Donmuş Hücreler itibaren Kültür: İnsan Embriyonik kök hücrelerin

Özet

Burada bizim laboratuvar donmuş bir stok tonlar insan embriyonik kök hücre hattı kültür başlar nasıl göstermektedir.

Özet

Burada bizim laboratuvar donmuş bir stok tonlar insan embriyonik kök hücre hattı kültür başlar nasıl göstermektedir. İlk olarak, yaklaşık bir 1-2 gün eski on cm plaka (iki) milyon ışınlanmış fare embriyonik fibroblast besleyici hücreler artık serum ve hücre enkaz kaldırmak için tonlar medya ile durulanır ve ardından tonlar medya ve hücre içinde denge sağlaması için sol kültür inkübatör. Uzun vadeli sıvı azot depolama ya da bir-80C dondurucu bir donmuş hücreleri flakon hızlı çözülme için 37C su banyosunda kaynaklı ve hızlı bir şekilde batık. Donma medya hücreler daha sonra şişeden çıkarılır ve büyük hacimli tonlar medya yerleştirilir. Tonlarının büyük hacimli ortam aşırı serum ve DMSO kaldırılması, insan embriyonik kök hücrelerin renk tonlarını ayırt neden olabilir kolaylaştırır. Hücreler yavaşça süspansiyon döndü ve daha sonra yeniden askıya sonra tohum MEF plaka için kullanılır taze tonlar medya küçük bir hacim. Nazikçe plaka boyunca eşit olarak dağıtmak için bir damla bilge moda tonlar hücreler ekleyerek MEF plaka tohum için önemli olarak kabul edilir. Medya yerini önce yeni kurulan tonlar kültür plakası 48 saat için inkübatör iade edilir, daha sonra bundan sonra her 24 saatte bir beslenir.

Protokol

Donmuş bir stok Çözülme:

1. Tonlar hücreleri çözülme önce zaten hazırladık MEF plaka iyi durumda düzgün bir kaplama olduğunu emin olun. Arzu edilen veya üç gün daha büyük bir plaka, daha az kullanmayı deneyin VERMEYİN. Tüm konik tüpler ve kuyu kullanılan ön-etiket tavsiye edilir.
   
   
2. 37 ° C'ye kadar ön-sıcak tonlar medya Kısım tonlar medya, her bir hat için, steril bir konik tüpe. -80 Den tonlar flakon / s çıkarın ve hemen batığın 37 ° C su banyosunda tüp alt yarısında. Hücrelerin% 80 (küçük donmuş kısmını sol) çözülmüş önce 45-60 saniye sürer.
   
   
3. Hızla tüp, laminer akış kaputu getirmek,% 70 alkol ile sprey ve hafifçe önceden ısıtılmış medya hücreleri aktarmak. Tüp Spin, medyayı çıkartın ve uygun bir ses, taze, önceden ısıtılmış tonlar medya olarak tekrar süspansiyon haline getirin.
   
   
4. MEF medya içine çözülme olacak gibi birçok kuyu olarak aspire edin. Çabuk, önceden ısıtılmış tonlar kısım medya plaka her kuyuya, ekli MEFS rahatsız etmemek için dikkatli olmak. Kaputun kenara plaka ayarlayın. Damla plaka konusunda eşit dağıtılır MEFS olduğu gibi, en iyi sonuçları elde edilir. Tonlar tohum hücreleri MEFS izin gecede 37 ° C inkübatör plaka dikkatle geri. Çözülme ~ 48 saat sonra taze tonlar medya ile değiştirilmesi, ortam değiştirin.

Tartışma

Bu video, bizim laboratuvarda rutin olarak donmuş bir stok tonlar insan embriyonik kök hücre kültürü nasıl kurulacağını göstermektedir. Bu süreç, bir DMSO çözüm dondurulmuş varsa memeli hücresi ile genel kullanım için tâbidir. Verimli çözülme, donmuş bir stok tonlar hücrelerinin yeni bir kültür oluşturulması için gerekli ve deneysel tutarlılık önemlidir.

Malzemeler

Tonlar medya 651,5 ml KO-DMEM 500 ml PenStrep 6,5 ml glutamin 6,5 ml NEAA 6.5 ml beta-mercaptoethanol 0.5ul KO Serum Değiştirme 65 ml Plasmanate 65 ml bFGF2 (10 ng / ml son) 0.65 ml