$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bu çalışma yalnızca kamuya açık ve kimliği yok veri setlerini kullandı ve doğrudan insan veya hayvan deneyleri içermedi; Bu nedenle, ek Etik Komitesi onayı ve bilgilendirilmiş onayı gerekmiyordu.
Veri indirme ve işleme
Akciğer skuamöz hücreli karsinomu (LUSC) için RNA dizileme verileri ve ilgili klinik bilgiler, TCGA-LUSC projesi kapsamında Genomic Data Commons veri portalı aracılığıyla Kanser Genomu Atlas (TCGA) veritabanından elde edilmiştir. Bu çalışmada kullanılan TCGA-LUSC ifade matrisi FPKM değerlerine dayanıyordu. Gen ifade değerleri, sonraki analizlerden önce dönüştürülüp normalleştirildi. Klinik değişkenler arasında yaş, cinsiyet, tümör evresi, patolojik TNM evresi, derece, sağ kalma süresi ve mevcut olduğunda sağkalım durumu yer alıyordu. Başlangıçta toplam 489 TCGA-LUSC vakası alındı ve tam ifade profili ile genel sağ kalım bilgisine sahip 381 hasta prognostik model oluşturma ve iç değerlendirmeye dahil edildi.
Bağımsız doğrulama veri setleri 3 Ocak 2026'da Gen İfadesi Omnibus (GEO) veritabanından indirildi. GSE30219, GPL570 platformuna dayanıyordu ve mevcut ekspresyon ve genel sağkalım bilgisi olan 307 LUSC hastasını içeriyordu. GSE37745 ayrıca GPL570 platformuna dayanıyordu ve mevcut ekspresyon ve genel sağkalım bilgisi olan 196 LUSC hastasını içeriyordu. GSE57148, GPL11154 platformuna dayanıyordu ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH) hastalarından 91 normal akciğer dokusu ve 98 akciğer dokusunu içeriyordu; toplamda 189 örnek bulunuyordu. GSE57148, KOAH ile ilişkili farklı ekspresyon genleri tanımlamak için kullanıldı, GSE30219 ve GSE37745 ise bağımsız dış doğrulama kohortları olarak kullanıldı.
GEO veri setleri için, prob açıklaması ilgili R annotasyon paketi ve platform annotasyon dosyaları kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Prob tanımlayıcıları resmi gen sembollerine dönüştürüldü. Birden fazla prob aynı gene eşleştiğinde, en yüksek ortalama ifade değerine sahip prob o geni temsil etmek üzere tutulurdu. Doğrulama veri setlerinde gen sembolü eşleştirmesinden sonra eksik model geni tespit edilmedi. TCGA-LUSC, GSE30219 ve GSE37745, bu analizde kullanılan açıklamalarda hasta düzeyinde KOKO komorbidite durumu doğrulanmadığı için genel LUSC kohortları olarak analiz edildi.
TCGA ve GEO veri setleri farklı ifade platformları kullanılarak oluşturulduğundan, platform çapraz normalizasyon ve toplu etki düzeltmesi model uygulamasından önce standart R tabanlı ön işleme yöntemleriyle gerçekleştirilmiştir. Risk modeli TCGA-LUSC kohortunda eğitildi ve ardından tüm kohortların doğrudan birleştirilmek yerine her harici GEO kohortunda bağımsız olarak değerlendirildi. Diferansiyel ifade analizi limma R paketi kullanılarak gerçekleştirildi. GSE57148 KOAH ile ilişkili farklı şekilde eksprese edilen genler, |log2FC| kullanılarak tarandı. > 0.263 ve P < 0.05. Bu log2FC eşiği yaklaşık 1,2 kat değişime karşılık gelir ve potansiyel olarak ilgili PANoptoz ile ilişkili genleri korumak için keşif tarama kriteri olarak kullanılmıştır. Daha önce yayımlanmış apoptoz, piroptoz, nekroptoz ve PANoptoz ile ilgili çalışmalardan toplam 277 PANoptoz ile ilişkili gen seçildi ve Ek Tablo 1'de sunulmuştur.
Genlerin fonksiyonel zenginleştirme analizi
Seçilmiş KOAH ile ilişkili PANoptoz genlerinin işlevsel etkilerini netleştirmek için, Gen Ontolojisi (GO) ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirme analizleri clusterProfiler R paketi ve organizasyon kullanılarak gerçekleştirildi. Hs.eg.db açıklama paketi. GO biyolojik süreç, hücresel bileşen ve moleküler fonksiyon kategorileri değerlendirildi. Seçilen genlerle ilişkili sinyal yollarını belirlemek için KEGG yol zenginleştirme analizi yapıldı. P değerleri, Benjamini-Hochberg yanlış keşf oranı yöntemiyle birden fazla test için ayarlandı. P < 0.05 olan zenginleştirme terimleri bu keşif analizinde istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edilmiştir. Zenginleştirme grafikleri ggplot2 kullanılarak oluşturuldu.
PANoptosis ile ilişkili gen ifade kalıplarının gözetimsiz kümeleme analizi
LUSC'de PANoptosis-ilişkili gen ifadesiyle ilişkili moleküler heterojenliği araştırmak için ConsensusClusterPlus R paketi kullanılarak konsensus kümelenmesi gerçekleştirildi. LUSC örnekleri, hayatta kalma ile ilişkili PANoptoz genlerinin ifade profillerine göre kümelenmiştir. Hiyerarşik kümeleme Pearson korelasyon mesafesi ile uygulanmıştır. Maksimum küme sayısı altı olarak ayarlandı ve kümeleme dayanıklılığını değerlendirmek için 1.000 yeniden deneme tekrarı gerçekleştirildi. Optimal küme sayısı, ortaya çıkan grupların konsensus matrisi, kümülatif dağılım fonksiyonu eğrisi, delta alan grafiki ve biyolojik yorumlanabilirliği değerlendirilerek belirlendi. Bu kriterlere dayanarak, k = 2 aşağı akış analizi için seçildi. İki moleküler grup arasındaki hayatta kalma farkları Kaplan-Meier analizi ve log-rank testi kullanılarak değerlendirildi.
Alt tipler arasındaki bağışıklık mikroortam farklılıklarının analizi
Moleküler alt tipler arasındaki bağışıklık mikroçevre özelliklerini karşılaştırmak için, bağışıklık hücresi sızması CIBERSORT dekonvolüsyon algoritması ile LM22 lökosit imza matrisi kullanılarak tahmin edilmiştir. Analiz, e1071 ve preprocessCore paketleri kullanılarak R dilinde gerçekleştirildi. CIBERSORT permütasyon P değerleri, dekonvolüsyon tahminlerinin güvenilirliğini değerlendirmek için kaydedildi. Bu çalışma keşif amaçlı ve retrospektif transkriptomik verilere dayandığı için, bağışıklık hücresi farklılıkları doğrudan hücresel ölçümler yerine hesaplamalı olarak çıkarılan bağışıklık infiltrasyon desenleri olarak yorumlandı.
ESTIMATE algoritması, her tümör örneği için stromal skoru, bağışıklık skoru, ESTIMATE puanı ve tümör saflığını hesaplamak için kullanıldı. GSVA, seçilmiş gen setlerine dayalı yol düzeyinde zenginleştirme puanlarını tahmin etmek için uygulanmıştır. Bağışıklık hücre fraksiyonları, bağışıklık kontrol noktası genleri, HLA ailesi genleri ve ESTIMATE kaynaklı skorlarda grup bazında farklar parametrik olmayan testlerle değerlendirildi. Birden fazla bağışıklık ilişkili karşılaştırma için, uygun olduğunda Benjamini-Hochberg düzeltmesi uygulandı; nominal P değerleri kullanılarak rapor edilen analizler keşif amaçlı olarak yorumlandı. Spearman rank korelasyon analizi, gen ekspresyonu ile bağışıklık ilişkili belirteçler arasındaki ilişkileri değerlendirmek için kullanıldı; hem korelasyon katsayıları hem de P değerleri bildirildi. HLA transkript farklılıkları, antijen sunumuna bağlı transkripsiyon değişiklikleri olarak yorumlandı, antijen sunumunun artırılmış sunumuna dair doğrudan fonksiyonel kanıt değil.
PANoptoz ile ilişkili genlerle ilişkili prognostik bir imza oluşturmak
Tam ifade profilleri ve genel hayatta kalma bilgisi ile TCGA-LUSC kohortu prognostik model inşası için kullanıldı. Başlangıçta alınan 489 TCGA-LUSC vakası arasında, tam genel sağkalım verilerine sahip 381 hasta prognostik analize dahil edilmiştir. Bu hastalar rastgele olarak bir eğitim grubu ve bir iç test kohortu olarak 7:3 oranında ayrıldı. Stratejiye göre rastgeleleştirme, eğitim ve test kohortları arasında benzer bir sağkalma olayları dağılımını korumak için gerçekleştirildi.
Eğitim kohortunda, her aday PANoptoz ile ilişkili gen ile genel hayatta kalma arasındaki ilişkiyi değerlendirmek için tek değişkenli Cox orantılı riskler regresyonu ilk olarak kullanıldı. P < 0.05 olan genler aday prognostik genler olarak kabul edildi ve daha sonra glmnet R paketiyle LASSO Cox regresyonuna girildi. Optimum ceza parametresini seçmek ve aşırı uyumu azaltmak için on kat çapraz doğrulama kullanıldı. LASSO Cox regresyon katsayıları ve buna karşılık gelen normalleştirilmiş gen ifade değerleri temelinde, her hasta için şu formülle bireysel bir risk puanı hesaplandı:
Risk puanı = Σ(coefi × Xi)
burada coefi, her seçilmiş genin regresyon katsayısını, Xi ise ilgili genin normalleştirilmiş ifade değerini temsil eder. Son prognostik model 12 gen içeriyordu: GSDMD, IL18, NFKBIA, PIK3CA, IL1B, BIRC3, MCL1, PSMB10, LMNA, CFLAR, IL1R1 ve AKT3. Tam katsayıya dayalı risk puanı denklemi, Ek Tablo 2'de sunulmaktadır.
Eğitim grubundaki medyan risk puanı, hastaları yüksek riskli ve düşük riskli gruplara sınıflandırmak için kesim noktası olarak kullanıldı. Aynı risk puanı formülü iç test grubuna ve dış doğrulama kohortlarına GSE30219 ve GSE37745 uygulandı. Model performansını değerlendirmek için Kaplan-Meier hayatta kalma analizi, log-rank testi ve zamana bağlı alıcı çalışma karakteristik eğrisi analizi kullanıldı. Doğrulama veri setleri mikroarray platformları kullanılarak oluşturulduğu ve doğrulanmış KOAH komorbidite notasyonu içermediği için, dış doğrulama, klinik olarak doğrulanmış KOAH-komorbid LUSC hastalarında doğrulama yerine bağımsız LUSC kohortlarında retrospektif değerlendirme olarak yorumlandı.
İlaç duyarlılığı tahmin analizi
İlaç hassasiyeti, tümör gen ekspresyon profillerinden ilaç yanıtını Genomics of Drug Sensitivity in Cancer veri tabanından alınan farmakogenomik referans verilerine dayanarak tahmin eden pRRophetic R paketi kullanılarak tahmin edilmiştir. Her hasta örneği için tahmin edilen yarı-maksimum inhibitör konsantrasyon (IC50) değerleri hesaplandı. İfade matrisleri pRRophetic giriş gereksinimlerine göre işlendi ve toplu etki düzeltmesi standart pRRophetik uyumlu iş akışı kullanılarak gerçekleştirildi. Tahmin edilen IC50 değerleri pRRophetic çıktı ölçeğinde bildirildi.
Sorafenib, gefitinib, bleomycin, bosutinib, etoposid, lenalidomid, camptothecin ve metotreksat dahil olmak üzere sekiz aday ajan, keşif amaçlı ilaç hassasiyeti paneli olarak değerlendirildi. Yüksek ve düşük riskli gruplar arasındaki tahmin edilen IC50 değerlerindeki farklar, Wilcoxon sıralama toplamı testi kullanılarak karşılaştırıldı. Bu sonuçlar, ölçülen klinik kemoterapi yanıtı veya deneysel olarak doğrulanmış ilaç direnci yerine hesaplamalı ilaç hassasiyeti tahminleri olarak yorumlandı.
İstatistiksel analiz
Tüm istatistiksel analizler R yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. İki grup arasındaki sürekli değişkenler Wilcoxon sıra-toplamı testi kullanılarak karşılaştırılırken, uygun olduğunda Kruskal-Wallis testi kullanılarak iki gruptan fazla grup arasında karşılaştırmalar yapıldı. Genel sağkalma, birincil sağ kalma son noktası olarak tanımlandı. Kaplan-Meier hayatta kalma eğrileri gruplar arasındaki hayatta kalma farklarını karşılaştırmak için oluşturuldu ve istatistiksel anlamlılık log-rank testi kullanılarak değerlendirildi. Tek değişkenli ve çok değişkenli
Cox orantılı riskler regresyon analizleri, klinik değişkenler, risk grubu ve genel sağkalma arasındaki prognostik ilişkileri değerlendirmek için kullanıldı. Tek değişkenli Cox analizinde klinik önemi veya istatistiksel anlamlılığı olan değişkenler, çok değişkenli Cox regresyonu için dikkate alınmıştır. Orantılı tehlike varsayımı Schoenfeld kalıntıları kullanılarak değerlendirildi. Eksik klinik değişkenler, Cox regresyonu ve nomogram yapısı için tam vaka analiziyle ele alındı. Klinik değişkenler arasındaki kollineerlik, çok değişkenli modellemeden önce değerlendirildi.
Zaman bağımlı ROC eğrileri, risk modelinin 1, 3 ve 5 yıllık genel hayatta kalma için öngörücü performansını değerlendirmek için kullanıldı. Bir nomogram, çok değişkenli modelde kalan değişkenler veya yeterli klinik kullanılabilirliğe sahip değişkenler kullanılarak oluşturuldu. Tahmin edilen ve gözlemlenen genel hayatta kalma olasılıklarını karşılaştırmak için kalibrasyon grafikleri kullanıldı. Karar eğrisi analizi, seçilmiş eşik olasılıklar boyunca potansiyel net faydanın keşif değerlendirmesi olarak gerçekleştirilmiştir.
Spearman rütbe korelasyon analizi, gen ekspresyonu ile bağışıklık ilişkili özellikler arasındaki ilişkileri değerlendirmek için kullanıldı. Korelasyon katsayıları ve P değerleri uygun olduğunda bildirildi. Çoklu karşılaştırmalar için, uygun olduğunda Benjamini-Hochberg yanlış keşif oranı düzeltmesi uygulanmıştır. Nominal P değerleri kullanılarak raporlanan analizler keşif amaçlı olarak kabul edildi. İki taraflı P değeri < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.