Koloni Oluşturan Birim Testi Hastadan Kaynaklanan Kemik Iliği ve Çevresel Kan Mononükleer Hücreler İçin Uyarlanmış

Özet

Bu protokol, hasta kemik iliği ve periferik kan mononükleer hücrelerinden türetilen insan hematopoietik kök ve progenitor hücrelerinin farklılaşmasını sağlamak için bir prosedürü açıklar. Test, eritroid ve miyeloid soy bağlılığını destekleyen yarı katı bir kültür ortamı kullanır ve preklinik ilaç karakterizasyonu için tekrarlanabilir koloni sınıflandırması için standart metrikler içerir.

Özet

Koloni oluşturan birim (CFU) testi, miyelodisplastik sendromlar (MDS) ve akut miyeloid lösemi (AML) dahil hematolojik hastalıkların incelenmesinde temel bir tekniktir. Bu test, eritroid ve miyeloid progenitor hücrelerin üç boyutlu büyümesini ve soy-suşuna özgü farklılaşmasını desteklemek için tanımlanmış sitokin kombinasyonlarıyla desteklenen yarı katı ortam kullanır. Ancak, hastadan kaynaklı periferik kan ve kemik iliği örnekleri, azalan canlılık, artan kullanım hassasiyeti ve koloni büyümesindeki değişkenlik nedeniyle teknik zorluklar yaratmaktadır. Ayrıca, koloni boyutlarını ve soy türlerini tanımlamada önemli değişkenlik göstermekte, çalışmalar arasında tekrarlanabilirliği sınırlayan koloni büyüklüğü ve soy türlerinin tanımlanmasında önemli değişkenlik göstermektedir. Burada tanımlanan protokol, MDS ve AML hasta örneklerinden izole edilen hematopoietik kök ve progenitor hücrelerin büyümesi ve farklılaşması için optimize edilmiştir. Protokol, hassas hücre yönetimi, hasta örneklerinin steril işlenmesi, optimize kültür koşulları ve hasta kaynaklı hücrelere göre uyarlanan büyüme sürelerini vurgular. Bu protokol, hastadan türetilen örnekler kullanılarak CFU testleri için pratik bir çerçeve sağlar ve hematolojik malignite araştırmalarında tutarlı koloni sayımı ve analizi için standart bir metrik oluşturur.

Giriş

Hematopoiez, kemik iliği nişlerinde bulunan hematopoietik kök hücrelerin (HSC) tüm olgun kan hücresi hatlarını ortaya çıkardığı sıkı şekilde düzenlenmiş bir süreçtir. Hiyerarşik bir dizi, farklılaşma olayları sayesinde, HSC'ler çoklu güçlü öncüller üretir ve bu atalar ileri aşamada eritroid, miyeloid ve lenfoid hatlara bağlanır ve ardından fonksiyonel dolaşımdaki kan hücrelerine terminal olgunlaşmadan geçerler. Bu süreç, kemik iliği mikroçevresinde koordineli sinyal ile içsel transkripsiyonel ve epigenetik düzenleyici mekanizmalarla yönetilir. Bu düzenleyici yollardaki bozulmalar, özellikle HSC'lerde genetik veya somatik mutasyonların birikimi nedeniyle, normal farklılaşmayı bozabilir ve anormal öncüllerin klonal genişlemesine yol açabilir. Bu tür değişiklikler, nihayetinde mielodisplastik sendromlar (MDS) ve akut miyeloid lösemi (AML) dahil olmak üzere etkisiz hematopoez ve sitopenilerle karakterize edilen hematolojik ^{bozukluklara yol açabilir.1,2,3,4,5}.

Koloni oluşturan birim (CFU) testi, hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin (HSPC) farklılaşma potansiyelini değerlendirmek için iyi kurulmuş bir in vitro tekniktir. Başlangıçta hematopoietik öncüllerin proliferatif ve farklılaşma kapasitesini ölçmek için kısa vadeli bir test^{olarak geliştirilen CFU} testi, o zamandan beri hem klinik hem de deneysel hematolojide yaygın olarak kullanılan^{bir araç haline gelmiştir9}. Preklinik laboratuvar ortamlarında, test genellikle genetik bozulmaların veya aday tedavilerin hematopoietik farklılaşma üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanılır. MDS ve AML araştırmaları bağlamında, CFU testleri moleküler ve genetik değişikliklerin hastadan kaynaklanan kemik iliği veya periferik kan hücrelerinin farklılaşma kapasitesini nasıl etkilediğini anlamak için işlevsel bir okuma sağlar.

CFU testi, HSPC'lerin metilselüloz bazlı yarı katı ortamda kültürlenmesini içerir; bu ortamda soyun özgül genişleme ve farklılaşmayı destekleyen tanımlanmış büyüme faktörleri bulunur. Bu koşullar altında, öncül hücreler çoğalır ve soy kimliğine göre morfolojik olarak sınıflandırılabilen ayrık koloniler oluşturur. Bu protokolde eritroid ve miyeloid farklılaşması için optimize edilmiş ticari olarak bulunan metilselüloz bazlı yarı katı ortam kullanılır. Bu ortam, interlökin-3 (IL-3), interlökin-6 (IL-6), kök hücre faktörü (SCF), eritropoietin (EPO), granülosit koloni uyarıcı faktör (G-CSF) ve granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) gibi sitokinlerin kombinasyonunu içerir. Bu faktörler birlikte, koloni oluşturan birim-eritroid (CFU-E) ve patlama oluşturan birim-eritroid (BFU-E) gibi eritroid öncüllerin büyümesini destekler; miyeloid granülosit-makrofaj öncülleri (CFU-GM) ve granülosit, eritrosit, monosit, megakariosit öncülleri (CFU-GEMM^{) gibi} multipotent öncüllerin büyümesini ^destekler.

Geniş kullanım alanına rağmen, yukarıda bahsedilen yarı katı ortam, megakaryositler ve trombositlerin ayırt edilmesini yeterince desteklemediği için farklılaşma kapasitesi açısından sınırlıdır. Bu uygulamalar için, trombosit büyüme faktörleri içeren daha özel formülasyonlar daha uygundur; Ancak, belirtilen protokol kapsamı dışındadırlar. Genel olarak, ortam formülasyonunun dikkatli seçimi, morfolojik değerlendirme ve akış sitometrisi gibi sonraki analizlerle birleşerek, araştırmacılar soy bağlılığı ve farklılaşma potansiyeli analiziyle ilaç hassasiyetini etkili bir şekilde değerlendirebilirler¹².

Bu çalışmada, CFU testi, nüks/dirençli yüksek riskli MDS tedavisinde kombinasyon tedavilerinin terapötik potansiyelini incelemek için kullanılmıştır. Pirimetamin, toksoplazmoz ve parazitik sıtma tedavisinde kullanılan klinik olarak onaylanmış bir antifolattır ve yakın zamanda bir kanser karşıtı^{ajan olarak incelenmiştir} 13,14,15. Son çalışmalar, pirimetamin tedavisinin de novo pirimidin sentezini düzenleyen anahtar yolların inhibisyonu yoluyla^{etkili olabileceğini göstermiştir 16}. Bu protokolde, CFU testleri, pirimetaminin tek ajan tedavisi olarak ve MDS ile AML tedavisinde güncel ön cephelerden biri olan Venetoclax ile kombinasyon tedavisi olarak klinik etkinliğini incelemek için kullanılır^(17,18).

Yaygın kullanımına rağmen, CFU testi birkaç teknik sınırlama taşır. Koloni tanımlama ve sınıflandırma, gözlemciler arasında ve araştırma merkezleri arasında değişkenlik yaratabilecek morfolojik^{kriterlere büyük ölçüde dayanır} 6,19,20,21. Ayrıca, MDS veya AML olan bireylerden alınan hastalardan alınan örnekler genellikle hücre canlılığının azalması, kırılganlığın artması ve heterojenlik gösterir; bu da koloni oluşumunu ve sonraki analizleri^{zorlaştırabilir.} 9. Bu nedenle, akış sitometrisi dahil olmak üzere daha fazla karakterizasyon için kolonilerin hazırlanması, hücre bütünlüğünü korumak için dikkatli bir şekilde ele alınması gerektirebilir. Koloni tanımlama, sayma ve aşağı akış analizi için standartlaştırılmış prosedürlerin olmaması, çalışmalar arasında değişkenliğe katkıda bulunur. Bu teknik hususlar, hasta kaynaklı hematopoietik örnekler için özel olarak optimize edilmiş standart prosedürlerin gerekliliğini vurgulamaktadır.

Bu protokol, hematolojik maligniteli hastaların birincil kemik iliği veya periferik kan örneklerinden türetilen mononükleer hücreler kullanılarak CFU testleri yapmak için optimize edilmiş bir iş akışını ortaya koyar. Yaklaşım, hassas hasta kaynaklı hücrelerin ele alınması, güvenilir kültür koşulları oluşturulması ve koloni tanımlaması ile nicelendirilmesi için tutarlı kriterlerin uygulanması için pratik stratejilere odaklanır. Detaylı metodolojik rehberlik sağlayarak ve tekrarlanabilir analiz uygulamalarına vurgu yaparak bu protokol, MDS ve AML'nin preklinik çalışmalarında hematopoietik farklılaşma ve terapötik yanıtın daha güvenilir değerlendirilmesini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır.

Protokol

Bu çalışma, Albert Einstein Tıp Fakültesi/Montefiore Tıp Merkezi'nde Kurumsal İnceleme Kurulu onaylı "İyi Nihli ve Malign Hematolojik Bozuklukların Moleküler Biyolojisi" (IRB Protokolü #200536) kapsamında bir biyobankadan alınan kimliği yok edilmiş insan biyoörneklerini kullanmaktadır. Tüm prosedürler kurumsal etik yönergelerine uygun olarak yürütülmüştür. Tüm reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Hastadan kaynaklanan kemik iliği veya periferik kan mononükleer hücrelerinin hazırlanması

NOT: Yaygın hasta örneği kullanım kılavuzlarına göre, kanla bulaşan patojenlere karşı kişisel koruma amacıyla tam boy laboratuvar önlüğü ve yırtılmaya dayanıklı laboratuvar eldivenleri giymek ve laboratuvar hücre kültürü kapüşonunun altında çalışmak önerilir. Hasta hücreleriyle temas eden tüm pipet uçları ve serolojik pipetler, biyolojik tehlike atıklarına atılmadan önce en az 30 dakika boyunca %10 ağartıcı bir çözeltiyle bekletilmelidir.

1. Deneysel hazırlık
   1. IMDM ortamını, fetal sığır serumunu (FBS) ve penisillin-streptomisin (Pen-streptokok) antibiyotiklerini en az 30 dakika boyunca 37 °C'ye kadar ısıtın.
   2. Gece boyunca 4 °C'de yarı katı ortamı erit. Tabaklama gününde, şişeyi en az 30 dakika oda sıcaklığında (RT) ısıtın.
   3. Hücre kültürü başlığını UV sterilizasyonuyla 15 dakika sterilize edin, ardından kapüş yüzeylerine, pipetlere ve tüp raflarına %70 etanol (EtOH) ile püskürtün.
   4. Kirlenmiş pipet uçları ve serolojik pipetleri toplayacak kadar büyük, %10 çamaşır suyu çözeltisi içeren bir atık bebekleri hazırlayın.
   5. Yoğunluk gradyan santrifüjleme yöntemleriyle izole edilmiş kemik iliği veya periferik kan mononükleer hücreleri alın. Hücreler, toplandığı aynı günde veya dondurulmuş biyo-bankalı örneklerden kullanılabilir.
2. Numuneler donduruluyorsa, buzun çoğu eriyip geriye sadece küçük bir buz kristali kalana kadar 37 °C'lik su banyosunda hızla eridin. Numuneleri erittikten sonra hemen buzun üzerine koyun.
   NOT: Hasta örnekleri erimeye karşı çok hassastır. Hücrelerin ölümünü en aza indirmek için örneklerin mümkün olduğunca hızlı ve toplu olarak çözülmesi önemlidir.
3. 5 mL ısıtılmış tam büyüme ortamında hücreleri askıya alın (%4 FBS ve %1 Pen-Streptokok takviyesi IMDM ortamı).
4. AO/PI boyama boyası ve otomatik hücre sayacı kullanarak hücre konsantrasyonunu ve canlılığını belirleyin.
5. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 350 x g ile santrifüjlenerek hücreleri peletleyin. Üst patronu at.
6. Hücreleri 5 mL steril Dulbecco'nun fosfat-tamponlu tuzlu suyumunda (DPBS) yeniden süzülür. Pelet hücrelerine santrifüjasyonu tekrarlayın ve üst örtü maddesini atın.
7. Hücreleri tam büyüme ortamında 2 milyon canlı hücre/mL konsantrasyona kadar askıya alın. 6 kuyruklu bir plakanın 100K hücre/kuyu için yeterli hücre hazırlayın.

2. İlaç hazırlama ve tedavi uygulaması.

NOT: Pirimetamin, liyofilize toz olarak elde edilir ve 100 mM konsantrasyonda dimetil sülfoksit (DMSO) içinde yeniden üretilir; aliquotlar −80 °C'de depolanır. Venetoklaks, DMSO'da 10 mM konsantrasyonda önceden çözünmüş olarak satın alınır ve -20 °C sıcaklıkta saklanır. Bu deney için, venetoklaks ve pirimetamin serbest alım yoluyla araç kontrol DMSO tedavi koşuluyla paralel olarak tek dozda uygulanır.
DIKKAT: Pirimetamin, venetoklaks ve DMSO biyolojik zararlı maddelerdir. Sadece kaputun altında, PPE giyerek kullan ve ekstra dikkatli kullanın.

1. Kaplama gününde, buzda uyuşturucu eritin ve masaüstü mini santrifüjde maksimum hızda 30 saniye boyunca döndürün.
2. Vortex ve yarı katı bir ortam şişesini şiddetle karıştırın, tüm bileşenler homojenleşene kadar. Kabarcıkların yüzeye çıkması için oda sıcaklığında 30 dakika boyunca kaputta rahatsız edilmeden bırakın.
3. Steril 15 mL konik tüplerde 3 mL yarı katı ortam alikotu hazırlayın. Tüplerin 30 dakika boyunca dokunulmadan kalmasına izin verin, böylece kabarcıklar yüzeye çıkabilir. Ekstra yarı katı ortam aliquotları tekrar dondurulup -20 °C'de saklanarak daha sonra kullanılabilir.
4. Yarı katı ortama en fazla 10 μL ilaç hacmi eklemeyin. Bu deney için, venetoklaks ve pirimetamin konsantrasyonları ampirik olarak belirlenen sinerjik koşullara göre ayarlanır. Araç kontrol grubuna, eşdeğer hacimlerde DMSO ekleyin. Her durum için 3 mL aliquot kopyası hazırlayın.
   NOT: Eklenen ilaç hacminin önemsiz tutulması önemlidir, böylece yarı katı ortamdaki nihai ilaç konsantrasyonunu etkilemez.
5. Vortex medyası 4–5 kısa aralıkta ilacın medyaya tam olarak dahil edilmesi için kullanılır.
   NOT: Hücre karışımını vorteksorda uzun süre tutmayın, çünkü bu hücre ölümüne yol açabilir.
6. Yarı katı ortamın 3 mL alikotuna 100 μL hücre veya eşdeğer 2.00.000 hücre hacmi ekleyin. Girdap karışımı kısa aralıklarla tamamen entegre olana kadar.
7. 3 mL'lik bir enşırıngaya kör uçlu 16 G iğne takın ve iğne ile şırıngayı hücre karışımına bırakın. 30 dakika boyunca rahatsız edilmeden bırakın ki kabarcıklar yüzeye çıksın.

3. İlaçla aranmış hücre askı örtüsünün kaplaması.

1. Su altında bir iğne ve şırınga kullanarak, hücre ve ilaç karışımını al, hava kabarcıklarını çekmemeye dikkat edin. 3–5 dakika bekleyin, ardından 15 mL'lik konik tüpün yanlarında biriken kalan karışımı alın.
2. Steril 6 delikli bir plakada, hücre karışımını damla olarak ekleyin, büyük damlaları plakanın dış kolonunun 2 kuyusu arasında dönüşümlü olarak kullanın. Karışımı, plakayı dairesel hareketlerle hafifçe eğip kuyunun tüm altını eşit şekilde kaplamanızı sağlar. Bu iki kuyu teknik kopyalar oluşturur.
   NOT: Kuyulara kabarcıklar oluşursa veya yanlışlıkla eklenirse, pipet filtre ucu kullanarak baloncukları nazikçe patlatır veya plaka kenarına hareket ettirir. Plakada kalan büyük baloncuklar koloni büyümesini etkileyebilir.
3. Koloni test karışımını sadece 6 kuyu plakasının dış kolonlarına ekleyin. Orta kolona, her kuyuya 5 mL steril su ekleyin. Kuyulara su eklemek, yarı katı ortamın kurumasını önlemek için yeterli nem olmasını sağlar.
4. Plakayı %5_CO2 ile 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde kuluçka yapın. Hücre büyümesini ve su seviyelerini haftada 2 kez izleyin. Hücreler, kaplamadan yaklaşık 7 gün sonra göz ile görülen koloniler oluşturmalı ve plakalar kaplamadan 14–21 gün sonra %75–%80 birleşmeye ulaşmalıdır.

4. Koloni görüntüleme ve sayımı

NOT: Bu protokol, EVOS M7000 görüntüleme sisteminde kullanılmak üzere doğrulanmış parametreleri tanımlar. Bu ayarların diğer plaka görüntüleme sistemleriyle uyumlu hale getirmek için optimize edilmesi veya uyarlanması gerekebilir.

1. Mikroskop platformundan koruyucu ışık filtresi kapağını çıkarın. Mikroskobu açın ve ilgili yazılımı açın.
2. Mikroskop cihazının üst lensine bir ışık difüzörü yerleştirin.
3. Plaka pozisyonunu platforma öyle yerleştirin ki, A1 iyi sol üst köşede olsun.
4. Görüntüleme yazılımında aşağıdaki odak ayarlarını girin:
   1. İmaj edilecek gemi seçin. Bu protokolde 6 kuyululu bir plaka kullanılır.
   2. Hedefi 4X olarak ayarlayın.
   3. Işık kaynağını Trans olarak seçin veya mikroskobu parlak alan moduna geçirin.
   4. Mikroskop ışığını açın ve kaba kaydırıcı ile ışık yoğunluğunu manuel olarak ayarlayın. Bu protokolte kullanılan cihaz için, görüntüleme kolonileri için optimal aralık yaklaşık 0.03'tür.
   5. Enstrümanda otomatik odaklama özelliği varsa, onu kullanarak odakları ayarlayın. Gerekirse, manuel ince odak ayarlarıyla odaklığı daha da ayarlayın.
5. Aşağıdaki otomatik görüntü yakalama ayarlarını girin:
   1. Her kuyuda görüntülenecek tüm kuyu alanını seçin.
   2. Kuyunun ortasından başlayıp kuyunun kenarlarına doğru spiral şeklinde hareket etmek için otomatik görüntü yakalamayı seçin.
   3. Otomatik odaklama ayarlarını seçin, böylece enstrüman her bir yuvada yeniden odaklansın.
   4. Her kuyudaki ham görüntülerin bir araya getirilmesi/birleştirilmesi için seçil.
   5. Görüntülerin yatay ve dikey olarak ters çevrilmesini seçin.
   6. "Tiled image" ve "merged image" toplamak için veri kaydetme ayarlarını seçin
   7. Otomatik plaka taramasını çalıştırın. Bu protokolte kullanılan cihaz 1,5 dakika hızda çalışacaktır.
   8. Plakayı çıkarın, koruyucu filtre kapağını mikroskop platformunun üzerine yerleştirin, mikroskobu kapatın ve yazılımı kapatın.
   9. Görüntüleme sonrasında, her kuyunun içinde toplam bireysel kolonileri ve miyeloid ve eritroid alt tiplerini elle sayın, karelanmış birleşik kuyu görüntüleri kullanılarak.
6. Kolonileri aşağıdaki morfoloji karakterizasyonuna göre tanımlayın:
   1. Bireysel bir koloni veya koloni kümesini, başka bir hücre popülasyonundan yeterince uzakta, kendi uzunluğuna eşit mesafede farklı olarak düşünün. Bu mesafe sınırı içindeki popülasyonlar tek bir koloni sayısına gruplanır.
   2. Eritroid kolonilerinin derin pigmentli olduğundan ve koyu kırmızı renkte göründüğünden emin olun. Bu koloniler, net tanımlanmış kenarlara sahip yoğun şekilde büyüyen tek popülasyonlar veya kümeler olarak görünür. Yavaş büyüyen olgunlaşmamış hücre popülasyonlarından oluşan daha küçük eritroid koloniler CFU-E olarak sınıflandırılır. Daha olgun popülasyonlara sahip daha büyük koloniler ise BFU-E olarak sınıflandırılır.
   3. Miyeloid kolonilerde daha saydam görünen ve daha açık renkli hücreler bulunduğundan emin olun. Miyeloid koloniler daha dağınıktır ve net tanımlanmış kenarlara sahip değildir. Miyeloid koloniler, kümeler halinde değil, daha sık tek popülasyon olarak büyür, ancak bazen kümeler görülebilir. Her iki durumda da miyeloid koloniler CFU-GM olarak sınıflandırılır.
   4. Hem eritroid hem de miyeloid alt tipleri içeren karışık kolonileri CFU-GEMM olarak sınıflandırın.

5. Akış sitometrisi ile aşağı akış analizi için hücre hasadı ve dondurulması

1. Başlamadan önce aşağıdaki adımları uygulayın:
   1. a. Floresansla aktive edilmiş hücre ayırma tamponu (FACS tamponu, DPBS/%4 FBS'den oluşan) ve dondurma ortamı (FBS/%10 DMSO) 37 °C su banyosunda en az 30 dakika ısıtın.
2. Her kuyunun yüzeyine 5 mL ısıtılmış FACS tamponu ekleyin. Yarı katı ortamı çözmek için plakaları en az 30 dakika boyunca 37 °C'lik bir kuluçka makinesinde kuluçka yapın.
3. Hücreleri 5 mL pipet kullanarak iyice yeniden askıya alın ve steril 50 mL konik bir tüpe aktarın.
4. 5 mL ısıtılmış FACS tamponu kullanarak, her kuyuyu 3 kez yıkayın ve tüm hacmi 50 mL'lik konik tüpe aktarın.
5. Hücreleri 4–5 kısa patlamada girdabla geri alabilir, ardından 400 x g ile RT'de 10 dakika boyunca santrifüj yaparak pellet hücreleri elde edilir. Santrifüjlemeden sonra pellet görünmezse, hücreler yarı katı ortamda asılı kalır. Aspirasyon yapmadan, tüpe ekstra 10–15 mL DPBS ekleyerek yarı katı ortamı daha da seyreltir ve iyi süzülür. Gerekirse, ortamın tamamen çözülmesi için 37 °C'de 10–15 dakika kuluçka yapın, ardından tekrar pellet hücreleri alın.
6. Süpernatantı aspire edin ve hücreleri 10 mL FACS tamponunda yeniden süzülür. 400 x g ile 10 dakika boyunca RT sırasında pelet hücrelerine santrifüj yapın.
7. Hücreleri dondurucu ortamda yeniden süspansiyona alın ve 3 milyon hücre/kriyovial aliquot yapın. Şişeleri, kontrollü bir dondurma kapında -80 °C'de 24 saat boyunca dondurarak 1 °C / dakika soğutma hızına ulaşın.
8. Kriyovialleri mümkün olan en kısa sürede sıvı azot deposuna aktarın.
   NOT: Uzun süre -20 °C'de tutulan örnekler canlılık azalır. Hücrelerin uzun süreli depolama için sıvı azota taşınması önemlidir.

Sonuçlar

Şekil 1, hasta örnek izolasyonundan koloni sayıları ve koloni morfolojisinin analizine kadar koloni testi boru hattını göstermektedir. Şekil 2, parlak alan mikroskopunda görüntüleme kolonileri için temel ayarları gösterir. Şekil 3 ve Şekil 4 , plakalamadan 13 gün sonra tek bir hasta kaynaklı örnekten koloni oluşumunun temsilci görüntülerini göst...

Tartışma

Burada açıklanan protokol, hastalardan birincil kemik iliği ve periferik kan örnekleri kullanılarak CFU testleri yapmak için optimize edilmiş bir iş akışını ortaya koyar; özellikle hücre canlılığını korumaya ve tekrarlanabilir koloni büyümesini sağlamaya dikkat eder. Protokoldeki birkaç adım, hastadan alınan örneklerle çalışırken güvenilir koloni oluşumu sağlamak için kritiktir. Kriyokonserif mononükleer hücrelerin hızlı çözülmesi ve ardından anında soğutma, hücre yaşamının korunması içi...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Blunt-End 16 G needles	STEMCELL Technologies	28110	MethoCult ortamını dağıtmak ve plakalamak için
Cellometer Auto 2000	Nexelcom Bioscience	26407	hücre sayacı
CHT4 Counting Chambers (cell counter slides)	Revvity	CHT4-SD100-002	hücre sayacı için slaytlar
Dimethyl sulfoxide	Fisher Bioreagents	BP231-100	ilaç yeniden çözülmesi ve hücre dondurma ortamı için kullanılır
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537	hücre kültürü için
Ethanol 200 proof	Decon Laboratories, Inc.	2701	hücre kültürü yüzeylerinin sterilizasyonu için
EVOS M7000 görüntüleme sistemi	ThermoFisher Scientific	AMF7000	koloni ve plaka görüntüleme için
Fetal bovine serum	BenchMark	100-106	hücre kültürü ve dondurma için ortam takviyesi
IMDM Modifiye Kültür ortamı	Cytiva	SH30228.01	hasta örnek işlemleri için uygun zenginleştirilmiş kültür ortamı
LuerLok Uçlu 3 mL Şırınga	BD	309657	MethoCult ortamını dağıtmak ve plakalamak için
MethoCult H4435 Zenginleştirilmiş	STEMCELL Technologies	04435	koloni testi için metilselüloz bazlı yarı katı ortam
Multiwell 6 kuyucukluk plaka	FALCON	353046	koloni testi plakalaması için
Nikon Eclipse TS2FL Ters Üçgölgeli Faz Kontrastı Floresan Mikroskopu	Coastal Microscopes	51623	Koloni morfolojisi görüntüleme ve karakterizasyonu için
Pen Strep	Gibco	15140-122	hücre kültürü için antibiyotik takviyesi
pyrimethamine	Sigma-Aldrich	46706	FDA onaylı antifolat
UltraPure Damıtılmış su	Invitrogen	10977-015	koloni testi plakalaması için
venetoclax	Selleck Chemical LLC	50-136-6419	FDA onaylı kemoterapi
ViaStain AOPI Boyama Çözeltisi	Revvity	CS2-0106	canlı hücre sayımı için canlılık boyası