Bakteri Kolonilerinden Topluluk DNA'sı Ekstraksiyonu

1. Bakteri Topluluğu DNA Ekstraksiyonu

1. Prosedüre başlamak için 100 g elenmiş toprağı tartın. Bunu bir polipropilen kaba ekleyin ve bakterilerin toprak matrisinden salınmasını teşvik etmek için EDTA ile modifiye edilmiş Tris tamponundan oluşan 100 mL ekstraksiyon tamponu ekleyin, ardından elle çalkalayın.
2. Daha sonra, 100 g cam boncuk tartın ve bunları karıştırma kabına ekleyin. Numuneyi 5 dakika boyunca bir boncuk çırpma cihazı veya mekanik bilek hareketli çalkalayıcı kullanarak 15 dakika çalkalayın. Karışıma 10 mL %20 sodyum dodesil sülfat veya SDS ekleyin, ardından bir dakika daha çalkalayın. 60 - 65 °C gibi yüksek bir sıcaklıkta 60 dakika inkübe edin.
3. Numuneyi ayrı 50 mL'lik tüplere eşit olarak dağıtın ve 6.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı tüplerden tek bir steril kaba aktarın. Daha sonra, taze bir hacimde ekstraksiyon tamponu kullanarak, daha önce tarif edildiği gibi toprak peleti üzerinde ekstraksiyonu tekrarlayın.
4. Daha sonra,% 30 polietilen glikol ve 1.6 M sodyum klorür çözeltisi ile yarım hacme doldurulmuş 50 mL'lik temiz bir tüpe toplam işlenmiş süpernatan hacmini, yaklaşık 200 mL'lik ekleyin. Karıştırmak için şişeleri birkaç kez elle ters çevirin ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin. DNA'yı peletlemek için numuneleri 10.000 x g'da 20 dakika santrifüjleyin.
5. Süpernatanı santrifüj tüpünden dikkatlice çıkarın ve kısmen saflaştırılmış nükleik asit peletini geride bırakın. Peleti yeniden süspanse etmek için 20 mL TE Tamponu ve 1,5 mL 7,5 M potasyum asetat çözeltisi ekleyin, ardından girdap yapın. Süspansiyonu 5 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Proteinleri ve polisakkaritleri çökeltmek için 16.000 x g'da 4 ° C'de 30 dakika santrifüjleyin.
6. Daha sonra, numuneye bir RNAse ve proteinaz K ekleyin, elle hafifçe karıştırın ve bir süre bekletin. Ekstrakte edilecek süspansiyona eşdeğer hacimde fenol:kloroform:izoamil alkol (25:24:1 oranlı karışım) ekleyin ve elle hafifçe karıştırın. Hazırlığı 13.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Kabı santrifüjden dikkatlice çıkarın ve iki katmana dikkat edin.
7. Alt, daha ağır tabaka fenol: kloroform: izoamil alkol ve ekstrakte edilen kalıntılardan oluşur ve üst tabaka suludur ve DNA'yı içerir. Sulu fazı steril bir kaba yerleştirin, eşdeğer hacimde izopropanol ekleyin ve DNA çökelmesini başlatmak için hafifçe ters çevirin. Süspansiyonu oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin. Saflaştırılmış DNA'yı 30 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleme ile peletleyin. Peletlenmiş DNA kabın dibinde görünebileceği veya görünmeyebileceği için süpernatanı dikkatlice çıkarın ve ardından 1 mL TE Tamponu içinde yeniden süspanse edin.
8. Bir spektrofotometre veya DNA/RNA miktar tayin florimetresi kullanarak, numuneden ekstrakte edilen DNA seviyesini ölçün. DNA miktarı 260 nm okumasından tahmin edilir. 1.0'lık bir absorbans okuması, mL çözelti başına 50 μg DNA'ya eşdeğerdir. Konsantrasyon doğru okumalar için çok yüksekse, süspansiyonu moleküler dereceli su kullanarak 1 ila 10 veya 1 ila 100 oranında seyreltin.
9. DNA'nın saflığı, 260 nm'deki okumanın 280 nm'deki okumaya oranından tahmin edilir. 1.7 > bir değer nispeten saf DNA'yı gösterir. Maksimum teorik değer 2.0'dır.