Bu çalışma, küçük hücreli dışı akciğer kanseri dokularında ve hücre hatlarında miR-21-5p ekspresyonunu, hücre adhezyon molekülü 1 ile olan ilişkisini ve migrasyon, proliferasyon, inflamatuar belirteç ekspresyonu ve sağkalım ile olan ilişkilerini değerlendirmektedir.
Araştırma makalesi
Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanseri Progresyonu ve Prognozunda miR-21-5p-Hücre Adezyon Molekülü 1 Ekseni
28 görüntülenme
⸱
11 Eylül 2026
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Kanıtlar, miR-21-5p'nin küçük hücreli dışı akciğer kanserinde (NSCLC) önemli bir moleküler regülatör olduğunu göstermektedir. Hücre adhezyon molekülü 1 (CADM1) potansiyel bir tümör baskılayıcıdır, ancak NSCLC progresyonunda miR-21-5p ve CADM1 arasındaki düzenleyici ilişki belirsizliğini korumaktadır. NSCLC doku ve hücrelerinde miR-21-5p ve CADM1 ekspresyonunu tespit etmek için kantitatif ters transkripsiyon PCR (qRT-PCR) kullanılmıştır; miR-21-5p ve CADM1'in hedef bağlanması çift lusiferaz raporlayıcı gen deneyi ile doğrulanmıştır; hücre migrasyon yeteneği Transwell deneyi ile tespit edilmiştir; miR-21-5p'nin klinik önemini araştırmak için klinikopatolojik veriler ve sağkalım analizleri birleştirilmiştir; miR-21-5p hedef genlerinin fonksiyonel zenginleştirmesi biyoinformatik ile analiz edilmiştir. NSCLC dokularındaki miR-21-5p ekspresyonu, komşu normal dokulara göre anlamlı derecede yüksek bulunmuştur ve yüksek miR-21-5p ekspresyonuna sahip hastalar daha kısa genel sağkalım göstermiştir. miR-21-5p'nin yüksek ekspresyonu, NSCLC hastalarının sağkalımı için bağımsız bir risk faktörüdür; miR-21-5p'nin aşırı ekspresyonu, NSCLC hücrelerinde hücre migrasyonunu teşvik etmiş ve enflamatuar faktörlerin ekspresyonunu yukarıye düzenlemiştir; çift lusiferaz raporlayıcı gen deneyi, miR-21-5p'nin doğrudan CADM1'i hedeflediğini doğrulamıştır; CADM1'in aşırı ekspresyonu, NSCLC hücrelerinde hücre migrasyonunu inhibe etmiş ve enflamatuar faktörlerin ekspresyonunu aşağıye düzenlemiştir; biyoinformatik analiz, miR-21-5p hedef genlerinin tümör oluşumu ve gelişimiyle ilgili çok sayıda sinyal yolunda zenginleştiğini göstermiştir. miR-21-5p, CADM1'i hedefleyip inhibe ederek NSCLC progresyonunu teşvik eder ve prognostik bir biyobelirteç ile terapötik bir hedef olarak hizmet edebilir.
Giriş
Dünya genelinde akciğer kanseri, insidansı istikrarlı bir şekilde artan, kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedenleri arasında yer almaktadır1,2. Doğu Asya popülasyonlarında, akciğer kanseri insidansı ve mortalitesi 100.000 erkekte sırasıyla 222,1 ve 155,5 iken, kadınlarda 158,1 ve 87,3'tür. Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC), tüm akciğer malignitelerinin yaklaşık %80'ini oluşturur ve üç ana histolojik alt tipi kapsar3. Oldukça agresif seyreden küçük hücreli akciğer kanseri (SCLC) ile karşılaştırıldığında, NSCLC daha yavaş ilerler ve metastaz yapar; ancak belirsiz erken klinik semptomlar, hastaların %75'inden fazlasının orta veya ileri evrelerde tanı almasına yol açarak 5 yıllık genel sağkalım oranlarının sürekli olarak düşük kalmasına neden olmaktadır4. Akciğer tümör oluşumu, onkogenik aktivasyon ve tümör supresör gen susturulması tarafından yönlendirilir5; bu durum, yeni terapötiklerin geliştirilmesi için NSCLC'nin moleküler temellerinin çözülmesine yönelik acil bir ihtiyacı vurgulamaktadır6.
MikroRNA'lar (miRNA'lar, 18–25 nükleotid uzunluğunda), hedef mRNA'ların 3′ çevrilmeyen bölgesine (3′-UTR) bağlanarak translasyonel baskılanmayı veya mRNA yıkımını tetikleyip post-transkripsiyonel gen represyonuna aracılık ederler7. miRNA biyogenezi, primer miRNA transkriptlerini üretmek için RNA polimeraz II transkripsiyonu ile başlar ve ardından RNase III enzimlerinin kesimiyle saç tokası şeklinde öncül miRNA'lar (pre-miRNA'lar) oluşur8. Çoğu miRNA, mRNA 3′-UTR'leri ile kısmi veya tam sekans komplementerliği yoluyla gen ekspresyonunu baskılarken, bazı miRNA'lar belirli hücre döngüsü bağlamlarında mRNA translasyonunu artırabilir9. Günümüze kadar, hücre proliferasyonu, diferansiyasyonu ve apoptoz dahil olmak üzere temel biyolojik süreçleri yöneten yüzlerce insan miRNA'sı tanımlanmıştır10. Daha önce, aberrant şekilde eksprese edilen miRNA'ların saptanması teknik olarak zorlayıcıydı; yüksek çıktılı sekanslamanın ortaya çıkışı, hastalık dokularındaki disregüle miRNA'ların hızlı ve tarafsız bir şekilde profillenmesini sağlamıştır11. Burada, onkojenik düzenleyici fonksiyonları yoğun şekilde araştırılan ve RNA polimeraz II tarafından transkribe edilen, en erken karakterize edilen miRNA'lardan biri olan miR-21-5p üzerine odaklanıyoruz12.
miR-21-5p, TMEM49 geninin bir intronu içinde kodlanmıştır ve özofagus, kolorektal ve akciğer kanserleri dahil olmak üzere birçok insan malignitesinde tutarlı bir şekilde aşırı eksprese edilmektedir13. Mevcut preklinik KHAK verileri, onkogenik aktivitesini doğrulamaktadır: yüksek miR-21-5p seviyeleri, PTEN ve PDCD4 gibi anti-onkogenik hedefleri susturarak tümör proliferasyonunu, epitel-mezenkimal geçişi (EMT) ve uzak metastazı hızlandırır14. Buna rağmen, önceki çalışmalar büyük ölçüde miR-21 tarafından yönlendirilen apoptotik ve proliferatif sinyallere odaklanmış olup, KHAK'ta miR-21-5p/CADM1 düzenleyici eksenini sistematik olarak inceleyen çok az rapor bulunmaktadır15. Hücre adezyon molekülü 1 (CADM1), epitelyal kanserlerde iyi tanımlanmış bir tümör baskılayıcıdır16; tümör hücresinin ayrılmasını ve metastatik yayılımı engellemek için hücreler arası adezyonu korur ve downregülasyonu, KHAK hasta kohortlarında ileri tümör evresi ve daha kötü sağkalım ile korelasyon gösterir. Mekanistik olarak CADM1, ayrıca pro-inflamatuar sitokin sekresyonunu indükleyerek ve tümör mikroçevresini yeniden şekillendirerek metastazı besleyen pro-tümöral nükleer faktör kappa B (NF-κB) inflamatuar sinyallemesini de kısıtlar17. miR-21-5p onkogenitesinin ve CADM1 tümör baskılayıcı etkilerinin ayrı ayrı belgelenmesine rağmen, KHAK'taki miR-21-5p/CADM1 ekseni için üç kritik bilgi boşluğu devam etmektedir: birincisi, miR-21-5p tarafından CADM1'in doğrudan bağlanması ve baskılanması akciğer kanseri hücrelerinde deneysel olarak doğrulanmamıştır; ikincisi, bu eksenin alt akış inflamatuar yolaklar aracılığıyla malign fenotipleri yönlendirip yönlendirmediği belirsizliğini korumaktadır; üçüncüsü, kombine miR-21-5p/CADM1 ekspresyon imzalarının prognostik öngörü kapasitesi klinik KHAK örneklerinde değerlendirilmemiştir.
Bu çözülmemiş sorulara dayanarak, merkezi bir mekanistik hipotez öne sürüyoruz: NSCLC'de artmış miR-21-5p, CADM1 ekspresyonunu baskılamak için doğrudan CADM1 3′-UTR bölgesine bağlanır, böylece CADM1 tarafından baskılanan metastatik inflamatuar sinyalleri serbest bırakır ve sonuç olarak NSCLC migrasyonunu hızlandırarak daha kötü bir klinik prognoza yol açar. Bu çalışma, önceden tanımlanmış üç araştırma amacını takip etmektedir: (1) miR-21-5p'nin CADM1'i doğrudan moleküler olarak hedeflemesini doğrulamak ve A549 ile H1299 NSCLC hücre hatlarında migrasyonu değerlendirmek; (2) miR-21-5p/CADM1 kaskadının, inflamatuar sinyal iletimi aracılığıyla metastatik potansiyeli modüle edip etmediğini aydınlatmak; (3) metastatik NSCLC için yeni tanısal biyobelirteçler ve terapötik adaylar belirlemek amacıyla miR-21-5p/CADM1 ekspresyon imzasının klinik prognostik değerini değerlendirmek.
Protokol
Bu retrospektif çalışma, Quzhou Geleneksel Çin Tıbbı Hastanesi Etik Kurulu tarafından incelenmiş ve onaylanmıştır (onay no. 202402208). Numune toplama işlemi öncesinde, kayıt altına alınan her hastadan veya yasal vasisinden yazılı bilgilendirilmiş onam alınmıştır.
Örnek toplama
Birincil NSCLC tümör dokuları kayıtlı hastalardan cerrahi olarak alınmış, bunlarla eşleşen komşu normal akciğer dokuları ise retrospektif olarak Ulusal Klinik Biyopsi Mühendislik Araştırma Merkezi'nden (Quzhou Şehri, Zhejiang Eyaleti, Çin) toplanmıştır. Bu kohort çalışmasına, Ocak 2019 ile Aralık 2024 tarihleri arasında ardışık olarak kaydedilen toplam 157 NSCLC hasta örneği dahil edilmiştir. 157 eşli örnekten oluşan örneklem büyüklüğü, daha önce yayınlanmış NSCLC miRNA prognostik araştırmalarına dayanarak istatistiksel olarak gerekçelendirilmiştir: 0,5 orta etki büyüklüğü, α = 0,05 ve %80 istatistiksel güç varsayıldığında, gereken minimum örneklem büyüklüğü 122 vaka olarak hesaplanmıştır. Olası örnek kaybı, şiddetli doku nekrozu ve takibi yapılamayan hastalar göz önünde bulundurularak, yeterli istatistiksel gücü garanti etmek amacıyla Ocak 2019'dan Aralık 2024'e kadar 157 uygun hasta ardışık olarak kaydedilmiştir. Tüm tümör ve eşleşen komşu normal akciğer dokuları, cerrahi rezeksiyon sırasında aynı hastadan alınarak sonraki karşılaştırmalı analizler için eşli örnekler oluşturulmuştur.
Dahil edilme kriterleri şunlardı: (1) Postoperatif biyopsi ile primer NSCLC olduğu patolojik olarak doğrulanmış hastalar; (2) Eksiksiz klinik bazal veriler, histopatolojik evreleme ve uzun süreli takip sağkalım verileri; (3) Doku örneklemesi öncesinde radyoterapi, kemoterapi veya hedefe yönelik tedavi uygulanmamış olmak; (4) Eşleşmiş tam tümör ve parakanseröz doku örneklerinin mevcut olması.
Dışlama kriterleri şunlardı: (1) Diğer organlarda kombine ikincil malign tümörler; (2) Ameliyattan sonraki 3 ay içinde takibi yapılamayan hastalar; (3) Şiddetli nekroz içeren veya sonraki moleküler tespit için yetersiz doku hacmine sahip örnekler.
Tüm taze doku örnekleri, cerrahi rezeksiyondan sonraki 15 dakika içinde sıvı azota yerleştirilmiş, ultra düşük sıcaklıklı bir dondurucuya aktarılmış ve RNA ile protein ekstraksiyonu için −80 °C'de saklanmıştır. Klinik takip düzenli olarak yapılmış ve genel sağkalım, patolojik tanıdan ölüme veya son takip kesit tarihine kadar geçen süre üzerinden ay cinsinden ölçülmüştür.
miR-21-5p ekspresyon seviyesinin tabakalandırılması
Tüm 157 hastanın miR-21-5p göreceli ekspresyon değerleri artan sırada sıralanmış ve kohort, medyan ekspresyon kesme noktasına göre tabakalandırılmıştır. Medyan civarındaki çok sayıda eşit değer nedeniyle, ekspresyonu medyanın altında olan hastalar düşük ekspresyon grubuna (n = 61) atanmış; medyan değerine eşit veya medyan değerinden yüksek ekspresyona sahip hastalar, medyan değerindeki tüm eşit gözlemler dahil olmak üzere, yüksek ekspresyon grubuna (n = 96) sınıflandırılmıştır. Bu eşit değer atama kuralı, yinelenen medyan okumalarını çözmek için gruplandırma öncesinde önceden belirlenmiş ve gruplandırma sonucu ham qRT-PCR kantifikasyon verileriyle çapraz doğrulanmıştır.
Hücre kültürü
İnsan NSCLC hücre hatları A549 ve H1299, ticari bir tedarikçiden temin edilmiştir (bkz. Materyaller Tablosu). A549 hücreleri RPMI-1640 besiyerinde, H1299 hücreleri ise DMEM'de kültüre edilmiştir. Her iki hücre kültürü besiyeri de %10 ısı ile inaktive edilmiş fetal bovin serumu (FBS), penisilin (100 U/mL) ve streptomisin (100 µg/mL) ile zenginleştirilmiştir. Hücreler, %5 CO₂ ile beslenen nemlendirilmiş bir inkübatörde, 37 °C'de standart koşullar altında kültüre edilmiştir.
Tüm fonksiyonel deneylerden önce, A549 ve H1299 hücre hatlarının kimliklerini doğrulamak amacıyla kısa tandem tekrar (STR) profillemesi gerçekleştirilmiştir. Mycoplasma kontaminasyon testi, ticari bir PCR tabanlı mycoplasma tespit kiti kullanılarak aylık olarak yapılmış ve sonraki analizler için yalnızca mycoplasma-negatif hücreler kullanılmıştır.
Geçici transfeksiyon için morfolojisi sağlam ve logaritmik büyüme fazındaki hücreler hasat edildi. Lipid bazlı bir transfeksiyon reaktifi (Materyaller Tablosuna bakınız), üreticinin talimatlarına uygun olarak kullanıldı. Hücresel analizler transfeksiyondan 50 h sonra gerçekleştirildi.
Hücre transfeksiyonu
Transfeksiyon için, morfolojisi bozulmamış ve logaritmik büyüme fazındaki hücreler, %60–70 konfluens düzeyine ulaşmaları için 24 saat önceden kültür plaklarına ekilmiştir. Transfeksiyon, üretici talimatlarına uygun olarak lipid bazlı bir transfeksiyon reaktifiyle (Materyal Tablosuna bakınız) gerçekleştirilmiştir. Dört deneysel grup kullanılmıştır: mimic negatif kontrol (mimic-NC), miR-21-5p mimic, inhibitör negatif kontrol (inhibitor-NC) ve miR-21-5p inhibitörü. Nükleotid dizileri Ek Dosya 1'de sunulmuştur.
Toplam RNA, transfeksiyondan 50 s sonrası ekstrakte edildi ve miR-21-5p'nin göreceli ekspresyonunu ölçmek ve transfeksiyon verimliliğini doğrulamak için kantitatif ters transkripsiyon PCR (qRT-PCR) uygulandı. Hücresel migrasyon analizleri transfeksiyondan 50 s sonra gerçekleştirildi. Geçici transfeksiyon için hücreler, 50 nM son konsantrasyonda miR-21-5p mimiği veya mimik negatif kontrolü (mimic-NC) ilele işlem gördü; miR-21-5p inhibitörü ve inhibitör negatif kontrolü (inhibitor-NC) ise 100 nM konsantrasyonda uygulandı. Nükleik asit girdi miktarındaki farklılıklardan kaynaklanabilecek kafa karıştırıcı etkileri önlemek için, transfekte edilen toplam nükleik asit miktarı dört tedavi grubunun tamamında aynı tutuldu.
Hücre proliferasyonu, Hücre Sayım Kiti-8 (CCK-8) analizi kullanılarak değerlendirildi. Stabil olarak transfekte edilen hücreler, her grup için altı teknik tekrar oluşturulacak şekilde, 96 kuyucuklu plakalara kuyucuk başına 3 × 103 hücre olacak şekilde ekildi. Ekimden 24, 48 ve 72 saat sonra, her kuyucuğa 10 µL CCK-8 reaktifi eklendi ve ardından 37 °C'de 2 saat boyunca inkübasyon yapıldı. Hücre proliferasyonu, bir mikroplaka okuyucu kullanılarak 450 nm'deki absorbans ölçülerek nicelendirildi.
Tüm geçici transfeksiyon, CCK-8 ve migrasyon deneyleri en az üç bağımsız biyolojik tekrarlı olarak gerçekleştirilmiştir ve yukarıda açıklandığı üzere her biyolojik tekrar 3–6 teknik tekrar içermiştir.
Kantitatif ters transkripsiyon PCR
NSCLC hücrelerinden ve eşleşmiş klinik tümör ile komşu normal dokulardan toplam RNA, fenol/guanidin bazlı bir RNA ekstraksiyon reaktifi ile izole edilmiştir (bkz. Materyal Tablosu). RNA saflığı ve konsantrasyonu ultraviyole spektrofotometre ile belirlenmiştir; yalnızca optik yoğunluk (OD) 260/280 ve OD 260/230 oranları 1,8–2,1 olan örnekler ters transkripsiyona tabi tutulmuştur. Primer dizileri Ek Dosya 1'de verilmiştir. Ters transkripsiyon sistemi; 500 ng toplam RNA, 2 µL ters transkripsiyon tamponu, 1 µL dNTP karışımı, 0,5 µL ters transkriptaz, miRNA için 1 µL spesifik stem-loop primer veya mRNA için oligo(dT) primer ve toplam 20 µL hacme tamamlanacak kadar RNase-free su içermekteydi. qRT-PCR amplifikasyon sistemi (20 µL toplam hacim); 10 µL SYBR Green qPCR master mix, 0,4 µL ileri primer (10 µM), 0,4 µL geri primer (10 µM), 2 µL seyreltilmiş cDNA kalıbı ve 7,2 µL RNase-free sudan oluşmaktaydı.
CADM1 ve GAPDH için haberci RNA, bir ters transkripsiyon kiti ile tersle çevrilirken; miR-21-5p, sap-döngü (stem-loop) primerleri ve spike-in kontrolü olarak ekzojen cel-miR-39 ile tersle çevrildi. Ekzojen cel-miR-39 spike-in, toplam RNA izolasyonundan hemen sonra ve ters transkripsiyon öncesinde her bir RNA örneğine eklendi. İnsan transkriptlerinde homolog dizisi bulunmayan sentetik bir C. elegans mikroRNA'sı olan cel-miR-39; farklı klinik doku örnekleri arasındaki diferansiyel RNA ekstraksiyon verimliliği, RNA degradasyon kaybı ve ters transkripsiyon verimliliği varyasyonunun neden olduğu sapmaları düzelterek miRNA kantifikasyonu için ekzojen bir evrensel normalizasyon kontrolü görevi görür. qRT-PCR, gerçek zamanlı bir PCR sisteminde floresan DNA bağlayıcı boya bazlı bir master mix kullanılarak gerçekleştirildi (bkz. Malzemeler Tablosu): 95 °C'de 3 dk, ardından 95 °C'de 10 sn, 60 °C'de 30 sn ve 72 °C'de 20 sn şeklinde 40 döngü uygulandı ve spesifik amplifikasyonu doğrulamak için erime eğrisi analizi yapıldı. Her örnek için üç biyolojik replika ve her birinin üç teknik replikası alındı ve bağıl ekspresyon 2⁻ΔΔCt yöntemi kullanılarak hesaplandı. CRP, TNF-α ve IL-6 mRNA amplifikasyonu için tam primer dizileri, CADM1, GAPDH ve miR-21-5p primer dizileriyle birlikte Ek Dosya 1'de verilmiştir.
Lentivirüs aracılı stabil miR-21-5p ekspresyonunun oluşturulması
Ticari lentiviral vektörler LV-miR-21-5p ve boş kontrol LV-NC, 293T hücrelerinde paketlendi. miR-21-5p öncül dizisi, puromisin direnci ve GFP raporlayıcı genler taşıyan bir lentiviral omurgaya yerleştirildi. Lentiviral süpernatanlar, transfeksiyondan 48 h ve 72 h sonra toplandı, konsantre edildi ve hücre enfeksiyonu için saflaştırıldı.
A549 ve H1299 hücreleri, %50–60 konfluens düzeyine ulaşmaları için enfeksiyondan 24 saat önce ekilmiştir. Transfeksiyon verimliliğini artırmak için hücreler, 5 µg/mL polybrene ile MOI = 10 (A549) ve MOI = 15 (H1299) değerlerinde enfekte edilmiştir. Besiyeri enfeksiyondan 24 saat sonra yenilenmiş ve hücreler puromisin taraması öncesinde 48 saat daha kültüre edilmiştir.
Stabil hücre seçimi, 10 ardışık gün boyunca 5 µg/mL puromisin ile gerçekleştirilmiştir; transduksiyon yapılmamış hücrelerin 7 gün içinde tamamen elendiğini doğrulamak için enfekte edilmemiş boş hücreler kullanılmıştır. Tekil GFP-pozitif klonlar izole edilmiş ve LV-21 ile LV-NC stabil monoklonal hücre hatlarını oluşturmak için genişletilmiştir.
CADM1 kurtarma analizleri için, ticari LV-CADM1 aşırı ekspresyon ve sh-CADM1 nakavt lentivirüsleri hazırlandı. Dört deney grubu oluşturuldu: LV-NC, LV-miR-21-5p, LV-CADM1 ve LV-miR-21-5p + LV-CADM1 kurtarma grubu. CADM1 lentivirüsleri, miR-21-5p vektörleri ile aynı MOI ve puromisin tarama koşullarında enfekte edildi. Tüm kurtarma proliferasyon ve migrasyon deneyleri, üç bağımsız biyolojik tekrarla gerçekleştirildi.
Stabil miR-21-5p aşırı ekspresyonunun doğrulanması
Hasat edilen LV-21 ve LV-NC stabil hücre klonlarından toplam RNA ekstrakte edildi. cel-miR-39 eksojen referans olarak kullanılarak hsa-miR-21-5p'nin göreceli ekspresyon seviyesini belirlemek için qRT-PCR yapıldı. LV-NC grubuyla karşılaştırıldığında miR-21-5p'de 8 kattan fazla artış gösteren hücre klonları, sonraki tüm fonksiyonel analizler için saklanarak miR-21-5p'yi stabil olarak aşırı eksprese eden hücre hatlarının başarılı bir şekilde oluşturulduğu onaylandı.
Çift lüsiferaz raporlayıcı testi
Tahmin edilen miR-21-5p bağlanma dizisini içeren yabanıl tip CADM1 3'-UTR raporlayıcı plazmidi (WT-CADM1) ve mutasyona uğramış bağlanma tohum bölgesine sahip mutant CADM1 3'-UTR raporlayıcı plazmidi (MUT-CADM1) oluşturuldu. A549 hücreleri, %60-70 konfluens düzeyine ulaşmaları için transfeksiyondan 24 saat önce 24 kuyucuklu plakalara ekildi. Her kuyucuğa, sabit bir kütle oranında 500 ng WT/MUT raporlayıcı plazmidi, 50 nM miR-21-5p takliğçüsü (mimic) veya mimic-NC ve Renilla lüsiferaz internal referans plazmidi birlikte transfekte edildi. Transfeksiyon sonrası 48 saatlik inkübasyonun ardından hücreler tamamen lizlendi ve bir çift lüsiferaz tespit kiti kullanılarak firefly ve Renilla lüsiferaz lüminesans sinyalleri sırayla tespit edildi. Rölatif lüsiferaz aktivitesi, firefly lüminesans değerinin Renilla lüminesans değerine oranı olarak hesaplandı. Her deneysel grup, biyolojik replika başına üç teknik replika olacak şekilde üç bağımsız biyolojik replika içeriyordu ve mimic-NC ile miR-21-5p mimic grupları arasındaki rölatif lüsiferaz aktivitesinin istatistiksel karşılaştırması için iki grup bağımsız örneklem t-testi kullanıldı.
Transwell migrasyon analizi
Transwell migrasyon analizi için, stabil olarak transfekte edilmiş hücreler serumsuz besiyerinde süspanse edildi ve üst insertlere kuyuk başına 4 × 104 hücre olacak şekilde ekildi. Kemotaktik bir gradyan oluşturmak için alt odalar, %10 FBS ile desteklenmiş tam kültür besiyeri ile dolduruldu. %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de 48 saat inkübasyonun ardından, membranın üst yüzeyinde kalan hücreler dikkatlice uzaklaştırıldı. Membranın alt yüzeyine migre olan hücreler metanol ile fikse edildi ve kristal viyole ile boyandı. Migrasyon, her insert başına rastgele seçilen beş mikroskobik alandaki hücrelerin sayılmasıyla nicelendirildi. Her deney, üç bağımsız biyolojik tekrarlanabilirlik ile gerçekleştirildi ve her biyolojik tekrarlanabilirlik için üç teknik tekrar dahil edildi.
İstatistiksel analizler
Tüm in vitro deneyler, her biri ilgili teknik tekrarlarla desteklenen en az üç bağımsız biyolojik tekrarla yürütülmüştür. Veri dağılımı, istatistiksel analize yön vermek amacıyla ilk olarak Shapiro-Wilk normallik testi ile değerlendirilmiştir. Tümör ve bitişik normal dokular arasındaki eşli karşılaştırmalar için, veri dağılımına bağlı olarak eşli t-testi veya eşli Wilcoxon işaretli sıralama testi uygulanmıştır. İki bağımsız grup arasındaki karşılaştırmalar, bağımsız t-testi veya Mann-Whitney U testi kullanılarak analiz edilmiştir. Kurtarma (rescue) deneyleri dahil olmak üzere çoklu gruplar arasındaki farklar, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Bonferroni post hoc düzeltmesi ile değerlendirilirken; CCK-8 proliferasyon ve yara iyileşme deneyleri gibi boylamsal veri setlerini analiz etmek için tekrarlı ölçümler ANOVA'sı kullanılmıştır. Kategorik klinik değişkenler arasındaki ilişkiler χ2 testi ile incelenmiş ve miR-21-5p ile CADM1 ekspresyonu arasındaki ilişki Pearson korelasyon analizi ile değerlendirilmiştir. Hasta sağkalımı, karşılaştırmaları log-rank testi ile yapılan Kaplan-Meier eğrileri kullanılarak analiz edilmiştir. Bağımsız prognostik faktörler, tek değişkenli ve çok değişkenli Cox orantılı risk regresyon analizleri aracılığıyla belirlenmiştir. İstatistiksel anlamlılık P < 0.05 olarak tanımlanmıştır. Çok değişkenli Cox regresyonu yaş, cinsiyet, histolojik tip, miR-21-5p seviyesi ve lenf nodu durumuna göre ayarlanmıştır (referans: yaş ≤ 60, kadın, skuamöz karsinom, düşük miR-21-5p, nod-negatif); orantılı risk varsayımı Schoenfeld rezidüelleri ile kontrol edilmiş ve tek değişkenli P < 0.10 olan değişkenler "enter" seçimi ile dahil edilmiştir.
Sonuçlar
miR-21-5p ekspresyonu ile NSCLC hastalarının klinikopatolojik özellikleri arasındaki korelasyon
Toplam 157 NSCLC tümör örneği, medyan miR-21-5p seviyelerine göre miR-21-5p düşük ekspresyonlu (n = 61) ve yüksek ekspresyonlu (n = 96) gruplara ayrılmıştır; ki-kare analizleri miR-21-5p ekspresyonunun hasta yaşı (χ2 = 1.36, P = 0.2435), cinsiyeti (χ2 = 1.06, P = 0.3032), histolojik tipi (χ2 = 1.09, P = 0.2965) veya tümör boyutu (χ2 = 5.623, P = 0.0601) ile anlamlı bir korelasyon göstermediğini ortaya koymuştur, buna karşılık yüksek miR-21-5p ekspresyonu, ileri tümör evresi (χ2 = 16.25, P = 0.06), pozitif lenf nodu metastazı (χ2 = 12.17, P = 0.049) ve daha yüksek T evresi (χ2 = 4.30, P = 0.17) ile anlamlı şekilde ilişkili bulunmuştur; bu durum miR-21-5p'nin NSCLC progresyonunu kolaylaştıran onkogenik etkiler sergilediğini düşündürmektedir (Tablo 1).
NSCLC'nin bağımsız prognostik faktörleri için çok değişkenli Cox orantılı riskler regresyon analizi
Yaş, cinsiyet, histolojik tip, miR-21-5p ekspresyonu ve lenf nodu metastazını içeren çok değişkenli Cox regresyon analizi; yüksek miR-21-5p ekspresyonunun (hazard ratio [HR] = 3.06; %95 güven aralığı [CI]: 1.412–6.659; P = 0.05) ve pozitif lenf nodu metastazının (HR = 2.295; %95 CI: 3.039–163.58; P = 0.02), NSCLC hastalarının düşük genel sağkalımı için bağımsız olumsuz prognostik risk faktörleri olduğunu, hasta yaşının, cinsiyetinin ve histolojik alt tipinin ise anlamlı bir bağımsız prognostik etki yaratmadığını ortaya koymuştur (tüm P > 0.05) (Tablo 2).
miR-21-5p'nin klinik ekspresyon özellikleri ve CADM1 ile inflamatuar faktörlerle olan korelasyonu
Eşleştirilmiş NSCLC tümör ve komşu normal dokuların qRT-PCR ile tespiti, kanser dokularında normal kontrollere kıyasla belirgin şekilde yükselmiş relatif miR-21-5p seviyeleri göstermiştir (Şekil 1A, P < 0.01). Kaplan-Meier sağkalım eğrileri, yüksek miR-21-5p ekspresyonuna sahip hastaların, düşük miR-21-5p ekspresyonuna sahip olanlara göre anlamlı derecede daha kötü genel sağkalım oranlarına sahip olduğunu göstermiştir (Şekil 1B, P = 0.027). İnflamatuar mediyatörler olan C-reaktif protein (CRP), tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α) ve interlökin-6'nın (IL-6) mRNA bolluklarının tamamı NSCLC örneklerinde belirgin şekilde artmıştır (Şekil 1C, P < 0.01, P < 0.01). Pearson korelasyon analizi, klinik örneklerde miR-21-5p ile CADM1 mRNA ekspresyonu arasında güçlü ve anlamlı bir negatif korelasyon olduğunu ortaya koymuştur (r = -0.73, %95 GA: -0.8325 ile -0.7076 arası, P < 0.01, Şekil 1D).
NSCLC hücrelerinde miR-21-5p'nin hücresel fonksiyonel doğrulaması
qRT-PCR, A549 ve H129 hücrelerinde miR-21-5p mimiğinin transfeksiyon verimliliğinin başarılı olduğunu doğrulamıştır (Şekil 2A). Transwell analizleri, miR-21-5p aşırı ifadesinin her iki hücre hattında da göreceli migrasyon kapasitesini ve hücre migrasyon sayılarını anlamlı düzeyde artırdığını göstermiştir (Şekil 2B,C). İnflamatuar sitokinlerin qRT-PCR ile saptanması, miR-21-5p mimiği transfeksiyonu sonrası CRP, TNF-α ve IL-6 mRNA düzeylerinde belirgin bir artış olduğunu, miR-21-5p inhibitörü uygulamasının ise bu yukarı regülasyonu geri çevirdiğini ortaya koymuştur (Şekil 2D). Kurtarma deneyleri, miR-21-5p mimiğinin CADM1 transkripsiyonunu şiddetli bir şekilde baskıladığını ve LV-CADM1 ko-transfeksiyonunun A549 ve H129 hücrelerinde CADM1 mRNA ekspresyonunu tamamen geri kazandırdığını doğrulamıştır (Şekil 2E,F). Toplu olarak bu hücresel veriler, miR-21-5p'nin CADM1'i baskılayarak NSCLC hücre migrasyonunu ve inflamatuar yanıtı teşvik ettiğini kanıtlamıştır.
miR-21-5p'nin NSCLC hücre proliferasyonu üzerindeki etkileri
24 sa, 48 sa ve 72 sa'daki CCK-8 proliferasyon eğrileri, miR-21-5p mimic transfeksiyonunun hem A549 hem de H1299 hücrelerinde 450 nm'deki OD değerlerini belirgin şekilde artırdığını, buna karşın miR-21-5p inhibitörünün hücre canlılığını önemli ölçüde baskıladığını göstermiştir ve 72 sa'da istatistiksel olarak anlamlı farklar gözlemlenmiştir (Şekil 3A,B; P < 0.01). Bu veriler, miR-21-5p'nin NSCLC hücreleri üzerinde pro-proliferatif bir etki yarattığını kanıtlamıştır.
Biyoenformatik tahmini ve çift lüsiferaz raporlayıcı testi aracılığıyla CADM1'in miR-21-5p'nin doğrudan hedefi olduğunun doğrulanması
miR-21-5p'nin aday aşağı akış genlerini taramak için üç çevrimiçi miRNA hedef tahmin veritabanı (miRWalk, StarBase, TargetScan) kesiştirilmiş ve 95 örtüşen hedef gen elde edilmiştir (Şekil 4A). Gen Ontolojisi (GO) zenginleştirme analizi, bu aday genlerin temel olarak hücre metabolizması, stres tepkisi ve transkripsiyon regülasyonu ile ilgili biyolojik süreçlerde, hücresel bileşenlerde ve moleküler fonksiyonlarda zenginleştiğini göstermiştir (Şekil 4B). Kyoto Gen ve Genom Ansiklopedisi (KEGG) yolak zenginleştirmesi, mitojenle aktive olan protein kinaz (MAPK) ve Ras yolakları dahil olmak üzere tümörle ilişkili sinyal kaskadlarında belirgin bir zenginleşme olduğunu ortaya koymuştur (Şekil 4C). Çift lüsiferaz raporlayıcı testi, miR-21-5p taklidinin (mimic), yaban tipi CADM1 3'-UTR raporlayıcısının göreceli lüsiferaz aktivitesini önemli ölçüde baskıladığını, ancak mutant CADM1 3'-UTR grubunda herhangi bir inhibitör etki gözlenmediğini göstermiş (Şekil 4D, P < 0.01, ns: anlamlı değil) ve miR-21-5p ile CADM1 arasındaki doğrudan bağlanmayı doğrulamıştır.
Kurtarma deneylerinde CADM1 baskılanması yoluyla NSCLC malign fenotiplerinin teşviki
qRT-PCR, A549 ve H129 hücrelerinde miR-21-5p mimic ve inhibitörünün transfeksiyon verimliliğini doğrulamıştır (Şekil 5A). CADM1 aşırı ekspresyonu (LV-CADM1), pro-inflamatuar faktörler olan CRP, TNF-α ve IL-6'nın mRNA seviyelerini azaltırken, küçük interferans RNA ile CADM1 nakavt edilmesi (si-CADM1) bu faktörlerin ekspresyonunu belirgin şekilde artırmıştır (Şekil 5B). Transwell migrasyon analizleri, LV-CADM1 transfeksiyonunun her iki NSCLC hücre hattının migrasyon kapasitesini anlamlı düzeyde baskıladığını göstermiştir (Şekil 5C,D). CCK-8 proliferasyon tespiti, LV-21 aracılı pro-proliferatif etkinin LV-CADM1 ko-transfeksiyonu ile tamamen dengelendiğini, buna karşın si-CADM1 kaynaklı hücre büyüme hızlanmasının miR-21-5p inhibitörü ile kurtarılabildiğini ortaya koymuştur (Şekil 5E,F). Toplu olarak bu kurtarma verileri, CADM1'in NSCLC'de miR-21-5p tarafından tetiklenen proliferasyon, migrasyon ve inflamatuar aktivasyondan sorumlu fonksiyonel bir aşağı akış mediyatörü olarak görev yaptığını doğrulamıştır.
VERİ ERİŞİLEBİLİRLİĞİ:
Bu çalışmanın bulgularını destekleyen kaynak veriler Ek Dosya 2'de sunulmuştur ve yayınlanan makale ile birlikte erişime açıktır.
Şekil 1miR-21-5p ve inflamatuar faktörlerin ekspresyon profilleri ve bunların ile olan korelasyonu CADM1 klinik KHUK örneklerinde. (A) Normal akciğer dokuları ile KHDAK tümör dokularında miR-21-5p'nin bağıl ekspresyonu. (B) miR-21-5p ekspresyon düzeyine göre tabakalandırılmış KHDAK hastalarının Kaplan-Meier genel sağkalım eğrileri. (C) İnflamatuar faktörlerin göreli mRNA ekspresyonu CRP, TNF-αve IL-6 normal ve KHNSK dokularında. (D) miR-21-5p ile [...] arasındaki negatif doğrusal korelasyonu gösteren Pearson korelasyon saçılım grafiği CADM1 mRNA ekspresyonu. **P < 0,01, ***P < 0.01. Panel için CCRP, TNF-α ve IL-6 için eşleştirilmiş tümör dokuları ile komşu normal dokular arasında sırasıyla istatistiksel karşılaştırmalar yapılmıştır; **P < 0,01, ***P < 0,01 eşleşmiş normal akciğer dokularına kıyasla anlamlı farkları belirtmektedir. Tüm paneller ≥3 bağımsız biyolojik replika içermektedir; qRT-PCR verileri ortalama ± standart sapmayı göstermektedir; eşleştirilmiş tGruplar arası karşılaştırma için -testi uygulanmış; saçılım grafiği korelasyon analizi için Pearson testi kullanılmıştır. Kısaltmalar: CADM1 CAM-1 = hücre adezyon molekülü 1; CI = güven aralığı; CRP = C-reaktif protein; IL-6 = interlökin-6; NSCLC = küçük hücreli dışı akciğer kanseri; TNF-α = tümör nekroz faktörü alfa. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2Hücresel fenotipler ve CADM1 A549 ve H129 KHAK hücrelerinde miR-21-5p tarafından düzenlenen ekspresyon. (A) Mimik transfeksiyonu sonrası miR-21-5p ekspresyonunun qRT-PCR ile tespiti. (B) Transwell deneylerinden elde edilen göreceli hücre göçünün istatistiksel nicelleştirilmesi. (C) Mikroskobik alan başına göç eden hücre sayısının kantifikasyonu. (D) mRNA'nın göreceli ekspresyonu CRP, TNF-αve IL-6 miR-21-5p aşırı ekspresyonu veya inhibisyonu altında. (E) Göreli CADM1 A549 kurtarma gruplarında mRNA ekspresyonu (NC, miR-21-5p mimik, LV-CADM1, mimic+LV-CADM1). (FBağıl CADM1 H1299 kurtarma gruplarında mRNA ekspresyonu. **P < 0,01, ***P < 0.01. Tüm hücresel analizler, her biri için üç teknik tekrar içeren üç bağımsız biyolojik replikat ile tekrarlanmıştır; hata çubukları ortalama ± SD'yi temsil etmektedir; gruplar arası karşılaştırmalarda Bonferroni düzeltmeli tek yönlü ANOVA uygulanmıştır; grup etiketleri, Yöntemler bölümünde açıklanan transfeksiyon gruplarıyla birebir örtüşmektedir. Kısaltmalar: CADM1 CAM-1 = hücre adhezyon molekülü 1; CRP = C-reaktif protein; IL-6 = interlökin-6; LV = lentiviral vektör; NC = negatif kontrol; NSCLC = küçük hücreli dışı akciğer kanseri; qRT-PCR = kantitatif ters transkripsiyon PCR; TNF-α = tümör nekroz faktör alfa. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3miR-21-5p aşırı ekspresyonu veya nakavt sonrası hücre canlılığını yansıtan CCK-8 proliferasyon eğrileri. (A) mimic-NC, miR-21-5p mimic, inhibitor-NC veya miR-21-5p inhibitörü ile transfekte edilmiş A549 hücrelerinin zamana bağlı OD₄₅₀ absorbans eğrileri. (B) Dört transfeksiyon grubundaki H129 hücrelerinin zamana bağlı OD₄₅₀ absorbans eğrileri. ***P < 0.01. CCK-8 analizleri, 3 biyolojik tekrar boyunca grup başına altı teknik replika içermiştir; veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur; zaman noktası karşılaştırmaları için tekrarlı ölçümler ANOVA kullanılmıştır. Kısaltmalar: CCK-8 = Hücre Sayım Kiti-8; NC = negatif kontrol; OD = optik yoğunluk. Lütfen bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayın.
Şekil 4miR-21-5p hedef geni için biyoinformatik tarama ve çift lüsiferaz analizi CADM1. (A) miRWalk, StarBase ve TargetScan tahmin veri tabanları tarafından belirlenen miR-21-5p'nin ortak hedef genlerini gösteren Venn diyagramı. (B) Kesişen hedef genler için GO fonksiyonel zenginleştirme analizinin kabarcık grafiği. (C) En çok zenginleşen KEGG sinyal yolaklarının sütun grafiği. (D) Vahşi tip ve mutantın çift lüsiferaz raporlayıcı aktivitesi CADM1 miR-21-5p aşırı ekspresyonu sonrası 3'-UTR. **P < 0,01; ns, anlamlı değil. Panel D yalnızca WT- tipini benimserCADM1 3'-UTR ve MUT-CADM1 Çift lüsiferaz tespiti için miR-21-5p mimic/mimic-NC ile birlikte ko-transfekte edilen 3'-UTR; ham çizim taslaklarında gösterilen Kontrol/aşırı ekspresyon/interferans etiketleri, final şekillerinde standart WT/MUT gruplandırmasına göre düzenlenmiştir. Hedef tahmin analizi için üç çevrimiçi veri tabanı kullanılmıştır; zenginleştirme P değerleri Benjamini-Hochberg FDR düzeltmesi ile ayarlanmıştır; çift lüsiferaz deneyleri üç biyolojik tekrardan (her biri için üç teknik tekrar) oluşmuştur; hata çubukları ortalama ± SD değerini temsil etmektedir; iki grup Lütfen çevrilecek metni sağlayın.-istatistiksel karşılaştırma için test. Kısaltmalar: CADM1 = hücre adhezyon molekülü 1; GO = Gen Ontolojisi; KEGG = Kyoto Gen ve Genom Ansiklopedisi; MUT = mutant; NC = negatif kontrol; ns = anlamlı değil; UTR = çevrilmeyen bölge; WT = yabanıl tip. Lütfen bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayın.
Şekil 5miR-21-5p/ aksını doğrulayan fonksiyonel kurtarma deneyleriCADM1 A549 ve H129 hücrelerindeki düzenleyici eksen. (A) Mimik veya inhibitör transfeksiyonu sonrası bağıl miR-21-5p ekspresyonu. (B) ...'nın göreceli mRNA ekspresyonu CRP, TNF-αve IL-6 LV- içerisindeCADM1 ve si-CADM1 gruplar. (C) ... altında göreceli migrasyon yeteneğinin istatistiksel kantifikasyonu CADM1 aşırı ekspresyon. (D) LV- mikroskobik alan başına migrasyon gösteren hücre sayısının kantifikasyonuCADM1 gruplar. (E) A549 kurtarma gruplarının (LV-NC, LV-21, LV- CCK-8 OD₄₅₀ değerleriCADM1, LV-21+LV-CADM1, si-NC, si-CADM1, si-CADM1+miR-21 inhibitörü). (F) Aynı transfeksiyon işlemlerine tabi tutulan H129 kurtarma gruplarının CCK-8 OD₄₅₀ değerleri. **P < 0,01, ***P < 0.01. Tüm kurtarma deneyleri üç bağımsız biyolojik replika içermiştir; hata çubukları ortalama ± SD'yi göstermektedir, çoklu grup karşılaştırmaları için Bonferroni post-hoc testi ile tek yönlü ANOVA uygulanmıştır. Kısaltmalar: CADM1 CAM-1 = hücre adezyon molekülü 1; CRP = C-reaktif protein; IL-6 = interlökin-6; LV = lentiviral vektör; NC = negatif kontrol; OD = optik yoğunluk; qRT-PCR = kantitatif ters transkripsiyon PCR; si = küçük interferans RNA; TNF-α = tümör nekroz faktörü alfa. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| miR-21-5p ekspresyonu | Toplam | x2 | P değeri | |||
| Düşük | Yüksek | |||||
| Yaş (yıl) | ≤60 | 24 | 29 | 53 | 1.357 | 0.24 |
| ˃60 | 37 | 67 | 104 | |||
| Toplam | 61 | 96 | 157 | |||
| Cinsiyet | Erkek | 42 | 73 | 15 | 1.06 | 0.3032 |
| Kadın | 19 | 23 | 42 | |||
| Toplam | 61 | 96 | 157 | |||
| Histolojik tip | Skuamöz hücreli karsinom | 31 | 41 | 72 | 1.09 | 0.2965 |
| Adenokarsinom | 30 | 5 | 85 | |||
| Toplam | 61 | 96 | 157 | |||
| Tümör derecesi | Ⅰ-Ⅱ | 5 | 58 | 13 | 16.25 | 0.06 |
| Ⅲ | 6 | 38 | 4 | |||
| Toplam | 61 | 96 | 157 | |||
| Lenf nodu metastazı | Negatif | 41 | 37 | 78 | 12.17 | 0.049 |
| Pozitif | 20 | 59 | 79 | |||
| Toplam | 61 | 96 | 157 | |||
| Tümör boyutu (cm) | ≤3 | 20 | 23 | 43 | 5.623 | 0.0601 |
| 3-7 | 40 | 62 | 102 | |||
| ˃7 | 1 | 1 | 12 | |||
| Toplam | 61 | 96 | 157 | |||
| T evresi | T1 | 15 | 17 | 32 | 4.295 | 0.17 |
| T2 | 36 | 52 | 8 | |||
| T3 | 10 | 27 | 37 | |||
| Toplam | 61 | 96 | 157 | |||
Tablo 1: Küçük hücreli dışı akciğer kanseri olan hastalarda miR-21-5p ekspresyonu ile klinikopatolojik özellikler arasındaki ilişki.Değerler hasta sayılarını temsil etmektedir. İlişkiler χ2 testi ile değerlendirilmiştir. Kısaltma: NSCLC = küçük hücreli dışı akciğer kanseri. Her bir χ2 testi kategorik klinikopatolojik değişkenler için gerçekleştirilmiş olup, tüm analizlerde 157 hasta örneğinin tamamı kullanılmıştır.
| n | P değeri | Bağıl risk | %95 güven aralığı | |||
| Alt | Üst | |||||
| Yaş (yıl) | ≤60 | 53 | 0.503 | 1.282 | 0.62 | 2.652 |
| ˃60 | 104 | |||||
| Cinsiyet | Erkek | 115 | 0.39 | 1.418 | 0.693 | 2.901 |
| Kadın | 42 | |||||
| Histolojik tip | Skuamöz hücreli karsinom | 72 | 0.515 | 1.261 | 0.627 | 2.537 |
| Adenokarsinom | 85 | |||||
| miR-21-5p ekspresyonu | Yüksek | 96 | 0.005 | 3.06 | 1.412 | 6.659 |
| Düşük | 61 | |||||
| Lenf nodu metastazı | Negatif | 78 | 0.02 | 2.295 | 3.039 | 163.58 |
| Pozitif | 79 | |||||
Tablo 2: Küçük hücreli dışı akciğer kanserli hastalarda genel sağkalımın çok değişkenli Cox orantılı riskler analizi. Değerler, %95 güven aralıklarıyla birlikte risk oranlarıdır. Kısaltmalar: CI = güven aralığı; NSCLC = küçük hücreli dışı akciğer kanseri. Çok değişkenli Cox regresyonu, eksiksiz klinik kohort verileri üzerinde gerçekleştirilmiş; bağımsız prognostik tarama için HR ve %95 CI hesaplanmıştır.
Ek Dosya 1: Transfeksiyon ve kantitatif ters transkripsiyon PCR için kullanılan oligonükleotid ve primer dizileri. Dosyada miR-21-5p mimik ve inhibitörü, bunların ilgili negatif kontrolleri ile CADM1, GAPDH, hsa-miR-21-5p ve cel-miR-39 primerleri listelenmektedir. Tüm diziler 5′–3′ yönünde sunulmuştur. Kısaltmalar: CADM1 = hücre adhezyon molekülü 1; cel = Caenorhabditis elegans; GAPDH = gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz; hsa = Homo sapiens; miR = mikroRNA; PCR = polimeraz zincir reaksiyonu. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 2. Şekilleri destekleyen kaynak veriler. Bu dosya; klinik özellikler, ekspresyon analizleri, sağkalım verileri ve ilgili istatistiksel sonuçlar dahil olmak üzere, makalede sunulan şekillerin oluşturulmasında kullanılan temel veri setlerini ve istatistiksel analizleri içermektedir. Bu kaynak veriler, ana metinde raporlanan bulguları desteklemektedir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tartışma
Bu çalışma, NSCLC klinik dokularında artmış miR-21-5p ekspresyonunu sistematik olarak doğrulamış ve bunun artmış inflamatuar faktör transkripsiyonu, daha güçlü hücre migrasyonu ve proliferasyon kapasitesi ile ilişkili olduğunu göstermiştir; çift lüsiferaz, qRT-PCR ve kurtarma deneyleri CADM1'i doğrudan fonksiyonel hedefi olarak tanımlarken, biyoinformatik öngörüler miR-21-5p alt hedeflerinin MAPK ve Ras onkojenik kaskadlarında zenginleştiğini belirterek miR-21-5p/CADM1 aksının tümörün malign progresyonu ile ilgili sinyal yolaklarında yer alabileceğine dair ön kanıtlar sağlamıştır.
Klinik kohort analizi, yüksek miR-21-5p ekspresyonunun ileri tümör evresi, lenf nodu metastazı ve daha kısa genel sağkalım ile yakından ilişkili olduğunu ortaya koymuştur. Çok değişkenli Cox regresyonu, miR-21-5p'nin bağımsız bir olumsuz prognostik faktör olduğunu doğrulamış ve miR-21-5p'nin, NSCLC hastalarının progresyon riskini ve sağkalım sonucunu değerlendirmek için potansiyel bir biyobelirteç olarak hizmet edebileceğini göstermiştir.
In vitro fonksiyonel analizler, miR-21-5p aşırı ekspresyonunun NSCLC hücre proliferasyonunu, migrasyonunu ve inflamatuar yanıtını kolaylaştırdığını, buna karşın CADM1 upregülasyon tüm bu onkojenik fenotipleri tersine çevirmiştir; miR-21-5p ile ... arasında negatif ekspresyon korelasyonu CADM1 hasta örneklerinde, kurtarma hücresel verileriyle birlikte, miR-21-5p'nin doğrudan inhibisyon yoluyla KHSEA malign davranışlarını nasıl yönlendirdiğine dair düzenleyici mekanizmayı tamamen aydınlatmıştır CADM1.
Akciğer karsinomunda miR-21-5p'nin onkojenik rolunu bildiren önceki çalışmalarla uyumlu olarak, bu çalışma, tümör teşvik edici işlevini pekiştirmek için eksiksiz klinik korelasyon verileri ve tam kurtarma doğrulaması sağlamaktadır; yalnızca tek bir metastaz fenotipine odaklanan mevcut araştırmalardan farklı olarak, bu çalışma miR-21-5p'yi CADM1 hedefi aracılığıyla hücre proliferasyonu ve tümör inflamatuar mikroçevresi ile eş zamanlı olarak ilişkilendirerek, NSCLC'de miR-21-5p'nin düzenleyici ağını genişletmektedir.
Yukarıdaki ön kanıtlara dayanarak, doku miR-21-5p ekspresyonunun tespitinin NSCLC risk sınıflandırması ve prognostik değerlendirme için potansiyel yardımcı değeri vardır ve klinik terapötik etkinliği henüz doğrulanmamış olsa da miR-21-5p/CADM1 aksı, NSCLC için ilerleme karşıtı müdahale stratejileri geliştirmek üzere yeni aday moleküler hedefler sağlayabilir.
Bu çalışmanın çeşitli kısıtlılıkları bulunmaktadır. Çalışmada, in vivo ksenogreft veya bağımsız harici kohort doğrulaması olmaksızın, in vitro hücre analizleri ve tek bir retrospektif klinik kohort kullanılmıştır. Ek proliferasyon analizleri (örneğin, EdU ve koloni oluşturma analizleri), invazyon, apoptoz ve hücre döngüsü analizleri gerçekleştirilmemiştir. Noninvaziv tanısal potansiyel için periferik kan testleri, CADM1 protein düzeyi doğrulaması, tam örtüşen hedef gen listesi ve sistematik protein-protein etkileşim (PPI) ağı analizi de mevcut değildir. Gelecek çalışmalar bu kısıtlılıkları gidermeli ve miR-21-5p'nin yukarı akış düzenleyicilerini ve aşağı akış CADM1 sinyal iletimini daha ayrıntılı olarak incelemelidir.
Kolektif olarak bu çalışma, miR-21-5p'nin CADM1'i doğrudan hedefleyerek NSCLC proliferasyonunu, migrasyonunu ve inflamasyonunu hızlandıran onkojenik bir mikroRNA olarak hareket ettiğine dair ön kanıtlar sunmakta ve yüksek ekspresyonu hastaların elverişsiz sağkalım oranlarını öngörmektedir.
Açıklamalar
Yazarların açıklanacak herhangi bir finansal veya finansal olmayan çıkar çatışması yoktur.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| %10 Nötr Tamponlu Formalin | Fisher Scientific (Fisherbrand)™) | SF100-4 (tipik) | Doku fissatifi; şu kalınlıkta dilimlenmiş dokular &<5 mm kalınlık, oda sıcaklığında 14-26 saat boyunca fikse edilmiş |
| 24 Kuyucuklu Hücre Kültür Plakası | Corning | 3526 | Transfekte edilmiş hücrelerin ekimi ve yara iyileşme (çizme) analizinin gerçekleştirilmesi için kullanılan plaka |
| A549 Hücre Hattı | ATCC (veya Şanghay Kaynak Merkezi) | CCL-185 | İnsan küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) hücre hattı (adenokarsinom) |
| CCK-8 analiz kiti | Dojindo | CK04 | Proliferasyon tespiti |
| Hücre Kültür Besiyeri (belirtilmemiş) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | Çeşitli (örn. RPMI-1640: 11875093, F-12K: 21127022) | NSCLC hücre hatları için bazal besiyeri; kesin kompozisyon kullanılan hücre hattına göre değişir |
| cel-miR-39 (Eksojen Spike-in Kontrolü) | GenePharma (Şanghay, Çin) | Özel (örneğin, B010302) | RNA izolasyonu sırasında eklenen, miRNA ekspresyon normalizasyonu için harici referans |
| CO2 İnkübatör (Nemlendirilmiş) | Thermo Fisher Scientific (Heracell) | Heracell 150i (50116047) | Sağlar 37°C, %5 CO22ve hücre kültürü için doygun nem |
| CRP/TNF-α/IL-6 primer çiftleri | Sangon Biotech | özel sentez | Tam diziler Ek Dosya 1'de yer almaktadır |
| Kristal viyole boyama çözeltisi | Solarbio | G1062 | Göç etmiş hücre boyaması |
| DMEM besiyeri | Gibco | 11965092 | H1299/293T kültürü için |
| Çift lüsiferaz raporlayıcı analiz kiti | Promega | E1910 | WT/MUT CADM1 3'UTR tespiti |
| Ekzojen cel-miR-39 | Qiagen | özel spike-in | Normalizasyon için RNA izolasyonu sonrası eklenenler |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 10437028 | Hücre büyümesini desteklemek için kültür ortamına %10 nihai konsantrasyonda eklenen takviye |
| Hassas Pipet Ucu (örneğin, 10 µL ipucu) | Axygen (Corning) | T-300 | Bir hücre tek tabakasını manuel olarak kazıyıp oluşturmak için kullanılır "yara" boşluk |
| GAPDH (Endojen Kontrol) | Çok sayıda tedarikçi (örneğin, Sangon Biotech, RiboBio; özel primerler) | Özel | qRT-PCR'de kullanılan mRNA normalizasyon referans geni |
| GO/KEGG (clusterProfiler anotasyonu) | Bioconductor | 2026 yapımı | |
| GraphPad Prism | GraphPad Yazılımı | v9.5.1 | Grafik Çizimi & in vitro istatistikler |
| H1299 Hücre Hattı | ATCC (veya Şanghay Kaynak Merkezi) | CRL-5803 | Lenf nodu metastazından türetilmiş insan küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) hücre hattı |
| Isıl işlemle inaktive edilmiş FBS | Gibco | 10099141 | %10 çalışma konsantrasyonu |
| HEK-293T hücre hattı | ATCC | CRL-3216 | RRID:CVCL_0063; aylık STR testi yapılmış, mikoplazma tespiti negatif |
| Lentivirüs Paketleme Karışımı | Genecopoeia (veya Takara Bio) | HPK-LvT-100 (Genecopoeia) | Lentivirüs üretimi için paketleme plazmidleri (gag/pol, rev, vsv-g) sağlar |
| Lentivirus-21 Vektörü (LV-21) | GeneChem (Şanghay, Çin) veya Genecopoeia | Özel | Stabil ekspresyonlu hücre hatlarının oluşturulması için miR-21-5p içeren lentiviral vektör |
| Lentivirüs-NC Vektörü (LV-NC) | GeneChem (Şangay, Çin) veya Genecopoeia | Özel | miR-21-5p eklemesi içermeyen negatif kontrol lentiviral vektör |
| Lipid transfeksiyon reaktifi | Thermo Fisher | L3000015 | Geçici transfeksiyon için |
| Lipofectamine 3000 Transfeksiyon Reaktifi | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | L3000015 veya L3000008 | Lipid tabanlı transfeksiyona ayıracı; sonraki deneyler için transfeksiyondan 50 saat sonrası |
| Metanol | Sinopharm | 67-56-1 | Hücre fiksasyonu |
| Metanol (Fiksatif/Boyama Seyreltici) | Sigma-Aldrich | 34860 | Kristal viyole boyamasında fiksatif veya dilüent olarak kullanılır |
| miR-21-5p inhibitörü/inhibitör-NC | GenePharma | özel sentez | Ek Dosya 1'deki Diziler |
| miR-21-5p mimetiği/mimetik-NC | GenePharma | özel sentez | Ek Dosya 1'deki Diziler |
| miRDB | Washington Üniversitesi | v6.0 | |
| miRWalk | Heidelberg Üniversitesi | v3.0 | |
| Ulusal Biyopsi Mühendisliği Merkezi | Ulusal Biyopsi Mühendisliği Merkezi (Çin) | Lütfen çevirmek istediğiniz metni sağlayın. | Kayıtlı klinik verilere ve histopatolojik tanıya sahip akciğer kanseri doku örneği sağlayan kurumsal sağlayıcı |
| NSCLC Dokusu (primer kültür için) | Shanghai Rui Bao He Biotechnology Co. | Özel sipariş | Doku kaynağı; %10 FBS içeren ortamda kültürlenmiştir 37°Clogaritmik büyüme evresinde olan ve morfolojisi uygun olan hücreler transfeksiyon için seçilir |
| PCR Cihazı | Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific) | 7500 Fast (4406984) | qRT-PCR için amplifikasyon ürünlerini elde edin |
| Penisilin-Streptomisin | Solarbio | P1400 | 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin |
| Pipetler (Tek Kanallı & Çok kanallı) | Eppendorf | Research Plus serisi | Tüm deneyler boyunca hassas sıvı aktarımı için |
| Polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | Final 5 μg/mL lentivirüs enfeksiyonu için |
| Puromisin | InvivoGen | ant-pr-1 | 5 μg/mL stabil hücre taraması için |
| Puromisin Dihidroklorür | Thermo Fisher Scientific (InvivoGen) | ant-pr-1 (InvivoGen); P7255 (Sigma-Aldrich) | Seçilim antibiyotiği, şu konsantrasyonda kullanılmıştır: 5 μg/mL stabil transfekte edilmiş hücre hatları oluşturmak için |
| R | R Foundation | v4.2.1 | Paketler: clusterProfiler, ggplot2 |
| Ters transkripsiyon kiti | Takara | RR047 | miRNA için stem-loop RT, mRNA için oligo(dT) |
| RNazden Arındırılmış EP Tüpleri | Axygen (Corning) | MCT-150-C | RNA saklama ve işleme için 1,5 mL RNazden arındırılmış tüpler |
| RPMI-1640 besiyeri | Gibco | 11875093 | A549 kültürü için |
| si-CADM1 | GenePharma | özel sentez | Ek Dosya 1'deki Diziler |
| si-NC | GenePharma | özel sentez | Ek Dosya 1'deki Diziler |
| SPSS | IBM | v26.0 | Klinik/Cox regresyon analizi |
| SYBR Green qPCR Master Mix | Roche | 4913914001 | qRT-PCR amplifikasyonu |
| TargetScan | MIT | v8.2 | |
| Toplam RNA ekstraksiyon reaktifi | Takara | 9109 | Fenol/guanidin bazlı lizis |
| Trans-well Odacığı | Corning (Costar) | 3422 (24 kuyucuklu, 8.0 µm) | Oda sıcaklığındaki besiyerinde hücre transfeksiyonu için; kimyasal primerler eklendi ve 48 saat inkübe edildi |
| Transwell migrasyon odacıkları | Corning | 3422 | 8 μm gözenek boyutu |
| TRIzol Reaktifi | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | 15596026 | Doku örneklerinden toplam RNA ekstraksiyonu; RNA kalitesinin OD260/280 ve OD260/230 oranları ile değerlendirilmesi |
| Trypsin-EDTA (%0,25) | Gibco (Thermo Fisher Scientific) | 25200072 | Hücrelerin 24 kuyucuklu plakalara ekimi öncesinde kültür kaplarından ayrılması için |
Kaynaklar
- Bautista-Sánchez D, et al. The promising role of miR-21 as a cancer biomarker and its importance in RNA-based therapeutics. Mol Ther Nucleic Acids. 2020;20:409-20.
- Zhou J, et al. Global burden of lung cancer in 2022 and projections to 2050: incidence and mortality estimates from GLOBOCAN. Cancer Epidemiol. 2024;93:102693.
- Nicholson AG, et al. The 2021 WHO classification of lung tumors: impact of advances since 2015. J Thorac Oncol. 2022;17(3):362-87.
- The Lancet Regional Health – Europe. NSCLC: bridging the gap between clinical progress and real-world application. Lancet Reg Health Eur. 2024;38:100878.
- Reyes J, et al. Oncogenic and tumor-suppressive forces converge on a progenitor niche at the benign-to-malignant transition. Cell. 2026;189(10):2875-97.e53.
- Yu L, Yang R, Long Z, Tao Q, Liu B. Targeted therapy of non-small cell lung cancer: mechanisms and clinical trials. Front Oncol. 2024;14:1451230.
- O'Brien J, Hayder H, Zayed Y, Peng C. Overview of microRNA biogenesis, mechanisms of actions, and circulation. Front Endocrinol (Lausanne). 2018;9:402.
- Treiber T, Treiber N, Meister G. Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 2019;20(1):5-20.
- Ohno S, Kuroda M. Exosome-mediated targeted delivery of miRNAs. Methods Mol Biol. 2016;1448:261-70.
- Ell B, Kang Y. MicroRNAs as regulators of bone homeostasis and bone metastasis. Bonekey Rep. 2014;3:549.
- Dedeoğlu BG. High-throughput approaches for microRNA expression analysis. Methods Mol Biol. 2014;1107:91-103.
- Qu K, et al. Circulating miRNA-21-5p as a diagnostic biomarker for pancreatic cancer: evidence from comprehensive miRNA expression profiling analysis and clinical validation. Sci Rep. 2017;7(1):1692.
- Xu H, et al. Engineered exosomes transporting the lncRNA, SVIL-AS1, inhibit the progression of lung cancer via targeting miR-21-5p. Am J Cancer Res. 2024;14(7):3335-47.
- Chawra HS, et al. MicroRNA-21's role in PTEN suppression and PI3K/AKT activation: implications for cancer biology. Pathol Res Pract. 2024;254:155091.
- Huang Y, Feng G. MiR-423-5p aggravates lung adenocarcinoma via targeting CADM1. Thorac Cancer. 2021;12(2):210-7.
- Hartsough EJ, et al. CADM1 is a TWIST1-regulated suppressor of invasion and survival. Cell Death Dis. 2019;10(4):281.
- Li H, Gao J, Zhang S. Functional and clinical characteristics of cell adhesion molecule CADM1 in cancer. Front Cell Dev Biol. 2021;9:714298.