Drosophila Görsel ve Koku aracılığı ile Uçuş Kontrol Araştırma Manyetik Tether Sistemi

Joof koku alma duyusuna yönelik gelişen çalışmalar, olfaktör manyetik bağlama düzeneği veya OMT gibi giderek daha sofistike davranışsal analizlerin geliştirilmesine yol açmıştır. Bu prosedür, sineğin dorsal toraksının bir mnuchin pinine yapıştırılmasını içerir. Sinek, pin uygun bir eğimle 30 derecelik bir açıyla askıya alınır ve ardından iki nadir toprak mıknatısı arasında hizalanır.

Doğru şekilde yapıldığında, bu işlem serbest bir hareket alanı sağlayacaktır. Ardından, bir koku portu, teslimat nozulundan başlayarak sineğin başı üzerinden vakum odasına doğru pürüzsüzce ilerleyen bir koku bulutu oluşturacak şekilde hizalanır. Sineğin kokuyu tespit etme yeteneği, daha sonra görsel uyaranların varlığında test edilir.

Merhaba, ben University of California Los Angeles Fizyolojik Bilimler Bölümü'nde Dr. Mark Fry'ın laboratuvarından Brian DeMars. Bugün size, bir olfaktör manyetik sabitleme düzeneğinde kullanılmak üzere sineklerin nasıl sabitleneceğini göstereceğiz. Ayrıca mıknatısların ve koku portlarının nasıl hizalanacağını ve koku iletim sistemi için kütle akış hızlarının nasıl ayarlanacağını da göstereceğiz.

Laboratuvarımızda, meyve sineklerinde görme ve koku yoluyla aracılık edilen uçuş kontrolünü incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Sabitleme işlemine başlamak için, eclosyondan dört ila altı gün sonra sinekleri toplayın ve onları dört ila altı saat boyunca aç bırakın.

Kurumayı önlemek için nemli bir kim wipe içeren bir besin listesi flakonuna, ardından işaretli sinek grubunu, 4 °C'ye ayarlanmış bir peltier soğutma tablasındaki pirinç bloğa yerleştirilmiş küçük bir flakona aktarın. Bu sıcaklıkta, sinekler yaklaşık 30 saniye içinde anestezi altına girecektir.

Nemi absorbe etmek için soğutma tablasının üzerine bir Kim wipe yerleştirin. Ardından, ayıklama yapmak için anestezi uygulanmış sinekleri tablanın üzerine yerleştirin ve sabitleme işlemi için en büyük dişileri seçin. İnce bir fırça kullanarak, tek bir sineği, tek bir vahşi tip dişi meyve sineğine uygun şekilde tasarlanmış özel yapım sarkofajın içine doğru itin.

Şimdi, sineğin dorsal tarafı ile doğru şekilde konumlandığından emin olmak için mikroskobu kullanın. Sineğin anterior kısmı size dönük, posterior kısmı ise sizden uzak olmalıdır. Ardından, mikro manipülatöre monte edilmiş manyetik bir çubukla birlikte bir minuchin iğnesini konumlandırın.

İğne, küt ucu sineğin dorsal toraksına bakacak şekilde hizalanmalıdır. Burası, başın hemen arkasında, iki kanadın arasındaki bölgedir. Sinek, iğne üzerinde üç eksen boyunca doğru şekilde konumlandırılmalıdır.

Yunuslama (pitch), yalpalama (roll) ve sapma (yaw) açısından; iğne, gözlere doğru karşıdan bakıldığında tamamen dikey olmalıdır; sinek ile iğne arasında çok az miktarda yalpalama bile kabul edilemez. İğne ile gövdenin uzun ekseni arasındaki yan görünüş açısı veya yunuslama, ufuk çizgisine göre 30 derecelik bir burun yukarı açıda olmalıdır. Optimal bağlama işlemi için iğnenin kırpılması gerekebileceğini unutmayın.

Bu durum, süspansiyon mıknatısları arasındaki mesafeye bağlı olacaktır. Mnuchin pini hizalandıktan sonra, ince bir çelik tel kullanarak mnuchin pininin küt ucuna küçük bir damla UV aktif yapıştırıcı uygulayın. Şimdi, yapıştırıcı damlası sineğin göğüs bölgesine, tam başın üzerine değecek şekilde pini yönlendirin.

Çok fazla yapıştırıcı kullanmamaya dikkat edin. Uygun damla boyutuyla, yapıştırıcı iğne üzerinde toplanmalı ve oradan toraksa doğru akmalıdır. Ardından, yapıştırıcıyı iki adet 22 saniyelik UV ışığı patlamasıyla kürleyin.

Bağlama işlemi tamamlandığında, sineklerin içgüdüsel konma refleksi nedeniyle, her bir sineğe pens yardımıyla küçük kare bir Kim wipe verilmelidir. Sinekler Kim wipe'lara tutunacaktır. Bir saatlik dinlenme süresinin ardından, bağlanan sinekler deneyler için hazır hale gelir.

Pürüzsüz bir 360 derecelik hareket aralığı elde etmek için mıknatısların doğru şekilde hizalanması kritik öneme sahiptir. Bunu yapmak için, alt halka mıknatısları plastik bir kılıf ile yatay olarak tutun ve bunları doğrudan şeffaf bir vakum odasının üzerine yerleştirin. Üst çubuk mıknatıs, alt mıknatısların yaklaşık üç çeyrek inç üzerine dikey olarak sabitlenmiş olup, üst mıknatısın alt yüzeyine epoksi ile bir V çift rulman takılmıştır.

Bu işlem, sinek konumlandırmasını standart hale getirecek ve dönme sürtünmesini minimize edecektir. Bu mıknatısların tehlikeli olabileceğini ve yanlış kullanımın ekipman hasarına veya hafif bedensel yaralanmalara yol açabileceğini unutmayın. Ardından, üst ve alt mıknatısları görsel olarak kabaca hizalayın.

Üst çubuk mıknatısı, alt halka mıknatısların merkez noktasının hemen üzerine yerleştirerek, hassas ayar yapabilmek için üst mıknatısı bir mikro manipülatöre sabitlemek faydalı olacaktır. Şimdi, arenaya bir sinek yerleştirin ve her deneyin başlangıcında sinek sorunsuz ve istikrarlı bir şekilde 360 derece dönebilene kadar üst mıknatısın yatay ve dikey konumunu ayarlayın; mıknatısların doğru şekilde hizalandığından ve mnuchin pinlerinin hasar görmediğinden emin olmak için her sineğin dönüşü kontrol edilmelidir. Kurulum hatalıysa, sinek hiç dönmeyebilir.

Hareket alanı kısıtlı olabilir veya tutarsız hızlarda dönebilir. Bu durum, sineğin önüne omo tepkisini tetiklemek için çizgili bir ızgara döndürülerek test edilebilen bir yapıştırma sorunu olabilir. Eğer sinek dönmüyorsa veya tutarsız dönüyorsa, başka bir sinekle değiştirin.

Eğer bu sinek doğru şekilde dönmüyorsa ve bu sorunlar her sinek için geçerliyse, problem muhtemelen mıknatısların hizalanmasından kaynaklanmaktadır ve kararlı koku elde etmek için daha fazla ayarlama gerekecektir. Koku sisteminin başlangıç kurulumunun takibi, gaz multipleksöründen özel yapım sulu koku şişelerine dar çaplı Teflon borular çekilmesini gerektirecektir. Bu şişelerin çıkışı, aynı Teflon borular kullanılarak doğrudan hipodermik port tüplerine bağlanmalıdır.

Ardından, mıknatısları desteklemek için arena altına şeffaf akrilik bir vakum odası yerleştirilir. Vakum açıklığını sineğe yaklaştırmak ve açıklığın çapını küçültmek için, sineğin altına monte edilmiş ve vakum odasına bağlanmış dört milimetrelik bir cam tüp kullanın. Şimdi, forseps kullanarak bağlanmış bir sineği arenaya yerleştirin.

Sinek yerine yerleştikten sonra, çekici bir koku verin. Koku verildiğinde, sineğin koku portunun konumuna doğru ilerleyip ilerlemediğini görsel olarak doğrulayabilirsiniz. Sineğin kokuya karşı bir tercihi yoksa, OMT'yi optimize etmek için deneme yanılma yöntemini kullanın.

Bunu yapmak için öncelikle, sinek kokuyu takip ediyor gibi görünene kadar koku portunun konumunu ayarlayın. Burada koku portları mikro manipülatörlere monte edilmiştir ve sineğin başının 4 mm dorsaline ve 3 mm anterioruna konumlandırılmıştır. Koku portunun konumunu değiştirmenin koku takibini iyileştirmediği durumlarda, sinek kokuyu takip ediyor gibi görünene kadar kütle akış hızını ayarlayın.

Ayarları dakikada yedi mililitre olarak kullanıyoruz. Kütlesel akış hızının ayarlanması koku takibini iyileştirmezse, sinek kokuyu takip edene kadar vakum akış hızını ayarlayın. Bir akış regülatörü kullanarak vakum akış hızını dakikada 13 litreye ayarlıyoruz.

Port konumu ve akış hızları ayarlandıktan sonra, değiştirilebilir bir gaz multipleksörü kullanarak su buharı ve koku buharı iletimi arasında periyodik olarak geçiş yapın. Düzeneklerinizi doğru kurduysanız, iki şeyi gözlemlemelisiniz. İlk olarak, sabit dönen görsel uyaranlar altında, OMT'ye yerleştirilen bağlı bir sinek, dikey veya ya ekseninde pürüzsüz bir şekilde 360 derece dönmelidir; sabit görsel uyaranların yokluğunda kendiliğinden dönme davranışının karakteristik özelliği olan, kos olarak adlandırılan kesikli dönüşler gözlemlenmelidir.

Sinekler sorunsuz bir şekilde dönemiyorsa, bunun nedeni hatalı yapıştırma veya hizalanmamış mıknatıslar olabilir. İkinci olarak, koku verildiğinde sineğin koku portunun yönüne doğru ilerlemesi gerektiğini gözlemlemelisiniz. Koku kapatıldığında ise sinek, arenadaki herhangi bir konuma yönelik bir tercih göstermeden kendiliğinden rastgele hareket etmelidir.

Sinekler koku plumasını aktif olarak takip etmiyorsa, bu durum koku portunun konumunu, hava akış hızını ve/veya vakum akış hızını ayarlamanız gerektiği anlamına gelebilir. Size, olfaktör manyetik bağlama aparatında kullanılmak üzere bir sineğin nasıl bağlandığını gösterdik. Ayrıca mıknatısların ve koku portlarının nasıl doğru şekilde hizalanacağını ve koku iletim sistemi için kütle akış hızlarının nasıl ayarlanacağını da gösterdik.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.