Polimeraz Zincir Reaksiyonu ve Jel Elektroforezi ile Çevresel Mikroorganizmaların Tespiti

Polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR, toprak, su ve diğer çevresel numunelerde bulunan mikroorganizmaları tespit etmek ve tanımlamak için yaygın olarak uygulanan temel bir biyolojik tekniktir.

Klasik olarak, mikroorganizmalar özel büyüme ortamı kullanılarak laboratuvarlarda kültürlenir. Bununla birlikte, doğal ortamdaki birçok mikrop, ya çok düşük metabolik aktiviteye veya büyüme hızına sahip oldukları için ya da bir kültür kabında tekrarlanamayabilecek çok katı büyüme gereksinimlerine sahip oldukları için "kültürlenemez". Mikroplar arasındaki kültürlenebilirlik farklılıkları aynı zamanda, çevresel bir numuneden gelen mikroorganizmalar kültürlendiğinde, kültürdeki nispi bolluklarının çevredeki gerçek seviyelerini yansıtmayabileceği anlamına gelir.

Karışık bir numunede bulunan küçük miktarlardaki DNA'yı bile spesifik olarak çoğaltabilen PCR'nin ortaya çıkışı, çevresel bir numunede bulunan karmaşık organizma çeşitliliği içinde, kültürlenemeyenler de dahil olmak üzere, ilgilenilen belirli mikropların hızlı bir şekilde tespit edilmesini ve tanımlanmasını mümkün kılar.

Bu videoda PCR ilkeleri tanıtılacaktır. Daha sonra, ilgilenilen bir organizmanın varlığını tespit etmek için çevresel bir numuneden izole edilen DNA üzerinde PCR gerçekleştirmek için genel bir protokol tartışılacaktır. Son olarak, PCR tabanlı mikrop tanımlamanın çeşitli uygulamaları araştırılacaktır.

PCR'nin temel dayanağı, DNA'nın üstel amplifikasyonunu elde etmek için, genellikle farklı sıcaklıklar arasında otomatik olarak döngü yapmak için termodöngüleyici olarak bilinen bir makine ile tekrarlanan sıralı sıcaklık değişiklikleri döngülerini kullanmaktır. DNA sentezi, Thermus aquaticus veya "Taq" gibi kaplıcalarda yaşayan bakterilerden elde edilen DNA polimeraz enzimleri tarafından gerçekleştirilir. Bu polimerazlar ısıya dayanıklıdır ve PCR sırasında kullanılan yüksek sıcaklıklara dayanmalarını sağlar.

Amplikon olarak bilinen hedef dizi, "primerler" olarak bilinen iki kısa nükleotid dizisi kullanılarak DNA şablonundan amplifiye edilir. Tamamlayıcı nükleik asit bağlanmasının yüksek özgüllüğü nedeniyle, primerler, ilgilenilen çok spesifik dizilerin hedeflenen amplifikasyonuna izin verir. PCR, ilgilenilen bir organizmadan yalnızca benzersiz bir diziyi veya benzersiz bir dizi kombinasyonunu çoğaltacak primerler tasarlayarak, karmaşık bir çevresel örnekte bulunan tüm genetik materyaller arasında o organizmanın DNA'sının varlığını farklı şekilde tespit etmek için kullanılabilir.

Her PCR döngüsü üç aşamaya ayrılır. "Denatürasyon" olarak bilinen ilki, genellikle 92 ° C'nin üzerine ayarlanır. C ve yaklaşık 30 s sürer. Denatürasyon, amplifikasyon reaksiyonunun ilerlemesine izin vermek için DNA moleküllerini tek sarmallara ayırmak için kullanılır.

İkinci aşama olan "tavlama", 2 ila 3 ? İki primerin erime sıcaklığının daha düşük olduğu C'nin altında, genellikle 50 ila 65 ° C arasında C ve ayrıca yaklaşık 30 s sürer. Erime sıcaklığı, çift sarmallı DNA moleküllerinin %50'sinin tek sarmallara ayrıldığı sıcaklıktır ve bu nedenle tavlama adımı, primerlerin DNA şablonundaki hedef bölgelerine bağlanmasına izin verir.

Bir PCR döngüsünün üçüncü aşaması, DNA polimeraz primer-şablon dupleksine bağlandığında ve yeni ipliklerin sentezini katalize ettiğinde "uzama" veya "uzama"dır. 72 olarak ayarlayın ? En yaygın olarak kullanılan PCR polimerazı olan Tak için C, bu fazın süresi, amplikonun uzunluğuna, genellikle 500 baz çifti başına 30 s'ye bağlıdır. Her döngüden sonra, amplifiye edilmiş DNA bir kez daha denatüre edilir ve yeni bir şablon görevi görür, bu da PCR ürünlerinin miktarında üstel bir artışa yol açar.

Reaksiyon tamamlandıktan sonra, PCR ürünleri, elektroforez olarak bilinen bir işlem olan genellikle polimer agarozdan yapılan bir "jel" üzerinde boyuta göre çözülebilir. Jel boyunca bir elektrik alanı uygulanır ve DNA moleküllerinin omurgasındaki negatif yükler, alanın pozitif ucuna doğru göç etmelerine neden olur. Genel olarak konuşursak, daha büyük olan doğrusal DNA moleküllerinin jel matrisinden geçmesi daha uzun sürecektir.

Artık PCR'nin nasıl çalıştığını anladığınıza göre, reaksiyonun çevresel bir numunedeki mikroorganizmaları tanımlamak için nasıl kullanılabileceğine bir göz atalım.

Başlamak için, işlenecek numune sayısına bağlı olarak gereken her bir reaktifin hacmini ve ayrıca pipetleme hatalarını hesaba katmak için ek %10'u hesaplayın. Reaksiyonun çalıştığından emin olmak için hedef bölgeyi içeren pozitif bir kontrol şablonu dahil edilmelidir; reaksiyon bileşenlerinden herhangi birinde kontaminasyonu dışlamak için hiçbir DNA şablonunun dahil edilmediği negatif bir kontrolün yanı sıra. Taq polimeraz enzimini buz üzerinde tutun ve kontaminasyonu önlemek için reaktiflerin geri kalanını ve DNA örneklerini oda sıcaklığında belirlenmiş bir laminer akış başlığında çözün.

Tüm reaktifler çözüldükten sonra, her bir reaktifin hesaplanan hacmini, moleküllerin tüp yüzeyine adsorpsiyonu nedeniyle reaktif miktarlarındaki tutarsızlıkları en aza indiren düşük bağlayıcı bir mikrofüj tüpüne ekleyerek reaktif "ana karışımını" oluşturun. Eklemeden önce her bir reaktifi nazikçe girdap haline getirin ve santrifüjleyin. Ana karışım hazırlandıktan sonra, santrifüjleme ile karıştırmak ve toplamak için girdap.

Kontroller de dahil olmak üzere her numune için bir tüp belirtmek için 8 tüplü bir PCR şeridini etiketleyin. Şeridin her bir tüpüne uygun miktarda PCR ana karışımı dağıtın. Ardından, her DNA örneğini ilgili tüpe ekleyin.

Şerit kapağını şerit tüpüne güvenli bir şekilde yerleştirin ve bir şerit adaptörlü bir mini santrifüjde kısa bir süre santrifüjleyin. Ardından, tüpü termocycler'a yerleştirin ve reaksiyonu uygun PCR programına göre çalıştırın.

PCR çalıştırılırken, PCR ürünlerinin elektroforezi için bir agaroz jeli hazırlayın. PCR ürünlerini beklenen boyutlarına göre çözebilecek bir konsantrasyona sahip bir jel için uygun miktarda agaroz tozu tartın. Agarozu 125 mL'lik bir şişeye ekleyin, ardından jel dökümünün hacmine bağlı olarak şişeye uygun hacimde jel akan tampon ekleyin ve karıştırmak için döndürün. agaroz çözeltisini 1 dakika boyunca yüksek güçte mikrodalgada pişirin. Tamamlandığında, şişeyi döndürerek agarozun tamamen çözündüğünü doğrulayın ve gerekirse mikrodalgada 30 saniyelik artışlarla tekrarlayın.

Kapağı şişeye sıkıca sabitleyin ve agaroz çözeltisini 50 ° C'ye soğutun. C: Şişeyi akan soğuk su altında döndürerek. Soğuduktan sonra 1 ? Agaroza L etidyum bromür. Etidyum bromür potansiyel olarak kanserojen olduğundan, gözlük, laboratuvar önlüğü ve etidyum bromüre dayanıklı eldivenler gibi kişisel koruyucu ekipman giydiğinizden emin olun.

Agaroz çözeltisini bir elektroforez jel döküm tepsisine dökün ve agarozun içinde hava kabarcığı sıkışmadığından emin olun. Çözeltiye gerekli sayıda kuyucuk içeren bir tarak yerleştirin. Jeli katılaşması için 20 ila 30 dakika oda sıcaklığında bırakın. Jel sertleştikten sonra, işlem sırasında jeli yırtmamaya dikkat ederek tarağı dikkatlice çıkarın.

Katılaşmış jeli elektroforez odasına yerleştirin. Jel sadece suya batırana kadar hazneye LB tamponu ekleyin. Bir Parafilm parçası üzerine, PCR ürünlerinin beklenen boyutu için uygun bir aralıkta bir DNA merdiveni "noktası" pipetleyin. Termocycler'dan tamamlanan reaksiyonlarla PCR tüplerini alın. Kısa santrifüjleme ile PCR tüplerindeki kondensatları toplayın ve 8 ? Parafilm üzerine her numunenin L'si. 2 ekle ? Boyanın nihai konsantrasyonu 2x olacak şekilde PCR ürününün her bir noktasına L 10x boya yükleyin.

Numuneleri ve merdiveni, jeli delmemeye dikkat ederek agaroz jel içindeki belirtilen kuyucuklara yükleyin. Yükleme tamamlandıktan sonra, elektroforez odasının kapağını kapatın ve elektrotları güç kaynağına bağlayın. DNA negatif yüklü olduğundan ve pozitif elektroda doğru hareket ettiğinden, kuyucukların negatif elektroda daha yakın tarafta olduğundan emin olun. Güç kaynağını açın ve elektroforez odasının boyutuna ve kullanılan tampon sistemine uygun bir voltaja ayarlayın. Elektroforezi "çalışacak" şekilde ayarlayın. Elektroforez düzgün bir şekilde ilerliyorsa, odanın kenarlarından yukarı doğru hareket eden küçük kabarcıklar gözlenecektir.

Boya cephesi jelin aşağısına yeterince ilerlediğinde, güç kaynağını kapatın. Elektroforezli ürünleri görselleştirmek için jeli dikkatlice bir jel görüntüleyiciye taşıyın. Koruyucu bir kalkan ile UV ışığını açın ve jel üzerindeki DNA bantlarını görselleştirin. Çevresel örnekte ilgilenilen türün varlığını gösteren beklenen modelle eşleşip eşleşmediğini görmek için bantların konumunu analiz edin.

Artık PCR'nin nasıl yapıldığını gördüğünüze göre, ortamdaki ilgilenilen mikroorganizmaları tespit etmek için uygulandığı çeşitli yollara bakalım.

PCR tabanlı çevresel mikrobiyal tespitin bir kullanımı, tatlı su kütlelerinde ve klorsuz havuzlarda bulunan ve insan sinir sistemine genellikle ölümcül şekilde saldırabilen tek hücreli bir organizma olan "beyin yiyen amip" Naegleria fowleri gibi hastalığa neden olan organizmaları tanımlamaktır. Bu ölümcül mikrobun su örneklerinde veya şüpheli hastaların beyin omurilik sıvısında varlığı, amip genomundaki benzersiz DNA dizilerini hedefleyen primerler kullanılarak PCR yapılarak test edilebilir.

PCR tabanlı mikrobiyal tanımlama için başka bir uygulama, halk sağlığı izleme ve hastalık salgını araştırmalarının bir parçası olarak, gıda işletmelerinin yakınında yakalanan sineklerde patojenik bakterilerin varlığını test etmektir.

Burada araştırmacılar, Salmonella ve Listeria gibi patojenik bakterilerin varlığını, önce bakterileri hem vücut yüzeyinden hem de sineklerin sindirim kanalından izole ederek ve daha sonra bu ilgili türler için zenginleştirmek için türe özgü kültür koşullarını kullanarak aradılar. Kültürlenen herhangi bir bakteriden DNA çıkarıldıktan sonra, kimliklerini test etmek için ticari olarak temin edilebilen türe özgü tespit PCR kitleri kullanıldı.

Son olarak, önemli halk sağlığı sorunları sunan Staphylococcus aureus gibi antibiyotiğe dirençli patojenik bakterilerin farklı suşları PCR ile tanımlanabilir ve ayırt edilebilir.

Bu örnekte, araştırmacılar klinik örneklerden S. aureus'u izole ettiler ve kültürlediler, daha sonra bakteri kolonilerinden DNA'yı çıkardılar ve PCR gerçekleştirdiler. Buradaki amplifikasyon reaksiyonları "çoğullanmış" idi, yani bakteri genomunun farklı benzersiz bölgelerini hedefleyen çoklu primer setleri aynı reaksiyonda birleştirildi. Bireysel primer setleri, PCR ürünlerinin yalnızca bazı suşların DNA'sından kaynaklandığı, ancak diğerlerinin DNA'sından kaynaklanmadığı şekilde tasarlanmıştır, böylece kombinasyon halinde, her suş için benzersiz ürün bandı modelleri gözlenmiştir.

Az önce JoVE'nin PCR tabanlı mikroorganizma tespiti ile ilgili videosunu izlediniz. Polimeraz zincir reaksiyonunun arkasındaki ilkelere baktık; çevresel mikroorganizmalardan ekstrakte edilen DNA üzerinde PCR gerçekleştirmek için bir protokol; ve son olarak, farklı türdeki çevresel veya klinik numunelerde ilgilenilen organizmaları test etmek için bu tekniğin birkaç özel uygulaması. İzlediğiniz için teşekkürler!