Rat Üstün Servikal Ganglia (SCG) kültür Sempatik Nöronlar Protokolü

Özet

Bu, yeni doğmuş sıçan yavruların üstün servikal ganglion (SCG) birincil sempatik nöronlar izole ve kültür nasıl açıklayan bir protokoldür.

Özet

Sıçanlarda üstün servikal ganglion (SCG), sempatik nöronlar içeren küçük, parlak, badem biçimli yapılar. Bu nöronlar, baş ve boyun bölgeleri için sempatik innervations sağlamak ve iyi karakterize ve görece homojen bir nüfus (4) oluşturmaktadır. Sempatik nöronlar NGF, kullanılabilirlik, kendi kültür ve deneysel manipülasyon (2, 3, 6) kolaylaştırır, hayatta kalma, farklılaşma ve aksonal büyüme ve yaygın sinir büyüme faktörü (NGF) bağlıdır. Bu nedenlerden dolayı, kültürlü, sempatik nöronlar nöronal gelişim ve farklılaşma, ve patolojik programlanmış hücre ölümü mekanizmaları ve sinyal iletimi (1, 2, 5 ve 6) da dahil olmak üzere geniş bir yelpazede çalışmalar kullanılmaktadır. Yeni doğan sıçan ve kültür sempatik nöronlar SCG Diseksiyon çok karmaşık değildir ve oldukça hızlı bir şekilde üstesinden gelinebilir. Bu makalede, yeni doğan sıçan yavrular SCG incelemek ve sempatik nöronların kültürleri kurmak için bunları kullanmak için ne kadar detaylı bir şekilde anlatacağız. Makalede ayrıca, hazırlık adımları ve bunu başarmak için gerekli olan çeşitli reaktifler ve ekipman anlatacağız.

Protokol

1. Diseksiyon için hazırlanması:

1. Uygun kültür deneyler doğa bağlı olarak çanak (10 cm veya 6-iyi ya da 24 kuyu tabak, vb), ve sıçan kuyruklu kollajen 24 saat diseksiyonu önce ceket seçin. Sıçan kuyruğu kollajen hazırlanması ve kat kültür yemekleri kullanarak yöntemleri (1) başka bir yerde tarif edilmiştir.
2. % 0.25 tripsin çözüm hazırlayın fosfat tamponlu salin (PBS) (hiçbir EDTA) ve sterilize. -20 º C'de 1 ml alikotları ve mağaza hazırlayın
3. Distile / deiyonize H ₂ O. üridin, 2.5 mM ve 5-FDU içeren bir çözüm hazırlayın Filtre sterilize ve 50 ul alikotları hazırlamak. -20 º C'de muhafaza
4. % 10 ısı inaktive at ser....

Tartışma

Biz kültürlerin Sprague Dawley rat kullanın.

Ganglionlar temizlik zaman ve özen. Tüm artıkları, kan damarları ve yağ çıkarın. Bu adım, daha az ya da çok homojen ve gereksiz hücre tiplerinin bir kültür sağlanmasında önemlidir. Uridine/5-FDU eklenmesi, büyük ölçüde kültür kirlenmesine kalan (mitotik) non-nöronal hücrelerin ortadan kaldırılması ya da en azından onların çoğalmasını baskıladığı.

Buna ek olarak, ayrışma adım sırasında, sabırlı olun ve plakalar üzerine numaralı seribaşı sonra büyük yığınlarda bulunmayan böylece nör.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Pens, Paslanmaz çelik #5	Alet	Roboz Surgical Instruments Co.	RS4976
Makas, DEAVER düz keskin-küt- 43mm bıçaklar - 5.5	Alet	Roboz Surgical Instruments Co.	RS6760
L-Glutamin içeren RPMI 1640	Reaktif	Cellgro	10-040-CV
Fetal Bovine Serum	Reaktif	SAFC Global	12103c
Donör At Serumu	Reaktif	JRH Biosciences	12449	30 dakika boyunca 56°C su banyosunda inkübe ederek ısı ile inaktive edin.
Penisilin/streptomisin	Reaktif	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
EDTA'sız Trypsin	Reaktif	Difco Laboratories	MT 25-050-CI
Uridin	Reaktif	Sigma-Aldrich	U3003
5-Fluoro-5’ deoksiüridin	Reaktif	Sigma-Aldrich	F-8791
NGF	Reaktif	Harlan Laboratories	BT-5025
Diseksiyon Mikroskobu ve ışık kaynağı	Mikroskop
15 ml polipropilen tüpler	Alet	BD Biosciences	352096
Hücre kültürü kapları	Alet	Corning