2.12: Çevresel Örneklerde Bakteriyofajların Tespiti

1. Kolifaj içeren bir kanalizasyon veya su örneği alın.
2. Numuneyi Tris tamponu kullanarak 1:10 ve 1:100 oranında seyreltin. Bunu, 1.0 mL kültürü 9 mL Tris tamponuna aktararak ve ardından ikinci bir 10 kat seyreltme yaparak yapın.
3. Üç tüp yumuşak agar (3 mL tüp başına %0,7 besleyici agar veya triptikaz soya agarı) bir buhar banyosuna veya otoklava yerleştirerek eritin.
4. Agarın sıcaklığının 45 °C'ye ayarlanmasını sağlamak için agarı 15 dakika boyunca 45-48 °C'de bir su banyosuna yerleştirin.
5. İlk tüpe 1 mL E. coli¹ log faz suyu kültürü ve 1 mL seyreltilmemiş numune ekleyin.
6. Tüpü su banyosundan çıkarın ve süspansiyonu 2-3 saniye karıştırmak için elleriniz arasında hafifçe sallayın.
7. Tüpteki suyu bir kağıt havluyla silin ve agarı, alt agar (normal besin agar veya triptikaz soya agar) içeren önceden hazırlanmış bir Petri kabının üzerine dökün.
8. Üst agarı yaymak için plakayı hızla döndürün. Agarın tüm yüzeyi kapladığından emin olun.
9. 1 mL bakteri ve her numune seyreltmesinden 1 mL kullanarak diğer iki yumuşak agar tüpü ile Adım 5-8'i tekrarlayın (Şekil 2).
10. Agar katılaştıktan sonra Petri kaplarını ters çevirin ve 37 °C'de 48 saat inkübe edin. Petri kabının kapağındaki nemi alın. Bir plağın üzerine bir damla nem düşerse, virüsün agar yüzeyine yayılmasına neden olur.
11. İnkübasyondan sonra, her seyreltmedeki plak sayısını sayın (Şekil 3) ve orijinal numunedeki faj konsantrasyonunu hesaplayın. Plakların boyutundaki veya görünümündeki herhangi bir büyük farkı kaydedin.

Şekil 2. Kolifaj sayımı için üst agar kullanılarak bir bakteri çiminin hazırlanması için prosedür.

Şekil 3. Bakteriyel bir çim üzerinde faj plakları.

¹E. coli suşu ATCC 15597 genellikle kanalizasyon örneklerinden en fazla sayıda plak üretecektir. 100 mL besin veya triptikaz soya suyu içeren 250 mL'lik bir Erlenmeyer şişesinde gece boyunca büyütülmeli ve 35 ° C'de çalkalama koşulları altında inkübe edilmelidir. Faj testinden 3 saat önce, bu kültürün bir mL'sini 100 mL besin veya triptikaz soya suyu içeren taze bir şişeye aşılayın ve 35-37 ° C'de çalkalanan bir su banyosuna koyun. Bu, bakterilerin büyümenin günlük aşamasında olmasını sağlayacaktır.

Virüsler, soğuk algınlığı ve grip, hepatit ve HIV gibi birçok hastalıktan sorumlu olan bulaşıcı biyolojik parçacıklardır.

Virüsler, bir DNA veya RNA genomundan oluşan, kapsid olarak bilinen bir protein kılıfının içine sarılmış, bazen ek bir lipit zarfı olan biyolojik parçacıklardır. Virüslerin kendi başlarına metabolik veya üreme yetenekleri yoktur ve kendilerinin daha fazla kopyasını yapmak için canlı hücreleri istila etmeli ve hücresel makinelerini ele geçirmelidir.

Hem bakteriler gibi prokaryotik hücreler hem de insanlarınki gibi ökaryotik hücreler, belirli virüs sınıfları tarafından enfekte olabilir. Spesifik olarak, bakteriyofajlar bakterileri enfekte eden virüslerdir. Örneğin, kolifajlar, bazı suşları gıda zehirlenmesine neden olabilen ve su kaynağının dışkı kontaminasyonunun bir göstergesi olan yaygın bir bağırsak bakterisi olan E. coli'yi enfekte eden fajlardır.

Fajların kendilerinin genellikle insanlarda patojenik olduğu bilinmemekle birlikte, aynı zamanda fekal olarak bulaşan ancak test edilmesi zor olan hastalığa neden olan enterovirüsler için güvenilir vekil göstergeler olduklarına dair kanıtlar vardır. Bakteriyofajları numaralandırmak için nispeten hızlı ve ucuz yöntemlerin mevcudiyeti, onları çevresel örneklerde dışkı kontaminasyonunun değerlendirilmesi için çekici bir araç haline getirir.

Bu video, faj sayımının arkasındaki ilkeleri tanıtacak; plak tahlili olarak bilinen fajları ölçmek için bir protokol göstermek; ve son olarak, fajların ve diğer virüslerin tespiti ve sayımı için çeşitli çevre bilimi uygulamalarını keşfedin.

Bakteriyofajlar, tüm virüsler gibi, üremek için canlı hücreleri, bu durumda bakterileri parazitleştirmelidir.

Fajlar bunu, bakteri hücre yüzeyine inip bağlanarak ve genetik materyallerini hücreye enjekte ederek yaparlar. Hücrenin içine girdikten sonra, viral genom kopyalanır ve viral kapsidin protein bileşenleri, her ikisi de konakçı hücrenin biyokimyasal makinesi kullanılarak üretilir. Faj parçacıkları bir araya getirildikten sonra, bakterilerden salınırlar, genellikle konakçıyı parçalayarak ve patlayarak, işlem sırasında konakçı hücreyi öldürürler.

Bir numunedeki faj konsantrasyonunu belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntem, bu litik aktiviteden yararlanır. Bu teknikte, numuneden alınan faj bakteri ve yumuşak agar ile karıştırılır. Bu karışım, substrat olarak normal agar ile Petri kaplarına dökülür ve üst tabaka bir kaplama oluşturur.

Bakteriler o kadar yüksek bir konsantrasyondadır ki sürekli bir çim oluştururlar. Fajların enfekte ettiği her bakterinin canlı olduğundan ve fajın döl üretmesine izin verdiğinden emin olmak için bakteriler, büyümenin log aşamasında olan kültürden elde edilmelidir.

Bir faj parçacığı bir bakteriyi enfekte ettiğinde ve parçaladığında, faj dölleri yakındaki bakteri hücrelerine yayılır ve enfeksiyona devam eder. Yumuşak agar, faj parçacıklarının difüzyonunu kısıtlar. Sonunda, plak olarak bilinen bir açıklık alanı oluşacaktır.

Faj yeterince düşük bir konsantrasyona seyreltilirse, bakteri çimi üzerinde ayrık, bireysel plaklar gözlenebilir. Bunlar sayılabilir ve orijinal numunenin mL'si başına plak oluşturan birimlerin veya PFU'ların sayısını hesaplamak için kullanılabilir.

Artık fajların bakterileri nasıl enfekte ettiğini ve bu aktivitenin faj konsantrasyonunu ölçmek için nasıl kullanılabileceğini anladığınıza göre, çevresel su örneklerinde fajları numaralandırmak için bir plak tahlili kullanmak için bir protokol gözden geçirelim.

Testi gerçekleştirmeden bir gün önce, bir E. coli suşu ATCC 15597 kolonisini 250 mL'lik bir Erlenmeyer şişesinde 100 mL triptikaz soya suyuna aşılayın. 35 ° C'de çalkalayarak inkübe edin. C bir gecede.

Testten 3 saat önce, gece boyunca 1 mL E. coli kültürünü 100 mL taze bir et suyuna aşılayın. Bu yeni kültürü 35 ila 37 °C arasındaki bir sıcaklıkta çalkalanan bir su banyosuna yerleştirin. Bu, tahlil başladığında bakterilerin büyümenin günlük aşamasında olmasını sağlar.

Plak tahlilini başlatmak için, 9 mL Tris tamponu kullanarak su numunesinin 10 ve 100 kat seri seyreltmelerini yapın.

Bir buhar banyosu kullanarak, triptikaz soya veya besin agarı olmak üzere% 0.7 yumuşak üst agardan oluşan üç adet 5 mL'lik tüpü eritin. Eridikten sonra, 45 ila 48 ° C'de bir su banyosuna koyun. Agarın sıcaklığının 45 ° C'ye düşmesi için en az 15 dakika C 'dir.

İlk yumuşak agar tüpüne, önceden hazırlanmış log faz E. coli kültüründen 1 mL ve seyreltilmemiş su örneğinden 1 mL ekleyin. Tüpü su banyosundan çıkarın ve süspansiyonu karıştırmak için ellerinizin arasında 2-3 saniye hafifçe sallayın.

Yumuşak agarı, triptikaz, soya veya besin agar ile önceden hazırlanmış bir Petri kabının üzerine dökün. Plakayı yaymak için hızlı bir şekilde döndürün ve tüm yüzeyi kapladığından emin olun.

Seyreltilmiş numunelerin her birinden 1 mL kullanarak diğer iki tüp için aşılama ve kaplamayı tekrarlayın.

Üst agar katılaştıktan sonra, bulaşıkları ters çevirin ve 37 ° C'de inkübe edin 48 saat için C.

Kuluçka işleminden sonra, her plakadaki veba sayısını sayın. Sayımdan, orijinal numunedeki faj konsantrasyonunu hesaplayın

Örneğin, 10 katlı seyreltme plakasından 9 plak elde edilmişse, orijinal su numunesinde 9 çarpı 10 bölü 1 mL veya 90 PFUs/mL kolifaj vardır.

Artık faj plak tahlillerinin nasıl yapıldığını gördüğünüze göre, plak tahlillerinin çeşitli kaynaklardan faj ve diğer virüs türlerini numaralandırmak için nasıl kullanılabileceğine bakalım.

Plak tahlili bazlı yöntemler, bakteriyofajı toprak gibi farklı çevresel örneklerden izole etmek için kullanılabilir. Bu örnekte, araştırmacılar ilk olarak filtrasyon yoluyla topraktan faj topladılar. Faj daha sonra bir plak tahlilinde ortak toprak bakterileri Arthrobacter'i enfekte etmek için kullanıldı. Fajlar tek tek plaklardan toplandı ve yeni agar plakalarına çizildi ve daha sonra bakteri içeren üst agar ile kaplandı. Faj konsantrasyonu, çizginin uzunluğu boyunca azalır, böylece muhtemelen tek bir faj türü tarafından oluşturulan ayrı plaklar elde edilebilir. Bu bireysel plaklar daha sonra içindeki fajları daha fazla analiz etmek için seçilebilir.

Bakteriyofajlara ek olarak, plak tahlilleri, memelileri enfekte eden grip gibi virüsler de dahil olmak üzere diğer virüslerle de yapılabilir. Bunu yapmak için, memeli hücreleri önce doku kültürü kaplarında tek tabakalar olarak büyütülür. Virüsleri içeren ortam daha sonra, hücreler jel benzeri agaroz gibi hareketsizleştirici bir ortam ile kaplanmadan önce, enfeksiyonun oluşmasına izin vermek için hücrelere eklenir. İki haftaya kadar sürebilen bir kuluçka döneminden sonra, enfekte olmuş hücreler, plakların görüntülenmesine ve sayılmasına izin vermek için sabitlenir ve boyanır.

Son olarak, çevreden toplanan örneklere ek olarak, plak tahlilleri, enfekte bireylerden alınan doku örneklerindeki virüsleri tespit etmek ve sayımlamak için yararlıdır. Burada araştırmacılar, gama-herpes virüsleri ile enfekte olmuş farelerden akciğer dokuları elde ettiler ve homojenize ettiler. Bu virüs içeren homojenat daha sonra memeli hücre kültürünü enfekte etmek için kullanıldı. Plakların sayısı daha sonra enfekte akciğer dokularındaki viral titre için bir tahmin sağlamak üzere sayılabilir.

JoVE'nin çevresel örneklerde bakteriyofajların tespiti ile ilgili videosunu az önce izlediniz. Artık fajların temel biyolojisini, çevresel bir numunedeki fajları ölçmek için bir plak testinin nasıl gerçekleştirileceğini ve çevresel veya klinik numunelerde fajları ve diğer virüsleri incelemek için plak tahlillerinin nasıl kullanılabileceğini anlamalısınız. Her zaman olduğu gibi, izlediğiniz için teşekkürler!