L-laktik asit aşırı üreten Bacillus coagulans mutantlarının yüksek verimli taraması otomatik damla mikrofluidik platform kullanılarak

Özet

Bu protokol, endüstriyel mikroorganizmalar için standart yüksek verimli tarama iş akışı sunar. ARTP mutagenezi yoluyla mutant bir kütüphane oluşturmayı, otomatik mikrofluidiklerle pozitif damla taraması yapılmasını ve ardından sonuçların doğrulanmasını içerir. İş akışının güvenilirliği, yüksek verimli B. coagulans suşlarının taramasıyla doğrulandı.

Özet

Endüstriyel biyoüretim, hedef ürünleri mühendislik koşullarında verimli bir şekilde sentezlemek için mikroorganizmalara dayanır. Ancak, vahşi tip suşlar genellikle doğal metabolik ağları nedeniyle bunu yapabilecek kapasiteden yoksundur. Bu nedenle, büyük ölçekli mutant kütüphanelerden yüksek performanslı suşların hızlı ve doğru taraması, endüstriyel mikrobiyal yetiştirmede kritik bir adımdır. Son yıllarda, damlacık mikroakışkanlık teknolojisi, yüksek verimliliği, düşük tüketimi ve tek hücre bölmelendirme yetenekleriyle önemli ilgi çekmiş ve çok sayıda tek hücreli ayırma sisteminin geliştirilmesine yol açmıştır. Bu çalışmada, otomatik damlacık mikrofluidik platform kullanılarak endüstriyel mikrobiyal suşlar için yüksek verimli bir tarama protokolü sunulmaktadır. Entegre iş akışı dört temel aşamadan oluşur: atmosfer ve oda sıcaklığında plazma (ARTP) mutagenezi yoluyla mutant bir kütüphanenin inşası; yüksek verimli tek hücreli kapsülleme ve pikolitre ölçeği damlalarında kontrollü mikro-yetiştirme; floresan biyosensörün hassas piko-enjeksiyonu, ardından floresansla aktive damla ayırma (FADS) ile yüksek üreten varyantlar içeren damlaları izole etmek; ve aday suşların mikroplaka ve shake-flask fermantasyonu ile doğrulanması. Tam ve entegre bir tarama iş akışı standartlaştırılmış bir şablon olarak tasarlanmıştır ve doğrulaması, yüksek verimli L-laktik asit üreten B . coagulans mutantlarının izolasyonu ile özel bir örnek olarak gösterilmiştir. Bu otomatik, yüksek verimli tarama platformu, yüksek performanslı türlerin endüstriyel yetiştirilişini hızlandırma potansiyeline sahip güçlü bir teknik çözüm sunar.

Giriş

Endüstriyel biyoteknoloji, mikroorganizmalar ve enzimleri biyokatalizör olarak kullanarak büyük ölçekte değerli ürünler üretmektedir. Bu yaklaşım, geleneksel kimyasal üretimden daha çevre dostu ve verimli kabul edilir. Ancak, mikroorganizmaların doğal metabolik ağları, insanların arzuladığı verimli ürünlerin sentezi yerine kendi hayatta kalma ve üremelerini önceliklendirecek şekilde evrimleşmiştir. Sonuç olarak, yüksek verimli mikrobiyal ıslahlaşma, endüstriyel üretim ortamlarının gereksinimlerini katı^{koşullarla karşılamak için genellikle gereklidir 1,2,3}. Bu süreç, fiziksel veya kimyasal mutagenez yoluyla büyük ölçekli mikrobiyal mutant kütüphanelerin hızla oluşturulmasını, ardından farklı genotiplere sahip mutantların kültürlenmesi ve fenotipik tespitini içerir. Daha sonra sadece üstün suşların küçük bir kısmı seçilir. Ancak, geleneksel plaka tabanlı ve mikroplaka tabanlı tarama teknolojileri, karmaşık prosedürler, düşük veri verimliliği ve yüksek maliyet nedeniyle engellenir. Bu darboğaz, sarf malzemeleri ve reaktiflerin önemli tüketimiyle birlikte, mikrobiyal yetiştirmenin genel verimliliğinin düşüklüğüne^{yol açar 4,5}.

Damlalı mikrofluidikler, bu soruna dönüştürücü bir çözüm olarak son zamanlarda ortaya çıkmıştır. Moleküllerin hücreden hızla uzaklaşması nedeniyle salgılanan ürünlerin taraması için uygun olmayan floresans-aktive hücre ayırtmasının (FACS) aksine, floresans-aktifeslenen damla ayırma (FADS) tek hücreleri pikolitre ölçeğinde, bölmelenmiş mikro-reaktörlerde^{kapsüller 6,7,8}. Bu fiziksel izolasyon, sürün rekabetini önler, salgılanan metabolitlerin lokal birikimini sağlar ve floresan biyosensörler aracılığıyla nicel olarak tespit edilmesini sağlar. Sonuç olarak, FADS, amino asitler, organik asitler ve enzimler dahil olmak üzere çeşitli hücre dışı ürünlerin yüksek verimli taraması için ideal bir platform olduğunu kanıtlamıştır. Bir ekip, genetik olarak kodlanmış floresan biyosensör GECFINDER'ı geliştirdi ve FADS ile birleşerek yüksek fenilalanin üreten suşları başarıyla taradılar ve tarama verimliliğini 1000 katından^{fazla artırdılar9}. Başka bir grup, E. coli'de 3-dehidroşikikik asit üreten suşların yüksek verimli taraması için genetik olarak kodlanmış bir biyosensör ile birlikte floresansla aktive damla ayırma platformu kurdu ve optimize edilmiş FADS sistemi, tarama verimliliğini büyük ölçüde artırdı ve mutant suşların izolasyonunu mümkün kıldı; üretim önemli ölçüde^{artırıldı 10}. Bazı araştırmacılar FADS teknolojisini Bst DNA polimerazının mühendisliğine uygulamış ve büyük ölçüde gelişmiş termostabilite ve iplik yer değiştirme aktivitesine sahip edinilmiş mutantlar, LAMP tespitine de uygulanmıştır; bu da reaksiyon süresini 40 dakikadan 10 dakika^11'e indirmiştir.

Ancak, bu teknolojik gelişmelerin rutin endüstriyel sürün geliştirme iş akışlarına dönüştürülmesi hâlâ zordur. Birçok ticari damla mikrofluidik sistem, gelişmiş donanımlarına rağmen, mikrobiyal fenotipik tarama için hazırlanmış, eksik, sezgisel ve tekrarlanabilir standart bir çalışma prosedüründen yoksundur. Bu açığı gidermek için, modüler akışkan kontrolü, kullanıcı dostu yazılım ve standartlaştırılmış çip tasarımını entegre eden otomatik damla mikroakışik platformu benimsendi ve tamamen entegre bir tarama iş akışı oluşturmak için ideal teknik temel oluşturuldu. Bu çalışma, yüksek verimli L-laktik asit üreten B. coagulanların yüksek verimli taramasını doğrulama vakası olarak kullanmaktadır. Damlacık mikrofluidik platforma dayanarak, dört önemli ardışık adımdan oluşan aşağıdaki iş akışı oluşturuldu: (1) atmosfer ve oda sıcaklığında plazma (ARTP) mutajezi yoluyla çeşitli mutant kütüphanesinin inşası; (2) B . coagulans büyümesi ve L-laktik asit üretimi için optimize edilmiş koşullarda damlacıklar içinde yüksek verimli tek hücreli kapsülleme ve kontrollü mikro-yetiştirme; (3) L-laktat-spesifik floresan biyosensörün hassas piko-enjeksiyonu, ardından üstün üreticileri kapsülleyen damlacıkların yüksek hızlı sıralaması; ve (4) artırılmış üretim ve genetik kararlılığı doğrulamak için shake-flask fermantasyonu yoluyla sıralanmış adayların titiz doğrulanması. Bu protokol, endüstriyel mikrobiyal ıslahçılıkla ilgilenen ve yüksek verimli hücre dışı ürünlerin taramasına ihtiyaç duyan araştırmacılar ve mühendisler için tasarlanmıştır. Özellikle küçük moleküllü metabolitler veya enzimler salgılayan kültürlenebilir bakteriler için uygundur. Tarama platformu, hedef metabolitlerin spesifik olarak tespit edilmesini sağlamak için damla mikro ortamıyla uyumlu sensörlerle donatılmalıdır. Özel yetiştirme gereksinimleri olan suşlar (örneğin, katı anaeroblar) için, yetiştirme parametreleri optimize edilecek şekilde uyarlanabilir ve özel bir kültür stratejisi oluşturulabilir. Bu kapalı döngü, standartlaştırılmış tarama iş akışını kurarak, bu çalışma suşların endüstriyel yetiştirilmesini hızlandırmak için güçlü ve aktarılabilir bir çözüm sunmayı amaçlamaktadır.

Protokol

Bu çalışma için etik onay gerekmemiştir. Tüm deneyler saf mikrobiyal kültürler kullanılarak gerçekleştirildi ve bu araştırmaya insan ya da laboratuvar hayvanı dahil edilmedi. Aşağıdaki protokolde kullanılan tüm malzemelerle ilgili detaylar için Materyal Tablosu'na bakınız.

1. Hazırlıklar

DIKKAT: Biyogüvenlik uygulamalarına uyun. B. coagulans, Biyogüvenlik Seviye 1 bir organizmadır. Eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin. Tüm açık manipülasyonları laminar akış başlığı içinde yapın. Canlı hücrelerle temas eden tüm malzemeleri 121 °C'de 20 dakika boyunca otoklav yapın, ardından bertaraf edin.

1. Strain kaynağı ve bakım
   1. B . coagulans ATCC 7050'yi ticari kültür toplama merkezinden ikinci nesil eğik kültür olarak satın alın.
   2. Eğik kültürü bir halka boyunca tohum ortamı agarına çizin ve 50 °C'de 24 saat kuluçka yapın. Tek bir koloni seçin, sıvı tohum ortamına aşılayın ve 50 °C'de, 200 rpm'de 12 saat boyunca büyütün.
   3. Ortaya çıkan kültürü steril %40 gliserol ile %25 (v/v) nihai konsantrasyona kadar karıştırın ve donmuş stok olarak –80 °C'de saklayın. Her deney için taze bir aliquot eritin, tohum orta agar'a damla ve 50 °C'de 24 saat kuluçka yapın.
   4. Sonra tek bir koloni seçip sıvı tohum ortamına aşılayın ve 50 °C, 200 rpm'de 12 saat boyunca kültür yapın, ardından mutagenez ve tarama için kullanın (Ek Şekil 1).
2. Laktik asit sensörü
   1. Ek Malzemeler^12'de (Ek Şekil 2) tanımlandığı şekilde eLACCO1.1 sensörünü ifade edin ve arındırın.
   2. Arındırılmış sensöre %5 (v/v) gliserol ekleyin ve –80 °C'de saklayın. Her deney için, bir aliquot buzda eritin ve hemen steril 10 mM PBS (pH 7,4) ile son çalışma konsantrasyonu 0,1 mg/mL olarak seyreltiltilsin.
3. Kültür medyasının hazırlanması
   1. Tohum ortamı (g/L: glikoz 20, maya ekstraktı 5, tripton 10, sodyum asetat 2, sodyum sitrat 2, K₂HPO₄ 2, MgSO₄·7H₂O 0.2, MnSO₄· H₂O 0.05, FeSO₄·7H₂O 0.01). Glikozu ayrı ayrı olarak 200 g/L stok olarak 115 °C'de 20 dakika boyunca sterilize edin.
      1. Kalan bileşenleri 121 °C'de 15 dakika boyunca otoklav edin. Soğuduktan sonra, steril glikoz stokunu son konsantrasyon olarak 20 g/L olarak ekleyin, ardından iz elementleri filtre ile sterilize edin.
      2. Tam ortamı 4 °C'de bir haftaya kadar sakla. Gece boyunca aktivasyon ve aşı hazırlığı için kullanın.
   2. Tarama ortamı (g/L: glikoz 20, maya ekstraktı 6.66, NaCl 0.333, NH₄Cl 0.665, KH₂PO₄ 2, Na_{2HPO 4.46}, MgSO₄ 0.12, CaCl₂ 0.074).
      1. Glikozu ayrı ayrı olarak 115 °C'de 20 dakika boyunca sterilize edin. Tuz/maya ekstraktı karışımını 121 °C'de 15 dakika boyunca otoklavlayın.
      2. Soğuduktan sonra steril glikoz stokunu 20 g/L'ye ekleyin. 4 °C'de bir haftaya kadar saklayın. Damla üretimi için sulu faz olarak ve 10 saatlik kuluçka sırasında damlaların içinde kültür ortamı olarak kullanılır.
   3. Fermantasyon ortamı (g/L: glikoz 90, tripton 13.33, maya ekstraktı 13.33, sodyum asetat 0.67, NaCl 0.0133, MgSO₄·7H₂O 0.0133, MnSO₄· H₂O 0.0133, FeSO₄·7H₂O 0.0133).
      1. Glikozu 115 °C'de 500 g/L stok olarak 20 dakika sterilize edin. Diğer bileşenleri 121 °C'de 15 dakika boyunca otoklavla.
      2. Soğuduktan sonra, steril glikoz stokunu 90 g/L'ye ekleyin. Aşılamadan hemen önce steril CaCO₃ tozu (%4 w/v) ekleyin ve pH tamponu edin. Her gün taze hazırlayın. Mikroplaka birincil taraması ve shake-flask doğrulaması için kullanım.
         NOT: Tüm ortamları damıtılmış suyla 1 L nihai hacme kadar hazırlayın. 1 M HCl ile pH 6.5'e ayarlayın.

2. ARTP kullanarak mutant bir kütüphanenin inşası

DIKKAT: ARTP işlemi yüksek frekanslı plazma ve UV lambası içerir. UV ışınları göz ve cilt hasarına neden olabilir. Plazma boşalması ozon ve yüksek sıcaklıklar üretir. Plazma açıkken odanın kapısını her zaman kapalı tutun. Laboratuvar önlüğü ve UV engelleyici gözlük takın. Sadece %99,999 saf helyum kullanılır; Yeterli havalandırmayı sağla. Her mutagenez işleminden sonra, çalışma tezgahını ve mutagenez odasının iç duvarlarını %75 (v/v) etanole batırılmış tüy içermeyen bir bezle silin. %75 etanol oldukça yanıcıdır. Açık alevlerden, kıvılcımlardan ve sıcak yüzeylerden uzak durun.

1. OD_600'ü canlı hücre konsantrasyonu ile ilişkilendiren standart bir eğri oluşturun.
   1. Tek bir B. koagulan kolonisini tohum ortamına aşılayın ve 50 °C, 200 rpm sıcaklığında 12 saat boyunca kuluçka yapın, kültür orta logaritmik aşamaya ulaşana kadar.
   2. Bakteriyel süspansiyonun seri seyreltmelerini 10,⁴, 10,⁵ ve 10,⁶ gradyanlarında hazırlayın.
   3. Her seyreltmeden 100 μL pipet yapın ve tohum orta ölçülü agar plakalarına üçlü olarak eşit şekilde yayın.
   4. Tüm kaplamalı agar plakalarını 50 °C'de 24 saat kuluçka edin.
   5. Her seyreltme için koloni oluşturan birimleri (CFU) sayın.
      NOT: Kalibrasyona göre OD₆₀₀ = 0.5 yaklaşık 1 ×^{10 8} CFU/mL denk gelir. Bu ilişkiyi kullanarak damla kapsülasyonu için başlangıç hücre yoğunluğunu belirleyin (Ek Şekil 3).
2. Kültür B. coagulan'ı orta ve geç logaritmik aşamaya kadar inceledikten sonra taze tohum kültürünü taze tohum ortamında OD₆₀₀ = 0.05'e kadar seyreltir.
3. Laminar bir akış başlığının içinde, sekiz steril küçük metal disk ve bir büyük metal disk hazırlanır. Sekiz küçük diski alkol ocağında 1 dakika boyunca alevle ısıtın, steril büyük diskin üzerine yerleştirin ve 10 dakika soğumasına izin verin.
4. Mikropipet kullanarak, seyreltilmiş bakteri süspansiyonundan 10 μL eşit şekilde sekiz soğutulmuş küçük diskin her birine yayılmıştır.
5. Aşılanmış küçük diskleri taşıyan büyük diski steril bir Petri kabına aktarın.
6. ARTP enstrümanını açın ve ana kontrol ekranını etkinleştirin. Mutagenez odasının içindeki UV lambayı açın. Soğutucu çalıştırın ve sıcaklık 20 °C'ye sabitlenene kadar 20 dakika önceden soğutun.
7. Mutagenez odasının kapısını hızla açın ve küçük diskleri içine yerleştirin.
8. Steril forseps kullanarak, her küçük diski sıralı olarak ARTP örnek aşamasına aktarın.
   NOT: RF gücü, helyum gazı akış hızı, memelik-numune mesafesi ve helyum saflığı sırasıyla 120 W, 10 SLM, 2 mm ve %99,999 olarak sabitlenmiştir. Helyum ışınlama süresi sırasıyla 5, 10, 15, 20, 25 ve 30 saniye olarak ayarlandı.
9. Her küçük diski belirlenen parametrelere göre ARTP mutagenezisine maruz bırakın. Işadanmadan sonra, tüm diskler 10 mL geri kazanım ortamı içeren 50 mL'lik santrifüj tüpüne aktarılır. Hücrelerin iyileşmesi ve büyümesi için 200 rpm'de 4 saat boyunca sallanarak 50 °C'de kuluçka yapın.
10. Ölümcüllük oranının belirlenmesi.
    1. Kurtarılan kültürü seri olarak ^10-2 ile ^10-6 arasında bir gradyana kadar seyrelt.
    2. Her seyreltmeden 100 μL tohum ortamlı agar plakalarına yayılır ve her seyreltme için üç replika hazırlanır.
    3. Tüm plakaları 50 °C'de 24 saat kuluçka edin.
    4. Kolonileri sayın ve karşılık gelen CFU/mL'yi hesaplayın.
    5. Ölümlülük oranını şu formülle hesaplayın:
       (1)
       NOT: Her zaman noktası için deneyi üçlü olarak yapın. Bu durumda ARTP için optimal mutagenez süresi 20 saniyedir (Ek Şekil 4).

3. Otomatik damlacık mikrofluidik platformun ve tüketim malzemelerinin bileşimi

1. Aktüye sistemi (Şekil 1)
   NOT: 0–1000 mbar basınç aralığına ve < 50 ms basınç tepki süresine sahip 3 yüksek hassasiyetli basınç kontrolörü kanalından oluşur (Şekil 1A).
2. Görüntüleme sistemi
   NOT: Yüksek hızlı CMOS mikroskobik görüntüleme, ≥ 2 GB/s yüksek hızlı görüntü veri toplama, 0–20.000 fps kare hızı ve maksimum 1280 x 860 çözünürlük sunar. Sistem, damla hareketinin gerçek zamanlı gözlemini sağlayan otomatik odaklama özelliğine sahiptir ve BMP, AVI, MP4 ve TIF dahil olmak üzere birden fazla formatta dışa aktarılabilen görüntü ve video kaydını destekler.
3. Tespit sistemi
   NOT: 2 lazerle floresan sinyal algılamaya olanak tanır: 488 nm ve 633 nm, ayrıca 2 tespit kanalı.
4. Ana kontrol sistemi
   NOT: Otomatik damla mikroakışkan platform yazılımı tarafından kontrol edilen sistem, sıvı aktuasyonu, mikroskobik görüntüleme, uyarılma ve algılama, damla üretimi, piko-enjeksiyon ve sıralama dahil olmak üzere birden fazla modülü entegre eder. Ayrıca deneysel verilerin edinilmesi, kaydedilmesi, saklanması, görüntülenmesi ve ihracatını destekler. Otomatik damlacık mikrofluidik platformun kısmi çalışma birimleri gösterilmiştir (Şekil 1B).
5. Tüketim Malzemeleri
   NOT: Bu protokolde kullanılan sarf malzemeleri şunlardır: yağ fazı için enjeksiyon tüpü, örnek ve reaktif (Şekil 2A); damla kuluçka için toplama tüpü (Şekil 2B); damla üretim çipi (Şekil 2C); damlalı piko-enjeksiyon çipi (Şekil 2D); ve damla ayırma çipi (Şekil 2E).

4. Damla üretimi

DIKKAT: Otomatik damla mikrofluidik platformunu temizleyin. Her deneyden sonra, aşamayı, çip tutucusunu ve dökülen bölgeleri tüy içermeyen mendillerle %75 etanol ile silin. Kalan florlu yağı, hücre süspansiyonunu veya sensör çözeltisini çıkarın.

1. Tek hücreli kapsülleme. 14 pL damlalarda λ = 0.1 elde etmek için bakteriyel süspansiyonu OD₆₀₀ ≈ 0.04'e seyreldin (OD₆₀₀=0.5, 1 ×^{10 8} CFU/mL ile eşleşir). Poisson dağılımına göre:
   (2)
   λ = 0.1 olduğunda, damlaların %90.5'i boş, %9.1'i tek bir hücre içerir ve %0.4'ü birden fazla hücre içerir.
   NOT: Bu durumda, ölçülen tek hücreli kapsülleme verimliliği %11,2'dir (Ek Şekil 5). Damladaki hücre sayısı DAPI boyama ile belirlenebilir. λ = 0.1 ve çoklu hücre kapsülleme oranı %1'i aştığında, birden fazla hücre içeren damlaların oranını azaltmak için OD₆₀₀ düşürülmelidir.
2. 300 μL florlu yağı yağ fazı giriş şişesine pipet yapın. Bakteriyel süspansiyondan 500 μL pipetle sulu faz giriş şişesine alın.
3. Damla üretim çipi yüzeyini kapatan bandı soyun. Yağ şişesini, numune şişesini ve toplama şişesini çipin ilgili kuyruklarına sırayla bağlayın.
4. Çipi sahneye yerleştirin ve sabitleyin. Hava tüplerini gaz yolu etiketlerine göre tek tek giriş şişelerine bağlayın.
5. Otomatik damla mikroakışkan platform yazılımını açın. Aşama hareket düğmesini çipteki ok yönlerine göre ayarlayarak görüş alanını damla üretim noktasına taşıyın.
6. Otomatik damla mikroakışkanı platform yazılımının "Damla Üretimi" arayüzünde "Başlat"a tıklayın (Şekil 3A). Görüntüleme arayüzünde, "Z ekseni" ve ışık kaynağı parlaklık kaydırıcılarını sürükleyerek görüntü netliği ve parlaklığını ayarlayabilirsiniz.
7. "Damla Hızı" ve "Damla Boyutu" düğmelerinin "+" ve "-" tuşlarına tıklayarak üretim hızını ve damla boyutunu ayarlayın.
   NOT: Bu durumda, damlacık üretimi için yağ fazı basıncı ve örnek faz basıncı otomatik olarak sırasıyla 300 mbar ve 400 mbar olarak ayarlanarak 1500 Hz üretim hızına ulaşılır. Bu ayarlarda, damlacıkların hacmi 14 pL olur ve damlacı çapının CV'si %5'in altında tutulur; böylece damla boyutu tutarlı ve güvenilir aşağı akış işlemleri sağlanır.
8. Ekipman stabil olana ve damla oluşumu durumu tutarlı kalana kadar 1 dakika bekleyin. Toplama şişesini hızlıca değiştirerek damla toplamaya başlayın.
   NOT: Yeni toplama tüpüne az miktarda florlu yağ eklemek için teflon tüpünün alt portunu kapatın, böylece damlaların doğrudan tüp duvarına temas etmemesini ve füzyona neden olmasını sağlayın.
9. 30 dakikalık operasyondan sonra damla toplamayı durdurun. Damla üretimini durdurmak için açılır pencerede "Durdur" seçeneğine tıklayın.
10. Toplama tüpünü çipten nazikçe çıkarın. Tüpü ve toplama şişesini dikey olarak yerleştirin ve tüpteki damlaların toplama şişesine girmesini bekleyin.
11. Aşamadan çipi, yağ fazı giriş şişesini ve sulu faz giriş şişesini çıkarın. Sahne yüzeyini %75 alkolle silin. Damla üretim aşaması tamamlanır.

5. Damla yetiştiriciliği

1. Toplama tüpüne 1 mL mineral yağ ekleyin.
   NOT: Mineral yağ tabakası, buharlaşmayı en aza indirmek ve oksijen maruziyetini azaltmak için damla süspansiyonunu kaplar, ancak fakultatif anaerob B. coagulans için yeterli gaz değişimini sağlar.
2. Toplama tüpünü dik konumda steril su içeren 15 mL'lik santrifüj tüpünün içine yerleştirin. Toplama tüpünü gevşek şekilde kapalı tutun ve 45 °C'de 10 saat kuluçka yapın.
   NOT: İnkubasyondan sonra, damla çapının CV'sinin %10 < olduğundan ve damla birleşmesinin gözlemlenmediğinden emin olun. Bu kriterler karşılanmazsa partileri at.

6. Damlalı piko-enjeksiyon

DIKKAT: Piko-enjeksiyon sırasında enstrüman bağlantısı aracılığıyla çip elektrotlarına yüksek voltaj uygulanır. Elektrik alanı şiddetli bir elektrik şokuna neden olabilir. Yüksek voltaj aktifken elektrotlara veya çip yüzeyine metal aletlerle veya çıplak ellerle dokunmayın. Çipi ele almadan önce her zaman yüksek voltaj çıkışını devre dışı bırakın. Yalıtımlı eldivenler giyin ve iletken olmayan aletler kullanın.

1. Yağ fazı giriş şşelyesini hazırlayın. Laminar akış başlığında, yağ fazı giriş şişesine 300 μL florlu yağ pipetleyin.
2. Numune giriş şişesini hazırlayın. Damlaları içeren toplama tüpünden giriş şişesi kapağını çıkarın. Yeni bir kapak takın.
3. Yeni giriş şişesinin ucunu kesin. Yeni giriş şişesinin ön ucundan küçük bir parça kesin, böylece uç numune şişesindeki damlaların sıvı seviyesinin altına ulaşsın.
4. Kapağı sık. Sızıntıyı önlemek için kapağı sıkıca sabitleyin.
5. Reaktif giriş şişesini hazırla. Laktik asit sensörünün 500 μL'sini reaktif giriş şişesine pipet edin.
6. Reaktif giriş şişesine PBS ekleyin. Aynı zamanda, aynı reaktif giriş şişesine 500 μL steril PBS tamponu ekleyin.
   NOT: Bu deneyde damlacıkların pH'ını dengelemek için PBS tamponu eklenmiştir. Laktat sensörünün nihai çalışma konsantrasyonu 0,1 mg/mL ve laktat sensörünün yükleme hacmi 500 μL idi.
7. Elektrotları açığa çıkarmak için elektrot yuvalarını kapatan bandı bir bıçakla kesin. Multimetreyi süreklilik moduna ayarlayın ve devre bağlantısını ile çipin kısa devre durumunu test edin.
   NOT: Multimetre çip elektrotlarının normal bir devre bağlantısını gösteriyorsa, bir sonraki adıma geçin. Devre açıksa, enjeksiyon çipini değiştirin ve tekrar test edin.
8. Multimetre ile normal devre bağlantısını doğruladıktan sonra, çip yüzeyindeki bandı soyun. Yağ şişesini, numune şişesini, reaktif şişesini ve toplama şişeyini çipin ilgili kuyularına sırayla bağlayın.
9. Çipi sahneye yerleştirin ve sabitleyin. Hava tüplerini gaz yolu etiketlerine göre tek tek giriş şişelerine bağlayın.
10. Otomatik damla mikroakışkan platform yazılımını açın. Aşama hareket düğmesini, çipteki ok yönlerine göre ayarlayarak görüş alanını damla çipinin elektrot alanına taşıyın.
11. Otomatik damla mikroakışkanlık platform yazılımının "Droplet Pico-injection" arayüzünde "Start" tuşuna tıklayın (Şekil 3B). Görüntüleme arayüzünde, "Z ekseni" ve ışık kaynağı parlaklık kaydırıcılarını sürükleyerek görüntü netliği ve parlaklığını ayarlayabilirsiniz.
    NOT: Bu noktada, cihaz otomatik olarak yağ fazı pompa basıncını 400 mbar, örnek faz pompa basıncını 420 mbar ve reaktif enjeksiyon fazı pompa basıncını 450 mbar olarak ayarlar.
12. Operasyonun ilk aşamasında, kateterdeki bir hava parçası çipe boşaldılır; bu, birkaç dakika süren normal bir olgudur.
13. Damlaların görüş alanına girmesini bekleyin. "Pico-enjeksiyonu başlat" seçeneğine tıklayın. Bu noktada, ekipmanın elektrik alanı aktive olacak. "Damla Hızı", "Damla Aralığı" ve "Enjeksiyon Stable" gibi "+" ve "-" tuşlarına tıklayarak damla üretim hızını, damla aralığını ve enjeksiyon sesliliğini ayarlayın.
    NOT: Elektrik alanı varsayılan maksimum vitese ayarlanmıştır. Füzyon sürecinde damlacıklar elektrik alan bölgesinde kırılırsa, orta veya düşük vitese geçin. Bu durumda, damla enjeksiyon hızı 200 Hz idi.
14. Yüksek hızlı görüntü görüntüleme yazılımında gözlemleyin. Damlacıklar laktik asit sensörüne 1:1 oranında istikrarlı şekilde enjekte edebiliyorsa, ekipmanın stabilleşmesini 5 dakika bekleyin. Toplama şişesini hızlıca değiştirerek damla toplamaya başlayın.
15. 2 saat boyunca stabil enjeksiyondan sonra, damlalı piko-enjeksiyonu sonlandırmak için "Stop" tuşuna tıklayın.
16. Toplama tüpünü çipten nazikçe çıkarın. Tüpü ve toplama şişesini dikey olarak yerleştirin ve tüpteki damlaların toplama şişesine girmesini bekleyin.

7. Damla ayırma

DIKKAT: Demulsifikator tahriş edici bir kaynaktır ve cilt ile göz tahrişine neden olabilir. Ayrıca solulursa veya yutulduğunda da zararlıdır. Her zaman uygun kişisel koruyucu ekipman (eldiven, laboratuvar önlüğü, güvenlik gözlüğü) giyin. Demulsifikatoru iyi havalandırılan bir alanda veya buharlı bir kaptan kullanın. Atık demulsifikatoru ayrı, açıkça etiketlenmiş bir kapta toplayın. Lavaboya dökme.

1. Laminar akış başlığında 300 μL florlu yağ pipetleyin ve yağ fazı giriş şişesine ekleyin. Mikroenjeksiyonlu damlacıklar içeren toplama tüpünün giriş şişesi kapağını yeni bir kapakla değiştirin.
   NOT: Damla ayırma deneyleri yapmadan önce, 5 μL damlacık alın ve floresan mikroskopu altında gözlemleyin. En az 200 damlanın çapını ölçün; CV %10 < devam edin.
2. Elektrotları açığa çıkarmak için elektrot yuvalarını kapatan bandı bir bıçakla kesin. Multimetreyi süreklilik moduna ayarlayın ve devre bağlantısını ile çipin kısa devre durumunu test edin.
3. Multimetre ile normal devre bağlantısını doğruladıktan sonra, çip yüzeyindeki bandı soyun. Yağ şişesini, numune şişesini ve ayırma toplama şişesini çipin ilgili kuyularına sırayla bağlayın.
4. Çipi sahneye yerleştirin ve sabitleyin. Hava tüplerini gaz yolu etiketlerine göre tek tek giriş şişelerine bağlayın.
5. Yüksek hızlı görüntüleme yazılımını açın. Aşama hareket düğmesini, çipteki ok yönlerine göre ayarlayarak görüş alanını damla çipinin elektrot alanına taşıyın.
6. Otomatik damla mikroakışkanı platform yazılımının "Damla Sıralama" arayüzünde "Başlat"a tıklayın. Görüntüleme arayüzünde, "Z ekseni" ve ışık kaynağı parlaklık kaydırıcılarını sürükleyerek görüntü netliği ve parlaklığını ayarlayabilirsiniz.
   NOT: "Başlat" tuşuna tıklandıktan sonra, cihaz otomatik olarak yağ pompası basıncını 300 mbar, örnek pompası basıncını ise 190 mbar olarak ayarlar ve bu da 100 Hz damlacık akışı sağlar.
7. Operasyonun ilk aşamasında, kateterdeki bir hava parçası çipe boşaldılır; bu birkaç dakika sürer ve normal bir olgudur.
8. "Lazer"i seçmek için tıklayın ve 488 nm algılama kanalını seçin.
   NOT: Deneysel personel, deneysel tespit tasarımına bağlı olarak 488 nm lazer, 633 nm lazer veya her ikisinin kombinasyonunu seçebilir. Lazer gücü: 20 mW.
9. "Veri Kaydı"na tıklayın. Cihaz damlalı floresans sinyallerini almaya başlayacak (Şekil 3C).
   NOT: 50.000 ila 100.000 damlacık arasında floresans sinyalleri toplayın; Cihaz sinyal değerlerini otomatik olarak sıralayacak ve floresans sinyal histogramı üretecektir.
10. Üretilen floresan sinyali histogramına dayanarak, sıralama eşiğini toplam floresan sinyallerinin en üst %0,1'ine ayarlayın ve bu eşiğin üzerinde floresan sinyali değerleri olan damlacıkları toplayın.
    NOT: Bu durumda, sıralama kapısı floresans yoğunluğu 2750 (a.u.) > damlacıkları toplayacak şekilde ayarlanmıştı; bu da damlaların en üst %0,1'ine karşılık geliyordu.
11. "Veri Kaydı"na tekrar tıklayın. Cihaz, kalan damlacıklardan floresan sinyallerini yeniden kaydedecek ve hedef damlacıkları Bölüm 7.10'daki eşik değerine göre sıralayacaktır.
    NOT: Kalan damla sinyalleri de otomatik olarak sıralanıp floresans histogramı olarak çizilir.
12. Hedef damla bölgesini seçtikten sonra "Sıralama Anahtarı"nı açın ve "Saptırma Gücü" değerini ayarlayın. Ekipman damlaları ayırmaya başlar.
    NOT: Cihaz, üç seçilebilir elektrik alan güç seviyesi sağlar (Yüksek, Orta, Düşük). 30 μm'den büyük damlalar için High; 25 μm'den küçük damlacıklar için Orta veya Düşük seçeneğini seçin. Bu, stabil sapma ve optimal ayırma verimliliği sağlar.
13. Ekipman 5 dakika stabil hale geldikten sonra, toplama şişesini değiştirerek pozitif damlacıkları toplayın.
    NOT: Sıralama sırasında, cihaz her damlanın floresans yoğunluğunu gerçek zamanlı olarak sürekli ölçür ve önceden belirlenmiş eşik ile karşılaştırır. Sadece eşik üzerindeki floresans yoğunluğuna sahip damlacıklar saptırılır ve pozitif toplama tüpüne toplanır. Bir damlacık, alet sıralama eşiğini aşan bir floresan sinyali gösterirse ve aynı zamanda görüntüleme arayüzünde damla sapması gözlemlenirse, damlanın pozitif toplama kanalına başarılı şekilde yönlendirildiğini doğrularsa.
14. 4 saat stabil çalışmadan sonra damla ayırmayı durdurun. "Droplet Sorting" arayüzünde "Dur"a tıklayın.
15. Toplama tüpünü çipten nazikçe çıkarın. Tüpü ve toplama şişesini dikey olarak yerleştirerek tüpteki damlaların toplama şişesine girdiğinden emin olun.
16. Damla toplama tamamlandıktan sonra, deneyin saçılım grafikini, sıralanmış pozitif damlacıkların floresan sinyal değerlerini ve tüm damlacıkların floresan sinyal değerlerini kaydetmek için dağılma grafikine tıklayın.
17. Aşamadan çip, yağ fazı giriş şişesini, numune şişesini ve reaktif şişesini çıkarın. Yazılımı kapatın.
18. Damla demulsifikasyonu. Damla toplama tüpüne 500 μL 1H, 1H, 2H, 2H-perflorooktanol ekleyin. 5 dakika bekleyin, sonra iyileşme için 500 μL yeni tarama ortamı ekleyin.
    NOT: Demulsifikatoru ekledikten sonra toplama tüpünü sertçe sallamayın; Nazikçe karıştır. Damla demulsifikasyonundan sonra, sulu ve petrol fazları arasında net bir arayüz oluşur.
19. Demulsifikasyon edilmiş bakteri süspansiyonundan 20 μL alın, 10 kat seyreldin ve iki agar plakasına yayın. 50 °C'de 2 gün kuluçka yapın.
    NOT: Sulandırma faktörü, toplanan damlaların sayısına göre ayarlanabilir. Bu durumda, iki plakadan yaklaşık 400 tek koloni elde edilmiştir.

8. Veri ihracatı

1. Yazılım sıralama arayüzünün boş alanındaki floresan sinyal grafikine tıklayın. Damla floresan sinyal saçılım grafikini, floresan sinyal histogramını ve floresan sinyali Excel tablosunu kaydetmek için seçin; bu tablolar, toplam damlacık sayısının kaydedilmiş floresans yoğunluk değerlerini ve ekrana alınan pozitif damlacıkların floresans yoğunluk değerlerini içerir.

9. Mikroplaka birincil tarama

1. Rastgele tek koloniler seçin.
2. 24 kuyuklu derin kuyu plakasını genleşme kültürü için aşılayın. Seçilen her koloniyi seçin ve 2 mL fermantasyon ortamı içeren 24 kuyruklu derin bir tabakanın bir kuyusuna aşılayın. Aşılama döngüsü kullanın.
3. 24 kuyruklu derin kuyu plakasını nefes almayan bir zarla mühürleyin.
   NOT: Nefes alınabilir bir zar kullanmayın. Kültür ortamının buharlaşmasına neden olur.
4. Genişleme kültürünü kuluçkaya sal. Mühürlü 24 kuyuyla derin kuyu plakasını 50 °C, 200 rpm'de 24 saat boyunca sarsıntı kuluçka makinesine yerleştirin.
5. Fermantasyon doğrulaması için alt kültür. 24 saat sonra, her kuyiden 200 μL kültür, 1,8 mL fermantasyon ortamı (%10 v/v inokulum) içeren taze 24 kuyruklu derin kuyulu bir tabakaya aktarın. Aşılamadan çok önce her birine %4 (w/v) son konsantrasyona steril CaCO₃ ekleyin ve pH tamponlanacaktır.
6. Kontrolleri de ekleyin. Her taze 24 kuyruklu derin kuyu plakasında, rastgele seçilmiş üç kuyuyu, negatif kontrol olarak ebeveyn suş ATCC 7050 ile doldurun. Onları aday suşlarla aynı şekilde işleyin.
7. 24 kuyruklu derin kuyu plakasını nefes almayan bir zarla mühürleyin.
8. 24 kuyu derin kuyu plakasını kuluçka altına alın. Kapatılmış plakayı 50 °C'de, 200 rpm'de 24 saat boyunca sallanan kuluçka makinesine yerleştirin.
9. Laktat tespiti için örnekler hazırlayın. Plakayı 5.842 × g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanttan 10 μL'sini 96 delikli siyah bir mikroplakaya aktarın ve 990 μL ultrasaf suyla seyreltin. İyi karıştır.
10. Laktat sensörünü ekleyin. Her bir taze 96 kuyruklu siyah plakanın her kuyusuna 100 μL seyreltilmiş numune ekleyin. Sonra 100 μL laktik asit sensörü ekleyin. Nazikçe karıştır.
11. Flüoresansı ölç. Plakayı oda sıcaklığında 5 dakika (ışıktan korunarak) kuluçka edin. 485 nm uyarımlı, 515 nm emisyonlu mikroplaka okuyucu ile floresansı ölçün.
12. Hit seçimi eşiğini belirleyin. Üç ebeveyn kontrol kuyusunun (ebeveyn) ortalama floresansını ve standart sapmayı (SD_parent) hesaplayın. Eşik değerini F_parent + 3 × SD_parent olarak tanımlayın.
13. Birincil isabetleri belirleyin. Aday bir suş, floresan sinyali eşiği aşarsa birincil vuruş olarak kabul edilir. Aşağı akış doğrulaması için birincil hit sayısını kaydedin.

10. Yüksek verimli suşların ikincil doğrulanması

DIKKAT: Hareketli faz, aşındırıcı olan seyreltilmiş sülfürik asit (5 mM) içerir. Cilt temasından ve solumadan kaçının. Uygun kişisel koruyucu ekipman (eldiven, laboratuvar önlüğü, koruma gözlüğü) giyin. Mobil aşamayı iyi havalandırılan bir alanda veya duman davlumbazında hazırlayın ve yönetin. Tüm asit içeren atıkları uygun şekilde bertaraf etmek üzere özel bir asit atık konteynerinde toplayın. Lavaboya dökme.

1. Tohum kültürünü hazırlayın. Birincil vuruş süzmelerini tohum orta ölçülü agar plakalarına çizin. 50 °C'de 24 saat kuluçka yapın. Her plakadan tek bir koloni seçin ve 250 mL'lik bir shake-flask'ta 30 mL sıvı tohum ortamına aşılayın. 50 °C'de, 200 rpm'de 12 saat kuluçka yapın.
2. Fermantasyonu kurun. Fermantasyon ortamını hazırlayın ve steril CaCO3 tozunu pH nötralize edici olarak %4 (w/v) nihai konsantrasyona ekleyin. 5 mL tohum kültürünü, 250 mL'lik Erlenmeyer şişesinde 45 mL bu ortama aktarın (%10 v/v inokulum; son çalışma hacmi 50 mL).
   NOT: Her aday suş için ve kontrol olarak ebeveyn suş ATCC 7050 için üç bağımsız şişe kullanın.
3. Matleleri kuluçka altına al. Termosları 50 °C, 200 rpm'de sallanan kuluçka makinesine yerleştirin. 24 saat fermente edin.
4. Örnekler toplayın. 24 saat sonra, her şişeden 1 ml kültür alın. Santrifüj 13.800 × g'de 2 dakika boyunca koyun. Süpernatantı ultra saf suyla 100 kat seyreldin ve 0,22 μm şırınga filtresinden geçirin.
5. HPLC koşullarını kur. Aminex HPX-87H kolonu kullanın. Mobil faz hazırlanır: ultrasaf suda 5 mM H₂SO₄, 0.22 μm membrandan filtre ve sonikasyon ile dega. Kolon sıcaklığını 40 °C'ye, akış hızını 0,6 mL/dakika'ya, enjeksiyon hacmini 20 μL'ye ve çalışma süresini örnek başına 20 dakikaya ayarlayın (laktik asit elülasyonları ~12.600 dakikada). Bir kırılma indisi dedektörü (RID) kullanın.
6. Standart eğriyi hazırla. Kalsiyum L-laktatı ultrasaf suda çözerek 0, 0.4, 0.8, 1.2 ve 1.6 g/L (kalsiyum L-laktat olarak ifade edilir) standart çözeltiler hazırlanır. Her standardı üçlü olarak enjekte edin.
   NOT: Zirve alanını konsantrasyona karşı çizin ve doğrusal regresyon denklemini elde edin (R² > 0.999). Her örnek partisinin başında ve sonunda kaymayı düzeltmek için standartlar çalıştırın.
7. Örnekleri enjekte edin. Filtrelenmiş fermantasyon süpernatantlarını (20 μL) HPLC sistemine enjekte edin. Kalsiyum L-laktat zirvesi için zirve alanını kaydedin.
   NOT: Sistem kararlılığını izlemek için her 10 örnekte bir kalite kontrol örneği (1 g/L kalsiyum L-laktat) enjekte edin. Kabul edilebilir tutma zaman kaydırması <0,2 dakika ve pik alan varyasyonu ilk kalibrasyon standardına kıyasla %<5'tir.
8. L-laktik asit verimini hesaplayın. Her örneğin tepe alanını standart eğriye interpolasyon ederek kalsiyum L-laktat konsantrasyonu (g/L) elde edilir.
   NOT: Moleküler ağırlık oranı kullanılarak L-laktik asit konsantrasyonuna dönüştürün:
   (3)
   İyileşme yüzdesini hesaplayın:
   (4)
9. Son yüksek verimli suşları belirleyin. Validasyonlu mutantlar olarak ebeveyn suşundan tutarlı olarak daha yüksek L-laktik asit verimi gösteren suşları seçin. Daha fazla karakterizasyon için en iyi oyuncuyu seçin.

11. Yüksek verimli suşların genetik kararlılık değerlendirmesi

1. Seçilmiş mutant süzü tohum orta ölçülü agar plakalarına çizin. 50 °C'de 24 saat kuluçka yapın. Bu 1. nesil.
2. 1. nesil plakadan tek bir koloni seçin ve 50 mL'lik bir tüpte 5 mL sıvı tohum ortamına aşılayın. F1 tohum kültürünü elde etmek için 50 °C, 200 rpm sıcaklıkta 12 saat kuluçka yapın.
3. 1. nesil tohum kültürünün %10'unu (v/v) 50 mL fermantasyon ortamına (%4 w/v steril CaCO₃ içerir) 250 mL'lik bir shake-flask'ta aktarın. 50 °C'de, 200 rpm'de 24 saat kuluçka yapın.
4. Fermantasyondan sonra 1 mL kültür toplayın. 13.800 × g sıcaklıkta 2 dakika santrifüj yapın, süpernatantı ultra saf suyla 100 kat seyreldin ve HPLC ile L-laktik asit konsantrasyonunu ölçün. Her nesil için üç bağımsız şişe kullanın.
5. Bir sonraki nesli elde etmek için, 1. nesil kültüründen bir halka dolusu taze tohumlu orta ölçülü agar tabağa çizin. 50 °C'de 24 saat kuluçka yapın. 2. nesil için 11.2 ve 11.3 adımlarını tekrarlayın.
6. Alt kültür sürecini tekrarlayarak 3. ve 4. nesil elde edin. Her nesil için üç shake-shot hazırlayın ve HPLC ile laktik asit üretimini ölçün.
7. Dört neslin (1–4) verimlerini tek yönlü bir ANOVA veya Öğrenci t-testi kullanarak karşılaştırın. Nesiller arasında laktik asit üretiminde önemli bir fark (p > 0.05) gözlemlenmezse, suş genetik olarak kararlı kabul edilir.

Sonuçlar

Otomatik damla mikrofluidik platformuna dayanarak, yüksek verimli bir tarama modeli oluşturuldu. ARTP mutajezi ile 20 saniyelik optimal radyasyon süresiyle B. coagulans mutant kütüphanesi oluşturulmuştur ve bu da yaklaşık %90 öldürücülük oranı sağlamıştır (Şekil 4A). Mutant hücreler daha sonra yaklaşık 30 μm çapında 14 pL damlacıklara kapsüllenmiş, üretim hızı 1500 Hz (Şekil 4B). 45 °C'de 10 saat kuluçka yapıldıktan sonra, sensör her damlaçaya 200 Hz hızda piko-enjekte edildi (Şekil 4C). Floresansla aktive damla ayırma, 488 nm lazer kullanılarak 100 Hz'de gerçekleştirildi (Şekil 4D). Sıralanan pozitif damlacıklar demulsifikasyona alındı ve doğrulama için tek koloni seçildi. Toplanan koloniler ilk olarak 24 saat boyunca 50 °C ve 200 devirde fermantasyon ortamı içeren 24 kuyu derin kuyulu plakalarda yetiştirildi. Her kuyunun floresansı, uyarılma ve emisyon dalga boylarında sırasıyla 485 nm ve 515 nm olan mikroplaka okuyucu ile ölçüldü. Ebeveyn suşunun ortalamasından daha yüksek floresans gösteren klonlar ve üç standart sapma seçildi. Bu adaylar daha sonra %10 aşı ile 250 mL'lik shake-flakonlara aktarıldı ve aynı koşullarda 24 saat daha fermente edildi. L-laktik asit konsantrasyonu nihayet yüksek performanslı sıvı kromatografi ile belirlendi (Şekil 4E).

Yüksek L-laktik asit üreten suşları taramak için laktik asit sensörünün kullanılmasının uygulanabilirliğini doğrulamak amacıyla, sensör ilk olarak karakterize edildi. Laktik asit sensörünün mikroplakalarda tespit edilebilmesini doğrulamak amacıyla, mikrotiter plakalara 100 μL laktik asit standartları (1, 10, 1000, 10000, 10000, 100000 μM) eklendi ve her kuyuya 100 μL laktik asit sensör karışımı eklendi. Sonuçlar, laktik asit konsantrasyonunun 100 μM'den 10 mM'ye yükselmesiyle floresans yoğunluğunun arttığını gösterdi. Sensör, hem L-laktik aside güçlü floresans yanıtları gösterdi (Şekil 5A). Buna rağmen, iki nedenle mevcut çalışma için tamamen uygun olmaya devam etmektedir. İlk olarak, B. coagulans ATCC 7050, L-LDH egemen metabolik profiliyle doğrulandığı gibi, önemsiz bir D-laktik asit oluşumuna sahip, iyi karakterize edilmiş bir L-laktik asit üreticisidir. İkinci olarak, sensörün gerçek fermantasyon örneklerinde L-laktik asit miktarı doğruluğu HPLC ile karşılaştırıldığında doğrulandı (Şekil 5B). Bu nedenle, D-laktik asite karşı in vitro çapraz reaktiviteye rağmen, sensör tarama iş akışımızda L-laktik asit seviyelerini güvenilir şekilde bildirir. Laktik asit sensörü kullanılarak nicel laktik asit tespit yapılabilirliğini doğrulamak için, sensörün hem sulu çözelti hem de tarama ortamında geri kazanma oranları ölçüldü. Sonuçlar, tarama ortamında %108,81 ve sulu çözeltide %98,39 olan yüksek iyileşme oranını göstermiş, göreli standart sapmalar %5< olmuştur (Şekil 5C). Ortamdaki hafif yükselme kabul edilebilir %90–110 aralığındadır ve bu da anlamlı bir matris girişimi olmadığını gösterir. Mikroplaka testlerinde, sensör L-laktik asit standartlarıyla 1:1 karıştırıldı, 5 dakika kuluçka içinde alındı ve 0–0,6 g/L aralığında mükemmel doğrusal performans sergiledi (Şekil 5D). Ayrıca, floresans yöntemi 96 örneğin 5 dakikada tespit edilmesini sağladı ve bu da HPLC'ye kıyasla toplam tespit süresinde 384 kat azalma anlamına geliyordu. Laktik asit sensörünün damla bazlı taramada uygulanabilirliğini daha da doğrulamak için, farklı konsantrasyonlarda L-laktik asit içeren damlacıklar üretildi ve her damlaçaya eşit miktarda laktik asit sensörü piko-enjekte edildi. Damlacıkların floresans yoğunluğu, otomatik damla mikroakışkanı platformu kullanılarak tespit edildi. Sonuçlar, L-laktik asit konsantrasyonu arttıkça floresan sinyalinin sağa doğru önemli bir kaymasını gösterdi (Şekil 5E). Depolama için, laktat sensörü %5 gliserol ile takviye edilmiş ve -80 °C'de depolanmış, bu da en az bir ay boyunca tespit kararlılığını korudu (Ek Şekil 6).

FADS teknolojisiyle üremek için uygun bir sensör seçmenin yanı sıra, damlacıklardaki suşların optimal kültür süresini belirlemek de çok önemlidir. Yetersiz kültür süresi, yetersiz L-laktik asit salgılanmasına yol açabilir ve yüksek verimli ile düşük verimli suşları ayırt edemeyen düşük floresans sinyallerine yol açabilir. Buna karşılık, aşırı uzun kültür süresi aşırı L-laktik asit birikimine neden olabilir ve bu da laktik asit sensörünün tespit aralığını aşabilir. Bu sorunu çözmek için, damlalardaki suşların kültür süresi, büyüme durumlarının dinamik izlenmesiyle optimize edildi. Suşlar, damlalarda kültürün 6 saatinde logaritmik büyüme aşamasına girdi ve damlacıklardaki bakteriyel biyokütle, 10 saatte önemli ölçüde arttı (Şekil 6A). Buna karşılık, kültür süresi 12 saati aştığında, damlacıklar belirgin bir küçülme göstermiştir. Bu olgu, dırılma büyümesinin geç aşamasında damlacıkların içinde oluşan osmotik basınç değişikliklerine atfedilir ve bu da damlaların küçülmesine neden olur. Bu tür küçülme, sonraki deneylerde farklı damlacıklar arasında tutarsız pico-enjeksiyon hacimlerine yol açabilir. Optimal kültür süresini belirlemek için, farklı süreler için kültürlenen damlacıklara eşit miktarda laktik asit sensörü enjekte edildi. Damlacıkların floresan sinyalinin 10 saatlik kültür sonrası önemli ölçüde arttığı tespit edildi; bu nedenle, damlacıklardaki suşlar için optimal kültür süresi olarak 10 saat seçilmiştir (Şekil 6B).

Tek bir tarama turunda, damlacıklar 100 Hz hızda 4 saat boyunca bir ayırma çipi kullanılarak sıralandı ve en yüksek floresans yoğunluğuna sahip damlaların en üst %0,1'i toplandı (Şekil 6C). Pozitif damlacıklar steril bir toplama tüpüne toplandı ve 500 μL demulsifleyici ile 500 μL taze tohum ortamı ile işlendi. 5 dakika boyunca hafif çalkalamadan sonra, üst sulu fazdan 20 μL alındı, 10 kat seyreltildi ve iki katı agar levhasına yayıldı. 50 °C'de 2 gün kuluçka yaptıktan sonra, 200 tek koloni rastgele seçilip 24 kuyu derin kuyulu plakalara aşılandı ve genleşme kültürü yapıldı. Kültürlenen 200 klon arasında, 78 mutant suş ebeveyn suşundan daha yüksek L-laktik asit verimleri göstermiştir (Ek Şekil 7). Bu 78 mutant daha sonra shake-flask doğrulamasına tabi tutuldu ve ebeveyn suşuna kıyasla daha iyi verimli 17 suş nihayet elde edildi. Bunlar arasında, mutant ADC-17 en büyük artışı gösterdi; 57,2 g/L'den 67,04 g/L'ye yükseldi ve bu da %17,2 iyileşmeyi temsil etti (Şekil 6D). ADC-17'nin genetik stabilitesi ardışık dört nesil boyunca değerlendirildi. Dört nesil arasında (p > 0.05) anlamlı bir fark gözlemlenmemiştir; bu da ADC-17'nin yüksek verimli özelliğinin ardışık dört alt kültürde stabil kaldığını gösterir (Şekil 6E). Bu sonuçlar, rastgele mutant kütüphanelerden yüksek verimli suşları tek bir tarama turunda zenginleştirmek için laktik asit sensörü kullanan FADS platformunun etkinliğini ve güvenilirliğini göstermektedir.

Şekil 1: Otomatik damla mikroakışkan platformunun bileşimi. (A) Platformun iç yapısı. Dört çekirdek modülden oluşur: basınçla yönlendirilen akışkan kontrolü, yüksek hızlı CMOS görüntüleme, 488 nm/633 nm çift lazer floresan algılama ve damla manipülasyonu ile veri çıkışı için bir ana kontrol sistemi. (B) Otomatik damla mikroakışkan platformu çalışma platformu. Etiketlenmiş bileşenler arasında a. Yerleştirme Platformu, b. Yüksek Hızlı Kamera, c. Çip Elektrotları, d. Çip Sabitleme Kelepçesi, e. Yonga Yerleştirme Oluğu, f. Metal Banyo, g. Hava pompası 1: Yağ fazını kontrol eder, h. Hava Pompası 2: Numuneyi kontrol eder. Hava Pompası 3: Reaktif enjeksiyonunu kontrol eder. Şekil 1A, Biorender kullanılarak oluşturulmuş ve telif hakkı lisansı sağlanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Deneysel tüketim malzemeleri. (A) Enjeksiyon tüpü: yağ fazı, örnek bakteri süspansiyonu ve reaktif çözeltisi enjekte etmek için. (B) Toplama tüpü: damlaların toplanması ve ardından yetiştirilmek için. (C) Damla hazırlama çipi: 14 pL damlacık üretir. (D) Damla mikroenjeksiyon çipi: reaktifleri damlacıklara mikroenjekte eder. (E) Damla ayırma çipi: pozitif suşları elektrotlar aracılığıyla ayırır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Otomatik damla mikroakışkanlık platformunun temel yazılım arayüzleri. (A) Damla üretim yazılımı arayüzü girişi. C. Başlat: Damla üretimini başlatmak için tıklayın. B. Hız: Damla üretim hızını ayarlayın. C. Boyut: Damla hacmini ayarlayın. D. Dur: Damla oluşumunu durdurmak için tıklayın. (B) Damla piko-enjeksiyon arayüzü. E. Enjeksiyon hacmi: Reaktif enjeksiyon hacmini ayarlayın. F. Füzyon kuvveti: Üç voltaj seviyesi (Yüksek/Orta/Düşük). (C) Damla sıralama arayüzü girişi. G. Laser. Lazer tipini seçin (488 nm veya 633 nm). H. Veri kaydı. I. Sapma Kuvveti: Üç voltaj seviyesi (Yüksek/Orta/Düşük). J. Sıralama anahtarı: Damla sıralamaya başlamak için tıklayın. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Otomatik damla mikroakışkanı platformuna dayalı yüksek verimli tarama iş akışı. (A) ARTP mutagenezi ile mutant kütüphane inşası. (B) Damla üretimi ve kuluçka. Tek hücreler pikolitre damlalarında bölümlere ayrılmıştır. (C). Damla piko-enjeksiyonu. Her damlaçaya bir floresan sensör piko-enjekte edilir. (D) Damla ayırma. Yüksek floresanslı damlacıklar (yüksek L-laktik asit üretimini gösterir) FADS ile zenginleştirilir. (E) Mikroplakalar ve sarsma şişelerinde pozitif klon doğrulaması. Kısaltma; FADS = Floresansla Aktive Damla Ayırma. Şekil 4 Biorender kullanılarak oluşturulmuş ve telif hakkı lisansı sağlanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Laktik asit sensörünün in vitro karakterizasyonu. (A) Laktik asit sensörünün L-laktik asite karşı yanıt aralığı. Uyarılma/Emisyon = 485/515 nm. Üç bağımsız deneyden (n = 3, her biri üçlü teknik kopyalara sahip) ortalama ± SD. (B) HPLC ile korelasyon. Altı fermantasyon örneği (farklı zaman noktaları) her biri laktat sensörü ve HPLC tarafından bir kez analiz edildi. Doğrusal regresyon R² = 0.9927 verdi. Uyarılma/Emisyon = 485/515 nm. (C) Laktik asit geri kazanım deneyi. L-laktik asit, ultra saf suya ve tarama ortamına 0.5 g/L ile karıştırıldı. Veriler ortalama ± SD (n = 3 bağımsız deney) olarak belirlendi. İyileşme oranları %98,39 (su) ve %108,81 (tarama ortamı) iken, STD < %5 idi. Uyarılma/Emisyon = 485/515 nm. (D) Tespit süresinin optimize edilmesi. Sensör, L-laktik asit standartlarıyla (0–0.6 g/L) karıştırıldı ve 0, 5, 10, 15, 20, 25 ve 30 dakika kuluçka edildi. En yüksek R² = 0.990 5 dakikalık karıştırmadan sonra elde edildi. Veriler üç bağımsız deneyden (n = 3) alınmıştır. Uyarılma/Emisyon = 485/515 nm. (E) Damla floresans histogramı. L-laktik asit konsantrasyonu başına en az 2000 damla analiz edildi. Algılama kanalı: 488 nm, DC (V) = bir damlanın floresans yoğunluğunu temsil eden voltaj sinyali. Kısaltma; STD = Standart sapma. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Yüksek L-laktik asit üretimine sahip B.coagulans'ın yüksek verimli taraması. (A) Damlacıklar içindeki deformasyon morfolojisi 0, 2, 4, 6, 8 ve 10 saatte gözlemlenmiştir. Ölçek çubuğu: 20 μm. Maruz kalma süresi: 100 ms. (B) B. coagulans içeren damlaların floresan yoğunluğundaki değişiklikler, laktik asit sensörü enjeksiyonu ile farklı süreler boyunca kuluçka sonrası. Görüntüler 2000 ms pozlama süresi ve %1500 kazanç ile alındı. Ölçek çubuğu: 50 μm. (C) Damlacıkların floresans yoğunluk dağılımı. Tarama eşiği: FL yoğunluğu > 2750 (a.u.). Tespit kanalı: 488 nm (D) L-laktik asit verimleri (g/L) ebeveyn suşunun (ATCC 7050) ve temsil eden pozitif mutantlar. Veriler ortalama SD ± (n = suş başına 3 bağımsız shake-flason). P < ebeveyn türüyle karşılaştırıldığında 0.0001. En iyi performans gösteren mutant ADC-17 %17,2 artış gösteriyor. (E) En iyi performanslı B. coagulans ADC-17'nin dört ardışık nesil boyunca genetik stabilitesi (1–4). L-laktik asit verimleri, 24 saat shake-flask fermantasyonundan sonra HPLC ile belirlendi. Veri, ortalama SD ± (n = 3 flason/nesil başı) olarak belirlenir. Tek yönlü ANOVA nesiller arasında anlamlı bir fark göstermedi (p > 0.05, ns). Kısaltma; HPLC = Yüksek performanslı sıvı kromatografi; SD = Standart Sapma. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Laktat sensörü eLACCO1.1'in arındırılması. Protein, 500 mM imidazol ile eluasyon yapıldı ve %5 gliserol ile -80 °C'de depolandı. Çalışma yoğunluğu 0.1 mg/mL'dir ve tespit sınırı 2 mg/L'dir. Ek Şekil 1, yalnızca Microsoft PowerPoint'teki yerel çizim araçları (temel şekiller, çizgiler ve metin kutuları dahil) kullanılarak tamamen yazarlar tarafından yeniden oluşturulmuştur. Üçüncü taraf simgeleri, şablonları veya harici görsel kaynakları kullanılmamıştır. Tüm unsurlar yazarların özgün eserleridir. Bu nedenle, bu rakam ek bir yayın lisansı gerektirmez. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: B. coagulans ATCC 7050'nin büyüme eğrisi. Suş, tohum ortamında 50 °C'de 200 rpm'de çalkalanma ile yetiştirildi. Veriler ortalama SD ± (n = 3 bağımsız kültür) olarak sunulur. Kültür yaklaşık 12 saat içinde geç logaritmik aşamaya ulaşmış ve bu zaman noktası sonraki deneylerde aşı hazırlamak için kullanılmıştır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: B. coagulans ATCC 7050 için OD₆₀₀ ile canlı hücre konsantrasyonu arasındaki kalibrasyon eğrisi. Orta log faz kültürünün seri seyreltmeleri hazırlandı ve OD₆₀₀ ölçüldü. İlgili koloni oluşum birimleri (CFU/mL), tohum ortamlı agar plakalarına 100 μL uygun seyreltme yayılması ve 50 °C'de 24 saat kuluçka yapılmasıyla belirlendi. Veriler ortalama SD ± (n = 3 bağımsız deney) olarak sunulur. Bu eğriye göre, OD₆₀₀ = 0.5 yaklaşık 1 ×^{10 8} CFU/mL'ye karşılık gelir. Bu kalibrasyon, damla kapsülasyonu için başlangıç hücre yoğunluklarını belirlemek için kullanıldı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 4: ARTP mutagenezi altında B. coagulans ATCC 7050'nin öldürücülük eğrisi. Hücreler helyum plazmasına farklı sürelerde (5, 10, 15, 20, 25, 30 saniye) maruz kalmıştır. Aşıtmadan sonra, hücreler tohum ortamlı agar'a örtülendi ve CFU 24 saat kuluçkadan sonra 50 °C'de sayıldı. Ölümcüllük (%) Denklem (2)'ye göre hesaplandı. Veriler ortalama ± SD (n = 3 bağımsız tekrar) olarak sunulur. Ok, yaklaşık %90 öldürücülük oranıyla seçilmiş mutagenez süresini (20 s) gösterir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 5: DAPI boyama ile tek hücreli kapsülleme verimliliğinin belirlenmesi. B. koagulanlar ATCC 7050 hücreleri DAPI ile boyanmış ve λ = 0.1 seviyesinde damlalara kapsüllenmiştir. Toplam 2000 damla floresan mikroskopisi altında incelendi ve 0, 1 veya ≥2 hücre içeren damlaların sayısı sayıldı. Gözlemlenen tek hücreli kapsülleme verimliliği %11,2 olup, teorik Poisson beklentisinden (λ = 0,1 %9,0) biraz daha yüksektir. Bu sapma, aktif hücre dispersyasyonu, zayıf hücrelerin spesifik olmayan DAPI boyaması ve damla oluşumu sırasında küçük agregaların kesme sonucu parçalanması gibi faktörlere bağlanabilir. Ölçek çubuğu: 30 μm. En az 2000 mikro damla analiz edildi. Görüntüler 2000 ms pozlama süresi ve %1500 kazanç ile alındı. Kısaltma; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindol. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 6: Sensör depolama kararlılığı.  Sensörün -80 °C'de %5 gliserol ile dört hafta boyunca depolanmış floresans tepkisini gösterir. Sinyalde önemli bir kayıp gözlemlenmedi ve bu da iyi bir depolama kararlılığını doğruladı (p > 0.05). Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 7: Derin kuyu plakalarında kontrolden daha yüksek laktik asit üretimi gösteren 78 suşun birincil tarama sonuçları. Bu birincil taramada, ana suşun verimini aşan L-laktik asit verimine sahip toplam 78 mutant suş tespit edilmiştir. Tüm mutant suş verileri, biyolojik kopya olmayan tek noktalı tarama sonuçlarını temsil eder. Ebeveyn sürün (kontrol) referans olarak 24 derin kuyu plakasına rastgele dağıtılmış ve verileri, üç bağımsız 24 derinlik kuyulu plaka replikasyonunda ortalama ± standart sapma olarak sunulmuş (n = 3). Y ekseni, x eksenindeki her suş için L-laktik asit verimini (g/L) gösterir; hata çubukları yalnızca ebeveyn gerilme kontrolü için gösterilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokol, otomatik damlacık mikrofluidik platformuna dayalı endüstriyel mikrobiyal tarama için standartlaştırılmış bir iş akışı sunar. Entegre iş akışı, mutant kütüphanelerin inşası, damla üretimi ve tek hücre kapsülasyonu, mikro reaktör yetiştiriciliği, biyosensör enjeksiyonu, floresansla aktive damla ayırma ve hedef suşların nihai validasyonu kapsar. Yüksek verimli L-laktik asit üreten B. coagulans'ın yüksek verimli taramasını doğrulama vakası olarak kullanarak, bu iş akışı B. coagulans suşunun iyileştirilmesi bağlamında geleneksel mikroplaka ve agar-plaka yöntemlerine göre birçok avantaj göstermiştir. Tarama verimliliği ve verimliliği açısından platform, mikrofluidik çiplerden yararlanarak saniyede binlerce ila on binlerce damlacı paralel olarak üretir ve işler yapar; geleneksel mikroplaka tabanlı yöntemlere kıyasla tek turda tarama veriminde yaklaşık^{10 kat 4} kat artış sağlar¹². B. coagulanlar için iş akışı 4 saat içinde 10⁶ damlayı taramak yapabilir, böylece sürün gelişim döngüsünü birkaç haftadan sadece birkaç güne kısaltır ve üreme sürecini önemli ölçüde hızlandırır. FADS sisteminin tarama verimliliği, plaka tabanlı tarama sisteminin yaklaşık 3 × 10³ katıdır; aynı zamanda altyapı, işçilik ve tüketim maliyetlerini önemli ölçüde azaltır¹³. Ancak, farklı mikroorganizmaların doğasında bulunan özellikleri nedeniyle, bu standart iş akışının hedefli optimize edilmesi gereklidir. Örneğin, maya yetiştiriciliğinin 36 saatinden sonra, osmotik basınçtaki değişiklikler damla hacminin azalmasına yol açar ve enjeksiyon ve ayırma işlemlerinin istikrarını sağlamak için kuluçka süresinin ayarlanmasını gerektirir¹⁴. Filamentimsi mantarlar için, damla arayüzünün miselil büyüme nedeniyle kırılması veya birleşmesini önlemek için damla hacminin artırılması genellikle^{gereklidir 15,16}.

Ayrıca, çok küçük miktarda pikolitre ölçeği damlaları nedeniyle, her hedef ürün için özel floresan biyosensörler geliştirmek gereklidir. Proteazlar ve küçük moleküllü metabolitler için birkaç klasik floresan tespit reaktifi, hidrojen^{peroksit 17},^{glikozidaz 18}, etanol¹⁹ ve glikoz²⁰ gibi ticari olarak mevcut olmaktadır. Buna rağmen, kimyasal olarak sentezlenen floresan probların türleri sınırlıdır ve damlacıklardan bitişik boş damlacıklara sızma eğiliminde, arka plan floresansının yükselmesine yol açar. Bunun başlıca nedeni, hidrofobik floresan moleküllerin yağ-su arasına kolayca nüfuz^{edebilmesidir 21}.

Son yıllarda biyosensörler ağırlıklı olarak iki türden oluşmaktadır: genetik olarak kodlanmış biyosensörler ve transkripsiyon faktörü (TF) tabanlı biyosensörler. Genetik olarak kodlanmış floresan biyosensörler, hücre içi olarak ifade edilebilen ve in vivo sinyal iletimi izlemek için sensör olarak tasarlanabilen kimerik proteinleri ifade eder. Mükemmel stabiliteleri, hızlı floresan yanıtı ve yüksek özgüllükleri nedeniyle, genetik olarak kodlanmış floresan biyosensörler birden fazla senaryoda^{uygulanmıştır 22}. Bir ekip, yoğunluk bazlı glutamat algılayıcı floresan raporlayıcıyı (iGluSnFR) mikrofluidik damla ayırma sisteminde kullanarak, Bacillus amyloliquefaciens mutantlarının glutaminaz üretimini artıran tarama için yüksek verimli bir iş akışı oluşturdu. Bu biyosensör tabanlı platform, 56 kat zenginleştirme oranı sağladı ve nihayetinde 10^{adet 5} üyeli tam genom mutant kütüphanesinden glutaminaz üretiminde %47'den fazla artışa sahip bir^{varyantı izole etti 23}.

Transkripsiyon faktörü (TF) tabanlı tam hücre biyosensörleri, transkripsiyon faktörleri etrafında inşa edilmiş önemli bir tüm hücre biyosensör sınıfıdır. Transkripsiyon faktörleri, belirli DNA dizilerine bağlanarak gen ifadesini düzenleyen bir protein^{sınıfıdır 14}. Bazı transkripsiyon faktörleri, metabolitlere veya dıştan bileşiklere bağlandığında aktive olur; bunlara allosterik transkripsiyon faktörleri (aTF) denir. Aktive edildikten sonra, aTF'ler konformasyonel değişiklikler geçirir ve bu değişiklikler hedef genlerin önündeki DNA dizisinden ayrılmalarına veya bağlanmalarına yol açar ve böylece bu genlerin ekspresyonunu aktive eder veya inhibe eder. Transkripsiyon faktörleri, sentetik biyolojide yaygın olarak kullanılan diğer DNA elementleriyle (promotörler, ribozom bağlanma noktaları, terminatörler ve raporlayıcı genler) birleştirilerek TF tabanlı biyosensör genetik devreleri oluşturulabilir. Bu genetik elementler, hücrede veya çevredeki çeşitli ligandların yoğunluğunu algılayabilir ve buna göre yanıt^{verebilir 24}. Eritritol tespiti, FADS platformuyla entegre edilmiş transkripsiyon faktörü tabanlı bir biyosensör kullanılarak başarıyla uygulanmıştır ve mutant bir suşun izolasyonuna ve eritritol üretiminde önemli ölçüde^{iyileşmeye olanak tanır 14}. Bu iki tür biyosensörün geliştirilmesi, FADS platformlarının mikrobiyal ıslahlaşmada uygulanmasını teşvik etme, geleneksel kimyasal probların sınırlamalarını aşarak ve taranabilecek hedef ürünlerin kapsamını genişletme konusunda büyük potansiyele sahiptir.

Özetle, endüstriyel mikroorganizmalar için standart yüksek verimli tarama iş akışı sunulmuştur. Bu iş akışının güvenilirliği, yüksek verimli L-laktik asit üreten B. coagulans suşlarının taramasında başarılı şekilde uygulanmasıyla gösterilmiştir. Bu iş akışı, yüksek verimli tarama yapan gelecekteki araştırmacılar için değerli bir referans sağlar.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Agar	Becton, Dickinson and Company	214030	Katı plaka hazırlanması için
Anhydrous Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218	Laboratuvar tezgahlarını ve cihazlarını silmek ve dezenfekte etmek
Atmospheric and Room Temperature Plasma (ARTP)	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-002	ARTP, suş mutagenezisi için mutant kütüphanesinin inşası için kullanılmıştır.
B. coagulans	Beijing Microbial Culture Collection Center, BMCC	1511C0004000002355	B. coagulans ATCC 7050, mutagenez ve yüksek verimli damla taramasının hedefi için başlangıç suşu olarak kullanılmıştır.
Black microplate (96 well)	Corning	3925	96 kuyuklu siyah mikroplate, laktat sensörü testleri ve laktik asit konsantrasyonunun belirlenmesi için kullanılmıştır.
Calcium carbonate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20011062	L-laktik asit aşırı üreticilerini izole etmek için.
Calcium chloride	Sinopharm	10005819	Kalsiyum klorür, mikrobiyal kültür ortamının hazırlanmasında kullanılır ve mikrobiyal büyüme için temel besin maddelerini sağlar.
Calcium L-lactate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	69027528	Tespit sürecinde standart eğri hazırlamada numune olarak kullanılır.
Centrifuge tube (15 mL)	Beijing Xinhengyan Technology Co., Ltd	HB53397	Bakteryal sıvı seyreltme için kullanılır
Collection tube	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell-CL	Damlacıkların toplanması ve sonraki kültivasyon için
Computer	Lenovo	E450	Yazılım kurulumu ve DREM Cell kontrolü.
DAPI	Solarbio	c0065	Hücre boyama için.
Deep-well plate (24-well)	BKMAMLAB	110424008	Derin kuyu plakası kullanılarak B. coagulans mutantlarının ilk verim doğrulama için
Demulsifier (1H,1H,2H,2H-Perfluorooctanol)	MACKLIN	H817022	Damla demulsifiye edici, su-yağ mikrodamlalarını parçalamak ve sonraki algılama ve analiz için iç hücreleri, süspansiyonları veya süpernatantı serbest bırakmak için kullanılır.
D-Glucose	Solarbio	G8150-1000	D-Glucose, mikrobiyal kültür ortamının hazırlanmasında kullanılır ve mikrobiyal büyüme için temel besin maddelerini sağlar.
Diammonium hydrogen citrate	Solarbio	D9950	Diammonium hydrogen citrate, mikrobiyal kültür ortamının hazırlanmasında kullanılır ve mikrobiyal büyüme için temel besin maddelerini sağlar.
Dipotassium hydrogen phosphate anhydrous	Sigma-Aldrich	P8281	Dipotassium hydrogen phosphate anhydrous, mikrobiyal kültür ortamının hazırlanmasında kullanılır ve mikrobiyal büyüme için temel besin maddelerini sağlar.
DREM Software version	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell v02.01.18	DREM cell cihazını kontrol etmek için. DREM Yazılımı, Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. tarafından üretilen DREM Cell cihazı için özel bir ticari programdır. Herhangi bir resmi erişimi veya indirme URL'si yoktur ve sadece cihazla birlikte yetki ile dağıtılır.
Droplet Entrapping Microfluidic Cell-sorter (DREM Cell)	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-027	Mutant kütüphanesinden yüksek verimli suşları hızlı bir şekilde taramak için tek hücreli kapsülleme ve sıralama için yüksek verimli tek hücreli kapsülleme ve sıralama için kullanılmıştır.
Droplet generation chip	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-009	Damla üretim çipi, tek hücreli kapsülleme için monodisperse pikolitre (pL) ölçekli damlalar üretmek için kullanılır.
Droplet injection chip	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-003	Damla mikroenjeksiyon çipi, önceden oluşturulan damlalara ardışık biyokimyasal reaksiyonlar için hassas ve iz bırakmadan reaktif enjeksiyonu sağlamak için kullanılır.
Droplet sorting chip	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-002	Damla sıralama çipi, yüksek verimli hücreler içeren hedef damlaları floresan sinyalleri temelinde sıralamak için kullanılır.
Erlenmeyer shake flask (250 mL)	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-001006	Derin kuyu plakası ile birincil taramadan sonra B. coagulans mutant suşlarının ölçek artırma kültür doğrulama için kullanılır, böylece yüksek verimli suşların stabilitesi ve tekrarlanabilirliğini doğrulamak için.
Filter Membranes (0.22 μm)	Merck	SLGPR33RB	Fermentasyon suyu filtrasyonu için kullanılır.
Fluorescence inverted microscope	Olympus	IX73	Olympus IX73 floresan inverte mikroskobu, damlalar içindeki bakteri morfolojisini gözlemlemek için kullanılmıştır
Fluorinated Oil	Bio-Rad	1864006	Florinated oil, su damlalarında su-yağ mikrodamlalarının oluşturulmasında sürekli faz olarak kullanılır ve bu da tek hücreli kültür ve taramayı destekleyen stabil, monodispers ve müdahale etmeyen su-yağ mikrodamlalarının oluşturulmasını sağlar.
High Performance Liquid Chromatography column	Bio-Rad	Bio-Rad Aminex HPX-87	Laktik asidi fermentasyon suyunda diğer bileşenlerden ayırmak için farklı tutma özelliklerine