Pan-kanser biyoinformatik analizi ve Kolon Kanseri Deneysel Doğrulama: TMED3'ün Tanısal ve Prognostik Biyobelirteç Olarak Çalışması

Özet

Bu protokol, pan-kanser biyoinformatik analizini kolon kanserinde immünohistokimyasal doğrulama ile birleştirerek Transmembrane Emp24 Protein Taşıma Alan 3 ifadesini, prognostik önemini, bağışıklık ilişkilerini ve ilgili biyolojik yolları genel multiomik veri tabanları ve klinik doku örnekleri kullanılarak değerlendirir.

Özet

Transmembran Emp24 Protein Taşıma Alanı 3 (TMED3), p24 protein ailesinin bir üyesi olarak, tümör çoğalması, invaziyası ve göçünde rol oynamıştır. Bu çalışma, kolon kanserinde pan-kanser biyoinformatik analizi ile immünohistokimyasal (IHC) doğrulama kullanılarak TMED3'ün birden fazla kanser tipinde ifade kalıplarını, prognostik önemini, bağışıklık ilişkilerini ve potansiyel biyolojik fonksiyonlarını değerlendirmeyi amaçladı. Kanser Genomu Atlas, Genotip-Doku İfadesi, UALCAN, İnsan Protein Atlası ve cBioPortal veritabanlarından alınan multiomik veri setleri, pan-kanserde TMED3 ifadesi ve genetik değişiklikleri incelemek için analiz edilmiştir. Kolon kanseri dokularında TMED3 protein ekspresyonunu değerlendirmek için immünohistokimya yapıldı. TMED3'ün prognostik değerini değerlendirmek için Kaplan–Meier sağ kalma analizi ve Cox regresyon analizi kullanıldı. Spearman korelasyon analizi, TMED3'ün tümör mutasyon yükü, mikrosatellit kararsızlığı (MSI), bağışıklık hücresi sızması ve bağışıklık kontrol noktaları ile ilişkilerini değerlendirmek için yapılmıştır. Kolon kanserinde TMED3 ile ilişkili potansiyel biyolojik yolları incelemek için Gen Seti Zenginleştirme Analizi yapıldı. TMED3 ekspresyonu çoğu tümör tipinde yüksekti ve adrenokortikal karsinom, kolon adenokarsinomu ve uveal melanomda olumsuz genel sağlıkla ve hastalık özgül sağkalımla ilişkilendirildi. TMED3 genetik değişikliklerinin en yoğun sıklığı mezotelyomada tespit edildi; amplifikasyon baskın değişim türünü temsil etmektedir. Ayrıca, TMED3 ekspresyonu böbrek-böbrek şeffaf hücreli karsinom, mide adenokarsinomu ve rahim korpusu endometriyal karsinomunda tümör mutasyonel yükü ve mikrosatellit kararsızlığı ile anlamlı korelasyon göstermiştir. TMED3 ekspresyonu, birkaç tümörde bağışıklık infiltrasyonu ve bağışıklık kontrol noktası ekspresyonuyla da ilişkilendirilmiştir. IHC analizi, kolon kanseri dokularında normal kolon dokularına kıyasla TMED3 ekspresyonunun arttığını ve T evresi ile ilişki gösterdiğini gösterdi. Fonksiyonel zenginleştirme analizi, ribozom, antijen işleme ve sunum, oksidatif fosforilasyon ve pentoz fosfatla ilgili yolları belirledi. Bu bulgular, TMED3'ün kolon kanseri ve diğer tümör türlerinin tanısı ve prognostik değerlendirmesi için umut vadeden bir biyobelirteç olabileceğini göstermektedir.

Giriş

Transmembran Emp24 Domain (TMED) protein ailesi, ökaryot hücrelerde monomer, dimer veya oligomerik kompleks olarak yaygın olarak bulunan dört alt aileden (α, β, γ ve δ) oluşur. TMED ailesinin üyeleri hücre içi vezikül ticaretinde rol almakta olup, kanser, bağışıklıkla ilişkili bozukluklar, diyabet, nörodejeneratif hastalıklar, alkol içermeyen yağlı karaciğer hastalığı, dilatlaşmış kardiyomiyopati, müsin 1 böbrek hastalığı (MKD) ve Sjögren sendromu (SS)1 gibi çeşitli insan hastalıklarında rol oynamaktadır^. Transmembran emp24 domen içeren protein 3 (TMED3), p24 protein ailesinin bir üyesi olup, insanlarda 15q25.1 kromozomunda kodlanan yüksek koruma altına alınmış tek geçişli tip I transmembran^{proteinidir 2,3}. Biriken kanıtlar, TMED3'ün birkaç malignitede anormal şekilde ifade edildiğini ve tümör başlangıcı, proliferasyon, invaziyon, metastaz ve ilerlemede rol aldığını göstermiştir. TMED3 ekspresyonunun yükseldiği^{osteosarkom 4}, akciğer skuamöz hücreli^{karsinomu 5}, meme^{kanseri 6}, endometriyal karsinom⁷ ve kolorektal^{kanser 8'de} bildirilmiştir. Deneysel çalışmalar, TMED3 ekspresyonunun baskılanmasının tümör hücre çoğalması, metastatik yeteneği ve anti-apoptotik aktiviteyi engellediğini ve böylece tümör ilerlemesini engellediğini göstermiştir. Gliomada, TMED3 aşırı ekspresyonu daha yüksek tümör derecesi ve daha kötü prognozla ilişkilendirilmiştir ve TMED3'ün ZBTB7A⁹ düzenlemesi yoluyla glioblastoma ilerlemesini teşvik ettiği bildirilmiştir. Önceki araştırmalar TMED3'ün belirli tümör tiplerindeki biyolojik rolünü incelemiş olsa da, pan-kanser genelinde ifade kalıpları, prognostik önemi ve moleküler işlevleri henüz sistematik olarak tanımlanmamıştır.

Multiomik veri tabanları ve biyoinformatik analizlerdeki son gelişmeler, farklı tümör tiplerinde gen ifadesi, prognoz, bağışıklık özellikleri ve moleküler değişikliklerin sistematik olarak değerlendirilmesini mümkün kılmıştır. Tek kohort çalışmalarına kıyasla, kamuya açık veri tabanları kullanılarak entegre pan-kanser analizi, kanserler arasında potansiyel biyobelirteçler ve terapötik hedeflerin belirlenmesi için daha geniş bir yaklaşım sağlar. Bu çalışmada, TMED3'ün birden fazla kanser tipinde rolünü incelemek için kapsamlı biyoinformatik analizler yapıldı; bu veriler arasında The Cancer Genome Atlas (TCGA), Genotype-Tissue Expression (GTEx), UALCAN, Human Protein Atlas ve cBioPortal dahil olmak üzere kamuya açık multiomik veritabanları kullanıldı. Çalışma, pan-kanserde TMED3 ifade kalıplarını, klinikopatolojik özelliklerini, prognostik önemini, bağışıklıkla ilişkili ilişkileri ve potansiyel biyolojik fonksiyonları sistematik olarak değerlendirdi. Ayrıca, kolon kanseri dokularında TMED3 protein ekspresyonunu ve bunun klinikopatolojik özelliklerle ilişkisini doğrulamak için immünohistokimyasal (IHC) analizleri yapıldı. Pan-kanser analizimiz, aday biyobelirteçleri belirlemek için bir tarama stratejisi olarak hizmet vermektedir. Daha sonra özellikle kolorektal kanser (CRC) için deneysel doğrulama yaptık. Sonuçlar, TMED3'ün CRC'de umut vadeden bir prognostik biyobelirteç olduğunu göstermektedir; ancak diğer kanser tipleriyle ilgisi daha fazla araştırma gerektirir.

Protokol

İnsan dokularıyla ilgili tüm işlemler, kurumsal biyogüvenlik ve etik yönergeler doğrultusunda ve sertifikalı bir biyolojik güvenlik kabini içinde gerçekleştirilmiştir. Çalışma protokolü, Tangshan Merkez Hastanesi Araştırma Etik Komitesi tarafından onaylandı (No. TZYL/K/2023-16) ve örnek toplamadan önce tüm katılımcılardan yazılı bilgilendirilmiş onay alındı.

Veri toplama
Farklı tümör ve eşleşmemiş normal dokulardan alınan TMED3 ifade profili verileri TCGA ve GTEx^{veritabanları 10,11} (TCGA: https://portal.gdc.cancer.gov/; GTEx: https://gtexportal.org/; 1 Temmuz 2025'te erişildi). Wilcoxon sıralama toplamı testleri, tümör ile eşleşmemiş normal dokular arasındaki farklı TMED3 ekspresyonunu analiz etmek için gerçekleştirildi. UCSC Xena'dan indirilen milyonda (TPM) normalize RNA dizileme ifade matrisleri aşağı akış analizleri için kullanıldı. İfade değerleri, istatistiksel analizden önce log₂(TPM + 1) dönüşümü kullanılarak uyumlaştırıldı. 33 tümör tipi ve eşleşen normal dokular için TMED3 ifade verileri TCGA veritabanından daha sonra indirildi. Wilcoxon imzalı sıralama testleri, tümörler ve normal dokular arasındaki TMED3 ifadesini diferensiyel değerlendirmek için kullanıldı. Tümör ile normal dokular arasındaki TMED3 protein ifadesi UALCAN^{veritabanı 12'den} alınmıştır (http://ualcan.path.uab.edu; 1 Temmuz 2025'te erişilmiştir). Proteomik analiz modülü erişildi ve analiz için "Pan-kanser Görünümü" seçeneği seçildi. Protein ifade analizleri, UALCAN "Pan-cancer View" modülü aracılığıyla varsayılan platform ayarlarıyla ve ek örnek filtreleme olmadan sunulan CPTAC veri setleri kullanılarak gerçekleştirildi.

Klinikopatolojik özelliklerin analizi
TCGA veritabanındaki 33 tümör tipinden klinopatolojik bilgiler, TMED3 ekspresyonu ile patolojik evre arasındaki ilişkiyi araştırmak için toplanmıştır. Tümör evreleri erken evre (evre I–II) ve ileri evre (evre III–IV) gruplara ayrıldı. Evre grupları arasında TMED3 ifadesindeki farklar, birden fazla kanser tipi arasında Wilcoxon sıralama toplamı testleriyle değerlendirildi.

Prognostik analiz
Prognostik analiz için 33 tümör tipinden sağkalım süresi ve sağkalım durumu verileri alındı. Normal vakalar ve klinik bilgisi olmayan vakalar hariç tutuldu. Eksik değerler, her değişkenin eksikliğine göre ele alındı. TMED3 ekspresyonu, medyan ekspresyon değerine göre yüksek ve düşük ekspresyonlu gruplara ayrıldı. R istatistiksel analiz yazılımındaki (sürüm 4.2.1) hayatta kalma paketi (Sürüm 3.2-7), Cox orantılı tehlike regresyon analizi yapmak için kullanıldı. Sonuçlar Survminer ve ggplot2 paketleriyle görselleştirildi. Genel sağkalım (OS), herhangi bir nedenle teşhisten ölüme kadar olan aralık olarak tanımlanırken, hastalığa özgü sağkalma (DSS) ise belirli kansere bağlı olarak teşhisten ölüme kadar olan aralık olarak tanımlandı; malignity'yle ilgisi olmayan ölümler ise sansürlü olaylar olarak değerlendirildi. Daha sonra kolon adenokarsinomunda (COAD) TMED3 ekspresyonu ile hem OS hem de DSS arasındaki ilişkileri değerlendirmek için Kaplan–Meier sağlıklandırma analizleri yapıldı.

Mutasyon analizi
cBioPortal veritabanı (www.cbioportal.org; 5 Temmuz 2025'te erişildi) 33 kanser tipinde TMED3 genetik değişikliklerinin sıklığını analiz etmek için^{kullanıldı.} cBioPortal web sitesine erişim sağlandı ve "TMED3" hızlı arama çubuğuna girerek TMED3'ün birden fazla kanser türündeki mutasyon profilini analiz etti. TMED3'ün genetik değişiklikleri başlıca mutasyon, amplifikasyon, derin silinme ve çoklu değişiklikleri içeriyordu. cBioPortal'da bulunan varsayılan pan-kanser çalışmaları ve sorgulama ayarları, ek filtreleme olmadan mutasyon analizi için kullanıldı.

DNA metilasyonu korelasyon analizi
TMED3'ün tümör ve normal dokularda promotor metilasyon durumunu değerlendirmek için UALCAN veritabanı kullanılarak (https://ualcan.path.uab.edu/; 5 Temmuz 2025'te erişildi) DNA metilasyon analizi yapıldı. TMED3 promotor bölgesinin DNA metilasyon durumu, TCGA'daki Illumina Infinium HumanMethylation450K platformundan oluşturulan Seviye 3 metilasyon verileri kullanılarak analiz edildi. Metil seviyeleri β değerler olarak ifade edildi; β = metilen prob yoğunluğu / (metillenmiş prob yoğunluğu + metillenmedik prob yoğunluğu) olarak hesaplandı, değerler 0 (metillenmemiş) ile 1 (tam metillenmiş) arasında değişti. Transkripsiyon başlangıç noktasının (TSS) 1500 bp yukarısında bulunan CpG probları, UALCAN tarafından tanımlanan TSS200 ve TSS1500 bölgeleri dahil, promotor metilasyon durumunu değerlendirmek için analiz edildi. UALCAN, hedef genin promotor bölgesindeki mevcut tüm CpG problarını ek filtreleme olmadan otomatik olarak çıkardı. Pan-kanser ve normal dokulardan metilasyon β değerleri alındı ve gruplar arasındaki farkları karşılaştırmak için eşleşmemiş iki örneklemli t testleri yapıldı. α = 0,05 anlamlılık eşiği kullanıldı ve P < 0,05 istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.

TMED3, tümör mutasyonel yükü ve mikrosatellit kararsızlığı arasındaki ilişkinin analizi
Tümör mutasyonel yükü (TMB) ve mikrosatellit instabilitesi (MSI), birden fazla kanser tipinde TMED3 ekspresyonuyla ilişkilerinin araştırılması için analiz edildi. Uniform olarak işlenmiş pan-kanser veri setleri UCSC Xena veritabanından indirildi (https://xenabrowser.net/; 5 Temmuz 2025'te erişildi) ve TMED3 ifade profilleri sonraki analizler için çıkarıldı. MuTect2 kullanılarak oluşturulan TCGA örnekleri için Seviye 4 Basit Nükleotid Varyasyonu verileri, Genomic Data Commons (GDC) veritabanından (https://portal.gdc.cancer.gov/)¹⁴ alınmıştır. TMED3 ifade verileri TMB veri setleriyle entegre edildi ve ifade değerleri, istatistiksel analizden önce log₂(x + 1) dönüşümü kullanılarak normalleştirildi. Bireysel tümör tipleri için MSI puanları, daha önce yayımlanmış¹⁵ çalışmadan toplandı ve aynı normalizasyon prosedürünün ardından TMED3 ifade verileriyle birleştirildi. TMED3 ekspresyonu ile TMB/MSI arasındaki ilişkiler, pan-kanser veri setlerinde Spearman korelasyon analizi kullanılarak^{değerlendirildi 16,17}.

TMED3'ün bağışıklık özelliklerinin analizi
ESTIMATE algoritması, birden fazla tümör tipi için stromal skorları, bağışıklık skorlarını ve ESTIMATE puanlarını hesaplamak için kullanıldı. Pan-kanser veri setlerindeki stromal ve bağışıklık infiltrasyon puanları, istatistiksel analiz yazılımındaki tahmin paketi (Sürüm 1.0.13) kullanılarak oluşturuldu. Yüksek ve düşük TMED3 ekspresyon grupları arasındaki stromal puan, bağışıklık skoru ve ESTIMATE puanlarındaki farklar Wilcoxon sıralama toplamı testleri kullanılarak değerlendirildi. Ayrıca, TMED3 ekspresyonu ile immün kontrol noktası molekülleri arasındaki ilişkileri araştırmak için bağışıklık kontrol noktası ile ilgili analizler yapıldı; bunlar arasında programlanmış hücre ölümü proteini 1 (PD-1), programlanmış ölüm ligandı 1 (PD-L1) ve sitotoksik T-lenfosit-ilişkili protein 4 (CTLA4) dahil olmak üzere, farklı kanser tiplerinde kullanıldı. STAR sayısı ifade verileri ve COAD için ilgili klinik bilgiler TCGA veritabanından indirildi. TPM formatlı ifade matrisleri, log₂(TPM + 1) dönüşümü kullanılarak çıkarılıp normalleştirildi. Daha sonra COAD örneklerinden sekiz bağışıklık kontrol noktası ile ilişkili genin ifade profilleri alındı ve TMED3 ekspresyonu ile bağışıklık kontrol noktası belirteçleri arasındaki korelasyonlar Spearman korelasyon analiziyle analiz edildi.

İlaç duyarlılığı analizi
İlaç duyarlılığı analizi, TMED3 ekspresyonu ile çeşitli kanser tiplerinde antikanser ilaç yanıtlılığı arasındaki ilişkiyi araştırmak için GSCALite platformu kullanılarak^{gerçekleştirilmiştir 18}. Seviye 3 RNA dizileme verileri ve COAD örnekleri için ilgili klinik bilgiler TCGA veri setinden alındı. Her örnek için tahmin edilen kemoterapi yanıtları, Kanserde İlaç Hassasiyeti Genomikleri (GDSC) veri tabanı (https://www.cancerrxgene.org/) verileriyle oluşturuldu. İlaç yanıt tahmini, istatistiksel analiz yazılımındaki pRRophetic paketi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Tahmini yarı-maksimum inhibitör konsantrasyon (IC₅₀) değerleri, savaş algoritması ile toplu etki düzeltmesi ve dokuya özgü ayarlama analizleri dahil olmak üzere varsayılan ayarlarla ridge regresyon kullanılarak hesaplandı. Tekrarlanan gen ifade ölçümleri, sonraki analizden önce ortalamaya alındı.

Kolon kanserinde TMED3'ün ifadesi ve prognozu
Kolon adenokarsinomu için TMED3 ifade profilleri ve ilgili klinikopatik veriler TCGA veritabanından alındı. Kolon kanseri dokuları ile eşleşmemiş normal dokular arasındaki farklı TMED3 ekspresyonu, Wilcoxon sıralama toplamı testleri kullanılarak değerlendirildi; TMED3 ekspresyonu ile klinikopatolojik özellikler arasındaki ilişkiler ise ki-kare testleriyle analiz edildi. Hastalar, medyan TMED3 ekspresyon seviyesine göre yüksek ve düşük ekspresyon gruplarına ayrıldı. Daha sonra iki grup arasındaki prognostik farklılıkları karşılaştırmak için Kaplan–Meier hayatta kalma analizi yapıldı. Kolon kanserinde TMED3 ekspresyonunun prognostik önemini değerlendirmek için tek değişken ve çok değişkenli Cox orantılı riskler regresyon analizleri yapıldı. Ayrıca, TMED3 ifadesinin 1, 3 ve 5 yıllık işletim sistemi için öngörücü performansını değerlendirmek amacıyla zamana bağlı alıcı çalışma karakteristikli (ROC) eğrisi analizi yapıldı. ROC analizleri, istatistiksel analiz yazılımındaki timeROC paketi kullanılarak gerçekleştirildi ve ggplot2 paketiyle grafiksel görselleştirme oluşturuldu.

İmmünohistokimya analizi
Tangshan Merkez Hastanesi'nden toplam 60 kolon kanseri dokusu örneği ve 20 kanser dışı doku rastgele seçildi. Çalışma, yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylandı (No. TZYL/K/2023-16) ve ameliyattan önce tüm hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onay alındı. Tüm doku örnekleri, önceden kemoterapi veya immünoterapi olmadan cerrahi rezeksiyon geçiren hastalardan alındı. Kohort, 20–87 yaş arası 39 erkek ve 21 kadın hastadan oluşuyordu. Duke'un aşamalandırma kriterlerine göre, 33 hasta evre I+II, 27 hasta ise evre III+IV olarak sınıflandırıldı. Kohortun evre dağılımı, ileri hastalık evrelerine yönelik potansiyel seçim yanlılığı yaratabilir; bu nedenle, hayatta kalma ile ilgili bulgular dikkatli yorumlanmalıdır.

Parafinle gömülü doku örnekleri 4 μm dilimlere ayrıldı, ardından deparafinizasyon ve rehidrasyon yapıldı. Endojen peroksidaz aktivitesi %4 H₂O₂ ile söndürüldü ve spesifik olmayan bağlanma daha sonra keçi serumu ile bloklandı. Bölümler daha sonra TMED3 birincil antikoru ile gece boyunca 4°C'de 1:100 seyreltme ile inkubasyon edildi. Ertesi gün, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca koyun anti-tavşan IgG polimeri (PV-6000) uygulandı. İmmünoreaktivite, diaminobenzidin boyama ile görselleştirildi ve bölümler nötr reçine ile monte edildi. Histolojik boyama yüksek büyütmeli optik mikroskop altında incelendi. İmpolojiboyama yoğunluğu 0 (negatif), 1 (zayıf), 2 (orta) ve 3 (güçlü) olarak puanlandırılırken, pozitif tümör hücrelerinin oranı 1 (%1–%25), 2 (%26–%50), 3 (%51–%75) veya 4 (%76–%100) olarak derecelendirildi. Nihai immünohistokimyasal skorlar, boyama yoğunluğunun pozitif tümör hücrelerinin yüzde puanıyla çarpılmasıyla hesaplandı. TMED3 ekspresyon seviyeleri negatif/düşük ekspresyon (puan ≤ 6) veya aşırı ekspresyon (skor > 6) olarak ^{sınıflandırıldı.19}

Kolon kanserinde TMED3'ün gen zenginleştirme analizi
Kolon kanserinde TMED3 ekspresyonuyla ilişkili potansiyel biyolojik fonksiyonlar ve sinyal yolları değerlendirilmek için gen zenginleştirme analizi yapıldı. Yüksek ve düşük TMED3 ekspresyon grupları arasında farklı ekspresyon genler, istatistiksel analiz yazılımındaki DESeq2 paketi kullanılarak tarandı. TCGA'dan elde edilen ham sayı, DESeq2'de uygulanan medyan oran normalizasyon yöntemiyle normalleştirildi. Düşük ekspresyonlu genler, örneklerin %50'sinden fazlasında <10 sayısına sahip, analiz öncesinde dışlandı. Farklı şekilde eksprese edilen genler, |log₂ (FC)| eşikleri kullanılarak tanımlandı. ≥ 1 ve Benjamini–Hochberg (BH) çoklu test düzeltmesinden sonra P< 0.05 ayarlandı. Tüm analitik parametreler analizin tekrarlanabilirliğini sağlamak için sabitlenmiştir.

Daha sonra, Gen Seti Zenginleştirme Analizi (GSEA), Moleküler İmzalar Veritabanı'ndan (MSigDB) elde edilen Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) gen setlerine (sürüm 7.5.1) dayalı R dilinde clusterProfiler paketi kullanılarak gerçekleştirildi. Yüksek ve düşük TMED3 ekspresyonlu gruplar arasındaki log2 katlama değişim değerlerine göre önceden sıralanmış bir gen listesi oluşturuldu. Zenginleştirme analizi 1000 fenotip permutasyonu kullanılarak yapıldı ve analize 15–500 gen içeren gen setleri dahil edildi. Normalize zenginleştirme skoru (NES) mutlak değerleri >1, ayarlanmış P < 0,05 ve yanlış keşif oranı (FDR) < 0,25 olan yollar anlamlı zenginleştirilmiş olarak kabul edildi. Parkinson hastalığı yolunun zenginleşmesi, bu yolun mitokondriyal işlevsizlik ve oksidatif fosforilasyona bağlı biyolojik süreçlerle yakından ilişkili olması nedeniyle korunmuştur; bu süreçler aynı zamanda tümör metabolik yeniden programlanması ve kanser ilerlemesinde de rol oynar.

İstatistiksel analiz
Tüm istatistiksel analizler istatistiksel analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Gruplar arasındaki farklı ifade, eşleşmemiş örnekler için iki taraflı Wilcoxon sıralama toplamı testleri ve eşleştirilmiş örnekler için Wilcoxon işaretli sıralama testleri kullanılarak değerlendirildi. TMED3 ekspresyonu ile klinikopatolojik değişkenler arasındaki ilişkiler ki-kare testleri kullanılarak değerlendirildi. Hayatta kalma analizleri hayatta kalma paketi (sürüm 3.3-1) kullanılarak yapıldı ve Kaplan–Meier hayatta kalma eğrileri survminer paketiyle oluşturuldu. Gruplar arasındaki hayatta kalma sonuçlarındaki farklar log-rank testi kullanılarak karşılaştırıldı. OS ile ilişkili prognostik faktörleri belirlemek için Cox orantılı riskler regresyon modelleri uygulandı. Hastalar, medyan TMED3 ifade seviyesine göre yüksek ve düşük ekspresyon gruplarına ayrıldı. Zamana bağlı ROC analizleri timeROC paketi kullanılarak yapıldı ve şekiller ggplot2 paketiyle oluşturuldu. Aksi belirtilmedikçe, istatistiksel anlamlılık iki taraflı P değeri olarak tanımlanmıştır < 0,05.

TMED3 ifadesi ile bağışıklık özellikleri, TMB ve MSI arasındaki korelasyonları değerlendirmek için Spearman korelasyon analizi yapıldı. Tüm korelasyon analizleri için ilgili kamuya açık veritabanlarından elde edilen normalize nicel ifade verileri kullanıldı. TCGA RNA dizileme verileri için, TPM formatlı ifade değerleri, analiz öncesinde log₂(TPM + 1) normalizasyonu kullanılarak dönüştürülmüştür. Eksik klinik veya moleküler veri olan örnekler istatistiksel analizden önce hariç tutuldu. Spearman korelasyon analizleri, iki kuyruklu, parametrik olmayan testler olarak gerçekleştirildi. Ham P değerleri, Wilcoxon testleri, Spearman korelasyon analizleri ve hayatta kalma analizleri dahil olmak üzere sınırlı karşılaştırmaları içeren analizlerde kullanıldı. Büyük ölçekli yüksek verimli biyoinformatik analizlerde, diferansiyel gen ekspresyonu analizi, KEGG zenginleştirme analizi ve GSEA için, çoklu test düzeltmeleri BH FDR yöntemiyle gerçekleştirilmiştir. Düzeltilmiş FDR değerleri <0,05 olarak istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.

Sonuçlar

Pan-kanserde TMED3'ün ekspresyon analizi
TCGA ve GTEx veri setlerinin analizi, TMED3 haberci ribonükleik asit (mRNA) ifadesinin, adrenokortikal karsinoma (ACC), mesane ürotelyal karsinoma (BLCA), meme invaziv karsinoma (BRCA), servikal skuamöz hücreli karsinom ve endoservikal adenokarsinom (CESC), kolanjiyokarsinoma (CHOL), kolon adenokarsinoması (COAD), diffüz büyük B-hücreli lenfoma (DLBC) dahil olmak üzere ilgili normal dokulara kıyasla anlamlı şekilde yüksek olduğunu göstermiştir. özofageal karsinoma (ESCA), glioblastoma multiforme (GBM), böbrek-böbrek şeffaf hücreli karsinomi (KIRC), böbrek-böbrek papillar hücreli karsinomu (KIRP), beyin alt dereceli glioma (LGG), karaciğer hepatosellüler karsinomu (LIHC), akciğer adenokarsinomu (LUAD), akciğer skuamöz hücreli karsinomi (LUSC), yumurtalık seroz sistadenokarsinom (OV), pankreas adenokarsinoması (PAAD), feokromositom ve paraganglioma (PCPG), prostat adenokarsinomi (PRAD), rektum adenokarsinoması (READ), deri deri melanomu (SKCM) mide adenokarsinomu (STAD), testis germ hücresi tümörleri (TGCT), tiroid karsinoması (THCA), timoma (THYM), rahim korpusu endometriyal karsinomu (UCEC) ve rahim karsinosarkoma (UCS) gibi durumlarda ise baş ve boyun skuamöz hücreli karsinomi (HNSC) ile akut miyeloid lösemi (LAML) ile azalmış ekspresyon gözlemlenmiştir (Şekil 1A). Eşleşen bitişik normal dokular, eşleştirilmiş ifade analizleri için kontrol görevi gördü. Eşleştirilmiş TCGA analizi, çift normal dokulara kıyasla BLCA, BRCA, CHOL, COAD, böbrek kromofobi (KICH), KIRP, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, PRAD, STAD ve UCEC dokularında TMED3 ekspresyonunun anlamlı artışını da doğruladı (Şekil 1B). Ayrıca, UALCAN/Klinik Proteomik Tümör Analizi Konsorsiyumu (CPTAC) veritabanı kullanılarak yapılan protein ekspresyonu analizi, BRCA, COAD, GBM, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, OV ve UCEC tümör dokularında TMED3 protein seviyelerinin arttığını göstermişken, PAAD'da protein ekspresyonunun normal dokulara kıyasla azaldığını gözlemlemiştir (Şekil 1C). Ancak, TMED3 protein ekspresyonu PAAD'da normal dokulara göre daha düşüktü. mRNA ile protein ifade desenleri arasındaki bu tutarsızlık, transkripsiyon sonrası veya translasyon sonrası düzenleyici mekanizmaları yansıtabilir. Bu bulgular, TMED3'ün birden fazla kanserde anormal şekilde yukarı regülasyonlu olduğunu ve birden fazla kanserde tanısal ve prognostik özelliklerle ilişkili olabileceğini göstermektedir.

Şekil 1. İnsan kanserlerinde TMED3 ekspresyon profilleri. (A) TCGA ve GTEx veri setlerine dayanarak birden fazla kanser tipinde tümör ve normal dokular arasında TMED3 mRNA ifadesi. İfade seviyeleri log₂(TPM + 1) olarak sunulur. (B) TCGA veri setlerinden tümör dokuları ile eşleşen bitişik normal dokular arasında TMED3 mRNA ekspresyonunun eşleştirilmiş analizi. (C) CPTAC/UALCAN veri setlerinde normal dokular ile primer tümörler arasında TMED3 protein ifadesi, meme invaziv karsinoması (BRCA), kolon adenokarsinoması (COAD), glioblastoma multiforme (GBM), böbrek-böbrek şeffaf hücreli karsinomi (KIRC), karaciğer hepatosellüler karsinomu (LIHC), akciğer adenokarsinomu (LUAD), akciğer skuamoz hücreli karsinomi (LUSC), yumurtalık seroz kistadenokarsinom (OV), pankreas adenokarsinoması (PAAD) ve rahim korpusu endometriyal karsinomu (UCEC) yer alır. Veriler kutu grafikleri olarak sunulur. İstatistiksel anlamlılık, uygun olduğunda Wilcoxon sıralama toplamı veya Wilcoxon imzalı rütbe testleri kullanılarak analiz edilmiştir. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001; NS, önemli değil. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Klinikopatopatolojik özellik analizi
Klinik evre analizi, TMED3 ekspresyonunun ACC, KIRC, KIRP ve LUAD'da erken evre tümörlere (Evre I–II) kıyasla (Evre I–II) oranında anlamlı olarak daha yüksek olduğunu göstermiştir (Şekil 2). Buna karşılık, ileri evre UCEC dokularında TMED3 ekspresyonu anlamlı şekilde azaldı. Bu bulgular, TMED3 ifadesinin yükselmiş olmasının çeşitli kanser tiplerinde tümör ilerlemesiyle ilişkili olabileceğini göstermektedir.

Şekil 2. TMED3 ifadesi ile birden fazla kanserde patolojik evresi arasındaki ilişki. Keman grafikleri, erken evre tümörlerde (Evre I–II) ve ileri evre tümörlerde (Evre III–IV) adrenokortikal karsinoma (ACC), böbrek-böbrek şeffaf hücreli karsinomu (KIRC), böbrek renal papiller hücre karsinomu (KIRP), akciğer adenokarsinoması (LUAD) ve rahim korpusu endometriyal karsinomunda (UCEC) ileri evre tümörlerde (Evre III–IV) gösterilmektedir. İfade seviyeleri log₂(TPM + 1) olarak sunulur. İstatistiksel anlamlılık Wilcoxon sıralama toplamı testleri kullanılarak değerlendirildi. *P < 0.05, ***P < 0.001. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Prognostik analiz
Cox regresyon ve sağ kalma analizleri, yüksek TMED3 ekspresyonunun ACC, COAD, LUAD ve UVM'de daha zayıf OS ile ilişkili olduğunu göstermiştir (Şekil 3A). DSS analizi ayrıca ACC, COAD, GBM, KIRP ve UVM'de yüksek TMED3 ekspresyonunun olumsuz DSS ile anlamlı ilişkili olduğunu ortaya koydu (Şekil 3B). Özellikle, ACC, COAD ve UVM, yüksek TMED3 ekspresyonuna sahip hastalarda hem OS hem de DSS için tutarlı olarak kötü prognoz göstermiştir. Trend düzeyinde prognostik ilişkiler LUAD, KIRC ve LGG gibi seçilmiş tümör tiplerinde de gözlemlendi. Bu bulgular, TMED3 ifadesinin birden fazla malignitede prognostik öneme sahip olabileceğini göstermektedir.

Şekil 3. Pan-kanser analizinde TMED3 ekspresyonunun prognostik önemi. (A) TMED3 ekspresyonu ile çoklu kanser tipleri arasında genel hayatta kalma (OS) arasındaki ilişkiyi gösteren orman grafiki. (B) TMED3 ifadesi ile hastalık-spesifik sağkalım (DSS) arasındaki ilişkiyi birden fazla kanser türünde gösteren orman alanı. Tehlike oranları (HR'ler) ve %95 güven aralıkları (%95 CI'ler) Cox orantılı tehlike regresyon analizi kullanılarak hesaplandı. HR > 1, yüksek TMED3 ekspresyonuyla ilişkili kötü prognoz olduğunu gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Mutasyon analizi
cBioPortal veritabanı kullanılarak yapılan genetik değişim analizi, TMED3 değişikliklerinin kanserler genelinde esas olarak mutasyonlar, amplifikasyonlar, derin silinmeler ve çoklu değişikliklerden oluştuğunu göstermiştir (Şekil 4). TMED3 değişikliklerinin en yüksek sıklığı mezotelyoma (MESO) olarak gözlemlendi; bu durum esas olarak gen amplifikasyonu (%2,3) nedeniyle gerçekleşmiştir. ESCA, mutasyon (%0,55), amplifikasyon (%1,1) ve derin delesiyon (%0,55) dahil olmak üzere karışık değişim türleri gösterdi. Buna karşılık, LIHC, KICH, THCA, PCPG, CHOL, UVM, LAML, UCS, DLBC, KIRC, TGCT ve GBM veri setlerinde tespit edilebilir TMED3 genetik değişiklikleri tespit edilmedi. Bu bulgular, TMED3 genomik değişikliklerinin tümörle özgün bir şekilde gerçekleştiğini ve kanser heterojenliğine katkıda bulunabileceğini göstermektedir.

Şekil 4. TMED3'ün kanserler arasında genetik değişim manzarası. cBioPortal veritabanından elde edilen pan-kanser veri setlerinde TMED3 genetik değişikliklerinin sıklığı ve türleri. Değişiklik kategorileri arasında mutasyon, amplifikasyon, derin silinme ve çoklu değişiklikler vardı. Y ekseni, kanser türleri arasında değişim frekansını (%) gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

DNA metilasyon analizi
UALCAN veritabanının analizi, TMED3 promotor metilasyon seviyelerinin BRCA, COAD, ESCA, HNSC, KIRC, KIRP, LIHC, LUAD, PAAD ve PRAD tümör dokularında normal dokulara kıyasla anlamlı şekilde arttığını göstermiştir (Şekil 5). Buna karşılık, normal kontrollere kıyasla BLCA, TGCT ve UCEC dokularında TMED3 promotor metilasyon seviyelerinde azalma gözlemlendi. Bu bulgular, TMED3 promotorunun anormal metilasyonunun, TMED3 ifadesinin tümör spesifik düzenlenmesine katkıda bulunabileceğini göstermektedir.

Şekil 5. TMED3'ün kanserler arasında promotor metilasyon seviyeleri. Mesane ürotelyal karsinomu (BLCA), meme invaziv karsinomu (BRCA), kolon adenokarsinomu (COAD), özofageal karsinomi (ESCA), baş ve boyun skuamoz hücreli karsinomu (HNSC), böbrek-böbrek şeffaf hücreli karsinomu (KIRC), böbrek böbrek papiller hücre karsinomu (KIRP), karaciğer hepatosellüler karsinomu (LIHC), akciğer adenokarsinosu (LUAD), pankreas adenokarsinosu (PAAD) içinde tümör dokuları ile ilgili normal dokular arasındaki TMED3 promotor metilasyon seviyelerinin karşılaştırılması. UALCAN'dan elde edilen prostat adenokarsinomu (PRAD), testis germ hücre tümörleri (TGCT) ve rahim korpusu endometriyal karsinomu (UCEC) veri setleri bulunmaktadır. Veriler, kutu grafiklerinde β değerler olarak sunulur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

TMED3, TMB ve MSI korelasyonlarının analizi
Spearman korelasyon analizi, TMED3 ifadesinin ACC, ESCA, KIRC, LGG, PAAD, STAD, THYM ve UCEC'de TMB ile pozitif korelasyon olduğunu, CESC, LUAD ve TGCT'de ise negatif korelasyonların gözlemlendiğini gösterdi (Şekil 6A). Ayrıca, TMED3 ekspresyonu DLBC, KIRC, SKCM, STAD ve UCEC'de MSI ile pozitif ilişkilendirilmiştir (Şekil 6B). Özellikle, TMED3 ekspresyonu KIRC, STAD ve UCEC'de hem TMB hem MSI ile pozitif korelasyon gösterdi ki, bu da bu kanserlerde tümör immünojenliği ile olası ilişkiler gösterebilir.

Şekil 6. Pan-kanser analizinde TMED3 ekspresyonunun tümör mutasyon yükü ve mikrosatellit kararsızlığı ile korelasyonu. (A) Kanserler arasında TMED3 ekspresyonu ile tümör mutasyon yükü (TMB) arasındaki korelasyonu gösteren radar grafiki. (B) Kanserler arasında TMED3 ifadesi ile mikro uydu kararsızlığı (MSI) arasındaki korelasyonu gösteren radar grafiki. Korelasyon katsayıları Spearman korelasyon analizi kullanılarak hesaplandı. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Bağışıklık karakteristik analizi
ESTIMATE analizi, TMED3 ekspresyonunun BCLA, ESCA, LAML, LUAD, LUSC, PAAD, PRAD, SKCM, STAD, THCA ve UCEC'de stromal skor, bağışıklık skoru ve ESTIMATE skoru ile negatif korelasyon olduğunu göstermiştir (Şekil 7A). Buna karşılık, TMED3 ifadesi ile bu bağışıklık ilişkili skorlar arasında olumlu korelasyonlar LGG, LIHC ve PCPG'de gözlemlendi. ACC, CHOL, DLBC, GBM, KICH, KIRC, KIRP, OV ve UCS'de anlamlı bir korelasyon tespit edilmedi. Bu bulgular, TMED3'ün tümör mikroçevresini ve bağışıklık hücresi infiltrasyonunu kanser tipine bağlı olarak etkileyebileceğini göstermektedir. Bağışıklık kontrol noktası korelasyon analizi, TMED3 ifadesinin BLCA, BRCA, CESC, ESCA, HNSC, LUAD, LUSC, PRAD, SKCM ve THCA'da bağışıklık kontrol noktası ile ilişkili genler CD274 (PD-L1), PDCD1 (PD-1) ve CTLA4 ile negatif ilişkili olduğunu gösterdi (Şekil 7B). LIHC ve UVM'de TMED3 ekspresyonu ile bağışıklık kontrol noktası genleri arasında pozitif korelasyonlar tespit edilirken, GBM, KICH, LAML, MESO, OV, PCPG, READ ve TGCT'de anlamlı bir ilişki gözlemlenmedi. Bu sonuçlar, TMED3'ün seçilmiş kanserlerde tümör bağışıklık regülasyonu ve bağışıklık kontrol noktası sinyalizasyonu ile ilişkili olabileceğini göstermektedir.

Şekil 7. TMED3 ekspresyonu ile tümör bağışıklık özellikleri arasındaki ilişkiler. (A) ESTIMATE algoritması kullanılarak hesaplanan kanserler arasında TMED3 ifadesi ile stromal skor, bağışıklık skoru ve ESTIMATE puanı arasındaki korelasyonları gösteren ısı haritası. (B) TMED3 ifadesi ile bağışıklık kontrol noktası ile ilgili genler arasında korelasyonları gösteren ısı haritası; bunlar arasında CD274 (PD-L1), PDCD1 (PD-1) ve CTLA4 dahil. Korelasyon katsayıları Spearman korelasyon analiziyle belirlendi. Renk ölçeği korelasyon gücünü gösterir. *P < 0.05. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

İlaç duyarlılığı analizi
GDSC veri setlerine dayalı GSCALite platformu kullanılarak yapılan ilaç duyarlılığı analizi, TMED3 ekspresyonunun 17-AAG, lapatinib, PD-0325901, RDEA119 ve trametinib yarı-maksimum inhibitör konsantrasyon (IC₅₀) değerleri ile negatif korelasyon gösterdiğini göstermiştir (Şekil 8). Bu bulgular, TMED3 ekspresyonu yüksek olan tümörlerin bu antikanser ajanlara karşı duyarlılığının artabileceğini ve TMED3 ekspresyonu ile terapötik hassasiyet arasında olası ilişkiler olabileceğini göstermektedir.

Şekil 8. TMED3 ekspresyonu ile antikanser ilaç hassasiyeti arasındaki korelasyon. GSCALite platformu aracılığıyla Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC) veri setlerinden elde edilen TMED3 mRNA ekspresyonu ile antikanser ilaçlara duyarlılık arasındaki korelasyonları gösteren balon grafiki. Balon boyutu, yanlış keşif oranına (FDR) dayalı istatistiksel anlamlılığı temsil eder ve renk korelasyon katsayısı değerlerini gösterir. Negatif korelasyonlar, yüksek TMED3 ekspresyonu ile ilişkili ilaç hassasiyetinin arttığını gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Kolon kanserinde TMED3'ün ifadesi ve prognozu
TMED3 ekspresyon analizi, TCGA veri setlerindeki normal kolon dokularına kıyasla kolon kanseri dokularında TMED3 mRNA seviyelerinin anlamlı şekilde arttığını göstermiştir (Şekil 9A). Kontroller olarak eşleşen bitişik normal dokularla yapılan eşleştirilmiş analiz, kolon kanseri dokularında TMED3 ekspresyonunun yükseldiğini daha da doğruladı (Şekil 9B). Transkriptomik bulgularla tutarlı olarak, UALCAN/CPTAC veri setleri ve immünohistokimyasal boyama kullanılarak protein ekspresyonu analizi, kolon kanseri dokularında normal kolon dokularına kıyasla TMED3 protein ekspresyonunun arttığını göstermiştir (Şekil 9C–9E). ROC eğrisi analizi, eğri altında (AUC) 0.869 alan göstermiştir; bu da TMED3'ün kolon kanseri dokularını normal dokulardan ayırt etmede avantajlı tanısal performansını gösterir (Şekil 9F). Klinikopatolojik analiz, TMED3 ekspresyonunun T evresi ile anlamlı ilişkili olduğunu, yaş, cinsiyet, N evresi veya TNM evresi ile anlamlı bir ilişki gözlemlemediğini ayrıca göstermiştir (Tablo 1). Bu bulgular, kolon kanserinde TMED3'ün potansiyel tanısal önemini desteklemektedir.

Şekil 9. Kolon kanserinde TMED3'ün ifadesi, tanı değeri ve immünohistokimyasal doğrulaması. (A) TCGA veri setlerinden kolon kanseri dokuları ile normal kolon dokuları arasında farklı TMED3 mRNA ekspresyonu. (B) Kolon kanseri dokularında TMED3 mRNA ekspresyonunun eşleştirilmiş analizi ve bitişik normal dokularla eşleştirilmiş analiz. (C) CPTAC/UALCAN veri setlerinden elde edilen kolon kanseri ve normal dokularda TMED3 protein ekspresyonu. (D) Normal kolon dokusunda TMED3'ün temsil immünohistokimyasal boyaması. (E) Kolon kanseri dokusunda TMED3'ün temsil immünohistokimyasal boyamasında artan TMED3 ekspresyonu gösteriliyor. (F) Kolon kanserinde TMED3'ün tanısal değerini değerlendiren alıcı çalışma karakteristikası (ROC) eğrisi. Ölçek çubukları = 100 μm. Eğri altındaki alan (AUC) 0,869 olup, %95 güven aralığı (CI) 0,813–0,924 arasındaydı. İstatistiksel anlamlılık, uygun olduğunda Wilcoxon sıralama toplamı veya Wilcoxon imzalı rütbe testleri kullanılarak analiz edilmiştir. P < 0.001. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tip		TMED3		P değeri	χ2
		Düşük ifade	Yüksek ifade
Yaş
≤ 55	25	15	10	0.13	2.34
> 55	35	14	21
Cinsiyet
Kadın	21	10	11	0.94	0.007
Erkek	39	19	20
T aşaması
T1+T2	23	15	8	0.04	4.26
T3+T4	37	14	23
N Sahnesi
N0	30	12	18	0.2	1.67
N1+N2	30	17	13
TNM Aşaması
I+II	33	13	20	0.13	2.35
III+IV	27	16	11

Tablo 1: Kolon kanserinde TMED3 ifadesi ile klinikopatolojik özellikler arasındaki ilişki. Kolon kanseri olan hastaların klinikopatolojik özellikleri, düşük ve yüksek TMED3 ekspresyon grupları arasında karşılaştırıldı. TMED3 ifadesi ile yaş, cinsiyet, T evresi, N evresi ve TNM evresi gibi klinikopatolojik değişkenler arasındaki ilişkiler, ki-kare (χ²) testleri kullanılarak analiz edildi. Veriler, her alt gruptaki hasta sayısı olarak sunulur. İstatistiksel anlamlılık P < 0.05 olarak tanımlandı.

KM sağlıklandırma analizi, yüksek TMED3 ekspresyona sahip hastaların, düşük TMED3 ekspresyona sahip hastalara kıyasla (P = 0.031) ve DSS (P = 0.020) oranlarının anlamlı derecede daha zayıf olduğunu göstermiştir (Şekil 10A ve 10B). Zamana bağlı ROC analizi, TMED3 ekspresyonunun OS için öngörücü performansının sırasıyla 1, 3 ve 5 yıl içinde 0.620, 0.564 ve 0.575 AUC değerleri verdiğini gösterdi (Şekil 10C). Ayrıca, tek değişkenli ve çok değişkenli Cox regresyon analizleri, kolon kanserinde genel hayatta kalma ile ilişkili prognostik faktörler olarak T evresi, M evresi, patolojik evre ve TMED3 ifadesini tespit etti (Tablo 2). Bu sonuçlar, yüksek TMED3 ekspresyonunun kolon kanserinde kötü prognozla ilişkili olduğunu göstermektedir; ancak zamana bağlı ROC analizi yalnızca mütevazı öngörü performansı göstermiştir.

Şekil 10. Kolon kanserinde TMED3 ekspresyonunun prognostik önemi. (A) Kaplan–Meier (KM) genel sağlık, kolon kanserinde yüksek ve düşük TMED3 ekspresyonu olan hastalarla karşılaştırılan genel sağlık, (OS) eğrileri. (B) Yüksek ve düşük TMED3 ekspresyonesine sahip hastaların karşılaştırılmasında Kaplan–Meier hastalığına özgü sağ kalma (DSS) eğrileri. (C) 1, 3 ve 5 yıllık işletim sistemi için TMED3 ekspresyonunun öngörücü performansını değerlendiren zamana bağlı alıcı çalışma karakteristikası (ROC) eğrileri. Hayatta kalma farkları log-rank testi kullanılarak analiz edildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Özellikler	Tek değişkenli analiz		Çok değişkenli analiz
	Tehlike oranı (%95 GÜ)	P değeri	Tehlike oranı (%95 GÜ)	P değeri
Cinsiyet	1.101(0.746–1.625)	0.627
T aşaması	3.072(1.423–6.631)	0.004	3.817(1.174–12.407)	0.026
N aşaması	2.592(1.743–3.855)	<0.001	0.587(0.223–1.584)	0.28
M aşaması	4.193(2.683–6.554)	<0.001	2.272(1.314–3.930)	0.003
Patolojik evre	2.947(1.942–4.471)	<0.001	3.115(1.032–9.401)	0.044
TMED3	1.537(1.037–2.277)	0.032	1.599(1.039–2.462)	0.033

Tablo 2: Kolon kanserinde genel sağkalmayla ilişkili prognostik faktörlerin tek değişken ve çok değişkenli Cox orantılı riskleri regresyon analizleri. Kolon kanseri hastalarında klinikopatolojik özelliklerin ve TMED3 ekspresyonunun prognostik önemini değerlendirmek için tek değişkenli ve çok değişkenli Cox orantılı riskler regresyon analizleri yapıldı. Tehlike oranları (HR'ler) %95 güven aralıkları (%95 CI) ile sunulur. Değişkenler arasında cinsiyet, T evresi, N evresi, M evresi, patolojik evre ve TMED3 ifadesi yer alıyordu. İstatistiksel anlamlılık P < 0.05 olarak tanımlandı.

İlaç hassasiyet analizi, yüksek TMED3 ekspresyon grubundaki hastaların düşük TMED3 ekspresyon grubuna kıyasla 5-flororavisil, lapatinib ve trametinib için tahmini IC₅₀ değerlerinin düşük olduğunu göstermiştir (Şekil 11). Bu bulgular, TMED3 ekspresyonu yüksek olan kolon kanseri hastalarının bu kemoterapötik ve hedefli tedavi ajanlarına karşı artan hassasiyet gösterebileceğini ve TMED3 ekspresyonu ile terapötik yanıt arasında olası ilişkiler olabileceğini göstermektedir.

Şekil 11. Kolon kanserinde TMED3 ekspresyonu ile kemoterapi ilaç hassasiyeti arasındaki korelasyon. Düşük TMED3 ekspresyonu (G1) ile yüksek TMED3 ekspresyonu (G2) grupları arasında 5-florourasil, lapatinib ve trametinib için tahmini yarı-maksimum inhibitör konsantrasyon (IC₅₀) değerlerini gösteren kutu grafikleri. Daha düşük IC₅₀ değerleri, ilaç hassasiyetinin arttığını gösterir. İstatistiksel anlamlılık Wilcoxon sıralama toplamı testleri kullanılarak analiz edildi. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Gen zenginleştirme analizi
MSigDB veritabanından KEGG veri setlerini kullanan GSEA, kolon kanserindeki TMED3 ile ilişkili genlerin ribozom, Antijen İşleme ve Sunum, oksidatif fosforilasyon ve Pentoz Fosfat Yolu ile ilişkili yollarda önemli ölçüde zenginleştiğini göstermiştir (Şekil 12). Bu bulgular, TMED3'ün kolon kanserinde tümörün yukarıda belirtilen yollar boyunca ilerlemesine katılabileceğini göstermektedir.

Şekil 12. Kolon kanserinde TMED3 ile ilişkili genlerin gen seti zenginleştirme analizi (GSEA). Kolon kanserinde antijen işleme ve sunum, ribozom, oksidatif fosforilasyon ve pentoz fosfat yollarıyla ilişkili yollarda TMED3 ile ilgili genlerin zenginleşmesini gösteren GSEA grafikleri. Her panelde normalleştirilmiş zenginleştirme puanı (NES), nominal P değeri ve yanlış keşif oranı (FDR) değerleri gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Bu çalışma, TMED3'ün birden fazla kanserde anormal şekilde eksprese edildiğini ve tümör ilerlemesi, prognoz, bağışıklık özellikleri, TMB, MSI ve ilaç hassasiyetiyle ilişkili olduğunu göstermiştir. Kolon kanserinde, TMED3 aşırı ekspresyonu olumsuz sağlık sonuçları ve artan tanı değeriyle ilişkilendirildi. Fonksiyonel zenginleştirme analizi ayrıca TMED3'ün kanserle ilişkili metabolik ve sinyal yollarında rol alabileceğini gösterdi. Bu bulgular toplamında, özellikle kolon kanserinde pan-kanserde potansiyel bir tanısal ve prognostik biyobelirteç olarak TMED3'ün daha fazla araştırılmasını destekler.

Veri Erişilebilirliği:
Bu çalışmada analiz edilen veri setleri, The Cancer Genome Atlas (TCGA; https://portal.gdc.cancer.gov/projects/; erişim tarihi: 1 Temmuz 2025), UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/; erişim tarihi: 1 Temmuz 2025), cBioPortal (https://www.cbioportal.org/; erişim tarihi: 5 Temmuz 2025) ve GSCA aracılığıyla Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC) platformu (https://guolab.wchscu.cn/GSCA/#/drug; erişim tarihi: 5 Temmuz 2025) yer almaktadır. Bu çalışma sırasında üretilen tüm işlenen veriler makaleye dahil edilmiştir.

Tartışma

TMED proteinleri, ökaryot hücrelerde monomer veya dimer olarak bulunan emp24 domenini içeren yüksek koruma altındaki^{proteinlerdir 20}. TMED ailesinin üyeleri, vezikül aracılı protein taşıması ve hücre içi taşıma^20'de yer alan tip I transmembran proteinlerdir. P24 protein ailesi, TMED3 dahil olmak üzere 10 TMED üyesinden oluşur. Artan kanıtlar, TMED3'ün endometriyal karsinom, osteosarkom, şeffaf hücreli karsinom, hepatosellüler karsinom, prostat kanseri ve meme^kanseri 4,6,21,22,23 gibi çeşitli malignitelerde anormal şekilde ifade edildiğini göstermektedir. Yükselmiş TMED3 ifadesi, çoklu tümör^tipleri 3,5,17,18,19'da olumsuz prognozla da ilişkilendirilmiştir. Akciğer skuamöz hücreli karsinomda, TMED3'ün ezrin'in düzenlenmesiyle tümör ilerlemesini kolaylaştırdığı gösterilirken, TMED3'ün susturması hücre çoğalması, koloni oluşumu, göç ve apoptozla ilişkili protein düzensizliğini^{bastırmıştır 5}. Bu çalışmalar topluca, TMED3'ün kanser gelişimi ve ilerlemesinde yakından rol oynadığını göstermektedir; ancak pan-kanserdeki biyolojik işlevleri ve moleküler mekanizmaları henüz tam olarak açıklanmamıştır.

Mevcut çalışmada, TMED3'ün kanserler arasında ifade kalıplarını, prognostik önemini, bağışıklık özelliklerini ve potansiyel biyolojik işlevlerini kapsamlı şekilde değerlendirmek için birden fazla kamuya açık veri tabanı entegre edilmiştir. TMED3 ekspresyonu 26 tümör tipinde belirgin şekilde artmış ve bu bulgular, çeşitli kanserlerde eşleştirilmiş tümör ve bitişik normal doku analizleriyle daha da doğrulanmıştır. Tutarlı olarak, CPTAC verileri BRCA, COAD, GBM, KIRC, LIHC, LUAD, LUSC, OV ve UCEC'de TMED3 protein ekspresyonunun yükseldiğini göstermiştir. İlginçtir ki, TMED3 mRNA ekspresyonu PAAD dokularında yüksek olsa da, UALCAN veritabanında protein ifadesinin azaldığı gözlemlendi; bu da transkripsiyon sonrası düzenleme, protein bozunması veya translasyon sonrası değişikliklerin bu uyumsuzluğa katkıda bulunabileceğini göstermektedir. Önceki çalışmalar, meme kanseri hücrelerinde TMED3 aşırı ekspresyonunun, MCF-7 hücrelerinin sitoplazması ve çekirdeğinde β-katenin ve Axin-2'nin birikmesini teşvik ettiğini ve C-myc, MMP7 ve TCF4 dahil Wnt/β-katenin aşağı akış hedeflerinin ekspresyonu artırdığını ve böylece tümör hücresinin çoğalması, göçü ve istilasını^{kolaylaştırdığını göstermiştir 24}. Benzer şekilde, TMED3'ün küçük hücreli olmayan akciğer kanserinde yukarı regülasyona uğradığı bildirilmiştir ve TMED3'ün susturulması tümör hücre çoğalmasını ve invaziv yeteneği^{bastırmaktadır 25}. Mevcut çalışmada, klinikopatik analizler TMED3 ekspresyonunun ileri evre ACC, KIRC, KIRP ve LUAD'da yüksek, ileri evre UCEC'de ise daha düşük ifadenin gözlemlendiğini gösterdi ve bu da TMED3'ün kanser ilerlemesi sırasında olası tümör-spesifik biyolojik rollerini gösterdi. Hayatta kalma analizleri, yüksek TMED3 ekspresyonu ile olumsuz OS ve DSS arasında ACC, COAD ve UVM'de önemli ilişkiler göstererek, çoklu malignitelerde TMED3'ün potansiyel prognostik değerini destekledi. Ayrıca, promotor metilasyon analizi BRCA, COAD, ESCA, HNSC, KIRC, KIRP, LIHC, LUAD, PAAD ve PRAD'da artan TMED3 metilasyon seviyelerini, BLCA, TGCT ve UCEC'de ise azalmış metilasyon seviyelerini ortaya koydu. Bu bulgular, anormal promotor metilasyonunun TMED3 ifadesinin tümör bağımlı şekilde düzensizleşmesine katkıda bulunabileceğini ve kanser gelişiminde rol alabileceğini göstermektedir.

MSI, bu tümörlerin genellikle yüksek mutasyonel yük ve artan PD-L1 ifadesi göstermesi nedeniyle immünoterapiye daha iyi yanıt verme ile sıkça ilişkilendirilen belirgin bir moleküler kanser alt^{tipidir 26,27}. Yüksek TMB'ye sahip tümörler, somatik mutasyonlardan türetilen çok sayıda neoantijen üretebilir; böylece T-hücre aracılı antitümör bağışıklık aktivitesini artırabilir ve bağışıklık kontrol noktası blokajına karşı^{hassasiyeti artırabilir 28,29}. Mevcut çalışmada, TMED3 ekspresyonu KIRC, STAD ve UCEC'de hem TMB hem MSI ile pozitif korelasyon gösterdi ve bu da TMED3'ün bu kanser tiplerinde tümör immünojenliği ve immünoterapik yanıt ile bağlantılı olabileceğini göstermektedir. Artan kanıtlar, özellikle bağışıklık ve stromal bileşenler olan tümör mikro ortamının kanser ilerlemesi, terapötik yanıt, nükleme ve hasta prognozunda kritik bir rol oynadığını göstermiştir. ESTIMATE algoritması, stromal, bağışıklık ve ESTIMATE puanlarını bağışıklık ile ilgili gen ifade kalıplarına göre hesaplar ve önceki araştırmalar, bu skorlar ile prostat kanseri, glioblastom ve kolon kanserinde klinik sonuçlar arasında önemli ilişkiler^{bildirmiştir (}30,31,32). Analizlerimiz, TMED3 ekspresyonunun farklı tümör tiplerinde stromal skor, bağışıklık skoru ve ESTIMATE puanıyla değişken şekilde ilişkili olduğunu gösterdi ve bu da TMED3'ün tümör mikroçevresinin modülasyonu yoluyla tümör ilerlemesine katkıda bulunabileceğini düşündürdü. Ayrıca, TMED3 ekspresyonu, CD274 (PD-L1), PDCD1 (PD-1) ve CTLA4 dahil olmak üzere birden fazla bağışıklık kontrol noktası ile ilişkili genlerle korelasyonluydu; ancak bu ilişkilerin yönü ve büyüklüğü tümör tipleri arasında farklılık gösteriyordu. ACC, KIRP, LGG, LIHC, THYM ve UVM'de TMED3 ile bağışıklık kontrol noktası belirteçleri arasında anlamlı pozitif korelasyonlar tespit edildi; bu da bu kanserlerde TMED3 ekspresyonu yüksek olan tümörlerin immünoterapiye karşı artan hassasiyet gösterebileceğini göstermektedir. İlaç hassasiyet analizleri, TMED3 ifadesi ile 17-AAG, lapatinib, PD-0325901, RDEA119 ve trametinib ile TMED3 ifadesi ile terapötik etkinlik arasında potansiyel bir ilişki olduğunu gösteren ilişkiler ortaya koydu.

İmmünohistokimyasal doğrulama için kolon kanseri seçildi ve sonuçlar, kolon kanseri dokularında TMED3 ifadesinin normal kolon dokularına kıyasla belirgin şekilde yüksek olduğunu doğruladı; bu, önceki bulgularla uyumlu⁷. Klinikopatolojik analizler, kolon kanserinde TMED3 ifadesi ile T evresi arasında anlamlı bir ilişki olduğunu ortaya koydu. Ayrıca, TMED3 potansiyel tanı değeri göstermişken, artan TMED3 ekspresyonu daha kötü hasta prognozuyla ilişkilendirilmiştir. Ancak, zamana bağlı ROC analizleri, 1-, 3- ve 5 yıllık işletim sistemini tahmin etmek için AUC değerlerinin sadece biraz 0.5'in üzerinde olduğunu ve istatistiksel anlamlılığa rağmen sınırlı tahmin doğruluğunu gösterdiğini gösterdi. Bu bulgular, TMED3'ün şu anda rutin klinik uygulama için sağlam bir öngörücü olmaktan ziyade keşif amaçlı bir biyobelirteç olarak daha büyük bir değere sahip olduğunu göstermektedir. Tek değişkenli ve çok değişkenli Cox regresyon analizleri, kolon kanserinde OS ile ilişkili bağımsız prognostik faktörler olarak T evresi, M evresi, patolojik evre ve TMED3 ekspresyonunu daha da belirlemiştir. İlaç hassasiyet analizleri, TMED3 ekspresyonu yüksek olan hastaların yaygın kullanılan 5-fluorouracil, lapatinib ve trametinib gibi yaygın kullanılan terapötik ajanlara daha duyarlı olabileceğini göstermiştir. Ayrıca, fonksiyonel zenginleştirme analizleri, kolon kanserinde TMED3 ile ilişkili genlerin öncelikle ribozom, antijen işleme ve sunum, oksidatif fosforilasyon ve pentoz fosfat yolu ile ilişkili yollarda zenginleştiğini ortaya koydu.

Bu çalışma, TMED3'ün birden fazla kanser türünde ifade profillerini, prognostik değerini ve bağışıklık ile ilgili özelliklerini sistematik olarak değerlendirmiştir. Buna rağmen, birkaç sınırlama göz önünde bulundurulmalıdır. Çoğu bulgu, kamuya açık veri setlerine dayalı biyoinformatik ve multiomik analizlerden türetildi ve deneysel doğrulama kolon kanseri dokularında immünohistokimyasal analizlerle sınırlıydı. Ayrıca, TMED3'ün tümör ilerlemesindeki rolünün kesin moleküler mekanizmalarını araştırmak için fonksiyonel deneyler yapılmadı. Bu nedenle, TMED3'ün farklı malignitelerde biyolojik işlevlerini ve potansiyel terapötik önemini daha da netleştirmek için ek in vitro ve in vivo çalışmalar gereklidir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0.5% Ammonia Solution	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:1336-21-6	N/A
1% Acid Alcohol	Ningbo Chiwell Biotechnology Co., Ltd	CWGQ-HE-1001	N/A
10% Neutral Buffered Formalin	Wuhan Huntz Biotechnology Co., Ltd	H-H8060	N/A
100% Ethanol	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
70% Ethanol	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
80% Ethanol	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
95% Ethanol	Shandong Lirun Medical Technology Co., Ltd	CAS:64-17-5	N/A
Alcian Blue Stain	Baso Diagnostics Inc., Zhuhai	BA4121	N/A
cBioPortal	Memorial Sloan Kettering Cancer Center	N/A	SCR_014555
Citrate-Based Antigen Retrieval Buffer	Leica Biosystems Newcastle Ltd	AR9640-CN	N/A
clusterProfiler package	Bioconductor	N/A	SCR_016884
DESeq2 package	Bioconductor	N/A	SCR_015687
Diaminobenzidine Tetrahydrochloride Hydrate	Leica Biosystems Newcastle Ltd	DS9800-CN	N/A
ESTIMATE package	R package	Version 1.0.13	N/A
GSCALite platform	GSCALite	N/A	N/A
GTEx database	GTEx Consortium	N/A	SCR_013042
Hematoxylin	Ningbo Chiwell Biotechnology Co., Ltd	CWGQ-HE-1001	N/A
Hydrogen Peroxide	OriGene Technologies, Inc	PV-6000D	N/A
Kaplan–Meier Survival Analysis	survival R package	Version 3.2-7	SCR_021137
KEGG Gene Sets	MSigDB	Version 7.5.1	SCR_016863
Light Microscope	Zeiss Technology (Suzhou) Co., Ltd	N/A	N/A
Paraffin Embedding Medium	PATHO-Reagent Department of YL Company	CAS:8002-74-2	N/A
Polymer-Based Detection System	Leica Biosystems Newcastle Ltd	PV-6000	N/A
R statistical analysis software	R Foundation for Statistical Computing	Version 4.2.1	SCR_001905
Secondary Rabbit Anti-Mouse IgG	Leica Biosystems Newcastle Ltd	DS9800-CN	N/A
TCGA database	National Cancer Institute	N/A	SCR_003193
TMED3 Primary Antibody	CUSABIO Technology, Houston, USA	CSB-PA897107LA01HU	N/A
Tris-Buffered Saline (TBS)	Leica Biosystems Newcastle Ltd	AR9590-CN	N/A
UALCAN database	UALCAN	N/A	SCR_015827
Wilcoxon Statistical Analysis	stats R package	N/A	SCR_003005
Xylene	Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd	CAS:1330-20-7	N/A