Kültürlenebilir Metodoloji ile Alg Sayımı

Algler, çeşitli ortamlarda yaşayan fotosentetik organizmalardır. Toprakta yaşayan algler laboratuvarda kültürlenebilir ve konsantrasyonları basit hesaplamalar kullanılarak numaralandırılabilir.

Algler, ortak bir özelliğe sahip, yani fotosentetik pigmentlere, genellikle klorofillere sahip olan oldukça heterojen bir organizma grubudur. Alglerin büyük çoğunluğu mikroskobiktir, ancak grubun kesin tanımı tartışmalıdır ve ayrıca tipik olarak makroskopik olan deniz yosunlarını da içerir.

Çevrede algler, göller veya rezervuarlar gibi yüzey sularında sorunlara neden olabilir, su besin maddelerini tüketen, su yüzeyinin ötesine geçen ışığı engelleyen ve toksinleri serbest bırakan alg patlamaları oluşturabilir. Örneklerdeki algleri numaralandırma yeteneği, bilim adamlarının bir ekosistemin sağlığını ve alg aşırı büyümesinin potansiyel riskini değerlendirmesine olanak tanır.

Topraklardaki alg popülasyonları sıklıkla gram başına yaklaşık on bin hücrede görülür. Algler, fotosentez için toprak yüzeyinin çok altına nüfuz edemeyen güneş ışığına ihtiyaç duyduğundan, bu sayılar tipik olarak karşılık gelen bakteri, mantar veya aktinomiset konsantrasyonlarından daha düşüktür.

Bu video, laboratuvarda topraktan alglerin nasıl kültürleneceğini ve başlangıç toprak numunesindeki alg konsantrasyonunun nasıl numaralandırılacağını gösterecektir.

Alglerin ekosistemler üzerinde faydalı etkileri vardır. Mavi-yeşil algler veya siyanobakteriler, nitrojen gazını atmosferden sabitleme yeteneğine sahiptir, bu da onları yarı kurak ortamlarda toprak nitrojenini arttırmada ve ayrıca biyoyakıt üretimi için potansiyel bir araç olarak faydalı kılar.

Diğer algler ökaryotiktir ve tek hücreliden deniz yosunu gibi karmaşık çok hücreli organizmalara kadar değişir. Bunlar arasında yeşil algler, öglenoitler, dinoflagellatlar ve diatomlar, kahverengi algler ve kırmızı algler bulunur.

Algler fototrofiktir, fotosentezden enerji ve karbondioksitten biyokütle için karbon elde eder. Sonuç olarak, ilave bir organik karbon substratı olmadan tamamen inorganik besinlerden oluşan ortamlarda yetiştirilebilirler. Bu organik substrat eksikliği, büyüme için dış organik karbona bağımlı olan heterotrofik bakterilerin büyümesini engeller.

Sayım için algleri kültürlemek için, toprak numuneleri seri olarak mL başına 10-6 g toprağa on kat seyreltilir ve büyüme ortamında kültürlenir. Her seyreltme için birkaç kopya yapılır. Daha sonra alg büyümesine izin vermek için iyi aydınlatılmış bir alanda 4 haftaya kadar inkübe edilirler.

Herhangi bir seyreltmede alglerin varlığı, ortamdaki tipik olarak yeşil bir balçık olarak görünecek olan pozitif bir büyüme işareti ile belirlenir. Son olarak, alg büyümesi için tasarlanmış ampirik olarak geliştirilmiş MPN tablolarına başvurulur ve kullanıcının seyreltme replikalarındaki büyümeye dayalı olarak orijinal alg konsantrasyonunu belirlemesini sağlar. MPN yöntemi, alglerin yok olana kadar seyreltileceği şekilde numunelerin seri seyreltilmesine dayanır, bu da bir miktar seyreltmede alg büyümesinin meydana gelmediği anlamına gelir.

Artık numunelerden alg yetiştirmenin ve numaralandırmanın arkasındaki kavramlara aşina olduğumuza göre, bunun laboratuvarda nasıl yapıldığına bir göz atalım.

Deneye başlamak için, önce tarladan nemli olarak toplanmış veya yeniden sulandırılmış ve 2 ila 3 gün nemli kalmış 10 gram nemli toprağı ağırlıklandırın. Toprak doymuş olmalı ama doymamış olmalı.

Daha sonra, önce 10 gram toprağı 95 mL Modifiye Bristol çözeltisine veya MBS'ye ekleyerek on katlı bir seyreltme serisi hazırlayın. Bunu süspansiyon A olarak etiketleyin.

Kuvvetlice çalkaladıktan sonra, bir test tüpüne 1 mL süspansiyon A ila 9 mL MBS ekleyerek seyreltme serisine devam edin. mL başına 10-6 g'a kadar seyreltmeler elde etmek için bu on katlı seyreltme serisine 4 kez daha devam edin.

Daha sonra, her biri 10-1 ila 10-5 dilüsyonlarının her birinden 1 mL ile 9 mL MBS içeren 5 replike tüpü aşılayın. Bu, 10-2'den 10-6'ya kadar her seyreltme için 5 kopya tüp ile sonuçlanır. Tüpleri gevşek bir şekilde kapatın.

Son olarak, tüpleri güneş ışığına maruz kalan bir alanda tam 4 hafta boyunca inkübe edin. Tüpleri her 7 günde bir alg büyümesi açısından gözlemleyin. Alg büyümesi sergileyen tüpler yeşil görünecektir.

En Olası Sayı veya MPN analizi, konsantre bir başlangıç substratının seyreltilmesinden büyüyen mikroorganizmaları numaralandırmak için yaygın olarak kullanılan bir matematiksel yöntemdir. Çözeltilerin seyreltme faktörleri ve her seyreltmede pozitif büyüme belirtileri gösteren tüplerin sayısı dikkate alınarak, orijinal toprak numunesinin gramı başına en olası organizma sayısı bir MPN tablosu ve basit formül kullanılarak hesaplanabilir.

MPN'yi hesaplamak için, en yüksek sayıda pozitif replike tüpe sahip en yüksek seyreltmeye p1 etiketi atanır, bu durumda tüp C'nin kopyaları. Buna karşılık, D ve E'den gelen tüplerin bazıları negatiftir ve alg büyümesi belirtisi yoktur.

Pozitif büyüme gösteren sonraki iki yüksek dilüsyondaki tüplerin sayısı p2 ve p3 olarak etiketlenir. Burada, p2 = D ve p3 = E.

p1 değeri, MPN tablosundaki ilk sütuna bakılarak bulunabilir. Aynısı p2 sütunu için de yapılmalıdır. Son olarak, üst kısımdaki p3 değeri, p1 ve p2 ile tanımlanan ikisini kesiştirmek için kullanılır ve mL başına en olası organizma sayısının bir değerini verir.

Daha sonra, orijinal toprak örneğindeki gram başına organizma konsantrasyonunu hesaplamak için, bu değer, p2'nin atandığı seyreltmedeki toprak konsantrasyonuna bölünür. Aşağıdaki denklem, bir gram toprak başına gerçek organizma sayısını tanımlamak için kullanılır.

Alg sayımı ve MPN analizi, bazıları burada incelenen geniş bir uygulama yelpazesine sahiptir.

Alg sayımının bu kültür yöntemi çeşitli ortamlarda kullanılabilir. Alg seviyelerini belirlemek ve zararlı alg patlamalarının risklerini değerlendirmek için nehirlere veya göllere uygulanabilir. Alternatif olarak, yüzme havuzları, su çeşmeleri veya diğer içme suyu kaynakları dahil olmak üzere insanlar tarafından daha doğrudan kullanılan suların temizliğini ve güvenliğini değerlendirmek için kullanılabilir. İdeal olarak, içme suyu örneklerinde ve yüzme havuzlarında yosun yoktur.

Sayım için MPN analizi, diğer alg olmayan mikroorganizmalara da uygulanabilir. Örneğin, su kalitesi, koliformlar veya E. coli gibi indikatör organizmalar kullanılarak değerlendirilebilir. Burada numuneler, indikatör organizmaların varlığında renk veya floresan üretmek üzere değiştirilmiş kimyasallar içeren ortamlarla kültürlenebilir. Bu deneyin tek tek hücrelerde birden fazla küçük kopyası gerçekleştirilerek, numuneler bilinen bir konsantrasyona seyreltilerek, pozitif hücrelerin oranı, spesifik indikatör organizma için bir MPN tablosuna ve belirlenen numunelerdeki başlangıç konsantrasyonuna atıfta bulunulabilir.

Algler ayrıca ticari uygulamalar için de kültürlenebilir. Örneğin, bazı biyogübre türleri, bitkilerle simbiyont görevi görebilen mavi-yeşil algleri kullanır, bu da onların fikstürüne ve azot alımına yardımcı olur, bu da özellikle fakir toprağa sahip bölgelerde mahsulün büyümesine yardımcı olmada yararlıdır. Benzer şekilde, algler biyoyakıtlar için veya hayvancılık için besin açısından zengin bir gıda kaynağı olarak yetiştirilebilir.

JoVE'nin alg kültürü ve numaralandırma ile tanışmasını az önce izlediniz. Artık alg büyümesi için toprak örneklerini nasıl seyrelteceğinizi, laboratuvarda algleri nasıl kültürleyeceğinizi ve başlangıç örneklerinizin alg konsantrasyonunu nasıl numaralandıracağınızı anlamalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler!