Bu video in situ hibridizasyon, 2 farklı genler mekansal ve zamansal ifade desen genç civciv embriyolarında görüntülenebilmekte hangi bir yöntem 2-renk tüm montaj göstermektedir. Bu yöntem başlangıçta David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham ve David Ish-Horowicz tarafından tanıtıldı.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı
Bu makalede
Özet
Özet
Civciv embriyo erken embriyonik gelişim çalışmaya değerli bir araçtır. Şeffaflık, erişilebilirlik ve manipülasyon kolaylığı, beyin, nöral tüp, hücre gruplarının ve kalp primordia oluşumu gen ekspresyonu çalışmak için ideal bir araçtır. Bu video 2-renk tüm montaj in situ hibridizasyon farklı adımları gösteriyor; İlk yumurta, embriyo disseke ve paraformaldehid sabit. İkincisi, embriyo prehybridization için işlenir. Embriyo daha sonra iki farklı probları, DIG akuple bir FITC akuple melezleşmiştir. Gecede hibridizasyon, embriyo DIG birleştiğinde antikor ile inkübe edilir. DIG substrat için renk reaksiyonu ve ilgi bölge mavi görünür. Embriyo daha sonra FITC birleştiğinde antikor ile inkübe edilir. Embriyo FITC ile renk reaksiyonu için işlenir ve ilgi bölge kırmızı görünür. Son olarak, embriyo, sabit ve işlenmiş phtograph ve kesit. Bir sorun giderme kılavuzu da sunulmaktadır.
Protokol
Bölüm 1: embriyoların Tespit
- Buz depc-PBS ile diseksiyon çanak doldurun. Buz üzerinde tutun. Forseps ile kabuk dokunarak açın ve yumurta kabuğu parçaları çıkarın.
- Forseps ile albümin kalın çıkarın. Kaba forseps ile yumurta sarısı kesesi, embriyo yukarı bakacak şekilde yatırın.
- Makas kullanarak, yolk kesesi embriyo etrafında bir kare kesti.
- Kaşık kullanarak, buz depc-PBS sarısı ve yerden embriyo çıkarın.
- Mikroskop altında, membranlar ve yumurta sarısı kaldırmak ve fiksasyon çanak transfer.
- Pin depc-PBS kaldırmak. Depc-PBS içinde% 4 PFA ile değiştirin ve 4 O / N düzeltmek ° C
- Fiksatif çıkarın. Buz depc-PBS ile değiştirin. Künt sonuna microcapillary iğne veya mikrodiseksiyon bıçak kullanarak, probun yakalama önlemek için, sinir sistemi ve kalp boşluklarında perfore.
- 2x 10 milyon depc-PBS% 0.1 Tween-20 (PBT) ile yıkayın. ,% 25,% 50, PBT% 75 metanol her 10 milyon dehydrate. % 100 metanol içinde iki kez embriyolar dehydrate. Metanol -20 ° C'de saklayın.
Bölüm 2: Prehybridization
- % 75,% 50 ve% 25 PBT metanol her embriyoların 10 milyon rehidrate. PBT 2x 10 milyon yıkayın.
- Bu arada, buz, soğuk fiksatif (PBT içinde% 4 paraformaldehid) hazırlar. Proteinaz K çözüm ([5 g / ml] son PBT 3 ml / flakon) PBT değiştirin. Tüm flakon flakon hafifçe yuvarlayarak proteinaz K çözüm için açık olduğundan emin olun; pozlama süreleri için bkz Sorun Giderme.
- RNaz ücretsiz Pasteur pipeti kaldır proteinaz K kullanma ve fiksatif (2 ml) ekleyin. Tam 20 milyon için hemen buz üzerine yerleştirin.
- Tüm RT yıkar nutator yapılmaktadır. 2x PBT 10 milyon ve% 50 hibridizasyon tamponu içeren PBT 1x 10mn yıkayın.
- Hibridizasyon tamponu 1x yıkayın. 65 inkübe ° C 4-5 saat için 2 ml hibridizasyon tamponu.
Bölüm 3: problar ile melez embriyolar
- DIG ve Ek FITC birleştiğinde prob sentezi açıklanmıştır. Güçlü bir sinyal vermek için beklenen probu, FITC içeren nükleotidler synhesized; zayıf prob DIG içeren nükleotidler ile sentezlenmiş olmalıdır.
- 2 ml flakon kullanarak hibridizasyon tamponu Prewarm probları (500 ng / ml). Derhal, prob çözüm ile hibridizasyon tamponu değiştirin. Embriyoların kuru izin vermeyin. 65 yaşında 16 saat inkübe ° C.
- Prob hibridizasyon tamponu, 2 yıkar, 30 milyon 65 ° C ile değiştirin. 65 (1 / 1 v / v /) hibridizasyon tamponu / MABT 15 milyon yıkayın ° C
Bölüm 4: DIG antikor kuluçka ve renk reaksiyonu
- MABT 2x20 milyon yıkayın. 1 saat içinde% 2 BBR / MABT yıkayın. % 2% 5 saat yıkayın BBR/20 HISS / MABT (tampon engelleme). Engelleme tampon seyreltilmiş 1:2000 DIG antikor inkübe, 4 O / N ° C nutator üzerinde.
- MABT içinde 3x 10 milyon, her biri 1 saat ve 3x MABT içinde her yıkayın.
- NTMT 2x 20 milyon yıkayın. 10 ml NTMT 200ul NBT / BCIP substrat ekleyin. Hemen şişeden NTMT kaldırın ve 1-2 ml NBT / BCIP tampon ile değiştirin. Karanlıkta koyun. 20 dk sonra renk reaksiyonu Monitör, ve bundan sonraki 20 milyon aralıklarla.
- Renk reaksiyonu (mavi görünmelidir), 10 milyon için PBS içinde yıkayın PBS ile dolu fiksasyon çanak aşağı pin ve PBS içinde% 4 PFA çözüm yerine. 4 O / N ° C Fix
- Yeni sintilasyon flakon aktarın. 2x10 milyon (PBS)% 1 Tween-20 PBST yıkayın. MABT 2x 10 milyon yıkayın.
- 63 ° C'de MABT 30 milyon inkübe
Bölüm 5: FITC antikor kuluçka ve renk reaksiyonu
- Yıkama MABT 2x 10 milyon,% 2 1 saat, 5 saat engelleme tampon BBR / MABT
- Alkalen fosfataz çiftli anti-FITC-antikor (1:500) O / N 4 ° C de inkübe
- MABT içinde 3x 10 milyon, her biri 1 saat ve 3x MABT içinde her yıkayın.
- TBS pH 8.45 ile% 0.1 Tween-20 (TBST) 2x 20 milyon yıkayın.
- Vektör Kırmızı çalışma solüsyonu (5 ml) TBST kitinde reaktifler 1,2 ve 3 ile hazırlayın. Hemen şişeden TBST kaldırmak ve Vektör Kırmızı tamponu ile değiştirin. Karanlıkta koyun. 40 milyon renk reaksiyonu sonra ve daha sonra 30 milyon aralıklarla izleyin.
- Aşağıdaki renk reaksiyonu (kırmızı görünmelidir), PBS için embriyoların transferi.
Bölüm 6: Fiksasyon ve işleme
- PBS içeren fiksasyon çanak Transfer ve 4 RT veya O / N 20 milyon için% 4 PFA düzeltmek ° C.
- PBS, 2x 10 milyon yıkayın. Fotoğrafçılığı için işlemek için, PBS içinde% 20 gliserol (bu embriyolar saydam hale getirecek) transfer. Bir oda oluşturmak için, slaytta bunları üst üste, 2 PVC bant şeritler kesin. Merkezi bir bıçak kullanarak bir kare kesin. Kare kullanarak forseps çıkarın.
- Balmumu kesit için işlemek için, metanol kademeli serisi (% 25,% 50,% 75 ve% 100 PBS, her biri 10 milyon) kurutmak, PBS, yıkama 2x 10 milyon transferi geri.
- Propanol, 3dk ile değiştirin. 1,2,3,4-tetrahydronaphthalene ile değiştirin, 20 milyon Histoclear (2x 1 saat) izledi. 1 saat histoclear / balmumu 1 / 1 (v / v) 60 ° C ile değiştirin. Balmumu bir süreç ile değiştirin.histoloji için.
Bölüm 7: Çözümler
Hibridizasyon tamponu, mağaza -20 ° C Falcon 50 ml: 25 ml formamid; 3.25 ml (20xSSC); 0,5 ml (0,5 M EDTA), 1 ml (% 10 Tween-20), 2.5 ml (% 1'lik SDS) 125 ul (20mg/ml tRNA); 100ul (50 mg / ml heparin) MABT, 100 mM maleik asit hazırlamak, pH 7.5 NaOH ttaneli. 150mm NaCl ve% 0.1 Tween-20 ekleyin.
NTMT kullanımdan hemen önce, 50 ml: 1ml (5M NaCl), 2.5 ml (2M Tris-HCl pH9.5), 1.25 ml (2M MgCl 2), 5 ml (% 10 Tween-20).
TBST: 0.1M Tris-HCl, 0.15m NaCl, pH 8.45,% 0.1 Tween-20.
Bölüm 8: Sorun Giderme
| Sorun | Neden | Çare |
|---|---|---|
| Embriyo kadar kıvrılmış | Yetersiz dehidratasyon / rehidrasyon | Ardışık dehidratasyon / rehidrasyon adımları sırasında 10 milyon aralıklarla koruyun |
| Prob sinyali yok | Probe flakon parçalanır RNaz kirlenme | % 1 agaroz jel üzerinde prob çalıştırın tüm flakon adım 2 Proteinaz K çözüm maruz olduğundan emin olun. |
| Probe etiketler kalp boşlukları bir nöral tüp | Probe sıkışıp | 2. adımda, delikli mikrodiseksiyon bıçak kullanarak tüm boşluklar olduğundan emin olun veya microcapillary |
| Embriyo aşağıdaki hibridizasyon (adım 3) parçalandı | Proteinaz K adım çok uzun Hibridizasyon sıcaklığı çok yüksek sol | Proteinaz K 2 milyon (evre 5 ila 7), 3 milyon (evre 8-10), 4 milyon (evre 11-13), (evre 3 ve 4) 1dk daha uzun bırakılmalıdır olmamalıdır yüksek T o melezleşme etmeyin 65 ° C daha |
Bölüm 9: Temsilcilik Sonuçlar
Temsilcisi embriyolar aşağıda gösterilmiştir: (A) Embriyo (evre HH7) DIG-Sox prob (mavi) ve bir FITC-delta-1 probu (kırmızı) ile etiketlenir. (B) Embriyo (evre HH8) DIG Pax6 prob (mavi) ve FITC Shh probu (kırmızı) ile etiketlenir. Nf, sinir kat, ANP, ön nöral plaka, PSM, presomitic mezoderm, n, notokord nt, nöral tüp). Dr, laboratuvarların Probe hediyeler. C. Tabin, M. Goulding, D. Henrique, ve J. Briscoe. 
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
In situ hibridizasyon yöntemi 2-renk tüm montaj, ilgi duyulan bir ya da iki gen, gen ekspresyonu mekansal ve zamansal desenler belirlemek için kullanılır. Uygulamalar yeni genlerin gen ekspresyonu değerlendirilmesi (örneğin 1,2 yanı sıra, gen ekspresyonu aşağıdaki hakaret değişiklikler (embriyonik manipülasyonlar 3, boncuk 4, ve RNA veya DNA elektroporasyon 5 oluşumlar) içerir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Margaret M. RHF Alkek Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar | |
|---|---|---|---|---|
| Yumurtalar | Hayvan | Charles River Laboratories | Premium Fertile | |
| Stereomikroskop | Mikroskop | Leica Microsystems | MZ9.5 | |
| Marsh Otomatik İnkübatör | Araç | Lyon | RX | |
| Hibridizasyon İnkübatörü | Araç | Hybaid | Micro-4 | |
| Adams Nutator orbital karıştırıcı | Araç | Fisher Scientific | 14-062 | |
| Kavisli Pens (1) | Araç | Electron Microscopy Sciences | 72991-4C | |
| Hassas makas | Araç | Fine Science Tools | 14161-10 | |
| Kaşık | Araç | Fine Science Tools | 10370-18 | |
| Pasteur Kılcal Pipet | Electron Microscopy Sciences | 70950-12 | ||
| Mikrokılcal tüp | Sigma-Aldrich | P1049-1PAK | Dikey mikropipet çekici kullanarak çekin; küt ucu hassas pens ile düzeltin | |
| Mikrodissection bıçağı | Fine Science Tools | 10056-12 | In situ hibridizasyon öncesinde boşlukları delmek için kullanın | |
| Minuten pinleri 0.2mm çap | Fine Science Tools | 26002-20 | Pinleri manyetik bir karıştırıcı kullanarak bir arada tutun; | |
| Sylgard 184 Silikon Elastomer Kürleme Ajanı ve Baz | Reaktif | Dow Corning | 0001986475 | 1 birim Kürleme Ajanı, 9 birim Baz karıştırın; 37°C'de gece boyunca (O/N) bekletin |
| Dietilpirokarbonat (depc) | Reaktif | Acros Organics | 10025025 | 1l PBS'e 1ml depc ekleyin; çalkalayın; otoklavlayın |
| 16% PFA | Reaktif | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Tween-20 | Reaktif | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Proteinaz K | Sigma-Aldrich | P2308-5MG | depc-H₂O içerisinde 10 mg/ml stok olarak 10µl'lik alikotlar halinde hazırlayın. -20°C'de saklayın. | |
| Formamid, deiyonize | Reaktif | Ambion | 9342 | |
| Maya tRNA-25 mg | Reaktif | Invitrogen | 15401-011 | depc-H₂O içerisinde 20 mg/ml stok olarak 125µl'lik alikotlar halinde hazırlayın. -20°C'de saklayın |
| Heparin Sodyum tuzu | Reaktif | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | depc-H₂O içerisinde 50 mg/ml stok olarak 100µl'lik alikotlar halinde hazırlayın. -20°C'de saklayın. |
| SSC x20 pH5.5 | Reaktif | Fisher Scientific | PR-V4261 | |
| EDTA (0.5M) | PR-V4231 | Fisher Scientific | ||
| SDS | Reaktif | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Maleik asit | Reaktif | Fluka | 63189 | |
| B–hringer Bloklama Reaktifi | Reaktif | Roche Group | 11096176001 | MABT içerisinde %2 konsantrasyonda kullanın. Hazırlamak için, MABT ile 60°C'de 20 dk ısıtın. Stok hazırlanıp 1-5 ml'lik alikotlar halinde 20°C'de saklanabilir. |
| Isı ile inaktive edilmiş koyun serumu | Reaktif | Jackson ImmunoResearch | 013-000-121 | 10 ml H₂O içerisinde çözün; 550°C'de 30 dk ısıtın. 1ml'lik alikotlar halinde -20°C'de saklayın. |
| Anti-Digoksinen-AP, Fab fragmanları | Reaktif | Roche Group | 11093274910 | |
| NBT/BCIP stok çözeltisi | Reaktif | Roche Group | 11681451001 | |
| Anti-Flüoresein-AP, Fab fragmanları | Reaktif | Roche Group | 11426338910 | |
| 2M Tris | BP1759-500 | Fisher Scientific | ||
| Vector Red Alkalen Fosfataz Substrat Kiti | Reaktif | Vector Laboratories | SK-5100 | |
| 1,2,3,4-tetrahidronaftalen | Reaktif | Sigma-Aldrich | 429325-100ML | Çeker ocak altında |
Kaynaklar
- Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
- Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, 243-251 (1999).
- Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
- Kawakami, M., Nakanishi, N. The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation. Development. 128, 2509-2515 (2001).
- Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
