıklı kemik iliği. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Tüp 3'te olgun blastlar (CD34⁻CD117⁻) kullanılarak AML'de MRD LAIP analizi için kapı geçimi stratejisi. İlk sıra: ardışık zaman kapıları, FSC ile SSC karşılaştırma esaslı canlı hücreler, FSC-W ile FSSC-H tabanlı tek hücreler, CD45 ile SSC'de WBC CD45⁺ hücreleri, CD45^dim/SSC'de blastlar, FSC-A/SSC-A'da mononükleer hücreler (MNC), CD45 ile CD34 grafiklerinde MNC CD34⁺ hücreleri ve CD34 ile CD117 grafikinde olgun patlama kapısı.
İkinci ve üçüncü satırlar: en ilgili LAIP kapılarını tanımlamak için kullanılan sabit biparametrik nokta grafikleri (LAIP1–LAIP8). MRD LAIP şu Boolean stratejisiyle tanımlanmıştır: zaman VE canlı hücreler ve tek hücreler ve blastlar VE CD34⁻CD117⁻ blastlar VE LAIP1, LAIP2, LAIP3, LAIP4, LAIP5, LAIP6, LAIP7 VE LAIP8. Gösterilen durumda, MRD WBC CD45⁺ oranının %15'i iken, sağlıklı kemik iliğinde %0,09 ± 0,02 oranı bulunuyordu.
Sağda: nicelik için kullanılan son MRD kapısının arka kapısı, belirli olmayan olayların temizlenmesine olanak tanır. Kısaltmalar: AML = akut miyeloid lösemi; MRD = ölçülebilir kalıntı hastalık; LAIP = lösemi ile ilişkili immünofenotip; FSC = ileri saçılım; SSC = yan dağılım; WBC = beyaz kan hücreleri; MNC = mononükleer hücreler; hBM = sağlıklı kemik iliği. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: CD34⁺CD38⁻ fraksiyonunda (Tüp 2) normal hematopoietik kök hücreler (nHSC) ve lökemik kök hücre (LSC) zenginleştirilmiş hücreler için kapı stratejisi. (A) CD34⁺CD38⁻ fraksiyonunda (Tüp 2) normal hematopoietik kök hücreler (nHSC) ve (B) lökemik kök hücre (LSC) ile zenginleştirilmiş hücreler. İlk sıra: ardışık zaman kapıları, FSC ile SSC karşılaştırmalı canlı hücreler, FSC-W ile FSC-H tabanlı tek hücreler, CD45 ile SSC'deki WBC CD45⁺ hücreleri, CD45dim/SSC'deki blastlar, FSC-A/SSC-A'da mononükleer hücreler (MNC) ve CD45 ile CD34 grafiklerinde MNC CD34⁺ hücreleri.
İkinci ve dördüncü sıralar: P6 (CD34⁺CD38⁻), P7 (CD34⁺CD38^düşük) ve P8 (CD34⁺CD38^yüksek) tanımlamak için kullanılan sabit biparametrik nokta grafikleri, MIX (CLL1/TIM3/CD97), CD123 ve CD45RA gibi en ilgili ikili LSC işaretleyicileri ile birlikte. MRD LSC aşağıdaki Boolean stratejisiyle tanımlanmıştır: zaman VE canlı hücreler VE tek hücreler ve blastlar VE MNC VE MNC CD34+ VE P6 VE (P6 LSC MIX⁺ VEYA P6 LSC CD123⁺ VEYA P6 LSC CD45RA⁺).
Sağda: Nicel için kullanılan son MRD LSC kapısının arka kapısı, belirsiz olayların temizlenmesine olanak tanıyan.
(A) Sağlıklı bir kemik iliği örneğinde nHSC'ler: nHSC'ler (mor olaylar) CD34⁺CD38⁻, MIX⁻ (CLL1/TIM3/CD97), CD45RA⁻, CD123⁻, CD117⁺, HLA-DR⁺, CD36⁻ ve CD90⁺ idi. nHSC CD34⁺CD38⁻ fraksiyonu, WBC CD45⁺'nın %0,02'sini temsil ediyordu ve LSC CD34⁺CD38⁻ hücreleri negatifti. Bildirilen analiz eşikleri LOQ %0,0001 ve LOD %0,001 idi.
(B) AML örneğinde LSC ile zenginleştirilmiş hücreler: LSC ile zenginleştirilmiş hücreler (turuncu olaylar) CD34⁺CD38⁻, MIX⁺ (CLL1/TIM3/CD97), CD45RA⁺, CD123⁺, CD117⁺, HLA-DR⁺, CD36⁻ ve CD90⁺ idi. LSC CD34⁺CD38⁻ fraksiyonu, WBC CD45⁺'nın %3,7'sini temsil ediyordu. Kısaltmalar: nHSC'ler = normal hematopoietik kök hücreler; LSC = lökemik kök hücre; MNC = mononükleer hücreler; WBC = beyaz kan hücreleri; SSC = yan dağılım; MIX = CLL1/TIM3/CD97; HLA-DR = insan lökosit antijeni-DR; LOQ = nicelendirme sınırı; LOD = tespit sınırı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: CD34⁺ popülasyonunda CD38⁻ eşiğinin CD38 floresans-eksi bir (FMO) kanalı kullanılarak tanımı. İlk sıra: CD45/SSC, MNC CD19⁺ hücreleri ve MNC CD34⁺ hücreleri dahil olmak üzere referans popülasyonların kapalı.
İkinci satır: CD38 FMO kanalında sinyal seviyesi. İlk satırda blast hücreleri, ikinci satırda MNC CD19⁺ hücreleri, üçüncü satırda ise MNC CD34⁺ hücreleri gösterilir. Turuncu çizgi, P6 CD34⁺CD38⁻ kapısını tanımlayan eşik noktasını gösterir.
Üçüncü sıra: CD38 PE-Cy7 sinyal seviyesi. İlk satırda blast hücreleri, ikinci satırda P8 CD34⁺CD38^yüksek seviyelerinde kullanılan CD38 hematogon seviyesine sahip MNC CD19⁺ hücreleri, üçüncü satırda ise turuncu renklerde P6 CD34⁺CD38⁻ hücreleri, yeşil renklerde P7 CD34⁺CD38^düşük hücreleri ve yüksek renklerde P8 CD34⁺CD38 hücreleri gösteriliyor mavi hücreler. Kısaltmalar: FMO = floresans eksi bir; MNC = mononükleer hücreler; SSC = yan dağılım; PE-Cy7 = fikoeritrin-siyanin 7; P6 = CD34+CD38− kesir; P7 = CD34+CD38 düşük fraksiyon; P8 = CD34+CD38 yüksek fraksiyon. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: MNC CD34⁺ hücrelerine dayalı kemik iliği örneği temsil edilebilirliğinin değerlendirilmesi. (A) MNC CD34⁺ hücreleri için kapı stratejisi ve formül hesaplamasında kullanılan parametreler: n, MNC CD34⁺ hücre sayısı; L, WBC CD45⁺ hücre sayısı; s, normal periferik kandaki MNC CD34⁺ hücrelerinin oranı; ve m., referans normal kemik iliğinde gözlemlenen MNC CD34⁺ hücrelerinin oranı. (B) Kemik iliği (BM) seyreltmesinin periferik kan (PB) tarafından CD34⁺ hücrelerinin kökeni üzerindeki etkisinin şematik temsili. (C) BM saflığını yorumlamak için kullanılan kriterler. Kısaltmalar: BM = kemik iliği; PB = periferik kan; MNC = mononükleer hücreler; WBC = beyaz kan hücreleri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Dört akış sitometre platformu üzerindeki ifade desenlerinin karşılaştırılması.
Normal kemik iliği (BM) örneği, her platform için tanımlanmış ayarlar ve ölçek ayarıyla dört sitometre platformunda eşzamanlı olarak test edildi. İlk satırda CD45/CD33 nokta grafikinde MNC hücreleri gösterilir; ikinci satırda ise ilkel işaretçi CD34/CD117 nokta grafikinde MNC hücreleri gösterilir; üçüncü satırda CD34/CD38 nokta grafikinde patlama hücreleri gösterilir; dördüncü satırda ise CD45RA/CD90 nokta grafikinde P6 CD34⁺CD38⁻ hücreleri gösterilir. Kısaltmalar: BM = kemik iliği; MNC = mononükleer hücreler; P6 = CD34⁺CD38⁻ fraksiyon. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Katılımcı akış laboratuvarlarında ıslak laboratuvar EQA tekrarlanabilirliği. (A) Beş ıslak laboratuvar EQA turu ve katılımcı akış laboratuvarları arasında %P6 CD34⁺CD38⁻ hücrelerinin WBC CD45⁺ hücrelerindeki dağılımını gösteren keman grafiki. (B) Beş ıslak laboratuvar EQA turu ve katılımcı akış laboratuvarları boyunca %MNC CD34⁺ hücrelerinin WBC CD45⁺ hücrelerindeki dağılımını gösteren keman grafiki. Kısaltmalar: EQA = dış kalite değerlendirmesi; P6 = CD34+CD38− kesir; WBC = beyaz kan hücreleri; MNC = mononükleer hücreler. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: LAIP/DfN ve LSC MRD ölçümünün kuru EQA değerlendirmesi. (A) AML tanısı, AML MRD ve normal kemik iliği referans dosyaları dahil olmak üzere 8 renkli panel grubundan altı ortak FCS dosyası kullanılarak LAIP/DfN ve LSC MRD ölçümü için kuru EQA2017 egzersizi. Tatbikat, katılımcı 23 laboratuvarla paylaşıldı. (B) AML tanısı, AML MRD ve normal kemik iliği referans dosyaları dahil olmak üzere 12 renkli panel grubundan altı paylaşılan FCS dosyası kullanılarak LAIP/DfN ve LSC MRD ölçümü için kuru EQA2024 egzersizi. Tatbikat, katılımcı 24 laboratuvarla paylaşıldı. (C) Wet EQA2025 sırasında ölçülen %MNC CD34⁺ hücreleri ve %nHSC P6 CD34⁺CD38⁻ hücrelerinin platformlar arası karşılaştırması, 25 katılımcı laboratuvarla paylaşılmıştır. Beklenen değerler MNC CD34⁺ hücreleri için %1,6, nHSC P6 CD34⁺CD38⁻ hücreleri için %0,02 idi. Kısaltmalar: EQA = dış kalite değerlendirmesi; LAIP = lösemi ile ilişkili immünofenotip; DfN = normalden farklı; LSC = lökemik kök hücre; MRD = ölçülebilir kalıntı hastalık; FCS = akış sitometrisi standardı; AML = akut miyeloid lösemi; MNC = mononükleer hücreler; nHSC = normal hematopoietik kök hücre; WBC = beyaz kan hücreleri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: LAIP/DfN yaklaşımlarıyla temsil MRD ölçümü. (A) LAIP/DfN yöntemiyle MRD ölçümüne örnek. Sol tarafta tanı örneğindeki lökemik hücrelerin LAIP kartografisi, sağ taraf ise aynı LAIP kartografisinin takip örnekte uygulanmasını ve MRD popülasyonunun siyah renkte gösterildiğini gösterir. (B) DfN yöntemiyle MRD ölçümüne örnek. Her bir nokta grafik çifti, sağlıklı kemik iliği (hBM; normal, sol grafik) ile MRD takip kemik iliği örneği (DfN, sağ grafik) karşılaştırır. "Boş kutu" alanı normal kemik iliği üzerinde tanımlanır ve bu boş kutudaki lökemik hücrelerin varlığı takip örneklemesinde değerlendirilir; anormal popülasyon siyah renkle gösterilir. Kısaltmalar: MRD = ölçülebilir kalıntı hastalık; LAIP = lösemi ile ilişkili immünofenotip; DfN = normalden farklı; hBM = sağlıklı kemik iliği. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 10: Tanı ve takiben CD34⁺CD38⁻ LSC zenginleştirilmiş hücrelerin temsil ölçümü. (A) AML tanı örneğinde LSC zenginleştirilmiş hücre ölçümü örneği. Sol tarafta LSC ile zenginleştirilmiş profil gösterilir; turuncu popülasyon CD34⁺CD38⁻ fraksiyonunda MIX (CLL1/TIM3/CD97), CD123, CD45RA, CD117, HLA-DR ve CD36 olarak ifade edilir.
(B) Aynı hastadan alınan takip örneği, aynı immünfenotipik profile (turuncu popülasyon) sahip MRD LSC ile zenginleştirilmiş hücrelerin kalıcılığını gösteriyor. Kısaltmalar: LSC = lökemik kök hücre; AML = akut miyeloid lösemi; MRD = ölçülebilir kalıntı hastalık; MIX = CLL1/TIM3/CD97; HLA-DR = insan lökosit antijeni-DR. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 11: LSC tespitinin analitik hassasiyeti. (A) LSC tespiti için boşluk sınırının (LOB) değerlendirilmesi. Sol taraf, beş sağlıklı kemik iliği örneğinden alınan beş FCS dosyasının birleştirilmesiyle CD34⁺CD38⁻ olaylarının nicelendirilmesini gösterir (5.148.000 WBC olayı edinildi). Sağ taraf, CD45/SSC nokta grafikinde LSC Boolean kapısına ait (14 olay) geri kapalı olay sayısını gösterir; bu da <0.0005% (5 × ^10-6) LOB'a karşılık gelir. (B) LSC nicelleştirmesi için doğrusal değer değerlendirmesi. Sol taraf, sağlıklı bir kemik iliği örneğinde LSC ile zenginleştirilmiş hücrelerin spike-in ile seri seyrelme göstermektedir. Sağ taraf, ölçülen MRD değerleri ile teorik değerler arasındaki korelasyonu gösterir; bu da 2 × ^10-5 (%0,002) bir nicelik sınırına (LOQ) karşılık gelir. Kısaltmalar: LSC = lökemik kök hücre; LOB = boşluk sınırı; FCS = akış sitometrisi standardı; WBC = beyaz kan hücreleri; MRD = ölçülebilir kalıntı hastalık; LOQ = nicelik sınırı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 12: MRD LAIP ölçümünün lineerlik ve nicel aralığı. (A) Sağlıklı kemik iliğinde farklı LAIP içeren blastların seri seyreltilmesi ile MRD LAIP niceltmesi için doğrusal değer değerlendirmesi, ölçülen MRD değerleri ile teorik değerler arasındaki korelasyonu göstermek, farklı LAP'lere göre değişken LOQ ile LOQ <0,1%. (B) Farklı LAIP'lere göre nicelendirme aralığı. Kırmızı çizgi %0,1 klinik eşiği gösterir. LOQ, test edilen tüm LAIP'ler için klinik eşiğe ulaştı. Kısaltmalar: MRD = ölçülebilir kalıntı hastalık; LAIP = lösemi ile ilişkili immünofenotip; LOQ = nicelik sınırı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Fluoro Krom	Zirve	LYRIC12c	Zirve	DxFlex13c	Zirve	NAVIOS10c	Zirve	CANTO8c
FITC	P8	44618	P6	89916	P7	104	P8	56316
PE	P8	84008	P6	110652	P7	136	P8	88803
ECD	x	x	P6	153011	P7	150	x	x
PerCPcy5,5 /PEcy5,5	P7	63610	P6	101791	P7	85	P7	75717
PC7/PEcy7	P8	32412	P6	21381	P8	88	P8	32003
APC	P7	111628	P6	192708	P6	181	P7	143946
AA700/AP CR700	P7	25958	P6	237374	P7	182	x	x
A7A750/ APCH7	P8	77444	P6	158729	P7	150	P8	98311
BV421	P6	62031	P6	239208	P6	268	P6	68315
KO/V500	P7	159941	P6	293917	P6	179	P7	124919
BV605	P7	31688	P6	65337	x	x	x	x
BV711/ V660	P8	21816	P6	12107	x	x	x	x
BV786	P8	17560	P6	3795	x	x	x	x

Tablo 1: 8-zirveli gökkuşağı boncukları kullanan her platform için hedef değerler. Her sitometre platformu için özel hedef değerler gösterilir (Canto, Lyric, Navios, DxFlex). Saklanan zirveler, blast hücreleri için gözlemlenen MFI'ye yakın olacak şekilde seçildi. Bu özellikle, PMT voltajı arttıkça sinyal yoğunluğunun doğrusal olarak artmadığı PMT tabanlı sitometreler için önemlidir. Buna karşılık, APD tabanlı sitometrelerde sinyal yoğunluğu kazançla doğrusal olarak artar; böylece tüm dedektörler için aynı zirve kullanılabilirken, PMT tabanlı sitometrelerde her kanal için farklı zirveler gereklidir. Kısaltmalar: MFI = medyan floresans yoğunluğu; PMT = fotoçarpan tüp; APD = çığ fotodiyod. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

KANTO 8C /NAVIOS 8c

FITC

PE

ECD

PerCPC y5,5

PECy7

APC

APC-R700 /AA700

APCH7

BV421

V500

BV605

BV711

BV786

Tüp 1 LAIP 8c

CD7 5μL /CD56 5μL

CD13 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

Tüp 2 LSC 8c

CD90 5μL

MIX3(2) .5μL/AC)

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3 Esnek mentaire Gran 8c

CD15 5μL

CD56 5μL

HLADR 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD11b 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3 Supplem Entaire - Monos 8c

CD36 5μL

CD64 5μL

CD14 10μL

HLADR 5μL

CD34 5μL

CD4 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

MIX3Ac =97 +TIM3+ CLL1

SÖZ 10-12c

FITC

PE

ECD

PerCPCy5,5

PECy7

APC

APC-R700

APCH7

BV421

V500

BV605

BV711

BV786

Tüp 1LAIP 12c

CD7 5μL

CD13 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD56 5μL

CD10 2μL

CD36 2μL

Tüp 2 LSC 12c

CD90 5μL

MIX3(2. 5μL/AC)

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD200 5μL

CD19 5μL

CD36 2μL

T3 Esnek mentaire 12c-Monos

CD15 5μL

CD64 5μL

CD33 10μL

CD38 5μL

CD34 5μL

HLADR (5μL)

CD4 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD14 5μL

CD11b 5μL

CD36 2μL

MIX3Ac =97+ TIM3+ CLL1

NAVIOS 10c

FITC

PE

ECD

PEcy5,5

PECy7

APC

AA700

AA750

BV421/PB

V500/KO

BV605

BV711

BV786

T1 Navios 10c

CD7 10μL

CD13 10μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD56 10μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T2 Navios 10c

CD90 5μL

MIX3(2.5) μL/Ac)

CD19 5μL

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

T3 Esnek mentaire 10c Monos

CD15 5μL

CD4 5μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD11b 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD14 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

MIX3Ac =97+ TIM3+ CLL1

DxFLEX 10 -13/12

FITC

PE

ECD

PEcy5,5

PECy7

APC

AA700

AA750

BV421/PB

V500/KO

BV605

BV650

BV786

T1 DxFLEX 12-13c

CD7 10μL

CD13 10μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD56 10μL

CD19 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD36 5μL

CD10 2μL

/

T2 DxFLEX 12-13c

CD90 5μL

MIX3(2.5) μL/Ac)

CD19 5μL

CD123 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD45RA 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

/

CD200 5μL

HLADR snv786 (3μL)

T3 Esnek mentaire 12c Monos

CD15 5μL

CD4 5μL

HLADR 5μL

CD33 5μL

CD38 5μL

CD34 5μL

CD36 5μL

CD14 5μL

CD117 5μL

CD45 5μL

CD64 5μL

CD11b 5μL

/

Tablo 2: AML MRD, LAIP/DfN ve LSC analizi için antikor panel konfigürasyonları. Tablo, sitometre platformuna göre 8, 10, 12 ve 13 renkli panel konfigürasyonlarını özetlemektedir. Tüp 1 LAIP/DfN analizi için, Tüp 2 CD34⁺CD38⁻ LSC zenginleştirilmiş hücre analizi için, Tüp 3 ise monositik/granülositik farklılaşma belirteçleri için kullanılır. Her platform için antikor hacimleri ve florokrom atamaları gösterilir. MIX3, CD97, TIM3 ve CLL1'e karşılık gelir. Kısaltmalar: AML = akut miyeloid lösemi; MRD = ölçülebilir kalıntı hastalık; LAIP = lösemi ile ilişkili immünofenotip; DfN = normalden farklı; LSC = lökemik kök hücre; MIX3 = CD97/TIM3/CLL1. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Miyeloid öncüllerde normal ifade edilen belirteçlerin tamamen kaybı

CD13++CD33-/CD34+ veya CD117+

CD13-CD33++/CD34+ veya CD117+

CD13+HLADR-/CD34+

CD13+CD117+CD34-

Miyeloid öncüllerde çapraz soy lenfoid belirteç ekspresörü

CD7+CD13+/CD34+ veya CD117+

CD7+CD33+/ CD34+ veya CD117+

CD56+CD13+/ CD34+ veya CD117+

CD56+CD33+/ CD34+ veya CD117+

CD19+CD117+/ veya CD13+ veya CD33+

Miyeloid öncüllerde aşırı ifade

CD34++/CD117+

CD117++/CD13+CD33+

Miyeloid öncüllerde azalmış ekspresyum

CD38loCD34+CD33+CD117+

Tablo 3: LAIP tabanlı DfN "boş kutu" tanımları. Tablo, anormal miyeloid öncü popülasyonları tanımlamak için kullanılan önceden tanımlanmış normalden farklı (DfN) "boş kutu" desenlerini listeler. Kategoriler arasında normal ifade edilen belirteçlerin tamamen kaybı, çapraz soy lenfoid belirteç ekspresyonu, belirtici aşırı ekspresyonu ve miyeloid öncüllerde azalan belirtici ekspresyonu yer alır. Kısaltmalar: LAIP = lösemi ile ilişkili immünofenotip; DfN = normalden farklı. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Holdrinet ve ark.17
Broolmans ve ark.15
Kemik iliği saflığı = (1 − (GRMO/GRSG) x (GBSG/GBMO)) x 100	>80%
Björlund et al.19	GPA >% 15
	CD3 < %20
Loken ve ark.18	CD16en yüksek < %30
Theunissen ve ark.20; Dworzak ve ark.21
Flow veya Ctr DIL sitolojisi: PNN < %40, EBL > %5, Ly < %20	CD16++ CD11b+ + <% 40%
	GPA >% 5
	CD3 < %20
BM saflık %: MNC 34+/WBC45+	Bağırsak saflığı %100-10

Tablo 4: AML MRD akış raporu için kemik iliği seyreltme kontrol yöntemleri. Tablo, AML MRD akış klinik raporlarında kullanılabilecek yayımlanmış kemik iliği seyreltme ve temsil kontrol yöntemlerini özetlemektedir. MRD sonuçlarının yorumlanmasını desteklemek için en az bir seyreltme-kontrol yöntemi uygulanmalıdır. CD34/WBC45⁺ kemik iliği saflığı yaklaşımı, tamamlayıcı kalite değerlendirmesi olarak dahil edilmiştir. Kısaltmalar: AML = akut miyeloid lösemi; MRD = ölçülebilir kalıntı hastalık; BM = kemik iliği; WBC = beyaz kan hücreleri; CD34/WBC45⁺ = CD45⁺ beyaz kan hücreleri arasında CD34⁺ hücreleri. Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Ek arka plan, platform uyumlaştırması, referans kemik iliği ve prognostik destek materyalleri. Bu ek dosya, LSC tanımlaması, AML fenotipik heterojenliği, platformlar arası yansıtma, platforma özgü optimizasyon, referans kemik iliği belirteç profilleri, boylamasına panel evrimi ve tanı sırasında LSC nicelenmesi için kullanılan prognostik eşik ile ilgili destekleyici şekiller ve tablolar içerir. Bu materyaller, CD34⁺CD38⁻ LSC ile zenginleştirilmiş hücre değerlendirmesinin gerekçesi, platform uyumlaştırmasının teknik temeli ve referans ilik geçmişi, panel göçü ve klinik eşik seçimi yorumlamak için kullanılan destekleyici veriler dahil olmak üzere çok merkezli MRD akış iş akışı için ek bağlam sağlar. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Protokoldeki kritik adımlar

Örnek kalitesi, doğru MRD ve LSC nicelendirmesi için çok önemlidir. Taze kemik iliği örnekleri oda sıcaklığında taşınmalı ve ideal olarak 24–48 saat içinde, gerekirse ise²³ saat topladıktan sonra 72 saat içinde işlenmelidir. Hemodilyusiyon her zaman noktasında değerlendirilmeli ve klinik akış raporuna dahil edilmelidir. Klinisyen, örneğin indüksiyon, konsolidasyon, hedefli immünoterapi, azasitidin/venetoklaks veya allogreft gibi daha az yoğun tedavi gibi tedavi zamanını belirtmelidir. Farklılaşma ortamı, tedavi ve zaman noktasıyla yakından ilişkilidir ve MRD yorumuna entegre edilmesi önemlidir. Boylamasına takip sırasında, aynı alet hassasiyeti ve analiz güvenilirliği, hedef değerlerin gökkuşağı kontrol boncuklarıyla düzenli kontrolleri, düzenli EQA ve çalışma boyunca FCS dosyalarının kolektif incelemesi ile korunmalıdır.

MRD akış niceliğinin yüksek standartlaştırma ve merkezler arası güvenilirliği, akış grubunda düzenli web tabanlı eğitim eğitimi sayesinde korunur. Ayda en az bir web eğitim oturumu gerçekleştirildi ve bu yıllar boyunca 100'den fazla MRD LAIP/DfN, MRD LSC veya tanısal LSC nicel uygulaması vakası tartışılıp incelendi. Bu sürekli eğitim önemlidir çünkü akış verilerini yorumlamak için özellikle düşük seviyeli MRD, fizyolojik arka plan popülasyonları, yenilenen ilik ve tedavi altındaki fenotipik anahtarlar için yüksek nitelikli bir biyolog gereklidir.

CD34⁺CD38⁻ LSC ile zenginleştirilmiş popülasyonların nicelendirilmesi bir diğer kritik adımdır. Normal hematopoietik kök hücreleri veya LSC'leri yakalayacak evrensel bir belirteç yoktur. HOVON grubu, ilgili "ikilik" LSC belirteçleri içeren 8 renkli bir panel kullanarak AML tanı ve takibinde LSC izleme^{uygulamasını tanıttı 3}. Dikotomik belirteçler, normal hematopoietik kök hücrelerde ekspresyon göstermemek, LSC ile zenginleştirilmiş popülasyonlarda pozitif ifade göstermek, soluk, orta, yüksek, heterojen veya bimodal desenlere sahip olarak tanımlanır. CLL1, TIM3 ve CD97 gibi spesifik dichotomik LSC belirteçlerinin karışımını tek bir kanala dahil etmek için ilgi vardır; çünkü sadece biri pozitif olsa bile, LSC ile zenginleştirilmiş hücreler yine de tespit edilebilir. Diğer belirteçler ise kemik iliğinin durumuna bağlı olarak, rejeneratör veya stresli ilik²⁴ dahil olmak üzere, normal hematopoietik kök hücrelerin ifadeleriyle örtüşebileceği için ayrı kanallarda ayrı olarak kullanılmalıdır. LSC ile zenginleştirilmiş hücrelerin tam tanımı, CD34⁺CD38⁻ fraksiyonundaki anormal belirteç ifadesi de dahil olmak üzere Boolean operatörlerine dayanır. Bu fenotipik bir tanım olarak kaldığı için, popülasyon her örneklemde işlevsel olarak kanıtlanmış LSC'ler olarak değil, CD34⁺CD38⁻ LSC zenginleştirilmiş hücreler olarak yorumlanmalıdır. Bu LSC paneli, aynı protokolle aşırı blastları olan MDS ve AML MRC hastalarda da uygulanabilir.

Yöntemin değişiklikleri ve sorun gidermesi

Platform ve panel evrimi sırasında, özellikle 8-10 renkli panellerden 12-13 renkli panellere geçildiğinde, laboratuvar ağı içinde standartlaştırma/uyum yaklaşımı sürdürülmelidir. Makinelerin evrimiyle birlikte, klinik çalışmalar boyunca fenotipik anomalilerin tespitinde ortak bir antikor omurgasının ve aynı hassasiyetin korunmasına ihtiyaç duyulmaktadır. Platform evrimi sırasında, omurgadaki antikorların florokromları tüm makinelerde stabil ve ortak kalır (CD34/CD38/CD45/CD117). Ancak, bazı kanallar için, makineye özgü optik banka nedeniyle florokromların değiştirilmesi gereklidir ve bu da uyumlaştırma yaklaşımı gerektirir. PMT dedektörü sitometresinden APD dedektör sitometresine geçilirken, yüksek dalga boylarında APD dedektörlerinin yüksek hassasiyeti dikkate alınmalıdır. Bu nedenle, bazı durumlarda, belirli antikorlar için florokrom seçimi aynı boyama indeksini koruyacak şekilde ayarlanmalı ve kanallar arasında aşırı yayılmayı önlemek için optimizasyon yaklaşımı benimsenmelidir. Mevcut klinik sitometreler, 12 ila 13 renkli panelleri destekleyerek LAIP tespitinde özgüllüğü artırır ve MRD kapısındaki kirletici hücreleri ortadan kaldıran belirteçlerin eklenmesiyle yorumu iyileştirir. Ancak bu aynı zamanda analizin karmaşıklığını^{da artırır 23}.

8 renkten 12 renkli panellere geçme, bazı durumlarda MRD değerlendirmesinin hassasiyetini ve özgüllüğünü artırdı (Ek Dosya 1). Tüp 1'de HLA-DR, CD36, CD10 ve CD56 eklendi ve CD7'den ayrıldı. Tube 2'de HLA-DR, CD36, CD200 ve CD19 eklendi. Tüp 3'te CD4, CD64, CD38, CD36 ve CD14 eklendi. HLA-DR, artık her tüpteki CD38 ile sistematik olarak birleştirilmiş, LAIP ve değiştirilmiş farklılaşma desenlerinin daha net bir tanımını sağlar. CD36, artık her tüpte sistematik olarak dahil edilen, eritroblastları, kırmızı hücreleri, trombositleri ve entrikleri tanımlamak ve nihai MRD kapısını iyileştirmek için anahtar bir işaretçidir. LSC tüpündeki CD19 ayrıca hematogonların tanımlanmasına yardımcı olur. Monosit ve granülosit farklılaşma belirteçlerinin tek bir tüpte birleştirilmesi, monositik ve granülosit farklılaşma desenlerinin daha iyi tanımlanmasını sağlar ve anormallikleri ayırt ederek LAIP'i tanımlamaya yardımcı olur. 8 renkten 10 renkli panellere geçildiğinde, ana gelişme LAIP algılamadan geldi; özellikle Tüp 1'deki CD7'den ayrılan HLA-DR ve CD56'nın eklenmesiyle ve Tüp 2'deki HLA-DR ve CD19'un eklenmesiyle elde edildi. 10 renkten 12 renk panellere geçildiğinde, ilerleme patlama ve LSC kapılarının daha iyi temizlenmesi ve her tüpte CD36 eklenmesiyle sağlandı; bu işlem Tüp 1'de CD10 ve Tüp 2'de CD200 ile tamamlandı. Bu özellikle, düşük seviyeli MRD'si tespit sınırının üzerinde ancak nicel sınırının altında olan hastalar için faydalıydı. Bir arada, klinik eşik ≥ %0,1'de MRD pozitifliği olan çoğu hasta zaten 8 renkli panel ile tanımlanmıştı; ancak tüplerde daha fazla işaretleyici kullanmak, özellikle ELN 2025 kılavuzlarında belirtildiği gibi düşük seviyeli MRD için MRD değerlendirmesinin özgüllüğünü ve yorumunu geliştirmiştir.

Yöntemin sınırlamaları

Çok merkezli bir yaklaşım seçmek zor olabilir. Bu kavramın uygulanabilirliği, AML klinik denemelerinde MRD akışını uygulamadan önce zorunlu adımlar gerektirir: enstrüman hassasiyeti ve örnek hazırlamanın uyumlaştırılması, analitik operatörler için eğitim ve sistematik eğitim²⁵. Platformlar geliştikçe, çok merkezli, çok platform stratejisi sonuçların sağlamlığını ve tekrarlanabilirliğini koruyacak şekilde uyarlanmalıdır. Bu, aynı platform tipi için aynı panel ve ayarların kullanılması ile standartlaştırmayı içerir; uyumlaştırma, aynı paneli birden fazla platformda uyumlu ayarlarla kullanmak; ve optimizasyon, her platforma uyarlanmış bir panel ve özel ayarlar kullanılarak kullanıldı.

Hemodilutasyon, MRD akışının nicelenmesi için en zorlu ve kritik noktalardan biridir. Bu protokolte tanımlanan CD34/WBC temsilcilik formülü, kemik iliği örneği için tamamlayıcı bir kalite kontrol ölçütü olarak kullanılmalı ve MRD sonuçlarını normalleştirmek için kullanılmamalıdır. Yorumu, ilik yenilenmesi, tedavi etkileri, kalıntı hastalık ve daha az yoğun uygulamalardan etkilenebilir. Benzer şekilde, CD56, CD123 ve CD45RA gibi belirteçler bağımsız DfN veya LSC belirteçleri olarak yorumlanmamalıdır. Bunlar tam bir kapı stratejisi, temizlik kapıları, referans kemik iliği geçmişi ve klinik bağlam içinde yorumlanmalıdır.

Yöntemin mevcut veya alternatif yöntemlere göre önemi

ELN 2025 yönergelerine göre, MRD, AML hastalarında değerlendirme tekniği veya zamanlaması ne olursa olsun önemli bir prognostik belirteçtir. Farklı MRD akış teknikleri ve işaretleyicilerinin kullanımı oldukça tamamlayıcıdır. LAIP/DfN ve LSC analizleri dahil olan multimodal MRD, analizin uyumlu bir şekilde raporlandığı standartlaştırılmış bir ağ içinde yapılması koşuluyla faydalıdır. MRD değerlendirmesi, terapötik yanıt ve nüks hakkında daha iyi bir tanım sağlar. Çok merkezli ve çok modlu MRD akışı ile moleküler MRD, yeni hedefe yönelik tedaviler, birinci ve ikinci basamak tedaviler, allogenik nakil ve düşük yoğunluklu tedavileri içeren giderek karmaşık bir terapötik ortamda gelecekteki klinik denemelerde stratejik bir rol oynayacaktır.

Yöntemin belirli araştırma alanlarındaki önemi ve potansiyel uygulamaları

HOVON ve ALFA grupları, AML tanısında CD34⁺CD38⁻ LSC ile zenginleştirilmiş popülasyonların nicelendirilmesinin klinik etkisi olduğunu bildirdi (Ek Dosya 1). LSC için klinik olarak anlamlı eşiklerin nicelik yöntemine dayanarak tanımlanması kritik görünüyor. Burada tarif edilen yöntemle daha önce bildirildiği gibi, LSC eşiği ≥%1 olumsuz bir sonuca ilişkilendirilmiştir (Ek Dosya 1)²⁶. AML yönetiminde, MRD, LSC izleme ve klonal hematopoezin diferansiyel entegrasyonu, terapötik yorumu geliştirmeye yardımcı olabilir. Ana zorluk, ek tedavi gerektirebilecek MRD'yi, stabil pre-lökemik klonlardan ayırt etmekte yatmaktadır; bu klonlar^{ise 27} olmayabilir. Patlama yüzdesini hesaplamak için entegre bir raporlama sistemi, AML takibi için yakın zamanda 2025 EHA/ELN^{yönergeleri 28'de} önerildi. MRD sonuçlarını morfolojik karşılaştırma ile birleştirerek blastların uyumlu bir değerlendirmesini sağlar ve AML hastalarında yanıt kategorilerini belirlemek için klinik çalışmalarda tutarlı raporlamayı kolaylaştırmalıdır.

Hem HOVON çalışması hem de ALFA/FILO BIG1 çalışması, LAIP/DfN ve LSC yaklaşımlarını birleştiren bir skorun hastaların dört gruba ayrılmasına olanak sağladığını göstermektedir: LAIP⁻/LSC⁻, LAIP⁺/LSC⁻, LAIP⁻/LSC⁺ ve LAIP⁺/LSC⁺; farklı 3 yıllık genel sağ kalma^{oranları 3,26,29}. Genel olarak, bu sonuçlar birleşik MRD LAIP/DfN ve LSC durumlarının prognostik klinik etkisini göstermektedir. Allogenik hematopoietik kök hücre nakli bağlamında, CD34⁺CD38⁻ LSC ile zenginleştirilmiş hücrelerin varlığı, toplam blast sayısı %50'dan az olsa bile, nakil sonrası başarısızlığın öngörücüsü olarak ^{bildirilmiştir30}. Bu klinik veriler, birleşik MRD akış stratejilerinin önemini desteklerken, mevcut protokol merkezler arasında teknik iş akışını ve raporlamayı standartlaştırmaya odaklanıyor.

Perspektif olarak, spektral akış teknolojisi, çoklu boyutlu akış sitometrisi yaklaşımında eşzamanlı olarak test edilen işaretleyici panelini genişletebilir, böylece izlenen LAIP'lerin özgüllüğünü artırabilir ve hematopoietik rejenerasyondan kaynaklanan biyolojik arka plan gürültüsünü azaltabilir. Burada önerilen platformlar, paneller ve merkezler arasında spektral akış tekrarlanabilirliğinin değerlendirilmesi klinik uygulama açısından zorlu olacaktır. FlowSOM, t-SNE ve UMAP gibi yeni denetimsiz analiz algoritmaları, normal hematopoezi ile lökemik bölme arasında, CD34⁺CD38⁻ LSC zenginleştirilmiş fraksiyondan blast kalına kadar ayırt etmeyi kolaylaştırabilir. LSC fraksiyonlarının daha derinlemesine yakalanması, hasta kaynaklı ksenograft modellerinde nakletin izlenmesini iyileştirmeye yardımcı^{olabilir 31,32}. ELN çalışma grupları bu yeni yaklaşımları doğrulamak ve uyumlaştırmak için^{kurulmuştur 33,34}.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Antibodies (CANTO 8C-LYRIC12C)	Fluorochrome	Company	Catalog Number
CD90	FITC	BD Pharmingen	555595
CD7	FITC	BD Bioscience	332773
CD13	PE	BD Bioscience	347406
CD33	PerCPCy5,5	BD Bioscience	333146
CD117	BV421	BD Bioscience	563856
CD38	PeCy7	BD Bioscience	335825
CD34	APC	BD Bioscience	345804
CD45RA	APCH7	BD Pharmingen	560674
CD19	APCH7	BD Bioscience	641395
CD45	V500	BD Bioscience	560777
CD97	PE	BD Pharmingen	555774
TIM3(CD366)	PE	BD Pharmingen	563422
CLL1(CD371)	PE	BD Pharmingen	562566
CD123	PerCPcy5.5	BD Pharmingen	558714
CD15	FITC	BD Bioscience	332778
CD64	PE	BD Pharmingen	558592
CD11b	BV711	BD Bioscience	740771
CD4	APCH7	BD Bioscience	641398
HLADR	APC-R700	BD Horizon	565127
CD56	BV605	BD Horizon	562780
CD14	BV605	BD Horizon	564054
CD200	BV605	BD Biosciences	562853
CD10	BV711	BD Biosciences	740770
CD36	BV786	BD Biosciences	745554
CD19	BV711	BD Biosciences	563036
Antibodies (NAVIOS 10C/DxFlex 12C/13C)	Fluorochrome	Company	Catalog Number
CD90	FITC	BD Pharmingen	555595
CD7 FITC	FITC	BC iotest	A07755
CD13	PE	BC iotest	A07762
CD33	PC5.5	BC iotest	B36289
CD117	SNV428	BC iotest	C76813
CD38	PEcy7	BDBioscience	335825
CD34	APC	BC iotest	IM2472
CD45RA	APCH7	BDBioscience	560674
CD19	AA750	BC iotest	A94681
CD45	KromeOrange	BC iotest	B36294
CD97	PE	BD Pharmingen	555774
TIM3(CD366)	PE	BD Pharmingen	563422
CLL1(CD371)	PE	BD Pharmingen	562566
CD123	PC5.5	BC iotest	B20022
HLADR	ECD	BC iotest	B92438
CD36	AA700	BC iotest	B46022
CD19	ECD	BC iotest	A07770
CD4	PE	BC iotest	A07751
CD11b	BV650	Bdhorizon	569704
CD14	AA750	BC iotest	B92421
HLADR	SNV786	BC iotest	C78087
CD56	AA700	BC iotest	B92446
CD64	BV605	Bdoptibuild	569172
CD36	BV605	BD Horizon	563518
CD10	BV650	Bdoptibuild	745390
CD15	FITC	BD	332778
CD200	BV650	Bdoptibuild	743085
BD FACSCanto II  (8-color, blue/red/violet)		BD Bioscience	338962
BD FACSLyric 3-Laser 12-Color Instrument		BD Bioscience	662383
BC NAVIOSNavios 10 Colors, 3 Lasers, B5-R3-V2 Configuration		Beckman Coulter	B47905
BC DxFLEX  13-Colors, 13 Detectors, 3 Laser,  B5-R3-V5		Beckman Coulter	C78505
BC Kaluza Software v 3.1		Bekman Coulter	A82959
BD FACSuite Software v1.6		BD  Bioscience	651360
BD FACSDiva software v 8.0.3 (Win 7 32 bit OS)		BD  Bioscience	659523
BD CST Beads		BD  Bioscience	656505
Multicolor COMPBEADS		BD  Bioscience	552843
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks), 3.0 - 3.4 µm		BD  Bioscience	559123
ClearL Lab Compensation Beads		Beckman Coulter	B99883
PharmLyse NH4Cl 100ml10x conc		BD  Bioscience	555899
DPBS, 1X		CORNING	21-031-CV
Brillant Stain Buffer Plus		BD  Bioscience	566385
MGG (May-Grünwald-Giemsa)		Sigma Aldrich	1014242500