Yeni ölçekli biyopsi yöntemi, canlı zebrabalıklardan akut lenfoblastik lösemi hücrelerinin toplanmasına olanak tanır. Sonuçlar, vahşi tip (WT) balık pullarında bol lenfositler ve ALL (akut lenfoblastik lösemi) olan balıklardan çıkan pullarda lenfositlerin dramatik şekilde arttığını gösteriyor. Bu teknik, epidermal normal ve kötü huylu lenfositlerin minimal invaziv şekilde incelenmesine olanak tanır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Zebrafish kötü huylu ve kötü huylu olmayan lenfositleri toplamak için yeni bir ölçek biyopsi yöntemi
Bu makalede
Özet
Özet
Zebrabalıklar (Danio rerio), zebrabalıklar ve insanlar benzer adaptif bağışıklık sistemlerine, B ve T hücrelerine sahip olduğundan, lenfopoezi ve lenfoid kanserleri incelemek için güçlü bir modeldir. Lenfoblast-spesifik insan MYC (hMYC) bulunan balıklar da dahil olmak üzere birkaç D. rerio T-hücreli akut lenfoblastik lösemi (T-ALL) modeli anlatılmıştır. rag2:hMYC balıklarının ayrıca B-hücreli akut lenfoblastik lösemi (B-ALL) geliştirdiğini bildirdik; bu da onları her iki ALL tipini incelemek için faydalı kılar. Zebrafish ALL modellerinin bir sınırlaması, ALL'nin seri örnekleme için ölümcül olmayan yöntemlerin olmamasıdır. Bunu çözmek için, canlı zebrabalıklardan TÜM hücreleri toplamak için yeni bir 'ölçek biyopsisi' yöntemi geliştirdik. Ancak, normal zebrafish pullarında hangi lenfositlerin bulunduğu hakkında bilgi azdır. Bu nedenle, normal epidermal lenfosit kimliklerini tanımlamak için, rag2:hMYC içermeyen lenfosit etiketli transgenik hatlar üzerinde ölçekli biyopsiler yaptık. Pulları analiz etmek için geleneksel ve konfokal mikroskopi kullandık ve bol miktarda epidermal lenfositler ortaya çıktı. Ayrıca, T- ve B-ALL içeren balıklardan alınan pulları analiz ettik; bu da birçok pulda ALL hücrelerinin birleşen tabakalarında belirgin şekilde artan lenfositleri gösterdi. Sonrasında ex vivo çalışmalar için malign olmayan ve ALL lenfositleri ölçeklerden arındırmak amacıyla floresans-aktive hücre ayırtma (FACS) kullandık. Aynı balığın pullarından veya diğer dokularından alınan TÜM hücrelerin akış sitometri ve ekspresyon analizleri, ölçek TÜM hücre gen ekspresyonunun başka yerlerdeki TÜM hücrelere benzediğini gösterdi. Ayrıca, ölçekte arıtılabilir normal T, B, T-ALL ve B-ALL hücrelerinin sayısını da niceleştirdik. Genel olarak, scale biyopsisi, zebrafish epidermal lenfositlerini incelemek için ölümcül olmayan, minimal invaziv bir teknik sunar ve malign örneklerin analizini de içeren ex vivo çalışmaları mümkün kılar.
Giriş
Memeli derisinin bariyer fonksiyonu ve bağışıklık rolleri 1,2,3 olarak belirlenmiştir. Memeli lenfositleri, epidermiste bulunan sitotoksik T hücreleri ile dermis 1,3,4,5 dermisinde bulunan deri bağışıklığına katkıda bulunur. Zebra balıkları bu lenfositlere sahiptir; yüzey immünoglobulinleri, T hücresi reseptörleri, ana histouyumluluk kompleksi (MHC) reseptörleri, sitokinler ve onların reseptörleri ile diğer bağışıklık molekülleri bulunur; böylece çoğu memeli immünolojik özelliğinipaylaşır 6,7,8,9. Zebrafish derisi ve pulları üzerine yapılan son çalışmalar, epitel T ve Bhücreleri 10,11 dahil olmak üzere çeşitli deri lenfosit popülasyonlarını ve T hücre taşımını ve antijen gözetimini kolaylaştıran bir lenfoid ağı12 göstermiştir. Teleost balıkları ile memelilerin lenfositleri arasındaki benzerlikler, D. rerio'yu lenfopoez, lenfosit fonksiyonu ve akut lenfoblastik lösemi (ALL) dahil lenfoid hastalıkları incelemek için güçlü bir in vivo model yapmaktadır. 8,10,13,14,15,16,17,18,19,20.
Önceki çalışmalarımız, T- ve B-soy hattının ALL (T-ALL, B-ALL) her ikisinin de transgenik rag2:hMYC zebrabalıklarında ortaya çıktığını gösterdi; bu da bu hattı her iki TÜMtip 13,15,21,22'yi incelemek için faydalı kılıyor. D. rerio ALL modellerinin başlıca sınırlamalarından biri, özellikle uzunlamasına ifade çalışmaları veya ilaç testi çalışmalarında, bireysel hayvanlardan seri ALL örnekleri toplamak için yöntemlerin eksikliğidir. Önceki yöntemler, örneğin retro-orbital kan toplama, D. rerio'nun küçük boyutu nedeniyle teknik olarak zordur ve seri kan örneklemesinizorlaştırır. Bu nedenle, çoğu araştırmacı zebrafishi ötenazi ederek TÜM hücreleri elde eder. Bu, laboratuvarda ve sahadaki çoğu kişinin yaygın uygulamasıdır, ancak canlı hayvanlar üzerinde uzunlamasına deneyler yapmayı engellemektedir. Bunu aşmak için, yakın zamanda zebrafish pullarında epitel T ve B lenfositlerini tanımladık; bu lenfotlar ölümcül olmayan bir ölçek biyopsistratejisi kullanılarak toplanmıştır 10. Başka bir yakın tarihli çalışma, bitişik pullar arasında zebrafish yüzeyi üzerinde/yakınında bir T hücresirezervuarı göstermiştir 12. D. rerio, yüzlerce pula sahiptir ve bu pullular çıkarıldıktan sadece birkaç gün sonrahızla yenilenir 24. Bu bulgular ve özellikler birlikte, zebrafish pullarının ötenazi gerektirmeyen lenfositlerin kaynağı olduğunu ve canlı balıklarda uzunlamasına çalışmalara olanak sağladığını göstermektedir.
Burada, lenfositlere özgü florofor belirteçleri olan balıklardan zebrafish epidermal lenfositlerinin toplanması için bir ölçek biyopsisi yöntemi tanımlıyoruz; ALL ile ya da olmadan. T-soy hücrelerini incelemek için, iyi bilinen lck:GFP balıkları ve benzer bir lck:mCherry hattı kullandık; her ikisi de T ve T-ALLhücreleri 10,13,15,20 olarak etiketler. B-soy hücrelerini incelemek için, floresan işaretli B ve B-ALL hücreleri olan cd79a:GFP ve cd79b:GFP transgenikbalıkları kullandık 10,13,17. Bu çizgilerin her biri floresan mikroskopi ile görselleştirmeye ve akış sitometrik hücre sıralamasıarındırmasına olanak tanır 13. Biyopsi sonrası pulları inceledik, pullarda lenfositlerin yüksek çözünürlüklü görüntüleri oluşturduk, epidermal lenfosit gen ekspresyonunu qRT-PCR ile belirledik, aynı balığın diğer lenfoid dokularından lenfositlerle karşılaştırdık ve akış sitometrisi/floresans-aktifete sahip hücre sıralaması ile ölçek başına lenfositleri nicelikle ölçüldük. Özetle, protokol canlı zebrabalıklardan lenfositleri elde etmek için basit ve pratik bir yöntem tanımlar; deneysel bir dizide bireysel hayvanları boyunlamasına boyunca örneklemeler içerir. Bu yöntem, zebrafish lenfosit biyolojisi, lösemi ilerlemesi, ilaç yanıtları veya bireysel zebrabalıkların tekrar tekrar örneklenmesini gerektiren diğer uzunlamasına deneysel tasarımları incelemek için tasarlanmıştır. Protokolü, floresan etiketli lenfosit popülasyonlarıyla yetişkin transgenik zebrafish kullanarak geliştirdik ve floresan mikroskopisi, akış sitometrisi/floresans-aktive hücre ayırma, RNA ifade analizleri ve canlı lenfositler gerektiren diğer ex vivo çalışmalar gibi sonraki uygulamalar için doğruladık.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan prosedürleri, Oklahoma Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi'nin Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı (protokoller 24-028-EAH ve 25-068-EACHIR). Bu protokol, normal ve/veya kötü huylu lenfositleri canlı zebra balıklarının pullarından izole etmek ve analiz etmek için bir yaklaşım sunar; bu prosedürlerin amacı, uygulanması ve temel ilkeleri hakkında detaylar yer alır.
DIKKAT: MS-222 tehlikeli bir kimyasal anesteziktir ve laboratuvar eldivenleri, göz koruma ve laboratuvar önlüğü gibi uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla (PPE) ele alınmalıdır. MS-222 çözeltilerini kurumsal kimyasal atık yönergelerine uygun olarak bertaraf etmelidir. Keskin yaralanmaları önlemek için iğne ve penss tutarken dikkatli olun. Tüm biyolojik örnekleri potansiyel olarak biyolojik tehlikeli olarak değerlendirin ve atıkları kurumsal biyogüvenlik prosedürlerine uygun olarak bertaraf edin.
1. Sıralama ortamının hazırlanması
- %1 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisillin/streptomisin içeren 1× RPMI 1640 media solüssiyonunu takviye edin.
NOT: RPMI 1640 ortamı, lenfositlerin canlılığını ex vivo korur. RPMI 1640, 0.9× PBS ile değiştirilebilir. Fetal sığır serumu (FBS), hücresel canlılığı artırmak için büyüme faktörleri sağlar. Penisilin ve streptomisin bakteriyel kontaminasyonu sınırlar. - Aliquot medyası, 500 μL hacimde 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine yerleştirilir; her tüp 10–20 ölçek için tasarlanmıştır. Medya tüplerini buz üzerinde ayırmaya devam edin.
2. Zebrafish anestezisi, floresan mikroskopi taraması ve görüntüleme
- D. rerio'yu balık sisteminden alınan su kullanılarak kurumsal hayvan bakım kılavuzlarına göre hazırlanan tamponlu %0,02 trikain metansülfonat (MS-222) ile anestezi edin.
- Sedasyon yaptıktan sonra, balığı nazikçe hücre kültürü kabına yerleştirin; böylece sonraki işlem sırasında nemi korumak için yeterli sistem suyu (artı %0,02 MS-222) bulunuyor.
- Anestezi edilmiş balıkları epifloresan mikroskopla inceleyin ve görüntüleyin; transgen(ler)den floresansı tespit edin. Bu adım, biyopsi için floresan ölçekleri tanımlar.
NOT: Flüoresan transgenleri olmayan çizgiler standart ışık mikroskobu ile görüntülenebilir. - T hücrelerini tanımlamak için floresans kullanın (lck:GFP veya lck:mKiraz balığı) veya T-ALL (rag2:hMYC + lck:GFP veya lck:mKiraz balığı). T-hatlı hücreler bu hatlarda parlak floresanslıdır; B-ALL hücreleri, lck:GFP ve lck:mCherry arka planlarında 13,15,21 loş floresanlıdır.
- Epidermal B hücreleri ve/veya B-ALL için cd79a:GFP veya cd79b:GFP (rag2:hMYC ile veya olmasın ) B-soyu etiketli balıkları ekrana getirin, biyopsi için pulları GFP olarak seçebilirsiniz.
- Görüntüleme isteniyorsa, biopsi öncesinde zebrafish konumlandırma ve mikroskop ayarlarını ayarlama pratiği yapın
NOT: Görüntüleme ve biyopsi için %0,02 MS-222 ile 5–7 dakika sedasyon gereklidir. Operküler hareketleri sürekli izleyin. Operkülyar hareket belirgin şekilde yavaşlarsa veya durursa, balık hemen anesteziksiz sistem suya transfer edilip biyopsi sonlandırılır. Görüntüleme ve biyopsi sırasında yüzey nemini korumak için her 1–2 dakikada bir ~50–100 μL anestezik içeren balık suyunu deri, operkulum ve solungaçlara tekrar uygulayın.
3. Ölçek toplama ve hazırlama
- Balığı biyopsi için konumlandırmak için, sedasyon edilmiş balığı yan yatarak hücre kültürü kabına yerleştirin.
- Biyopsi sırasında balığın kaymasını önlemek için, doğrusal veya V şeklinde bir kesik içeren nemli bir sünger kullanın ve balığı hücre kültürü kabına yerleştirerek balığı kucaklayabilirsiniz.
- Alternatif olarak, sistem su seviyesinin hücre kültürü tabağı tabanını neredeyse kaplamasından (yüzeyi nemli tutacak kadar) olduğundan emin olun, böylece yüzey gerilimi balığı stabilize edebilir.
- Sistem suyunda hazırlanmış %50–50–100 μL MS-222 periyodik olarak operkulum ve solungaçlara uygulanarak görüntüleme ve biyopsi sırasında anesteziyi sürdürmek ve nemi sürdürmek.
- Epifloresans mikroskopisi kullanarak biyopsi yapın; lenfositler veya TÜM hücrelerle zenginleştirilmiş yüksek floresan ölçekleri seçin.
- Tek bir yüksek floresan bölgeden, tercihen birinci veya ikinci yatay pigmentli şerit içinden 10–20 bitişik pulu toplayın.
NOT: Görüntüleme için genellikle bir ölçek yeterlidir. 10–20 pulluk bir koleksiyon genellikle WT balıklarından >1.000 lenfosit elde eder ve akış sitometrisi ile qRT-PCR gibi aşağı akış analizleri için önerilir. - Dominant el (iğne): 31 gauge bir şırınga iğnesi kullanın, iğne ucunu nazikçe bir pulun arka kenarının altına yerleştirin ve öne doğru çevirin (yani cephalad). Her balık için farklı steril iğne kullanın. Balıklar arasında temiz pensler; Kurumsal prosedürler gerektirdiğinde sterilize edin.
NOT: Pulu iğneyle yükseltmek, sadece forseps kullanmaktansa tercih edilir, çünkü bu teraziyi kaldırarak yüzey sürtünmesini en aza indirir. Bu, pulun altındaki hassas epidermal tabakanın pulun yüzeyine yapışmasını sağlar ve bu da hücre verimini maksimize etmek için kritik öneme sahiptir. - Non-dominant el (forseps): Teraziyi iğneyle öne çevirilmiş pozisyonda tutarak, pinsle terazın sert dış yüzeyini tutun. Pürüzsüz bir hareketle cebinden pulu çıkar.
NOT: Pulun çekildiği yerlerde hafif kanamalar meydana gelebilir, bu genellikle kendi kendine sınırlanır. - Aşırı kanama oluşursa, forsepsle hafifçe baskı uygulayın ve sistem suyunda %0,02 MS-222 ile kısa bir süreliğine durulayın.
NOT: Hemostaz saniyeler içinde sağlanabilir ve ardından bir sonraki ölçeğe geçilir. - Birden fazla pulu biyopsi yapmak için, her balık için 10–20 pulluk toplayın; bitişik pulları bitişik bölgeden yatay pigmentli bir şeritte çıkarır; hayvanın birden fazla vücut bölgesi veya her iki tarafı yerine.
- Bireysel pulları sırayla yypın ve toplama sırasında penss uçlarında medial pulun yüzeyi yukarıya bakacak şekilde tutun.
- Birikmiş pulların sonrasında pul çıkarılmasıyla karışmasını önlemek için, her pulu önce öne çevirin ve ardından arka kenarından tutun. Her 5 puldan sonra veya ek pullar forseps uçlarında güvenli bir şekilde tutulamıyorsa, terazileri ayırma ortamı içeren bir tüpe aktarın.
- Ölçek toplandıktan sonra, örnekleri mümkün olan en hızlı şekilde işleyin. Pulları hemen forsepslerden 1,5 mL tüplere aktarın; bu tüpler 500 μL soğuk ayırma ortamı içeren buz üzerinde hücre canlılığını koruyun. Sonraki örnekleri toplamadan önce %70 etanol kullanarak balıklar arasında pensleri dezinasyon yapın. Her balığın pullarını toplama, ayrıştırma ve aşağı akış analizleri boyunca ayrı tüplerde işleyin.
- Pul toplandıktan sonra, balıkları MS-222 içermeyen taze sistem suyu içeren bir geri kazanım tankına hemen nakledin.
- Normal nefes alma ve duruş sağlanana kadar operküler hareket ve yüzme davranışını izleyin. Balıkları dolaşım sistemine geri göndermeden önce biyopsi bölgesinde kalıcı kanama veya rahatsızlık belirtileri açısından gözlemleyin.
- Normal denge ve yüzme devam ettikten sonra balığı ev tankına geri döndürün.
4. Hücre ayrışması ve filtreleme
- Tüpün altındaki pulları kontrol edin. Pullar, dissosiyasyondan önce çıplak gözle kolayca görülebilir. Steril plastik mikrotüp tokojenizatoru kullanarak 30–60 saniye boyunca nazik ve kontrollü manuel basınç uygulayarak pulları ayırın.
- Epidermal hücreleri serbest bırakmak için yavaş dönme ve yukarı-aşağı hareketler kullanın, ancak pulların aşırı kesilmesini önleyin.
- Ayırma medyası gözle görülür şekilde bulanık hale gelene kadar dissosiyasyona devam edin.
NOT: İşlemin başarısı, ortamın bulanıklaşmasıyla gösterilir; bu da süspansiyonda yüksek bir serbest kalmış hücre yoğunluğunu gösterir. - Homojenize örnekleri 35 μm naylon ağ filtreden geçirerek kalıntıları temizler ve akış sitometrisi/floresans ile aktive hücre ayırtması için tek hücreli süspansiyonlar oluşturulur.
- İlk filtreleme sonrası görünür hücre agregaları varsa, numuneyi akış sitometrik analizinden hemen önce bir kez daha yeni bir 35 μm mesh filtresinden geçirin. Hücre kaybını en aza indirmek için toplam 2 katından fazla filtreleme tekrarlanmalıdır.
5. Akış sitometrik analizi
- Akış sitometrisiyle örnekleri analiz edin.
NOT: Akış sitometrisi, floresansla aktifleşen hücre ayırma arındırması veya RNA çıkarımı öncesinde yapılabilir; örnek bileşimi değerlendirilmelidir. - GFP algılama için 488 nm lazer ve mCherry tespiti için 561 nm lazer ile donatılmış bir akış sitometresi kullanılarak tek hücreli süspansiyonları analiz edin.
- Enkaz dışlanarak ileri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) parametreleri kullanılarak alın. Daha önce tanımlanan lenfositkapısı 10,13,21 kullanılarak lenfositleri tanımlayın.
- Hücre agregalarını singlet kapı (yani SSC-alanı [SSC-A] ile SSC-yükseklik [SSC-H]) parametreleriyle hariç tutun.
- Propidium iyodid (PI) veya eşdeğer canlı/ölü boya kullanarak hücre canlılığını değerlendirin. Sonraki analizler ve sıralama prosedürlerinden PI-pozitif hücreleri hariç tutun.
- Transgen olmayan zebrafish kontrolleri ve tek renkli floresan transgenik kontroller kullanarak floresan kapıları oluşturun. GFP-pozitif ve mCherry-pozitif popülasyonları negatif kontrollere göre tanımlayın.
- Akış sitometrisi standart (FCS) dosyalarını dışa aktarın ve akış sitometrisi analiz yazılımı kullanarak verileri analiz edin.
6. Floresansla aktive hücre sıralaması
- Hücreleri ayırmak için, GFP ve mCherry tespiti için 488 nm ve/veya 561 nm lazerlerle donatılmış floresans ile aktive hücre ayırma kullanın.
- Floresans tabanlı sıralamadan önce ardışık olarak lenfositleri (FSC/SSC), tekli hücreleri (SSC-A vs. SSC-H) ve canlı hücreleri (PI-negatif) kapatı.
- Negatif kontrol örneklerinden oluşturulan floresan kapıları kullanarak GFPlo,GFP hi ve mCherry-pozitif popülasyonları tanımlayın.
- GFPlo, GFPhi ve mCherry-pozitif popülasyonları, soğutulmuş ayırma ortamı içeren toplama tüplerine ayırın.
NOT: Bu çalışmada, lck:GFP hattıyla yapılan çalışmada, yüksek GFP (GFPhi) ile düşük GFP (GFPlo) hücreleri daha önce tanımlandığı gibi farklı lenfosithattlarıdır 10,13,15,21. - Sıralanmış örnekleri buz üzerinde tutun ve hemen RNA izolasyonu gibi sonraki uygulamalara geçin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Yukarıdaki adımları takip ederek, yetişkin zebrabalıkları floresan lenfositler veya ALL için mikroskopi ile anestezi yaptık ve tarandık. Vahşi tip (WT) lck:GFP balıkları esas olarak timik bölgede floresans gösterirken, cd79b:GFP balıkları ise önceki gözlemlerle uyumlu olarak baş/solungaç bölgesinde floresansgöstermiştir (Şekil 1A, sol). Buna karşılık, çift transgenik rag2:hMYC; lck:GFP/lck:mT-ALL ve...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, hem kötü huylu olmayan lenfositleri hem de akut lenfoblastik lösemi (ALL) hücrelerini içeren zebrafish epidermal lenfositlerinin toplanması için ölümcül olmayan bir pul-biyopsi yöntemini tanımlar. Zebrafish, lenfopoezi ve lenfoid maligniteler için iyi kurulmuş modellerdir, ancak lenfositleri elde etmek için çoğu yaklaşım ötenazi ve doku diseksiyonu gerektirir; bu da tek hayvanların uzunlamasınaçalışmalarını engeller 8,10,1...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların finansal çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu projeye katkıları için Ameera Hasan, M.B.B.S., Ph.D. ve Brashé Wood'a teşekkür ediyoruz. Çalışmalar, OUHSC Stephenson Kanser Merkezi Pilot Hibe Programı, Oklahoma Yetişkin Kök Hücre Araştırma Merkezi (OCASCR), Presbiteryen Sağlık Vakfı Ekip Bilim ve Tohum Hibe Programları ile W.J. Jones Aile Vakfı tarafından desteklendi. OUHSC Stephenson Kanser Merkezi Moleküler Biyoloji ve Sitometri Araştırma Merkezi'nin FACS, NCI Kanser Merkezi Destek Hibe Ödülü P30 CA225520 tarafından finanse edilmiştir. Bu çalışma, kısmen Amerikan Kanser Derneği'nden (ACS-POST-BACC-23-1156971-01-DPBACC) alınan fonlarla desteklendi. Iman Owens, ACS lisans sonrası "STRONG" programı bursiyeridir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktipler ve Tüketim Malzemeleri: | |||
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | Anestezik ajan |
| RPMI 1640 ortamı | ThermoFisher | 11875093 | Lenfosit canlılığı için ortam |
| Fetal Bovin Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Hücresel canlılık için |
| Penisilin-Streptomisin | ThermoFisher | 15140122 | Bakteriyel kontaminasyonu sınırla |
| 70% etanol | ThermoScientific | T038181000 | Forepleri sterilize etmek için |
| CellPro 1x PBS | VWR | 104027-280 | Steril su ile 0.9x'e seyreltin |
| Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MMP | Akış/FACS için canlı/ölü hücre ayrımı |
| Cut Goods Misc-Pn; Boyut: 12 x 12 IN. 35um filtre kağıdı Lab Pak 03-35/16 | Sefar | Hücre sıralaması için Referans: Burroughs-Garcia, J., Hasan, A., Park, G., Borga, C., Frazer, J. K. lck:Egfp zebrabalığından malign ve malign olmayan b hücrelerini izole etme. J Vis Exp. 10.3791/59191 (144), (2019). | |
| Filtre kağıdı için alternatif: EASYstrainer Hücre Eleği, Greiner Bio-One | Greiner | 89508-342 | Hücre sıralaması için |
| Eppendorf® Flex-Tubes® Mikrotüpler, 1,5 ml | Eppendorf® | 20901-551 | Hücre sıralaması için mikrosantrifüj tüpü |
| UltiCare VetRx U-100 İnsülin Şırıngaları 3/10cc 31G x 5/16" Yarım Birim İşareti | UltiCare | 9436 | Ölçek biyopsileri için |
| 100 x 25 mm Derin Petri Kabı | USA Scientific | 8609-0625 | Ölçek biyopsileri için |
| Bel-Art® Tek Kullanımlık Pesteller | Bel-Art® | BAF199230001 | Ölçek ayrışması için |
| E-Z Pik 6 Parça Cımbız Seti | Aven | 18480EZ | Ölçek biyopsileri için |
| Corning® mikroskopik slaytlar, bir tarafı buzlu, bir ucu | Sigma-Aldrich | CLS294875X25 | Görüntüleme için |
| Kapak camları | Sigma-Aldrich | C8181 | Görüntüleme için |
| SlowFade™ Cam Yumuşak Kurulum Antifade Mountant, DAPI'li | ThermoFisher | S36920 | Ölçekleri slayt üzerine monte etmek için |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | RNA ekstraksiyonu için |
| Ekipman: | |||
| Nikon AZ100 mikroskobu ve DS-Qi1MC kamera | Nikon | Floresan mikroskobu ve kamera | |
| CFX96 Touch-PCR Sistemi | Bio-Rad | 3600037 | |
| CytoFLEX | Beckman-Coulter | Akış sitometri analizleri | |
| Leica SP8 | Leica | Konfokal mikroskobu | |
| Yazılım: | |||
| Kaluza Analysis yazılımı sürüm 2.1 | Beckman-Coulter | Akış sitometri analizleri Referans: https://www.beckman.com/flow-cytometry/software/kaluza/downloads | |
| LAS-X yazılımı sürüm 3.7.4.23463 | Leica | Konfokal mikroskobu Referans: https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/ |
Kaynaklar
- Egawa G, Kabashima K. Skin as a peripheral lymphoid organ: revisiting the concept of skin-associated lymphoid tissues. J Invest Dermatol. 2011;131(11):2178–85.
- Matejuk A. Skin immunity. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2018;66(1):45–54.
- Zhang C, Merana GR, Harris-Tryon T, Scharschmidt TC. Skin immunity: dissecting the complex biology of our body's outer barrier. Mucosal Immunol. 2022;15(4):551–61.
- Kupper TS, Fuhlbrigge RC. Immune surveillance in the skin: mechanisms and clinical consequences. Nat Rev Immunol. 2004;4(3):211–22.
- Lafouresse F, Groom JR. A task force against local inflammation and cancer: lymphocyte trafficking to and within the skin. Front Immunol. 2018;9:2454. doi:10.3389/fimmu.2018.02454
- Danilova N, Bussmann J, Jekosch K, Steiner LA. The immunoglobulin heavy-chain locus in zebrafish: identification and expression of a previously unknown isotype, immunoglobulin Z. Nat Immunol. 2005;6(3):295–302.
- Hansen JD, Landis ED, Phillips RB. Discovery of a unique Ig heavy-chain isotype (IgT) in rainbow trout: implications for a distinctive B cell developmental pathway in teleost fish. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(19):6919–24.
- Page DM, et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 2013;122(8)–e11.
- Sunyer JO. Evolutionary and functional relationships of B cells from fish and mammals: insights into their novel roles in phagocytosis and presentation of particulate antigen. Infect Disord Drug Targets. 2012;12(3):200–12.
- Park G, et al. Diverse epithelial lymphocytes in zebrafish revealed using a novel scale biopsy method. J Immunol. 2024;213(12):1902–14.
- Zhou Q, et al. Cross-organ single-cell transcriptome profiling reveals macrophage and dendritic cell heterogeneity in zebrafish. Cell Rep. 2023;42(7):112793. doi:10.1016/j.celrep.2023.112793
- Robertson TF, et al. A tessellated lymphoid network provides whole-body T cell surveillance in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023;120(20). doi:10.1073/pnas.2301137120
- Park G, et al. Zebrafish B cell acute lymphoblastic leukemia: new findings in an old model. Oncotarget. 2020;11(15):1292–305.
- Ferrero G, et al. The macrophage-expressed gene (mpeg) 1 identifies a subpopulation of B cells in the adult zebrafish. J Leukoc Biol. 2020;107(3):431–43.
- Borga C, et al. Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. 2019;33(2):333–47.
- Tian Y, et al. The first wave of T lymphopoiesis in zebrafish arises from aorta endothelium independent of hematopoietic stem cells. J Exp Med. 2017;214(11):3347–60.
- Liu X, et al. Zebrafish B cell development without a pre-B cell stage, revealed by CD79 fluorescence reporter transgenes. J Immunol. 2017;199(5):1706–15.
- Wan F, et al. Characterization of gamma delta T cells from zebrafish provides insights into their important role in adaptive humoral immunity. Front Immunol. 2016;7:675. doi:10.3389/fimmu.2016.00675
- Moore FE, et al. Single-cell transcriptional analysis of normal, aberrant, and malignant hematopoiesis in zebrafish. J Exp Med. 2016;213(6):979–92.
- Langenau DM, et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101(19):7369–74.
- Burroughs-Garcia J, et al. Isolating malignant and non-malignant B cells from lck zebrafish. J Vis Exp. 2019;(144):59191. https://www.jove.com/t/59191/isolating-malignant-and-non-malignant-b-cells-from-lckegfp-zebrafish
- Borga C, et al. Molecularly distinct models of zebrafish Myc-induced B cell leukemia. Leukemia. 2019;33(2):559–62.
- Pugach EK, Li P, White R, Zon L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. 2009;(34):1645. https://www.jove.com/t/1645/retro-orbital-injection-in-adult-zebrafish
- Iwasaki M, Kuroda J, Kawakami K, Wada H. Epidermal regulation of bone morphogenesis through the development and regeneration of osteoblasts in the zebrafish scale. Dev Biol. 2018;437(2):105–19.
- Traver D, et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 2003;4(12):1238–46.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
