Matrigel MEFS Matrigel 3: Matrigel üzerine gelen Pasajlanması hESC

Özet

Bu video, besleyici, hücre koşullarda ve ne kadar besleyici sürekli geçit hESC hücre koşulları, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) büyümesini nasıl koruyacağınızı gösteriyor. HESC, Onay pluripotency immünofloresan mikroskobu ile besleyici, hücre koşullarda yetiştirilen da gösterilmiştir. 3 Bölüm 3

Özet

Bu video, besleyici, hücre koşullarda ve ne kadar besleyici sürekli geçit hESC hücre koşulları, insan embriyonik kök hücreleri (hESC) büyümesini nasıl koruyacağınızı gösteriyor. HESC, Onay pluripotency immünofloresan mikroskobu ile besleyici, hücre koşullarda yetiştirilen da gösterilmiştir.

Protokol

Matrigel Matrigel için Yarma hESC

Genellikle Matrigel üzerinde hESC bir konfluent 6 plaka, kuyu, yarma, 4-5 gün sonra tekrar konfluent olma, başka bir Matrigel plaka 1:5 için 1:3 bölünmüş olabilir.

1. Yarma önce yukarıda açıklandığı gibi, CM ve Matrigel plakaları hazırlanır.
2. Bölme gününde, × 1 ile bölme PBS, pH7.4 her iyi yıkayın iyi 1mg/ml Dispase (DMEM/F12 medya ile seyreltilmiş 5mg/ml stok solüsyonu) 1 ml ve 37 inkübe ° C 3 dk.
3. 1 ile her iyi üç kez yıkayın × PBS, pH7.4,, ES medya, 1ml bFGF olmadan eklemek iyi alt kapalı koloniler kazımak için bir hücre kazıyıcı, 50ml şahin tüp askıya hESC toplamak ve santrifüj yoluyla pelet 200g oda sıcaklığında 5 dakika.
4. Matrigel plakalar üzerinde yeniden plakalı hESC, ilk DMEM/F12 ile Matrigel tabak yıkama ve başına 10 ng bFGF ile desteklenmiş CM 2.5ml ekleyin. 10 ng bFGF, pipet hücre süspansiyonu yukarı ve aşağı üç kez ile desteklenmiş CM uygun bir hacmi hESC pelletini tekrar. (NOT: yarma için hESC Matrigel plakaları geldiğinde, yığınları kırmak için çok kolay, bu nedenle üç tur pipetleme yeterli ve daha koloniler üzerinde bozabilir ve tek hücre yapabilir pipetleme.) Temsili miktar 0.5 ml ortalama hESC kümeleri süspansiyon 6-iyi Matrigel plaka nihai bir birim olarak ortalama 3ml ulaşmak için. 37 ° C inkübatör plaka koyun.

Immünofloresan mikroskopi pluripotency belirteçlerin saptanması

İmmünofloresan mikroskopi, kültür sırasında hESC pluripotency belirteçlerinin Ekim-4 ve SSEA-4 ifadesi incelemek için kullanılır.

1. Iyi bir medya aspire ve 1 ile yıkayın × PBS, pH 7.4. 10 dakika düzeltmek için iyi,% 3.7 formaldehit 2ml ekle.
2. 2 dakika süreyle iyi yer ve -20 ° C 2 ml metanol eklemek, 1xPBS pH 7.4 ile durulayın.
3. 5 dakika süreyle% 0.2 sığır serume albumin (BSA) 1ml 1xPBS, pH 7.4 ve blok ile durulayın.
4. Ekim-4 veya anti-h/mSSEA-4 antikor (% 0,2 BSA 1:200 dilüsyon) 1 ml ekleyin ve 1 saat veya 4 ° C'de gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. (NOT: SSEA-4 boyama, doğrudan 6. adıma gidin)
5. 1xPBS, pH 7.4 ile üç kez durulayın FITC-konjuge tavşan IgG (% 0,2 BSA 1:500 dilüsyon), ve 1 saat oda sıcaklığında inkübe ekleyin.
6. 1xPBS, pH 7.4 ile 3 kez durulayın ve iyi merkezi montaj çözümü bir damla koymak (nükleer görselleştirme isteniyorsa DAPI içerebilir). Oje mühür, hücrelerin üstüne lamel koyun, ve immünofloresan mikroskobu ile değerlendirmek.

İnsan embriyonik kök hücre makbuzlar

ES medya (Embriyonik Kök hücre ortam):

DMEM/F12 - 400ml
Nakavt Serum Replacer - 100ml
Non-Essential Amino Asitler - 5ml
200mm GlutaMax / BME Çözüm - 5ml
Penisilin / Streptomisin - 5ml

4 iyice karıştırınız ve 500ml şişelerde son hESC Kültür Medya saklamak ° C En fazla bir iki hafta iyi.

MEF Kültür Medya:

DMEM - 1000ml
FBS - 100ml
Non-Essential Amino Asitler - 10ml
Glutamin - 10ml
Penicllin / Streptomisin - 10ml

İyice karıştırın ve 4 final MEF Kültür Medya saklamak ° C.

200mm Glutamax / BME Çözüm:

Glutamax - 100ml
β-mercaptoethanol (14.3M Stok çözelti) - 140 μ1
Iki ve sonra çözümler kısım 10ml bölümlerini karıştırın. -20 ° C'de alikotları tutun
bFGF Çözümü (stok nihai konsantrasyonu: 10 mikrogram / ml):
bFGF (FGF2) - 50 mikrogram
1xPBS% 0,1 BSA, pH: 7.4 - 5ml

10 mg / ml stok yapmak için 50 mikrogram olarak 5ml% 0.1 BSA bFGF eritin. 500 ul parçaya kısım. -80 ° C saklayınız

Kollajenaz IV Çözümü (1mg/ml):

Kollajenaz IV - 50mg
DMEM/F12 Medya - 50ml

50ml şahin tüp kollajenaz IV tozu ekleyin. Kaput, 50ml steril DMEM/F12 medya karıştırın. <1 dakika vorteksleyin çözüm. toz çözülmüş olduğundan emin olun. Kaputu, yeni bir steril 50ml şahin tüp içine filtresi 0.22 mikron geçmesi. Bu çözüm için iyi saklanan 2 hafta, 4 ° C maksimum

Dispase Çözüm (1mg/ml):

Dispase 5mg/ml - 2ml
DMEM/F12 Medya - 8 ml

-20 ° C'de kısım ticari, 5mg/ml Dispase çözüm ve mağaza DMEM/F12 kullanarak 1mg/ml dispase sulandırınız. Bu çözüm, 1 hafta, 4 tutulmalıdır ° C.

Tartışma

Bu dizi 3 video (MEF) besleyici hücreler (video 1), geçit onları besleyici hücre-levhalar (Video 2) Matrigel nasıl ve ne kadar korumak için fare embriyonik fibroblast insan embriyonik kök hücreleri (hESC) büyümeye nasıl gösterir Matrigel besleyici hücre koşulları (video 3) Pasajlanması hESC. Birçok önceki çalışmalar, bu bakım yaşayabilir, farklılaşmamış hESC inaktive MEF besleyici hücreler kültür gerektirir gösterdi. Ancak, pek çok deney, besleyici hücre kontaminasyon ücretsiz hESC saf bir nüfus gerekmektedir. Bu amaca ulaşmak için, biz nas...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Knockout Serum Replacer (KSR)	Reaktif	GIBCO, by Life Technologies	10828-028
DMEM/F12	Reaktif	GIBCO, by Life Technologies	11330-057
Temel Olmayan Amino Asitler	Reaktif	GIBCO, by Life Technologies	11140-050
GlutaMax	Reaktif	GIBCO, by Life Technologies	35050-061
DMEM	Reaktif	GIBCO, by Life Technologies	11995-065
FBS	Reaktif	Clontech Laboratories	631107
L-glutamin	Reaktif	GIBCO, by Life Technologies	25030-081
BME	Reaktif	Fisher Scientific	BP176-100
bFGF	Reaktif	R&D Systems	233-FB-025
Kollajenaz IV	Reaktif	GIBCO, by Life Technologies	17104-019
Dispase	Reaktif	Stem Cell Technologies	17105-041
Penisilin / Streptomisin	Reaktif	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Jelatin	Reaktif	Chemicon International	ES-006-B
Matrigel	Reaktif	BD Biosciences	354277
Oct-4 antikoru	Reaktif	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-9081
anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Konjuge Fare IgG3	Reaktif	R&D Systems	FAB1435P
FITCI-konjuge antitavşan IgG	Reaktif	Jackson ImmunoResearch	715-095-152