Name: Astrositler Plazma Membran ve Küresel Hücre içi kalsiyum Dynamics civarında Ölçüm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-26T23:27:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Öğrenin astrositlerde küresel ve plazma membranı yakınındaki kalsiyum dinamiklerini ölçme yöntemini. Bu teknik, sinir biliminde hücresel sinyalleşme mekanizmalarını anlamak için güvenilir bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Japonya Uehara Memorial Foundation (ES) yanı sıra Whitehall Vakfı, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme ve Stein-Oppenheimer Endowment Ödülü (BSK) Enstitüsü tarafından desteklendi.

DENEYSEL PROSEDÜRLER Deneysel işlemin bir adım daha akıllıca bir şekilde aşağıda açıklanan iki ana bölümden oluşmaktadır. Bölüm 1: HAZIRLAMA hipokampal astrosit KÜLTÜRLER Kısaca, karışık, hipokampal astrosit nöron kültürleri iyi kurulmuş bir protokol 1,2,3 kullanılarak hazırlanmıştır. Prosedürü, sağlıklı kültürlü astrositler verim için optimize edilmiş. Aşağıda listelenen tüm işlemler, steril bir ortamda böyle bir laminer akış kaputu gibi yapılmalıdır. Hazırlanması lamelleri <ul><li> 22 mm lamelleri (VWR, 48.380-068) </li><li> Poly-D-Lizin (PDL, Sigma P0899), alikotları (1 mg / ml) </li><li> Laminin alikotları (20 mg / ml): 1 mg / ml laminin solüsyonu (Sigma L2020) ile 49 ml steril su ekleyin, -20 ° C&#39;de 1.2 ml alikotları ve mağaza </li></ul><ol><li> (50 mg / ml) steril su PDL çözülür </li><li> Lamelleri Otoklav, PDL steril su ve yeri (100 lamelleri için 20 ml) ile durulayın. Gece boyunca oda sıcaklığında bekletin. </li><li> PDL steril su ile (3 geniş yıkar) değiştirin. Sonra 4 lamelleri ve mağaza ° C kuru </li><li> 6 plaka (Steril Bioscience BD Kapaklar multiwell Düz Tabanlı Tabaklar) steril bir kuyu astrositler, bireysel lamelleri kaplama bir gün önce. Her lamel laminin ul 400 koyun ve buharlaşmasını önlemek için inkübatör, gece inkübe edin. </li></ol> Diseksiyon Diseksiyon medya: <ul><li> 500 ml Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) (1X), sıvı (Invitrogen, 14.155-063) </li><li> 5 ml Hepes solüsyonu (Sigma, H0887) </li></ul> Hipokampal medya: <ul><li> 412,5 ml Minimum Essential Medium (MEM) (1X), sıvı Earle Kullanıcı tuz içerir, ancak hiçbir L-glutamin veya fenol kırmızısı (Invitrogen, 51.200-038) </li><li> 10 ml glikoz (Sigma, D-(+) GLİKOZ susuz SIGMA ULTRA G7528) 1 M MEM </li><li> 5 ml Penisilin-Streptomisin (Invitrogen, 15.140-122) </li><li> 5 ml sodyum piruvat çözüm (Sigma, S8636) </li><li> 12.5 ml Hepes çözüm 1 M (Sigma, H0887) </li><li> 5 ml N-2 Eki (100X), sıvı (Invitrogen, 17.502-048) </li><li> 50 ml At Serum, Isı-İnaktive (Invitrogen, 26.050-088) </li></ul> Papain çözüm: <ul><li> Worthington papain-022 flakon (LK003178; nihai konsantrasyonu, 20 U / ml), diseksiyon medya 5 ml ve 37 ° C 60 dakika inkübe edin. </li></ul><ol><li> P1 (genellikle 2 yavrular) ulusal düzenlemeler ve yerel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve onaylanan yönergeleri izleyerek yaşlı sıçan yavrular başını kesmek. </li><li> Petri kabındaki soğuk diseksiyon medya ile doldurulmuş deri ve kafatası yer ve beyin çıkarın. </li><li> Meninksler kaldırıldı, her iki yarımkürede incelemek ve hippocampi teşrih. </li><li> Hippocampi ~ 37 ° papain çözüm 1X1 mm parçaları ve hazmı ° C 11-13 dakika süreyle içine doğrayın. </li><li> Doku parçaları yerleştikten sonra, kaldırmak dikkatle papain ve enzim bütün izlerini kaldırmak için 5 ml hipokampal orta eklemek. Hipokampal orta (2 ml) ve bu adımı tekrar süspansiyon tekrarlayın. </li><li> Kümeleri, üç aşamalı olarak küçük delikleri (1000 mm, ~ 500 mm ~ 300 mikron) alev cilalı pipetler sol kalmayana dek hücreleri ~ 5 kez Karışım. </li><li> Triturated sonra, bir hücre süzgeç (gözenek boyutu, 70 mikron, BD Bioscience) aracılığıyla hücrelere geçerler. 10 ul süspansiyon hücreleri saymak. 400.000 hücre / ml sahip amacıyla hipokampal ortamın ses seviyesini ayarlayın. </li><li> Lamelleri kapalı laminin aspire ve lamel başına hücre süspansiyonu kapakları kuru önce, plaka 200 ul. </li><li> Onları inkübatörde 60 dakika ekleyiniz ve sonra iyi ortalama 2 ml hipokampal orta eklemek bırakın. </li><li> Ertesi gün, ölü hücreleri ve enkaz kaldırma ve 2 ml, önceden ısıtılmış taze hipokampal orta eklemek için eski hipokampal orta aspirat. </li></ol> Bakım Neurobasal medya: <ul><li> 500 ml neurobasal (Invitrogen, 12.348-017) </li><li> 10 ml B27 serum serbest eki (Invitrogen, 17.504-044) </li><li> 5 ml Penisilin-Streptomisin (Invitrogen, 15.140-122) </li><li> 1.25 ml L-glutamin (Invitrogen, 25.030-149) </li></ul> Kaplama dört gün sonra başlayan, neurobasal orta astrosit-nöron kültürler haftada iki kez besleyin. Sıcaklık ve CO 2 denge sağlaması için yaklaşık 30 dakika havalandırılan bir balonuna inkübatör medya Preincubate. Bölüm 2: KALSİYUM GÖRÜNTÜLEME Hipokampal kayıt tampon: 110 mM NaCl, 5.4 mMKCl, 1.8 mM CaCl 2, 0.8 mM MgCl 2, 10 mM D-glukoz, 10 mM HEPES (Sigma tüm kimyasallar), pH 7.4 (NaOH ile düzeltilmiş) . Astrositler kalsiyum göstergesi boya yükleme <ol><li> 2 ml hipokampal kayıt tampon DMSO 2.5 mcM Fluo-4, AM (Invitrogen, F-14.217) ve% 0.05 Pluronic ® F-127% 20 çözüm içeren dolu bir 6-plaka (Invitrogen, iyi bir kültür koyun P-3000MP) ve 10-30 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Fluo-4 çözüm çıkarın ve 30 dakika oda sıcaklığında hipokampal kayıt tampon ve inkübe ile lamelleri 3 kere yıkayın. </li><li> Lamel odasına yerleştirin ve lens temizleme sıvı ile lamel diğer tarafında temiz. </li><li> Amaç küçük bir damla immersiyon yağı (Cargille Immersion Yağı TİPİ DF) koyun ve mikroskop (Olympus IX71) sahne odası (25 mm yuvarlak lamel için Warner Instruments Açık odası) koymak. </li><li> Iletim ışık kullanarak hücreleri hücrelerin nasıl göründüğüne bakmak ve onları almak için odak noktası haline bakın. Sonra (Vizyon KADAR Polychrome V) monokromatör gelen 488 nm hücreleri aydınlatmak ve Fluo-4 floresan sinyal üniforma ve astrositler saptanabilir olup olmadığını belirlemek. </li><li> EPI ve TIRF aydınlatma astrositler kalsiyum ölçmek için kullanın. </li></ol> TIRF mikroskopi Kısaca, biz bir Andor IXON DV887DCS EMCCD kamera ile donatılmış bir Olympus IX71 mikroskop kullanıyoruz. Eksitasyon ve görüntü alımı kontrolü TILLVision yazılımı kullanılarak elde edilir. 454/488/515 nm Argon (100 mW) ve 442 nm (45 mW) katı hal lazerleri kirişler kombine ve kontrollü bir KADAR Polyline lazer birleştirici, TIRF çift bağlantı kondansatör ve acoustoptical arasında ayarlanabilir filtre ve denetleyicisi (AOTF tüm TIRF kondenser içine giriş için Kineflex geniş bant fiber içine Fotonik) ve beslenen KADAR. Biz TIRF elde etmek için Olympus 60X 1.45 NA lens kullanın. Kamera kazancı en iyi sinyal-gürültü görüntüleri sağlamak için her astrosit ayarlanır. Arka plan ve TIRF mikroskopi ilkeleri, son zamanlarda, 5 4 gözden geçirilmiştir . Kullandığımız optik bileşenlerin çoğu şimdi Agilent Technologies (http://www.till-photonics.com/) bir parçası Fotonik, KADAR satın alındı. TIR penetrasyon derinliği aşağıdaki denklemler hesaplanabilir. <img style="float:left;" src="/files/ftp_upload/1142/equation.png" alt="Denklem" /> d = penetrasyon derinliği n1 = cam kırılma indisi n2 = kırılma indisi hücre insidansı = açısı NAI = sayısal açıklık insidansı Lazer TIRF için optimal aynı hizada olmasını sağlamak için 100 nm floresan boncuk (Invitrogen, F8803) gözlemlemek için yararlı bulabilirsiniz. Biz hala EPI ve TIRF mikroskopi ile boncuk çerçeveleri ve videoları mevcut. Zaman TIRF, bir sinyal-gürültü dramatik bir artış gözlemlemiştir ve boncuk Brown difüzyon gösterilecek. Kritik açı eşit olmasaydı oluşacak tehlikeye eğik aydınlatma yerine daha optimum TIRF oluşur emin olmak için düzenli olarak (haftada ~ kez) TIRF mikroskobu ile 100 nm boncuk davranışlarını gözlemlemek için yararlı buluyorum α (bkz. Şekil 1). G-protein kenetli reseptör agonistleri Uygulama Astrositler Gq-reseptörler 6, 7 metabotropik glutamat reseptörleri ve P2Y reseptörleri (agonist, ATP, ADP) de dahil olmak üzere çeşitli ifade eder. Bu reseptörlerin aktivasyonu astrositler içinde hücre içi kalsiyum düzeylerinde önemli artışlara yol açar. Örneğin, bir hücre içi kalsiyum yükselmeler astrositler 8-10 ATP (30 mcM) uygulama sırasında kolayca izleyebilirsiniz . Warner Instruments switcher VC-77SP Hızlı Adım Perfüzyon Sistemi (http://www.warneronline.com/index.cfm) olarak adlandırılan hızlı bir çözüm kullanın. ~ 10 ms &#39;den daha az bir süre içinde bu yöntemi çözümleri uygulanabilir. <img src="/files/ftp_upload/1142/Fig 1a.jpg" alt="Şekil 1" /> <img src="/files/ftp_upload/1142/fig1c.jpg" alt="" /> ŞEKİL 1 Karikatür ve fotoğrafları görüntüleme kurdu. A., (B) lazer montaj, kontrolörler ve kiriş kutuları bir fotoğraf gösterir iken, üzerine monte edilmiş bir airtable mikroskop bir fotoğraf gösterir. C. mikroskop aşamasında bir fotoğraf görüntüleme için monte edilen oda gösterir. Hızlı perfüzyon cihazı (step motor ve teta tüp ile birlikte) görülebilir bıraktı. Sağ tarafta bir Axopatch 200A amplifikatör headstage görülür. Karikatür set ışık yolu schematizes ve nasıl TIRF elde edilir. Lazer, kritik açı α immersiyon ortaya çıkar, böylece merkezi ayarlanır 60X 1.45 NA objektif lens ve konumunu arka odak düzlemi üzerinde duruldu. Bu noktada demiri düşük kırılma indisi orta mesafe λ (ana metin denklemi) ile toplam iç yansıma ve bozunur muzdarip. Bu durumda bu kayıt tampon astrositler ve astrositler kendilerini çevreleyen. Sonuç olarak plazma zarı ~ 100 nm içinde moleküllerin optik uyarım (ve dolayısıyla görüntüleme). Hücre içinde veya hücrenin üst yüzeyinde bu heyecanlı ise hücre karikatür, yeşil &quot;heyecan&quot; membran reseptörleri olarak gösterilir. TIRF mikroskopi tam bir hesap Steyer ve Almers 4 tarafından sağlanmıştır. <img src="/files/ftp_upload/1142/fig2.png" alt="Şekil 2" /> ŞEKİL 2 EPI ve TIRF mikroskobu ile elde edilen 100 nm floresan boncuk Görüntüler. A. birkaç düzine 100 nm floresan boncuk manzaralı bir alan EPI görüntüleri gösterir. Mavi ok ucu suya difüzyon. Boncuk noktası ise, cam lamel üzerine yerleşmiş boncuk kırmızı oklar noktası. B. Bu görüşe göre, sadece kırmızı oklarla gösterilen yapışık boncuk görünür A&#39;da gösterildiği gibi aynı alan TIRF bir görüntü gösterir. Bu cam coverlsip üzerine yerleşti ve böylece ~ 100 nm kaybolan saha içinde vardı çünkü. Boncuk mavi oklarla gösterilen bu bölge içinde değildir ve TIRF görüntüleri böylece görünmez. Düşük araziler görüntülerin 3D render göstermektedir. Bu sinyal-gürültü TIRF mikroskopi tarafından gözlemlenen büyük bir artış kaybolan alanı içinde boncuklar oluşur açıktır. Aslında bu görüntüler için TIRF için 20 iken ± 0.7 EPI için sinyal-gürültü, 7.1 ± 0.6 idi. <img src="/files/ftp_upload/1142/fig3.png" alt="Şekil 3" /> ŞEKİL 3 EPI ve TIRF mikroskobu ile elde Fluo-4 kalsiyum gösterge boyası ile yüklü astrositler Görüntüler. Beş astrositler manzaralı bir alan A. EPI görüntüler. B. A, A ve B görüntüleri anlamlı derecede farklı olduğunu B. Not gösterilen bakış aynı alanda TIRF görüntü. Bu TIRF aydınlatma ile cam lamel yakın apozisyon sadece plazma zarı bölgelerde görüntülü çünkü. Alt panelleri göstermek ATP-uyarılmış hücre içi kalsiyum transientler EPI ve TIRF mikroskobu ile görüntülenmiş.

<ol><li>Richler, E., Chaumont, S., Shigetomi, E., Sagasti, A., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+image+activation+of+transmitter-gated+P2X+receptors+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An approach to image activation of transmitter-gated P2X receptors in vitro and in vivo.</a> Nature Methods. 5, 87-93 (2008).</li>
<li>Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin-mediated+endocytosis+is+the+dominant+mechanism+of+vesicle+retrieval+at+hippocampal+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses.</a> Neuron. 51, 773-786 (2006).</li>
<li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+hippocampal+neurons+from+P0+newborn+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture of hippocampal neurons from P0 newborn rats.</a> J Vis Exp. 19, (2008).</li>
<li>Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+real-time+view+of+life+within+100+nm+of+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A real-time view of life within 100 nm of the plasma membrane.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 268-275 (2001).</li>
<li>Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+vesicle+fusion+from+lysis+to+monitor+calcium-triggered+lysosomal+exocytosis+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 14151-14156 (2007).</li>
<li>Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+signalling+between+astrocytes+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dynamic signalling between astrocytes and neurons.</a> Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).</li>
<li>Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLIA%3A+listening+and+talking+to+the+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GLIA: listening and talking to the synapse.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 185-193 (2001).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+excites+interneurons+and+astrocytes+to+increase+synaptic+inhibition+in+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ATP excites interneurons and astrocytes to increase synaptic inhibition in neuronal networks.</a> J Neurosci. 24, 8606-8620 (2004).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+astrocyte+single+vesicle+exocytosis+imaged+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Two forms of astrocyte single vesicle exocytosis imaged with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 4212-4217 (2007).</li>
<li>Bowser, D. N., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+ATP+is+the+predominant+cause+of+intercellular+calcium+waves+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Vesicular ATP is the predominant cause of intercellular calcium waves in astrocytes.</a> J Gen Physiol. 129, 485-491 (2007).</li>
<li>Agulhon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+role+of+astrocyte+calcium+in+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">What is the role of astrocyte calcium in neurophysiology.</a> Neuron. 59, 932-946 (2008).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60, 430-440 (2008).</li>
<li>Lee, S. Y., Haydon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+glutamate+targets+NMDA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Astrocytic glutamate targets NMDA receptors.</a> J Physiol. 581, 887-888 (2007).</li>
<li>Shigetomi, E., Bowser, D. N., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+forms+of+astrocyte+calcium+excitability+have+distinct+effects+on+NMDA+receptor-mediated+slow+inward+currents+in+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Two forms of astrocyte calcium excitability have distinct effects on NMDA receptor-mediated slow inward currents in pyramidal neurons.</a> J Neurosci. 28, 6659-6663 (2008).</li>
<li>Cahoy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+database+for+astrocytes%2C+neurons%2C+and+oligodendrocytes%3A+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J Neurosci. 28, 264-278 (2008).</li>
</ol>

Astrositler hücre içi kalsiyum yükselmeler görüntüler çok iyi kurulmuştur. Bu, kendiliğinden meydana gelen nöronal aktivite veya 11 astrosit yüzey reseptörleri aktive agonistleri uygulama tarafından tetiklenebilir. Bir önemli ve tartışmalı bir konu olmadığını astrosit hücre içi kalsiyum yükselmeleri, nöronlar 11, 12 reseptörleri aktive sinyal molekülleri serbest bırakılması tetikleyebilir. Yorum Haydon 7, 13 ve McCarthy 11 laboratuvarları tarafından vurgulanan bu görüşe karşı kanıt olmuştur, çünkü...

<table><tbody><tr><td>VWR&amp;#174; Mikro Lamel, Yuvarlak, No. 1</td><td>Araç</td><td>VWR international</td><td>48380-068</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysin hidrobromür</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkom bazal membranından elde edilen Laminin</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Earle&amp;rsquo;s Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) (1X), sıvı</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>14155-063</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Esansiyel Medium (MEM) (1X), sıvı Earle&amp;rsquo;s tuzları içerir, ancak L-glutamin veya fenol kırmızısı içermez</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin sıvısı</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat çözeltisi</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>HEPES çözeltisi 1 M</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Suplementi (100X), sıvı</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>At Serumu, Isıyla İnatize Edilmiş</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>26050-088</td><td></td></tr><tr><td>PAPAIN-022</td><td>Reaktif</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal&amp;#8482; Medium (1X) Fenol Kırmızısı içermeyen sıvı</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Serumsuz Suplement (50X), sıvı</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin-200 mM (100X), sıvı</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>25030-149</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Süzgeçleri</td><td>Araç</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Kapaklı, Steril, BD Falcon Çok Kuyucuklu Düz Tabanlı Plakalar</td><td>Araç</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; hekzahidrat</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; hekzahidrat</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>HEPES serbest asit</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glukoz</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>DMSO içinde 1 mM Fluo-4, AM çözeltisi</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>F-14217</td><td></td></tr><tr><td>DMSO içinde %20 Pluronic&amp;#174; F-127 çözeltisi</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>İmmersiyon Yağı TİP DF</td><td>Mikroskop</td><td>Cargill Labs</td><td>16242</td><td></td></tr><tr><td>25 mm yuvarlak lamel için açık hazne, 100 &amp;mu;l hacim</td><td>Araç</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0362 (RC-21BDW)</td><td></td></tr><tr><td>Seri 20 hazneler için P-2 platformu, ısıtıcısız</td><td>Araç</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0278 (P-2)</td><td></td></tr><tr><td>FluoSpheres karboksilat-modifiye mikroküreler, 0.1 &amp;mu;m, sarı-yeşil floresan (505/515) %2 katı</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>F8803</td><td></td></tr></tbody></table>

astrositler plazma membran ve küresel hücre içi kalsiyum dynamics civarında Ölçüm

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

Beyin glial hücreler içerir. Astrositler, glial hücre tipi, uzun nöronlar için pasif bir destekleyici bir rol sağlamak için bilinmektedir. Ancak, artan kanıtlar astrositler nöronlar ile fonksiyonel etkileşim yoluyla da aktif beyin fonksiyonu katılmak olabileceğini düşündürmektedir. Ancak, birçok temel yönleri astrosit biyoloji, tartışmalı, belirsiz ve / veya deneysel keşfedilmemiş kalır. Bir önemli konu astrositlerde hücre içi kalsiyum Transientlerin dinamikleri. Kalsiyum önemli bir ikinci haberci olarak iyi kurulmuş ve çünkü astrosit kalsiyum yükselmeler astrositler gelen vericileri serbest bırakılması tetikleyebilir ileri sürülmektedir çünkü bu geçerlidir. Ancak, yakın plazma membranı kalsiyum astrositler sinyal herhangi bir ayrıntılı ve tatmin edici bir açıklama olmamıştır. Toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi canlı hücrelerinin plazma membranı yaklaşık 100 nm içinde önemli fizyolojik sinyalleme olaylarını analiz etmek için güçlü bir araçtır. Burada, TIRF mikroskobu kullanımı ve neredeyse aynı anda, plazma membranı ve küresel hücre içi kalsiyum dinamikleri yakın izlemek nasıl tarif. Bu yaklaşımın daha rafine ve sistematik bir uygulama astrosit kalsiyum sinyal kesin detaylar hakkında bilgi potansiyeline sahiptir. Astrosit kalsiyum dinamiklerinin ayrıntılı bir anlayış, nasıl, ne zaman ve neden astrositler ve nöron kalsiyum-bağımlı fonksiyonel etkileşimleri tabi anlamak için bir temel sağlayabilir.

Biz toplam iç yansıma ve Epifloresans mikroskopi kullanılarak kültürlü astrositler membran ve küresel hücre içi kalsiyum dinamikleri yakın ölçmek için nasıl açıklar.

Astrositler Plazma Membran ve Küresel Hücre içi kalsiyum Dynamics civarında Ölçüm

Beyin glial hücreler içerir. Bir glial hücre tipi olan astrositlerin, nöronlara pasif bir destekleyici rol sağladığı uzun süredir bilinmektedir. Ancak, ...

Bu videonun ilk bölümünde, astrosit nöron ko-kültürünün nasıl hazırlanacağını göstereceğiz. Bunun için, P1 sıçanlarından alınan birkaç hipokampus bir tüpe toplanıp proteinaz ile sindirilecek, tritürasyonla ayrıştırılacak ve ardından lam üzerine ekilecektir. İkinci bölüm, astrositlerde hücre içi kalsiyum dinamiklerinin nasıl ölçüleceğini gösterecektir; bu işlem, astrositlere fluo-4 kalsiyum indikatör boyasının yüklenmesini, epifloresan mikroskopi ile global kalsiyum dinamiklerinin ölçülmesini ve TIRF mikroskopi ile membran yakınındaki kalsiyum dinamiklerinin ölçülmesini içerir.Aydınlatma otomatik ve hızlı bir şekilde değiştirilerek, hem global kalsiyum hem de membran yakını kalsiyum neredeyse eş zamanlı olarak gözlemlenebilir. Merhaba, ben Aji omi, California Üniversitesi Los Angeles Fizyoloji Bölümü'ndeki Budget COS laboratuvarından doktora sonrası araştırmacıyım. Bugün size astrositlerin kalsiyum görüntülemesine yönelik bir prosedür göstereceğiz.Laboratuvar çalışmamızda bu prosedürü, bir astrositte membran yakınındaki ve global kalsiyum dinamiklerini incelemek için kullanıyoruz. Eliminasyonu otomatik ve hızlı bir şekilde değiştirerek, global kalsiyum ile membran yakını kalsiyumu ayırt edebiliriz. Hemen ardından, astrositte kalsiyum yükselmesine neden olmak için bir TP'yi nasıl uyguladığımı göstereceğim.Ardından, astrosit inceleme yöntemiyle birlikte bariyerin özetlenmesi ve tartışılmasıyla bitireceğim. Öyleyse çalışmaya başlayalım. Astrosit kültürüne başlamak için, başı kesilmiş bir sıçan yavrusunun başındaki deriyi ve kafatasını çıkarın.Beyni soğuk diseksiyon medyumu ile doldurulmuş bir Petri kabına yerleştirin, her iki hemisferi diseke edin ve meningesleri uzaklaştırın. Ardından, hipokampusları diseke edin. Hipokampusları yaklaşık birer milimetrelik parçalar halinde doğrayın.Pappa çözeltisi içerisinde 37 °C'de 11 ila 13 dakika boyunca sindirin. Diseke edilmiş dokuyu inkübatörden çıkarın. Ardından doku parçaları çöktüğünde, bunları propano sindirim çözeltisinden dikkatlice çıkarın ve doğranmış hipokampus parçalarını yıkamak için beş mililitre hipokampal ortam ekleyin.Bu adımı tekrarlayın ve son olarak, hipokampal ortamda süspansiyona getirin. Hücreleri, alevle cilalanmış, kademeli olarak küçülen üç pipet kullanarak yaklaşık beş kez pasajlayın. Ardından hücreleri 70 µm gözenek boyutuna sahip bir hücre süzgecinden geçirin ve süzgece dört mL ortam ekleyin.Süspansiyonun 10 µL'sindeki hücreleri sayın. Mililitre başına 400,000 hücre olacak şekilde hipokampal besiyeri hacmini ayarlayın. Ardından, gece boyunca laminat çözeltisine maruz bırakılan lamellerdeki laminatı aspire ederek, hücre süspansiyonunun ekimi için lamelleri hazırlayın.Lameller kurumadan önce, her bir lam üzerine 200 µL hücre süspansiyonu ekleyin. Hücrelerin yapışması için inkübatörde 60 dakika bekletin. İnkübasyon sonrası, her kuyucuğa iki mililitre hipokampal ortam ekleyin.Ertesi gün, ölü hücreleri ve kalıntıları uzaklaştırmak için eski hipokampal medyumu aspire edin ve iki mililitre önceden ısıtılmış taze hipokampal medyum ekleyin. Astrosit-nöron ko-kültürlerinin bakımı, ekimden dört gün sonra başlamalı ve haftada iki kez bir mililitre taze nörobazal medyum eklenmelidir. Sıcaklık ve karbondioksit dengesinin sağlanması için medyumun inkübatörde havalandırmalı bir flask içinde yaklaşık 30 dakika ön inkübasyona tabi tutulduğundan emin olun.Astrositleri incelemeden önce, turf için lazer açısını optimize etmek amacıyla nano floresan boncukların incelenmesi faydalıdır. Bunun için, Petri kabına 200 µL su koyun, bir µL 100 nm floresan boncuk ekleyin ve karıştırın; ardından boncukları epi-floresans mikroskopisi ile inceleyin. Sonrasında, boncukları turf mikroskopisi ile inceleyin.Kalsiyum görüntüleme için, kültürü 2,5 µM Fluo-4 AM ve %0,05 Pluronic F-127 (%20'lik DMSO çözeltisi) içeren iki mL hipokampal kayıt tamponu ile doldurulmuş altı kuyucuklu bir plakanın kuyucuğuna yerleştirin ve oda sıcaklığında 10 ila 30 dakika inkübe edin; Fluo-4'ün ağarmasını önlemek için plakayı kapatmayı unutmayın. Fluo-4 çözeltisini uzaklaştırın ve lamelcikleri hipokampal kayıt tamponu ile üç kez yıkayın. Yıkanmış lamelcikleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.Lameli hazneye yerleştirin, lamelin diğer tarafını lens temizleme sıvısı ile temizleyin ve 200 µL hippocampal buffer ekleyin. Objektifin üzerine küçük bir damla immersiyon yağı damlatın ve hazneyi mikroskobun tablasına yerleştirin. Hücreleri odaklamak ve görünümlerini incelemek için transmisyon ışığını kullanarak gözlemleyin.Ardından, hücreleri monokrom bir kaynaktan 488 nanometre ile aydınlatın ve flu oh four'ün floresan sinyalinin homojen ve tespit edilebilir olup olmadığını belirleyin. Astrositlerde, astrositlerdeki kalsiyumu ölçmek için epi ve turf aydınlatma kullanın. Burada, floresan boncuklar epi aydınlatma ile gözlemlenmektedir.Arka plan floresansı üretmenin yanı sıra, aydınlatma açısına bağlı olarak belirgin bir brown hareketi de sergilerler. Lazer kritik açıya yaklaştığında, lazer ışını cam-su ara yüzeyinden tamamen yansır. Bu toplam iç yansıma, evanescent alan adı verilen bir elektromanyetik alan oluşturur.Bunun, daha düşük kırılma indeksine sahip hücre içine doğru yaklaşık 100 nanometrelik bir derinliği vardır. Numune yüzeyindeki bu ince tabakada floroforları uyarabilirsiniz. Burada, epi aydınlatma ile karşılaştırıldığında TIRF aydınlatma ile gözlemlenen floresan boncuklar yer almaktadır.Açıyı azalttığınızda aydınlatma sinyal-gürültü oranı önemli ölçüde artar. Lazer ışını yüzeyden yansımaz ve floresan boncuklara doğrudan çarpmak için lamelden geçer. Yoğun bir arka plan floresansı görebilirsiniz.Şimdi açıyı artırıyoruz. Yine, arka plan gürültüsü önemli ölçüde azalır ve lamelin yüzeyine yakın floresan boncukları görebilirsiniz. Bu görüntüler, flu oh four yüklü astrositleri ve nöronları göstermektedir.Astrositler ince uzantılara sahip yassı hücrelerken, nöronlar yuvarlak hücre gövdelerine ve kalın, uzun dendritlere sahiptir. Hem astrositler hem de nöronlar sağlıklı ve floresanla yüklü görünmektedir. Dört örneği uygun şekilde hazırlanmıştır.Astrositlerin epi veya konfokal mikroskopi ile incelenmesi, astrositlerin sağlıklı olup olmadığını ve kalsiyum indikatörlerinin astrositlere düzgün şekilde yüklenip yüklenmediğini anlamak için faydalıdır. Astrositin lam şeridine en yakın olan ve ayak izi (footprint) olarak adlandırılan bölgelerinde, bir TP'nin plazma membranı yakınında kalsiyum artışına neden olduğu gözlemlenir. Hipokampal astrositlerin saf anerjik reseptörler eksprese ettiği bilinmektedir ve banyo ortamına uygulanan bir TP, küresel bir kalsiyum salınımına neden olabilir.Hipokampal osteosit kültürünün nasıl hazırlanacağını ve osteositlerdeki kalsiyum seviyesinin hem global olarak hem de plazma membranına yakın bölgede nasıl ölçüleceğini size göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, lazer açısını optimize etmeyi hatırlamak önemlidir; mikroskopta bunu sağlamanın en iyi yolu 100 milimetre akış hızlarının davranışını gözlemlemektir. Global kalsiyum ve membran yakınındaki kalsiyum seviyelerinin eş zamanlı kaydı, bize sadece kalsiyum sinyalinin ayrıntılı bir açıklamasını sunmakla kalmayacak, aynı zamanda astrositteki kalsiyum düzenleme mekanizmasına dair yeni bir bakış açısı sağlayacaktır.Burada açıklanan yaklaşımın, diğer uyarılebilir bilinmeyen alanlarda membran yakınındaki ve küresel hücre içi kalsiyum seviyelerini ölçmek için de yararlı olacağı kanaatine vardık. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz, deneylerinizde başarılar dileriz.

measuring-near-plasma-membrane-global-intracellular-calcium-dynamics

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

İzole hipokampi akut beyin kesitleri, hem de astrosit ve nöronların eşzamanlı elektrofizyolojik...

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Kaynak: Bannai, H., et. al., Kültürlenmiş Hücrelerde Yerel Ca2+ Sinyallerinin Membran Hedefli Ca2+ Göstergeleri ile Diseksiyonu. J. Vis. Uzm. (2019)Video, plazma zarı ve endoplazmik retikulum üzerinde lokalize kalsiyuma duyarlı proteinleri sırayla izleyerek astrositlerde kompartmana özgü spontan kalsiyum dinamiklerini gözlemlemek için floresan görüntülemeyi göstermektedir.

Astrositlerde Kompartmana Özgü Dinamikler için Spontan Kalsiyum Görüntüleme

Burada astrositik G-protein bağlı reseptörlerin plastisite çalışma için nöronlarda homeostatik plastisite indüklemek için kullanılan protokol bir uyarlama tarif eder. En son astrositik grubu çocuk farelerde I mGluR'leri değişiklikleri incelemek için kullanılan yöntem, in situ ve in vivo olarak erişkin farelerden dokuda çeşitli astrositik GPCRs ölçekleme ölçülmesi ve astrositik reseptörlerinin duyarlılığının daha iyi takdir elde etmek için uygulanabilir nöronal aktivite değişikliklere.

Nöronal Ateşleme Oranlarının Manipülasyon tarafından Astrositik reseptörleri Plastisite Inducing

Striatumdaki astrosit hücre içi Ca2+ sinyallerinin özellikleri ve işlevleri tam olarak araştırılmamıştır. Striatal astrositlerde genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini ifade etme yöntemlerini, adeno-ilişkili serotip 2/5 (AAV2/5) virüslerini ve ayrıca striatal astrositler içindeki Ca2+ sinyallerini yerinde güvenilir bir şekilde görüntüleme prosedürlerini açıklıyoruz.

Görüntüleme hücre içi Ca 2+ Genetik olarak kodlanmış Kalsiyum Göstergelerini Kullanma Yetişkin fareler ile Striatal Astrositler Sinyalleri

Burada açıklanan AWESAM iletişim kuralı diğer beyin hücreleri izolasyonu fare astrocytes bir hızlı, basit ve ucuz şekilde kültür için en iyi yöntemdir. AWESAM astrocytes spontan Ca2 + sinyal, morfoloji ve gen ifade profilleri için astrocytes vivo içindebenzer sergi.

Vivokültür-tarihlerde hızlı, basit ve ucuz AWESAM iletişim kuralını kullanarak fare Astrocytes

Burada gösterdi (1) taze olduğu gibi beyin endotel "boru" ve endotel kalsiyum ve membran endotel kaynaklı hyperpolarization sırasında potansiyel (2) eşzamanlı ölçümler sorunlarının yalıtılması iletişim kurallarıdır. Ayrıca, bu yöntemler farmakolojik endotel hücre kalsiyum ve bireysel veya etkileşimli deneysel değişkenler olarak elektrik sinyali ayarlamak için izin verir.

Hücre içi kalsiyum ve taze izole ve olduğu gibi fare serebral endotel membran potansiyeli eşzamanlı ölçümler

Burada bir iletişim kuralı için Ca2 + sinyaller hücre altı çözünürlükte diseksiyon sağlayan Ca2 + düşsel nöronlar ve gliyal hücreler, mevcut. Bu işleme genetik olarak kodlanmış Ca2 + göstergeleri ifade izin tüm hücre tipleri için geçerlidir.

Yerel Ca2 + sinyalleri membran hedefli Ca2 + göstergeleri tarafından kültürlü hücrelerdeki diseksiyon

Burada, organellerin hücre içi naklini ve murine astrositlerinde plazma membran proteinlerinin ticaretini görselleştirmek için in vitro canlı görüntüleme yöntemini açıklıyoruz. Bu protokol aynı zamanda kargo taşımacılığı güzergahları ve kinetik belirlemek için bir görüntü analizi metodolojisi sunar.

Astrositlerde Organeller ve Diğer Kargoların Hücre İçi Taşınmasının Görselleştirilmesi ve Analizi

Bu proktokol, astrositlerde ve nöronlarda in vitro ve in vivo mitokondriyal Ca2+ görüntüleme için bir yöntem sağlamayı amaçlamaktadır.

Genetik Olarak Kodlanmış Ca2+ Göstergeleri (GECI'ler) Kullanarak Astrositlerde ve Nöronlarda Mitokondriyal Ca2+ Alımı Görüntüleme

Mevcut yöntemler, kolayca bulunabilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanarak Caenorhabditis elegans'ta in vivo olarak yüksek çözünürlüklü, sub-kompartmanlı kalsiyum görüntüleme için orantılı olmayan bir yaklaşımı tanımlamaktadır.

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Bu protokol, birden fazla hafıza ile ilgili beyin bölgesinde nöronlardan ve astrositlerden gelen kalsiyum sinyallerinin eşzamanlı kaydı için kapsamlı bir yöntem tanımı sunar ve öğrenme ve hafıza davranışı paradigmasında uygulanmasını gösterir.

Öğrenme ve Hafıza Davranışları sırasında Astrosit-Nöron Aktivitesini Birden Fazla Beyin Bölgesinde KaydEtmek İçin İki Renkli Lif Fotometri Yöntemi

Öğrenin astrositlerde küresel ve plazma membranı yakınındaki kalsiyum dinamiklerini ölçme yöntemini. Bu teknik, sinir biliminde hücresel sinyalleşme mekanizmalarını anlamak için güvenilir bir yaklaşım sunar.

Astrositler Plazma Membran ve Küresel Hücre içi kalsiyum Dynamics civarında Ölçüm

Daha fazla video keşfet