Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bir Nöroblastoma Zebrafish Modeli Kullanılarak Tümör Mikroçevresindeki İmmün Hücrelerin Görüntülenmesi ve Kantifikasyonu

141 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/72028

⸱

18 Eylül 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Departments of Pharmacology and Medicine, Section of Hematology and Medical Oncology, The Cancer Research Center, Boston University School of Medicine, 2Tulane University School of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol; bileşik transgenik zebra balıkları oluşturma, larva ve yetişkin zebra balıklarında tümörlerle ilişkili bağışıklık hücrelerini görüntüleme ve tümör mikroçevresindeki bağışıklık hücresi sıklığını nicelendirme yöntemlerini açıklamaktadır.

Özet

İmmün hücrelerin tümör mikroçevresine (TME) katılımı, immün regülasyonun ve tümör progresyonunun önemli bir bileşenidir. İn vivo ortamda immün hücreler ve tümör hücreleri arasındaki mekansal ve zamansal ilişkilerin incelenmesi, TME içindeki etkileşimlere dair içgörü sağlayabilir. Ancak, bu etkileşimlerin sağlam organizmalarda görselleştirilmesi ve nicelendirilmesi, geleneksel görüntüleme ve histolojik yaklaşımlarla hala zorlayıcıdır. Zebrafishler; genetik olarak kolay yönetilebilmeleri, hızlı gelişimleri ve erken gelişim evrelerindeki optik şeffaflıkları sayesinde, floresan işaretli hücrelerin in vivo görselleştirilmesine olanak tanıyarak kanser araştırmaları için değerli bir model sunarlar. Burada, bir nöroblastoma zebrafish modelinde floresan markerlar ile farklı şekilde işaretlenmiş immün ve tümör hücrelerini üretmek, tanımlamak, görüntülemek ve nicelendirmek için bir protokol sunuyoruz. Protokol; bileşik transgenik zebrafishlerin üretimi ve taranmasını, larvaların canlı görüntülemesini, yetişkin tümör taşıyıcısı balıkların hazırlanması ve görüntülenmesini ve tümör bölgelerinin çevresindeki ve içindeki immün hücrelerin nicelendirilmesini içermektedir. Transgenik reporter hatları kullanılarak, CD4+ immün hücreler ve MYCN tarafından sürüklenen nöroblastoma hücreleri farklı gelişim evrelerinde görselleştirilebilir ve analiz edilebilir. İş akışı, hem larva hem de yetişkin balıklarda immün hücre lokalizasyonunun tümörlere göre değerlendirilmesine olanak tanır ve hastalık evreleri boyunca immün hücre bolluğunu karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu protokol, zebrafishler kullanılarak TME içindeki immün hücrelerin in vivo görüntülenmesi ve nicelendirilmesi için tekrarlanabilir bir yaklaşım sağlar ve diğer kanser modellerindeki immün-tümör etkileşimleri çalışmalarını kolaylaştırabilir.

Giriş

Tümör mikroçevresi (TME); tümör, immün, fibroblast ve vasküler hücrelerden oluşan bir ekosistemdir1. TME, kanser progresyonunda, terapötik yanıtta ve anti-tümör immünitede temel bir rol oynar. TME içerisinde immün hücreler, ya anti-tümör yanıtlara katılarak ya da immünsüpresyonu tetikleyerek tümörün kaderini belirleyen ana düzenleyicilerdir2. TME içindeki immün hücrelerin genişlemesini, dağılımını ve fonksiyonunu anlamak, tümörlerin immün gözetimden kaçma mekanizmalarını aydınlatmak için kritiktir. Ancak, uç nokta histolojisi, akış sitometrisi ve tek hücre sekanslama gibi TME'yi incelemeye yönelik geleneksel yaklaşımlar yalnızca statik anlık görüntüler sağlar ve genellikle doku yapısının bozulmasını gerektirir; bu da mekansal bilgilerin ve hücre-hücre etkileşimlerinin kaybıyla sonuçlanır3,4,5,6,7. Ayrıca bu yöntemler, özellikle tümör gelişiminin erken evrelerinde, TME içindeki immün hücreleri görselleştirme ve nicelleştirme kapasitesi bakımından sınırlıdır.

Zebrafishlar (Danio rerio), düşük maliyetleri, hızlı gelişimleri, nispeten şeffaf olmaları ve yüksek genetik korunumları nedeniyle kanser araştırmaları için güçlü bir modeldir8,9. Bu avantajlar, kısa bir zaman dilimi içinde geniş örneklem boyutlarına ve verimli mikroskopi taramalarına olanak tanıyan, tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir bir deneysel sistem sağlar10. Önemli bir nokta olarak, zebrafishlar hem doğuştan gelen hem de adaptif bağışıklık sistemlerinin temel bileşenleri dahil olmak üzere insanlarla önemli immünolojik benzerlikler paylaşmakta, bu da elde edilen bulguları insan hastalıkları için anlamlı kılmaktadır1. Bu özellikler, özellikle nöroblastoma gibi pediatrik kanserlerin incelenmesinde faydalıdır8. Sonuç olarak, çok sayıda zebrafish immün-raportör hattı ve kanser modeli geliştirilmiştir1. Bu nedenle zebrafishlar, tümör ve immün hücreler arasındaki etkileşimleri incelemek için değerli bir in vivo model teşkil ederek, immün regülasyonun tümör gelişimini, özellikle erken aşamalarda nasıl şekillendirdiğine dair içgörü sunar.

Zebrafish'lerde TME'yi inceleyen önceki çalışmalar, tümörler içindeki immün hücre lokalizasyonunu değerlendirmek için büyük ölçüde uç nokta görüntüleme ile birleştirilmiş tümör ksenogreft modellerine dayanmıştır12,13,14,15,16,17. Bu yöntemler faydalı bilgiler sağlasa da, TME'nin üç boyutlu organizasyonunu ve gelişim sırasında tümör ile immün hücreler arasındaki mekansal ilişkileri tam olarak yakalayamayan iki boyutlu görüntülemeye olan bağımlılıkları nedeniyle sınırlıdırlar14. Ek olarak, tümör ksenogreft modelleri insan tümör hücrelerinin yapay transplantasyonunu içerir ve doğal tümör başlangıcını tam olarak taklit etmeyebilir18. Bu modeller ayrıca tipik olarak kısa sürelidir ve tümör progresyonunu veya gelişim sırasında tümör ile immün hücreler arasındaki mekansal ilişkideki değişiklikleri tam olarak yakalayamazlar14,19. Dahası, bu yaklaşım TME içindeki immün hücre davranışının mekansal organizasyonunun, gelişimsel bağlamının ve fizyolojik uygunluğunun sınırlı bir temsilini sunar. Yakın zamanda, biz ve diğer araştırmacılar, tümörlerle ilişkili immün hücreleri görselleştirmek için tümör ve immün hücrelerin farklı floresan markerlarla işaretlendiği bileşik transgenik zebrafish'leri uyguladık20,21. Bu bileşik transgenik balıklar, hayvan ve tümör gelişimi boyunca TME'nin incelenmesine olanak tanıyarak in vivo immün-tümör etkileşimlerinin araştırılmasını kolaylaştırır.

Burada, bir zebra balığı nöroblastoma modelinin TME'si içindeki bağışıklık hücrelerini incelemek için konfokal mikroskopi kullanan bir yöntem sunuyoruz. Bu yaklaşımda, bağışıklık hücrelerini işaretleyen zebra balığı raporlayıcı hatları ve dopamin-β-hidroksilaz promotörü (dβh) altında insan MYCN onkogenini aşırı ifade ederek insan hastalığına benzeyen bir nöroblastoma gelişimi sağlayan genetik olarak mühendislik ürünü bir zebra balığı hattı kullandık20. Bu bileşik transgenik zebra balığı modelinde, tümör ve bağışıklık hücreleri sırasıyla EGFP ve mCherry ile farklı şekilde işaretlenmiştir. dβh promotörü sempatoadrenal soy hücrelerinde aktiftir ve birden fazla zebra balığı nöroblastoma modelinde kullanılmıştır2,23,24,25. Ayrıca, CD4+ hücrelerini görselleştirmek için mCherry floresansını yönlendiren bir Cd4 promotörü kullandık15. Tümör gelişiminin farklı aşamalarında TME'yi üç boyutta görselleştirmek için Z-stack kazanımlı konfokal görüntüleme uygulanmış, bu da sağlam doku içindeki tümör ve bağışıklık hücreleri arasındaki mekansal ilişkilerin değerlendirilmesine olanak sağlamıştır. Bu yöntem, tümör gelişiminin farklı aşamalarında bağışıklık hücrelerinin tümör hücrelerine göre organizasyonunun analiz edilmesini sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Boston Üniversitesi Chobanian & Avedisian Tıp Fakültesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından PROTO202100001 protokolü kapsamında onaylanmıştır. Bileşik transgenik zebra balığı üretimi, larva görüntülemesi, yetişkin doku hazırlama ve görüntü analizi için genel iş akışı Şekil 1'de özetlenmiştir.

figure-protocol-1
Şekil 1. Zebra balığı tümör mikroçevresi (TME) içindeki immün hücrelerin görselleştirilmesi ve nicelleştirilmesi için iş akışı. Deneysel iş akışının şematik genel görünümü. Immün-izleyici zebra balıkları, hem immün hücrelerde (kırmızı) hem de tümör hücrelerinde (yeşil) floresan işaretleyicileri ifade eden bileşik transgenik yavrular üretmek amacıyla tümöre yatkın zebra balıklarıyla çaprazlandırıldı. Embriyolar, bileşik transgenik balıkları belirlemek amacıyla floresan mikroskobu kullanılarak tarandı. Seçilen balıklar larval gelişim sırasında (<21 döllenmeden sonraki gün [dpf]) canlı konfokal görüntülemeye tabi tutuldu ya da 21 dpf'ten büyük balıklar için fikse edilip, kriyokesit alındıktan sonra konfokal görüntüleme yapıldı. Bu iş akışı, birden fazla gelişim aşaması boyunca TME ile ilişkili immün hücrelerin görselleştirilmesini ve nicelleştirilmesini mümkün kılar. Resmin bir bölümü BioRender kullanılarak oluşturulmuştur. Lütfen bu şeklin daha büyük halini görmek için buraya tıklayınız.

1. Üretim: Transgenik Zebra Balığı Hatlarının Üretilmesi

  1. Doğal üreme için en az 3 aylık yetişkin immün-geri bildirim veren balıklar ve tümörlü balıklar seçin.
    NOT: Temsili sonuçlar için, Tg(cd4-1:mCherry) heterozigot balıklar, immün hücreleri ve tümör hücrelerini farklı şekilde etiketlemek amacıyla Tg(dβh:MYCN; dβh:EGFP) heterozigot balıklarla çaprazlandı15,23.
  2. Üreme öncesinin akşamında, çiftleşme tankını balık suyuyla iki katman doldurun.
  3. Çiftleşme odasına delikli bir üst ekleyin. Bir erkeği bir veya iki dişiden ayırmak için ayırıcıları kullanın.
  4. Ayırıcıları gece boyu yerinde bırakın. Doğal üreme koşullarını taklit etmek için yapay bitkiler veya diğer zenginleştirme malzemeleri ekleyin.
    NOT: Tümörlü erkek balıkların immün-geri bildirim veren balıklarla üretilmesinde başarılı yumurtlama olasılığını artırmak için erkek/dişi oranı 1:2 olmalıdır. Erkekler arasında rekabet yaşanabileceğinden, iki erkeği bir dişiyle üretmeyin.
  5. Ertesi sabah, tesis ışıkları yandıktan sonra ayırıcıları çıkarın.
  6. Delikli üst odanın bir tarafını ayırıcıyı takoz gibi kullanarak hafifçe eğin ve sığ su alanı oluşturun. Balıkların en az 1 saat boyunca yumurtlamasına izin verin.
  7. İnce gözenekli bir file kullanarak çiftleşme odasının dibinden yumurtaları toplayın.
  8. Yumurtaları, balık suyu içeren steril bir Petri kabına, yoğunluğu en fazla 1 yumurta/50 mm2 olacak şekilde aktarın (yaklaşık 100 mm'lik bir kaba 200 yumurta).
  9. Ölü ve döllenmemiş yumurtaları çıkarın.
    NOT: Sağlıklı döllenmiş yumurtalar saydam ve yuvarlaktır. Bulanık, beyaz, döllenmemiş veya şekil bozukluğuna sahip yumurtaları çıkarın.
  10. Yanlışlıkla cinsiyet karıştırılmasını veya transgenik tanklarda çapraz bulaşmayı önlemek için balıkları tekrar kontrol edin.
  11. Erkek ve dişi balıkları sırasıyla kendi tanklarına geri yerleştirin.
  12. Embriyoları 28,5°C'lik bir inkübatöre gece boyu yerleştirin. 1.8. adımda belirtilen embriyo yoğunluğunu aşmayın.
  13. Ertesi sabah embriyoları kontaminasyonu kaldırmak için dezenfekte edin.
    1. 200 mL sistem suyuna 100 µL çamaşır suyu ekleyerek çalışma çözeltisi hazırlayın. 150–200 mL sistem suyuna 0,5 g sodyum tiosülfat ekleyerek nötralizasyon çözeltisi hazırlayın.
    2. Canlı embriyoları süzgeçli bir kafese ayırın ve kafesi 5 dakika boyunca çamaşır suyu çözeltisine daldırın.
    3. Kafesi doğrudan sodyum tiosülfat çözeltisine aktarın. Artan çamaşır suyunu nötralize etmek için 2 dakika inkübe edin.
    4. Embriyoları taze sistem suyuyla son bir kez durulayın. Embriyoları temiz Petri kaplarına aktarmak için bir sıktırma şişesi kullanın ve içlerine taze sistem suyu ekleyin.
  14. Dezenfeksiyondan sonra embriyoları inkübatöre geri yerleştirin.
  15. 5–7 gün döllenmeden sonra (dpf) veya daha geç dönemde larvaları büyütme amacıyla 5 ppt rotifer suyu içeren daha büyük bir tanka aktarın.
    1. 1 kısım stok rotifer suyu (15 ppt) ile 2 kısım zebra balığı sistem suyunu karıştırarak 5 ppt rotifer suyu hazırlayın.
    2. Larvaları aktarmadan önce, nihai tuzluluğun 5 ppt olduğundan emin olmak için bir iletkenlik ölçer kullanın.
      NOT: 3–5 dpf'de EGFP+ MYCN larvalarını ayırmak, büyütmeden önce tümör yatkınlığı olan balıkların belirlenmesini kolaylaştırır. Bu aşamada MYCN embriyolarını ayırmak, MYCN kaynaklı apoptoz nedeniyle nöral krest hücrelerinde EGFP ekspresyonunun daha sonra azalabilmesi nedeniyle yanlış negatif tanımlamalardan kaçınır.

2. Zebrafish'leri Floresan Markırlar İçin Tarama

  1. Sistem suyu kullanarak %0,4 (ağırlık/hacim) tricaine stok çözeltisi hazırlayın.
  2. Balıkları, altını örtecek kadar sistem suyu bulunan temiz bir petri kabına aktarın.
  3. 14 dpf'ten küçük balıklar için yaklaşık %0,005 (50 mg/L) veya 14 dpf'ten büyük balıklar için %0,012 (120 mg/L) nihai konsantrasyonuna ulaşmak üzere tricaine stok çözeltisi ekleyin. Gönüllü hareketin azalması ya da tamamen olmaması gözlenerek yeterli anestezi düzeyi doğrulansın.
  4. Balıklar anestezi altına alındıktan ve yüzememe durumuna geldikten sonra, solungaç kapağı veya kalp hareketlerinin görünür kalması koşuluyla kabın fazla suyunu uzaklaştırın.
  5. Balıkları floresans açısından tarayın. MYCN balıklarında interrenal bez bölgesi gibi beklenen bölgede yeşil veya kırmızı floresansı belirleyin.
  6. Sert kıllı bir ayırma aracı kullanarak balıkları gruplara ayırın.
    NOT: MYCN ile indüklenen apoptozis ileri gelişim evrelerinde yanlış negatif tanımlamalara yol açabileceğinden, tümör yatkın balıklar erken yaşlarda ayrılmalıdır. İmmün raportör balıklar larval aşamada görüntülemeden hemen önce veya erişkin çalışmalarda 2 ile 4 ay arasındaki yaşlarda ayrılmalıdır. Bu yaklaşım, işleme kaynaklı stresi en aza indirger ve hayatta kalımı en üst düzeye çıkarır.
  7. Pozitif ve negatif balıkları, devam eden yetiştirilme için sistem suyu içeren ayrı tanklara aktarın.
    NOT: 3. adım, 21 dpf'ten küçük larvaların işlenmesini ve görüntülenmesini açıklar. 4–6. adımlar ise daha büyük balıkların fikse edilmesini, doku hazırlanmasını, görüntülenmesini ve görüntü analizini açıklar.

3. Larva Canlı Montajı ve Görüntüleme

  1. Tricaine balık suyu içeren 100 mm'lik bir petri kabına sıralanmış larvaları yerleştirin (yaşa uygun konsantrasyonlar için 2.3. adıma bakın).
  2. Sedatif etkisi altındaki larvaları cam tabanlı bir görüntüleme kabına aktarın.
  3. Larvayı örtecek ve sedasyonun devamını sağlayacak kadar çözelti kullanın.
  4. Balık suyunda %1–1,5 oranında düşük erime noktası agaroz hazırlayın. Agaroz çözeltisini tamamen çözülene kadar ısıtın.
  5. Agarozun 1–2 dakika soğumasını sağlayın. Montajdan önce katılaşmasını önlemek için agarozu ısı bloğu kullanarak 30°C'de tutun.
  6. Her bir larvayı görüntüleme kabında yanal pozisyona yerleştirin.
  7. Larvayı sabitlemek için üzerine yaklaşık 30–200 µL agaroz uygulayın. Daha büyük larvalar için daha büyük hacimler, daha küçük larvalar için daha küçük hacimler kullanın.
  8. Agaroz katılaştıktan sonra üzerine yaklaşık 100 µL %0,005 tricaine çözeltisi ekleyin.
  9. Larvaları konfokal mikroskop kullanarak görüntüleyin.
    1. Rezonant tarayıcıya sahip standart bir lazer taramalı konfokal mikroskop kullanın. Sayısal açıklığı 1,10'dan büyük olan 40× objektif kullanın.
    2. Tüm görüntüleme kanalları için pinhole ayarını 1,0 Airy birimi (AU) olarak belirleyin.
    3. EGFP uyarımı için 488 nm, mCherry uyarımı için 594 nm lazer kullanın. Fotonun parçalanmasını ve fototoksisiteyi en aza indirmek için lazer çıkışını 25 mW'ın altında tutun. Piksel doygunluğundan ve siyah kesilmeden kaçınmak için dedektör kazancını ve lazer gücünü bir aralık göstergesi arama tablosu (LUT) kullanarak ayarlayın. Daha yüksek voltajların aşırı gürültüye neden olmasından dolayı dedektör kazancını 800 V'in üzerine çıkarmayın.
    4. 1024 × 1024 piksel çözünürlükte ve 6,0 µm Z-adım aralığında 0,42 × 0,42 × 6,0 µm (x, y, z) boyutunda bir voxel kullanın. Genellikle toplamda 90–120 µm görüntüleme derinliği kapsayan ilgilenilen tam hacim boyunca sürekli optik kesitler alın. 16 bitlik edinim modunda çalışan yüksek duyarlıklı fotodedektörler kullanın.
    5. Rezonant tarama frekansı 33,3 kHz (yaklaşık 1,58 µs piksel bekleme süresi) olan tek yönlü çizgi taraması kullanarak görüntüleri edinin. Lazer maruziyetini sınırlarken hareket artefaktlarını azaltmak için 2× veya 4× ortalama kullanın.
      NOT: Görüntüleme sırasında larvaların hayatta kalmasını sağlamak için tricaine maruziyetini optimize edin. Görüntülemeden sonra görüntüleme kabını yaklaşık yarısına kadar dolduracak kadar balık suyu ekleyin.
  10. Görüntülemeden hemen sonra görüntüleme kabına taze balık suyu ekleyin.
  11. Sert kıllı bir çubuk kullanarak larvayı agarozdan dikkatlice çıkarın ve larvayı temiz balık suyu içeren bir kaba aktararak iyileşmesini sağlayın.
  12. Normal yüzme davranışları geri döndüğünde balığı orijinal tankına iade edin.
    NOT: 21 gpd'den daha büyük balıklarda, yüksek çözünürlüklü konfokal görüntüleme imkanı sağlamak için tümörü örten derinin kriyoseksiyon ile çıkarılması gerekir.

4. Balık Fikse Edilmesi ve Kriyoseksiyonu

  1. Balıkları onaylanmış kurumsal hayvan bakım yönergelerine uygun olarak öldürün.
  2. Karın boşluğunu ortaya çıkarmak ve fiksatifin iç doku içine nüfuz etmesini kolaylaştırmak için anal delikten pectoral kemere kadar uzanan bir ventral kesim yapın.
  3. Balığı, 4% paraformaldehit (PFA) içeren fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) çözeltisi bulunan 1,5 mL'lik bir tüpe veya doku hacminden en az 10 kat daha fazla hacimde fiksatife pense kullanarak aktarın.
    NOT: Doku bütünlüğünü korumak için tümör içeren bölgeye dokunmaktan kaçının.
  4. Örnekleri nazik sürekli sallamalı (30 dev/dk) bir nüvatör rocker üzerine yerleştirin ve 4°C'de en az 12 saat (gece boyu) inkübe edin.
    DİKKAT: PFA tehlikeli, toksik ve potansiyel olarak karsinojendir. Eldiven ve göz koruyucu gibi uygun kişisel koruyucu ekipmanları giyin. PFA içeren tüm işlemleri bir füme kabini içinde gerçekleştirin ve buharlarının inhalasyonundan kaçının.
  5. PFA'yı uzaklaştırın ve örnekleri 1,5 mL 1× PBS ile en az dört kez yıkayın. Her yıkamada tüpü nazikçe iki ila üç kez ters çevirin.
  6. Balığı PBS'de hazırlanmış %30'luk sakkaroz çözeltisine aktarın.
  7. Örneğin dik bir tüpün dibine battığına işaret olarak yaklaşık 12 saat (gece boyu) soğuk oda içinde inkübe edin; bu, yeterli sakkaroz penetrasyonunu gösterir.
  8. Balığı laboratuvar kağıdına nazikçe dokunarak fazla sakkaroz çözeltisini uzaklaştırın.
  9. Balığı saklama tüplerine aktarın.
  10. Örnekleri görüntüleme yapılıncaya kadar −80°C'de saklayın.
    NOT: Floresan protein bozulmasını ve sinyal kaybını en aza indirmek için örnekleri 3 ay içinde işleme alın.
  11. Sabitlenmiş balıkları kuru buz üzerinde kriyostat odasına taşıyın.
  12. Balığı, bir sagital yüzeyi aşağı bakacak şekilde düz bir şekilde plastik bir kalıba yerleştirin.
  13. Balığın tamamı kaplanana kadar Optimal Kesim Sıcaklığı (OCT) bileşiği ekleyin.
  14. Kalıbı OCT beyazlaşana kadar −20°C'de veya kriyostatta dondurun.
    NOT: Tutarlı kesim yapmayı kolaylaştırmak için dondurmadan önce balığı mümkün olduğunca düz konumda yerleştirin.
  15. Zebra balığını sagital düzlemde kriyoseksiyon yaparak cildi, sonraki tüm-mount görüntüleme için kaldırın.
    1. Kriyostat çenesini soğutun.
    2. Çeneye oda sıcaklığında OCT uygulayın.
    3. OCT'li balık bloğunu OCT katmanına sıkıca bastırın.
    4. Yeni uygulanan OCT beyazlaşana kadar çeneyi ve bloğu dondurun.
    5. Çeneyi kriyostata yerleştirin.
    6. Bıçak örneğe ulaşana kadar bloğu 14 µm kalınlıkta kesin.
      NOT: Dondurma sırasında örnek kayması meydana gelebilir ve bu durum balığın blokta beklenenden daha yüksek durmasına neden olabilir. Örneğe giriş, opak OCT arka planının yerini yarı saydam doku görüntüsünün almasıyla belirlenir.
    7. Kesim kalınlığını 7 µm'ye düşürün.
    8. Bir ek kesim daha yaparak kesime devam edin.
      NOT: Bu işlem, cildi kaldırırken örnek boyunca düzgün bir sagital profili korur.
    9. Toplanan kesitlerde cilt görülerek son nokta doğrulansın.
      ​NOT: Cildin kesitlerde görünümü, göz morfolojisinden daha güvenilir bir gösterge sağlar. Bu işlem yalnızca cilt tümör mikroçevresinin görüntülenmesini engelliyorsa uygulanmalıdır.
  16. Çeneyi ellerinizle nazikçe ısıtın.
  17. Örneğin kesilmiş yüzeyine zarar vermeden balık bloğunu pense kullanarak çeneden çıkarın.
  18. OCT hâlâ donmuş iken balık etrafındaki fazla OCT'yi kesin.
  19. OCT kıvamlı bir kıvama geldiğinde balığı pense kullanarak OCT bloğundan çıkarın.

5. Derisi Çıkarılmış Balıkların Montajı ve Görüntülenmesi

  1. Balığı, sagital düzlemde kesilmiş tarafı cam yüzeye bakacak şekilde bir cam altlı kaba yerleştirin.
    NOT: Balık OCT bloğundan çıkarıldıktan sonra kesilmiş tarafın belirlenmesi zorlaşabileceğinden, balığın oryantasyonunu işlem sırasında koruyun.
  2. %1–1,5 oranında düşük erime noktalı agaroz hazırlayın.
  3. Örneği sabitlemek için balığın dorsal ve ventral yüzlerine yaklaşık 30–50 µL agaroz uygulayın.
    NOT: Agarozu balığın altına koymaktan kaçının çünkü görüntü kalitesini düşürebilir. Sadece sabitleme için gerekli olan en düşük agaroz miktarını kullanın.
  4. Örneği taşıma sırasında buz üzerinde tutun. Örneği montajdan sonra 2 saat içinde görüntüleyin.
  5. Örneği konfokal mikroskopi tesisine taşıyın.
  6. Örneği konfokal mikroskopi kullanarak görüntüleyin.
    1. Rezonant tarayıcılı standart bir lazer taramalı konfokal mikroskop kullanın. Otomatik floresans görüntü kalitesini sınırladığında iki fotonlu mikroskop kullanılabilir. En az 0,80 sayısal açıklığa sahip düzeltici 20× objektif lens kullanın.
    2. Tüm görüntüleme kanalları için pinhole ayarını 1,0 Airy birimi (AU) olarak tutun.
    3. EGFP uyarımı için 488 nm'lik, mCherry uyarımı için 594 nm'lik lazer kullanın. Lazer çıkışını 25 mW'ın altında tutun. Piksel doygunluğundan ve siyah kesilmeden kaçınmak için dedektör kazancını ve lazer gücünü bir aralık göstergesi arama tablosu (LUT) kullanarak ayarlayın. Daha yüksek voltajların aşırı gürültüye neden olmasından dolayı dedektör kazancını 800 V'nin üzerine çıkarmayın.
    4. Görüntü alma parametrelerini şu şekilde ayarlayın.
      1. 1024 × 1024 piksel çözünürlükte ve 6,0 µm Z-adım aralığında, 0,42 × 0,42 × 6,0 µm (x, y, z) boyutunda bir voxel kullanın.
      2. İlgili tam hacim boyunca spektral görüntü yığınlarını elde edin; genellikle toplamda 90–120 µm (15–20 optik kesit) kapsayan bir Z-yığını görüntüleme aralığı kullanılır.
      3. Görüntü alımını doku yüzeyinin hemen üzerindeki sıvı ortamından başlatın ve tüm hedef görüntüleme derinliğine kadar devam edin, böylece örnek tamamen kapsansın.
      4. Görüntüleri 16 bitlik alma modunda çalışan yüksek duyarlıklı fotodedektörler kullanarak elde edin.
    5. Görüntüleri, 33,3 kHz rezonant tarama frekansında (yaklaşık 1,58 µs piksel bekleme süresi) ve 8× satır ortalaması ile tek yönlü satır taraması kullanarak elde edin.

6. Görüntü Analizi ve Nicelleme

  1. Fiji (sürüm 1.54p) kullanarak görüntü görselleştirme.
    1. Konfokal z-yığın görüntülerini açın.
    2. Görüntü kanallarının üst üste bindirilmesini görmek için Görüntü > Renk > Kanalları Birleştir seçeneğini belirleyin.
    3. Görüntüleme bölgesini içeren tam z-aralığı için bir projeksiyon oluşturmak üzere Görüntü > Yığınlar > Z Projeksiyonu seçeneğini belirleyin. İlginizi çeken dilim aralığını ve Maksimum Yoğunluk projeksiyon türünü girin. Bu, görüntünün 2B projeksiyonunu gösterecektir.
      NOT: Larva balıklarında, tüm TME'yi konfokal mikroskopi ile yakalamak mümkündür. Bu nedenle, TME analizi için hacimsel normalizasyon ve nicelleştirme yöntemini öneririz. Daha büyük balıklarda, tüm TME'yi konfokal mikroskopi ile yakalamak mümkün değildir; bu nedenle alan temelli normalizasyon ve nicelleştirme yöntemini uygulamanızı öneririz. Larva balıklarımızın analizlerine ve nicelleştirmelerine dayanarak, her iki yöntem de güvenilir biyolojik sonuçlar sağlayabilir.
  2. Larva balıklarında TME'nin hacimsel normalizasyonu ve nicelleştirilmesi.
    1. Tümör hacminin MATLAB R2022b (paketin Matlab web sitesinden indirilmesi gerekir) ve Bio-Formats paketi (openmicroscopy web sitesinden indirilir) kullanılarak nicelleştirilmesi.
    2. Kullanıcı, aşağıdaki görevleri gerçekleştiren bir betiği çalıştırır:
      1. Kullanıcıdan bilgisayarından bir .CZI dosyası seçmesini isteyin.
      2. Görüntüyü okuyun ve tümör bölgesini içeren kanaldan verileri çıkarın.
      3. Fluoresans eşik değeri kullanarak (kullanıcı girişi veya makine öğrenimi ile olabilir) her dilim için tümör bölgesini belirleyin ve tutarlılık için tüm analiz edilen görüntülerde aynı eşik değerini kullanın.
      4. Tümör bölgesini belirginleştirin ve kullanıcı doğrulaması için tüm dilimlerin bir kolajında tümör bölgesi belirginleştirilmiş şekilde görüntüyü gösterin.
      5. Her dilimdeki tümör bölgesinin piksel cinsinden alanını hesaplayın ve görüntü ölçeği ile görüntüleme ayarlarını kullanarak mm2'ye dönüştürün.
      6. Her dilimin hacmini elde etmek için tümör bölgesinin alanını derinlikle (dosyanın meta verilerinde saklıdır) çarpın.
      7. Her dilimin hesaplanan değerlerini toplayarak görüntülenen tümörün ve çevresindeki bölgenin toplam hacmini voxel veya mm3 cinsinden elde edin.
      8. Hacim ölçümlerinin her ikisini de tümör hacmi için 104  ile, çevreleyen bölge için 106  ile çarparak ölçekleyin. Bu, normalizasyon sırasında daha makul bir hücre sayısı:hacim oranını oluşturacaktır.
    3. Hücre sayısının nicelleştirilmesi.
      1. Konfokal z-yığın görüntülerini açın.
      2. Görüntü kanallarının üst üste bindirilmesini görmek için Görüntü > Renk > Kanalları Birleştir seçeneğini belirleyin.
      3. Görüntüleme bölgesini içeren tam z-aralığı için 3B görünüm oluşturmak üzere Görüntü > Yığınlar > 3B Projeksiyon seçeneğini belirleyin. Projeksiyon yöntemi olarak En Parlak Noktayı ve diğer ayarları istenen değerlere seçin.
      4. Hücre sayısının az olması nedeniyle, tümör sınırı içindeki hücreleri dışındakilerden ayırarak elle sayın ve tablolaştırın.
        NOT: Tümör bölgesinin sınırındaki hücreler dışarıda kabul edilir.
    4. Normalizasyon.
      1. Tümör bölgesi içindeki infiltratif hücreler için, hücre sayısını ölçeklenmiş tümör hacmine bölün. Tümör bölgesi dışındaki hücreler için, tümör hacmi dışındaki hücre sayısını, tam görüntü hacminin tümör hacmi çıkarılarak ölçeklenmiş değerine bölün.
      2. Aşağıdaki başlıkları içeren bir tablo oluşturun: “balık tanımlaması”, “tümör hacmi”, “tümör bölgesindeki hücre sayısı”, “tümör bölgesi dışındaki hücre sayısı”, “normalize edilmiş hücre sayısı (içeride)”, “normalize edilmiş hücre sayısı (dışarıda)”.
  3. TME'nin alan temelli normalizasyonu ve nicelleştirilmesi.
    1. Dikdörtgen veya Serbest Şekil seçim aracı kullanarak tümör ilgi bölgesini (ROI) tanımlayın ve tümörü belirginleştirin.
    2. ROI'yi T tuşuna basarak veya Analiz > Araçlar > ROI Yöneticisi > Ekle seçeneğini belirleyerek ROI Yöneticisine ekleyin.
    3. ROI alanını Analiz > Ölç seçeneğini kullanarak ölçün.
    4. Ölçümleri kaydetmeden önce Ölçümleri Ayarla altında Alan'ın seçili olduğundan emin olun.
    5. ROI'yi ROI Yöneticisinde kaydedin.
    6. Tüm görüntülere ROI Yöneticisi > Daha Fazla > Çoklu Ölçüm kullanarak aynı ROI'yi uygulayın.
    7. Görüntüler arasında ROI'nin boyutunu değiştirmeyin.
    8. ROI içindeki hücreleri elle sayın. Hücre sayısı fazlaysa, Eklentiler > Analiz > Hücre Sayacı seçeneğini belirleyerek Hücre Sayacı eklentisini kullanın.
    9. Hücrenin merkezi ROI içindeyken sol tıklayarak her sayılan hücreyi işaretleyin.
    10. Hücre kimliğini doğrulamak için z-yığını boyunca kaydırın.
    11. Aynı hücere birden fazla görüntü düzleminde birden fazla kez saymayın.
    12. Hücreler tümör sınırına temas ediyorsa veya içindeyse infiltratif hücreleri ayrı ayrı sayın.
    13. Hücre merkezi ROI dışında olsa bile infiltratif hücreleri ayrı bir kategori olarak kaydedin.
    14. ROI alanını piksel cinsinden mm2'ye dönüştürün.
    15. Piksel genişliği, piksel yüksekliği ve Z-adım aralığını Görüntü > Özellikler menüsünden alın.
    16. Normalize edilmiş hücre sayılarının hesaplanması.
      1. Her balık için ham hücre sayısını ilgili ROI alanı değerine bölün.
      2. Elde edilen değeri normalize edilmiş hücre sayısı olarak kaydedin.
      3. Mutlak yoğunluk ölçümleri için, Görüntü > Özellikler menüsünden alınan görüntü kalibrasyon değerlerini kullanarak fiziksel alanı hesaplayın.
      4. Ham hücre sayısını hesaplanan alana (mm2) bölün.
      5. Sonucu hücre/mm2 olarak ifade edilen hücre yoğunluğu olarak kaydedin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Genel deneysel iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. CD4+ hücreleri ve dβh eksprese eden hücrelerin sırasıyla mCherry ve EGFP floresansı ile farklı şekilde işaretlendiği bileşik transgenik yavrular üretmek için yetişkin Tg(cd4-1:mCherry) zebra balıkları ile Tg(dβh:MYCN;dβh:EGFP) zebra balıkları çaprazlanmıştır. Embriyolar uygun floresan belirteçler için taranmış ve ardından larva gelişimi sırasında canlı konfokal görüntüleme ile veya daha yaşlı balıklarda ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada açıklanan protokol, TME içerisindeki bağışıklık hücrelerini görselleştirmek ve nicelleştirmek için bir in vivo model olarak zebra balıklarını kullanmaktadır. Bu yaklaşımın başarılı bir şekilde uygulanması için birkaç faktör kritik öneme sahiptir. İlk olarak, bileşik transgenik zebra balığı hatlarının uygun seçimi ve doğrulanması esastır. Larvalar, beklenen floresan ekspresyon modelleri açısından taranmalı ve gerekirse genotipleme ile onaylanmalıdır. Deneysel ve kontrol gruplarının doğru atanmasını sağlama...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

H.F.'ye sağlanan destekler için National Institutes of Health (NIH; 1UL1TR01430, CA215059 ve NS140967), American Cancer Society (RSG-17-204-01-TBG), National Science Foundation (1911253) ve Alex’s Lemonade Stand Foundation'a; X.Q.'ye sağlanan destek için ise Warren Alpert Distinguished Scholars Fellowship'e teşekkür ederiz. Y.W., Boston University Undergraduate Research Opportunities Program (UROP) ve St. Baldrick’s Summer Fellowship Program tarafından desteklenmiştir. M.V., St. Baldrick’s Summer Fellowship Program tarafından desteklenmiştir. Bu makalenin içeriği yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve NIH'nin resmi görüşlerini temsil etmeyebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
20 µL Jel Yükleme UcuMilliporeSigma102-060Larva manipülasyonu için kullanılır
Yapay BitkilerThe Hidden Reef628742000Opsiyonel üretim zenginleştirmesi
Çamaşır SuyuFisher Scientific5037150Embriyo dekontaminasyonu için kullanılır
Hücre Sayıcı EklentisiNational Institutes of Health (NIH)N/AHücre kantifikasyonu için kullanılan Fiji eklentisi
Bilgisayar ve MonitörHP2TB68A8#ABAGörüntüleme ve analiz için kullanılır
Konfokal MikroskopZeissLSM 710Larva ve yetişkin görüntüleme için kullanılır
Kriyokalıp, PlastikEpredia2-050-160OCT gömme işlemi için kullanılır
KriyostatThermo Fisher Scientific95-664-0EC70Kriyoseksiyonlama için kullanılır
Kuru BuzFisher ScientificN/ANumune taşıma için kullanılır
Fiji YazılımıNational Institutes of Health (NIH)Version 1.54pGörüntü analiz yazılımı
İnce Gözenekli AğCarolina Biological651345Embriyo toplama için kullanılır
Balık İnkübatörüVWR35960-05628.5°C'de tutulmuştur
PensFisher Scientific10-316BNumune tutma işlemleri için kullanılır
Cam Tabanlı KapIBIDI81218-20Görüntüleme için kullanılır
Düşük Erime Noktalı AgarozProlab Supply9012-36-6Larva ve yetişkin sabitleme için kullanılır
Çiftleşme Tankı (ana tank, ayırıcı, ızgaralı bölüm)Carolina Biological161937Zebrafish üretimi için kullanılır
Nutating RockerMidsciR2D-30Gece boyu inkübasyon sırasında fiksasyon için kullanılır
OCT BileşiğiTissue-Tek4583Kriyoseksiyonlama için gömme medyumu
Paraformaldehit (PFA)Sigma Aldrich158127-50GFiksatif
Petri Kabı, PlastikMilliporeSigmaBR4520Embriyo ve larva tutma işlemleri için kullanılır
Fosfat Tamponlu Salin (PBS)Gibco14080-05Yıkama ve fiksasyon prosedürleri için kullanılır
Plastik Transfer PipetiFisher Scientific50-98-10Embriyo ve larva transferi için kullanılır
JiletFisher Scientific12-640Numune hazırlama sırasında kullanılır
İletkenlik ÖlçerYSIEC30ACC-04Rotifer suyu tuzluluğunu doğrulamak için kullanılır
RotiferlerThe Hidden Reef16151603Larva yetiştirme için kullanılır
Sodyum TiyosülfatThermo Fisher ScientificAAA1762936Çamaşır suyunun nötralizasyonu için kullanılır
SükrozFisher ScientificS2590AKriyoproteksiyon reaktifi
Trikain MetansülfonatWestern ChemicalNC0872873Anestezik; Fisher Scientific tarafından satılmaktadır
CımbızFisher Scientific12-0-12Numune tutma işlemleri için kullanılır
Dik Floresan MikroskopLeicaM165Floresan tarama için kullanılır

Kaynaklar

  1. Anderson NM, Simon MC. The tumor microenvironment. Curr Biol. 2020;30(16):R921-R925.
  2. Kumagai S, Momoi Y, Nishikawa H. Immunogenomic cancer evolution: A framework to understand cancer immunosuppression. Sci Immunol. 2025;10(105):eabo5570.
  3. Keren L, et al. A structured tumor-immune microenvironment in triple negative breast cancer revealed by multiplexed ion beam imaging. Cell. 2018;174(6):1373-1387.e19.
  4. Gerner MY, et al. Histo-cytometry: A method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes. Immunity. 2012;37(2):364-376.
  5. Pittet MJ, Weissleder R. Intravital imaging. Cell. 2011;147(5):983-991.
  6. Wienke J, et al. The immune landscape of neuroblastoma: Challenges and opportunities for novel therapeutic strategies in pediatric oncology. Eur J Cancer. 2021;144:123-150.
  7. Spitzer MH, Nolan GP. Mass cytometry: Single cells, many features. Cell. 2016;165(4):780-791.
  8. Roy D, et al. Zebrafish—A suitable model for rapid translation of effective therapies for pediatric cancers. Cancers (Basel). 2024;16(7):1361.
  9. White RM, et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2008;2(2):183-189.
  10. MacRae CA, Peterson RT. Zebrafish as tools for drug discovery. Nat Rev Drug Discov. 2015;14(10):721-731.
  11. Miao KZ, et al. Tipping the scales with zebrafish to understand adaptive tumor immunity. Front Cell Dev Biol. 2021;9:660969.
  12. Povoa V, et al. Innate immune evasion revealed in a colorectal zebrafish xenograft model. Nat Commun. 2021;12(1):1156.
  13. Wang J, et al. Novel mechanism of macrophage-mediated metastasis revealed in a zebrafish model of tumor development. Cancer Res. 2015;75(2):306-315.
  14. Loveless R, Shay C, Teng Y. Unveiling tumor microenvironment interactions using zebrafish models. Front Mol Biosci. 2020;7:611847.
  15. Dee CT, et al. CD4-transgenic zebrafish reveal tissue-resident Th2- and regulatory T cell-like populations and diverse mononuclear phagocytes. J Immunol. 2016;197(9):3520-3530.
  16. Murali Shankar N, et al. Preclinical assessment of CAR-NK cell-mediated killing efficacy and pharmacokinetics in a rapid zebrafish xenograft model of metastatic breast cancer. Front Immunol. 2023;14:1254821.
  17. Tan KE, et al. LMO1 expression in neuroblastoma cells reprograms tumor-associated macrophages to promote metastasis. iScience. 2026;29(3):115144.
  18. Fior R, et al. Single-cell functional and chemosensitive profiling of combinatorial colorectal therapy in zebrafish xenografts. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114(39):E8234-E8243.
  19. Fazio M, et al. Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy. Nat Rev Cancer. 2020;20(5):263-273.
  20. Qin X, et al. CKLF instigates a “cold” microenvironment to promote MYCN-mediated tumor aggressiveness. Sci Adv. 2024;10(11):eadh9547.
  21. Ludin A, et al. CRATER tumor niches facilitate CD8+ T cell engagement and correspond with immunotherapy success. Cell. 2025;188(24):6720-6736.e26.
  22. Zhu S, et al. LMO1 synergizes with MYCN to promote neuroblastoma initiation and metastasis. Cancer Cell. 2017;32(3):310-323.e5.
  23. Tao T, et al. The pre-rRNA processing factor DEF is rate limiting for the pathogenesis of MYCN-driven neuroblastoma. Oncogene. 2017;36(27):3852-3867.
  24. Zimmerman MW, et al. MYC drives a subset of high-risk pediatric neuroblastomas and is activated through mechanisms including enhancer hijacking and focal enhancer amplification. Cancer Discov. 2018;8(3):320-335.
  25. Dankert EN, Look AT, Zhu S. Unraveling neuroblastoma pathogenesis with the zebrafish. Cell Cycle. 2018;17(4):395-396.
  26. Langenau DM, et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101(19):7369-7374.
  27. Lam SH, et al. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: A gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev Comp Immunol. 2004;28(1):9-28.
  28. Zhen A, et al. CD4 ligation on human blood monocytes triggers macrophage differentiation and enhances HIV infection. J Virol. 2014;88(17):9934-9946.
  29. Ferrero G, et al. The macrophage-expressed gene (mpeg)1 identifies a subpopulation of B cells in the adult zebrafish. J Leukoc Biol. 2020;107(3):431-443.
  30. Hall C, et al. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev Biol. 2007;7:42.
  31. Lorenzini F, et al. Melanoma innervation, noradrenaline and cancer progression in zebrafish xenograft model. Cell Death Discov. 2025;11(1):260.
  32. Ramakrishnan G, et al. Real-time imaging reveals a role for macrophage protrusive motility in melanoma invasion. J Cell Biol. 2025;224(2):e202403096.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

İmmün Hücre GörüntülemeNöroblastoma Hücreleriİmmün Hücre KantifikasyonuTransgenik ZebrafishFloresan İşaretlemeIn Vivo Görüntülemeİmmün-Tümör EtkileşimleriCD4 Pozitif Hücreler

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.