Çevresel Örneklerde Bakteriyofajların Tespiti

1. Kolifaj içeren bir kanalizasyon veya su örneği alın.
2. Numuneyi Tris tamponu kullanarak 1:10 ve 1:100 oranında seyreltin. Bunu, 1.0 mL kültürü 9 mL Tris tamponuna aktararak ve ardından ikinci bir 10 kat seyreltme yaparak yapın.
3. Üç tüp yumuşak agar (3 mL tüp başına %0,7 besleyici agar veya triptikaz soya agarı) bir buhar banyosuna veya otoklava yerleştirerek eritin.
4. Agarın sıcaklığının 45 °C'ye ayarlanmasını sağlamak için agarı 15 dakika boyunca 45-48 °C'de bir su banyosuna yerleştirin.
5. İlk tüpe 1 mL E. coli¹ log faz suyu kültürü ve 1 mL seyreltilmemiş numune ekleyin.
6. Tüpü su banyosundan çıkarın ve süspansiyonu 2-3 saniye karıştırmak için elleriniz arasında hafifçe sallayın.
7. Tüpteki suyu bir kağıt havluyla silin ve agarı, alt agar (normal besin agar veya triptikaz soya agar) içeren önceden hazırlanmış bir Petri kabının üzerine dökün.
8. Üst agarı yaymak için plakayı hızla döndürün. Agarın tüm yüzeyi kapladığından emin olun.
9. 1 mL bakteri ve her numune seyreltmesinden 1 mL kullanarak diğer iki yumuşak agar tüpü ile Adım 5-8'i tekrarlayın (Şekil 2).
10. Agar katılaştıktan sonra Petri kaplarını ters çevirin ve 37 °C'de 48 saat inkübe edin. Petri kabının kapağındaki nemi alın. Bir plağın üzerine bir damla nem düşerse, virüsün agar yüzeyine yayılmasına neden olur.
11. İnkübasyondan sonra, her seyreltmedeki plak sayısını sayın (Şekil 3) ve orijinal numunedeki faj konsantrasyonunu hesaplayın. Plakların boyutundaki veya görünümündeki herhangi bir büyük farkı kaydedin.

Şekil 2. Kolifaj sayımı için üst agar kullanılarak bir bakteri çiminin hazırlanması için prosedür.

Şekil 3. Bakteriyel bir çim üzerinde faj plakları.

¹E. coli suşu ATCC 15597 genellikle kanalizasyon örneklerinden en fazla sayıda plak üretecektir. 100 mL besin veya triptikaz soya suyu içeren 250 mL'lik bir Erlenmeyer şişesinde gece boyunca büyütülmeli ve 35 ° C'de çalkalama koşulları altında inkübe edilmelidir. Faj testinden 3 saat önce, bu kültürün bir mL'sini 100 mL besin veya triptikaz soya suyu içeren taze bir şişeye aşılayın ve 35-37 ° C'de çalkalanan bir su banyosuna koyun. Bu, bakterilerin büyümenin günlük aşamasında olmasını sağlayacaktır.