2.6: Bakteri Kolonilerinden Topluluk DNA'sı Ekstraksiyonu

1. Bakteri Topluluğu DNA Ekstraksiyonu

1. Prosedüre başlamak için 100 g elenmiş toprağı tartın. Bunu bir polipropilen kaba ekleyin ve bakterilerin toprak matrisinden salınmasını teşvik etmek için EDTA ile modifiye edilmiş Tris tamponundan oluşan 100 mL ekstraksiyon tamponu ekleyin, ardından elle çalkalayın.
2. Daha sonra, 100 g cam boncuk tartın ve bunları karıştırma kabına ekleyin. Numuneyi 5 dakika boyunca bir boncuk çırpma cihazı veya mekanik bilek hareketli çalkalayıcı kullanarak 15 dakika çalkalayın. Karışıma 10 mL %20 sodyum dodesil sülfat veya SDS ekleyin, ardından bir dakika daha çalkalayın. 60 - 65 °C gibi yüksek bir sıcaklıkta 60 dakika inkübe edin.
3. Numuneyi ayrı 50 mL'lik tüplere eşit olarak dağıtın ve 6.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı tüplerden tek bir steril kaba aktarın. Daha sonra, taze bir hacimde ekstraksiyon tamponu kullanarak, daha önce tarif edildiği gibi toprak peleti üzerinde ekstraksiyonu tekrarlayın.
4. Daha sonra,% 30 polietilen glikol ve 1.6 M sodyum klorür çözeltisi ile yarım hacme doldurulmuş 50 mL'lik temiz bir tüpe toplam işlenmiş süpernatan hacmini, yaklaşık 200 mL'lik ekleyin. Karıştırmak için şişeleri birkaç kez elle ters çevirin ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin. DNA'yı peletlemek için numuneleri 10.000 x g'da 20 dakika santrifüjleyin.
5. Süpernatanı santrifüj tüpünden dikkatlice çıkarın ve kısmen saflaştırılmış nükleik asit peletini geride bırakın. Peleti yeniden süspanse etmek için 20 mL TE Tamponu ve 1,5 mL 7,5 M potasyum asetat çözeltisi ekleyin, ardından girdap yapın. Süspansiyonu 5 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Proteinleri ve polisakkaritleri çökeltmek için 16.000 x g'da 4 ° C'de 30 dakika santrifüjleyin.
6. Daha sonra, numuneye bir RNAse ve proteinaz K ekleyin, elle hafifçe karıştırın ve bir süre bekletin. Ekstrakte edilecek süspansiyona eşdeğer hacimde fenol:kloroform:izoamil alkol (25:24:1 oranlı karışım) ekleyin ve elle hafifçe karıştırın. Hazırlığı 13.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Kabı santrifüjden dikkatlice çıkarın ve iki katmana dikkat edin.
7. Alt, daha ağır tabaka fenol: kloroform: izoamil alkol ve ekstrakte edilen kalıntılardan oluşur ve üst tabaka suludur ve DNA'yı içerir. Sulu fazı steril bir kaba yerleştirin, eşdeğer hacimde izopropanol ekleyin ve DNA çökelmesini başlatmak için hafifçe ters çevirin. Süspansiyonu oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin. Saflaştırılmış DNA'yı 30 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleme ile peletleyin. Peletlenmiş DNA kabın dibinde görünebileceği veya görünmeyebileceği için süpernatanı dikkatlice çıkarın ve ardından 1 mL TE Tamponu içinde yeniden süspanse edin.
8. Bir spektrofotometre veya DNA/RNA miktar tayin florimetresi kullanarak, numuneden ekstrakte edilen DNA seviyesini ölçün. DNA miktarı 260 nm okumasından tahmin edilir. 1.0'lık bir absorbans okuması, mL çözelti başına 50 μg DNA'ya eşdeğerdir. Konsantrasyon doğru okumalar için çok yüksekse, süspansiyonu moleküler dereceli su kullanarak 1 ila 10 veya 1 ila 100 oranında seyreltin.
9. DNA'nın saflığı, 260 nm'deki okumanın 280 nm'deki okumaya oranından tahmin edilir. 1.7 > bir değer nispeten saf DNA'yı gösterir. Maksimum teorik değer 2.0'dır.

Bakteri topluluğu DNA ekstraksiyonu, tek bir ekstraksiyon prosedürü sırasında bir topluluk içindeki birden fazla bakteri türünden DNA'nın elde edildiği bir işlemdir.

Topraktaki mikrobiyal toplulukların geleneksel analizleri, genellikle farklı seçici ortamlar üzerinde seyreltme ve kaplama metodolojisini kullanan kültürel tahlilleri içermektedir. Bununla birlikte, birçok bakteri laboratuvar koşullarında veya seçilen spesifik büyüme ortamı koşullarında zayıf bir şekilde büyür, bu da gözden kaçabilecekleri veya ciddi şekilde yetersiz temsil edilebilecekleri anlamına gelir.

Son zamanlarda, toprak bakteri örneklerinden topluluk DNA'sının çıkarılması, bakteri topluluklarının daha kapsamlı bir şekilde örneklenmesine izin vermiştir. Bu kültür temelli olmayan yaklaşımın, geleneksel kültür temelli yöntemlerden ziyade mevcut gerçek toplulukları daha iyi temsil ettiği düşünülmektedir.

Bu video, bakteri topluluğu DNA ekstraksiyonunun kültür dışı bir yöntemini, ekstrakte edilen DNA'nın kalitesinin ve miktarının nasıl kontrol edileceğini gösterecek ve bu DNA'nın bakteri çeşitliliğini incelemek için nasıl kullanılabileceğini keşfedecektir.

Topraktan DNA ekstraksiyonu iki yoldan biriyle gerçekleştirilebilir. Fraksiyonlama yönteminde, hücreler ilk olarak genetik materyalin çıkarılmasından önce toprak matrisinden ayrılır. Numune daha sonra bir pelet içinde bozulmamış hücreleri toplamak için ardışık karıştırma ve yavaş santrifüjleme döngülerine tabi tutulur.

Lizozimler daha sonra hücrelere eklenir ve süspansiyon inkübe edilir. Lizozimler, bakteri hücre duvarlarını parçalayan enzimlerdir. Hücre duvarı yapısı tehlikeye girdiğinde, DNA saflaştırma için serbest bırakılabilir. Bununla birlikte, ikinci bir topluluk DNA ekstraksiyon yöntemi olan in situ yöntemin daha fazla DNA konsantrasyonu sağladığı gösterilmiştir.

Burada, bir toprak kütlesi, eşdeğer hacimde Tris-EDTA ekstraksiyon tamponu ve cam boncuklar ile birleştirilir ve hücrelerin toprak parçacıklarından ayrılmasını kolaylaştırmak için agresif bir şekilde karıştırılır. Daha sonra, genellikle sodyum dodesil sülfat veya SDS olmak üzere bir deterjan eklenir ve numune, hücrelerin parçalanmasını ve DNA dahil olmak üzere içeriklerinin serbest bırakılmasını teşvik etmek için daha fazla karıştırılır.

Daha sonra kalan bakteri hücrelerini parçalamak için yüksek bir sıcaklıkta inkübasyon yapılır. Numuneler santrifüjlenir ve DNA'yı çökeltmek için süpernatan üzerinde bir polietilen glikol ekstraksiyonu ve inkübasyonu gerçekleştirilir ve daha sonra bir pelet halinde santrifüjlenir.

Proteinlerin ve polisakkaritlerin DNA'sını daha fazla yıkamak için DNA, TE Tamponu ve potasyum asetat içinde yeniden süspanse edilir, daha sonra bu istenmeyen bileşenleri peletlemek için santrifüjleme yapılır. DNA'yı içeren sulu süpernatan çıkarılır ve DNA'yı daha fazla temizlemek ve konsantre etmek için bir fenol-kloroform ekstraksiyonuna ve izopropanol çökeltmesine tabi tutulur. İki saatlik bir oda sıcaklığında inkübasyon süresinin ardından, DNA santrifüjlenir ve analize kadar saklanmak üzere TE Tamponunda yeniden süspanse edilir.

Artık bakteri topluluğu DNA ekstraksiyonunun arkasındaki kavramlara ve süreçlere aşina olduğumuza göre, bunun laboratuvarda nasıl gerçekleştirildiğine bir göz atalım.

Prosedüre başlamak için 100 g elenmiş toprağı tartın. Bunu bir polipropilen kaba ekleyin ve bakterilerin toprak matrisinden salınmasını teşvik etmek için EDTA ile modifiye edilmiş Tris tamponundan oluşan 100 mL ekstraksiyon tamponu ekleyin, ardından elle çalkalayın.

Daha sonra, 100 g cam boncuk tartın ve bunları karıştırma kabına ekleyin. Numuneyi bir boncuk çırpma cihazı veya mekanik bilek hareketli çalkalayıcı kullanarak 5 dakika çalkalayın. Karışıma 10 mL %20 sodyum dodesil sülfat veya SDS ekleyin, ardından bir dakika daha çalkalayın. Yüksek sıcaklıkta 60 dakika inkübe edin.

Numuneyi ayrı 50 mL'lik tüplere eşit olarak dağıtın ve 6.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı tüplerden tek bir steril kaba aktarın. Daha sonra, taze bir hacimde ekstraksiyon tamponu kullanarak, daha önce tarif edildiği gibi toprak peleti üzerinde ekstraksiyonu tekrarlayın.

Daha sonra, işlenmiş süpernatanın toplam hacmini,% 30 polietilen glikol ve 1.6 M sodyum klorür çözeltisi ile yarım hacme doldurulmuş 50 mL'lik temiz bir tüpe ekleyin. Karıştırmak için şişeleri birkaç kez elle ters çevirin ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin. DNA'yı peletlemek için numuneleri 20 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.

Süpernatanı santrifüj tüpünden dikkatlice çıkarın ve kısmen saflaştırılmış nükleik asit peletini geride bırakın. Peleti yeniden süspanse etmek için 20 mL TE Tamponu ve 1,5 mL 7,5 M potasyum asetat çözeltisi ekleyin, ardından girdap yapın. Süspansiyonu 5 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. 16.000 x g'da 30 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüjleyin Proteinleri ve polisakkaritleri çökeltmek için C.

Daha sonra, numuneye bir RNAse ve proteinaz K ekleyin, elle hafifçe karıştırın ve bir süre bekletin. Ekstrakte edilecek süspansiyona eşdeğer hacimde fenol: kloroform: izoamil alkol ekleyin ve elle hafifçe karıştırın. Hazırlığı 13.000 x g'da 10 dakika santrifüjleyin. Kabı santrifüjden dikkatlice çıkarın ve iki katmana dikkat edin.

Alt, daha ağır tabaka fenol: kloroform: izoamil alkol ve ekstrakte edilen kalıntılardan oluşur ve üst tabaka suludur ve DNA'yı içerir. Sulu fazı steril bir kaba yerleştirin, eşdeğer hacimde izopropanol ekleyin ve DNA çökelmesini başlatmak için hafifçe ters çevirin. Süspansiyonu oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin. Saflaştırılmış DNA'yı 30 dakika boyunca 16.000 x g'da santrifüjleme ile peletleyin. Peletlenmiş DNA kabın dibinde görünebileceği veya görünmeyebileceği için süpernatanı dikkatlice çıkarın ve ardından 1 mL TE Tamponu içinde yeniden süspanse edin.

Bir spektrofotometre veya DNA/RNA miktar tayin florimetresi kullanarak, numuneden ekstrakte edilen DNA seviyesini ölçün. DNA/RNA florimetreleri, DNA seviyelerini mililitre başına nanogram birimlerinde verecektir. Konsantrasyon doğru okumalar için çok yüksekse, süspansiyonu moleküler dereceli su kullanarak 1 ila 10 veya 1 ila 100 oranında seyreltin.

Bir bakteri topluluğundan DNA elde edildikten sonra, bu bir dizi farklı şekilde kullanılabilir. Bu uygulamalardan bazıları burada incelenmiştir.

Topluluk DNA'sından ekstrakte edilen DNA'nın spektrofotografik analizleri, belirli bir toprak örneğinde bulunan bakteri hücrelerinin sayısı hakkında bir fikir verebilir. Çözelti başına mL ng cinsinden tahmini DNA miktarı, g toprak başına toplam DNA miktarını vermek için çözelti içinde ekstrakte edilen toplam DNA hacmi ile ilişkilendirilebilir. Hücre başına DNA'nın teorik değeri bilinerek, g toprak başına toplam hücre sayısı hesaplanabilir.

Daha hedefli uygulamalar için, bakteri topluluklarından ekstrakte edilen DNA, topluluk içinde belirli bir türün mevcut olup olmadığını belirlemek için PCR'ye tabi tutulabilir. Örneğin, bilim adamları toprak örneklerinin Clostridium perfringens veya Bacillus anthracis gibi belirli patojenler içerip içermediğini belirlemek isteyebilirler.

Son olarak, bir toplulukta bulunan bakterilerin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını sağlamak için, DNA örnekleri, numune içindeki orijinal bakterilerin daha derin analizine izin veren "omik" ve biyoinformatik karakterizasyona tabi tutulabilir. ? Omik? Organizmalar veya topluluklardaki moleküllerin rollerini, ilişkilerini ve eylemlerini araştıran bir dizi teknolojiyi tanımlar. Bu, genlerin ve işlevlerinin incelenmesini içerir, veya ? Genomik?, ve ? Proteomik?, proteinler ve rolleri üzerine çalışma. Örneğin, 16S'nin dizilimi? Örneklerden elde edilen RNA, topluluk içindeki belirli türlerin metagenomik olarak belirlenmesine izin vererek daha ayrıntılı bir çeşitlilik tahmini verebilir. Bu yaklaşım, bilim insanlarına bir topluluğun tür yapısını ve hangi rolleri üstlenebileceklerini daha iyi anlamalarını sağlayabilir.

Az önce JoVE'nin bakteri topluluğu DNA ekstraksiyonuna girişini izlediniz. Artık bir bakteri topluluğundan DNA'nın nasıl çıkarılacağını, bu DNA'nın kalitesinin nasıl kontrol edileceğini ve bu DNA'nın bakteri topluluğu bileşiminin araştırılması için nasıl kullanılabileceğini anlamalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler!