Name: 14 gün eski Fideler Dokular protoplast izolasyonu Arabidopsis thaliana /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-17T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Öğrenin, Arabidopsis thaliana fidelerinden canlı protoplast izolasyonu için bu güvenilir yöntemi. 14 günlük fideler kullanılarak elde edilen protoplastlar en az 96 saat bozulmadan kalır ve bitki biyolojisi çalışmaları için uygundur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, Start-Up Hibe OKV verilen, Cornell Üniversitesi Ziraat Deney İstasyonu (CUAES) NYC-125.433 Hatch Grant ve Cornell tarafından desteklenmiştir.

Bölüm 1. Büyüyen bitkiler için sağlam bir ortamın hazırlanması. Biz genellikle kültür bitkilerinin konsantre Murasige ve Skoog (MS) orta,% 1 sakkaroz ve% 0.7 agar ile desteklenmiş. Bu bitkilerin sağlıklı tutmak için gerekli tüm maddeler içerir. MS 1L, medya, pH 5.7 hazırlamak için <ol><li> 1.5-2.0L otoklavlanabilir şişede 800 ml su içine 2.15 g MS tozu ekleyin. </li><li> Karıştırma çubuğu şişeye koyun ve karıştırarak plaka orta karıştırma MS tozu çözülür. </li><li> Karıştırma, damla damla, 1N KOH 5.7 MS ortamın pH ayarlamak için. </li><li> 10 g sakaroz, karıştırmaya devam edin. </li><li> 7 g agar ekle *. </li><li> 1000 ml hazırlanan orta son ses seviyesini ayarlayın ve otoklav ile sterilize edin .* </li><li> Karıştırarak bir plaka üzerine yerleştirin orta otoklavlanabilir ve karıştırma süre soğumasını, o agar şişenin dibinde çökelti olmaz. Orta ~ 60 ° C&#39;ye kadar soğutun </li><li> 100 mm Petri kapları dökün. 4 plakaları tutun ° C </li></ol> * İpucu 1: Agar çözülür teşebbüs etmeyin. Otoklav sırasında çözünür. İpucu 2: otoklav sırasında bir şişe karıştırma çubuğu tutun, daha sonra ihtiyacınız olacak. * İpucu 3: otoklavlanmış şişe 10 s ellerinizi Eğer orta yeterince soğutulur ve plakaları dökülmeye başlandı. Bölüm 2. Bitki materyali ve büyüme koşulları. <ol><li> Arabidopsis thaliana tohum sterilize <ol><li> 100 mg tohum Eppendorf mikrosantrifüj tüpler içine yerleştirin ve 1 ml% 70 etanol ekleyin. İyice karıştırın ve 2 dakika boyunca inkübe edin. , Tohumlar Spin süpernatantı aspire. </li><li> 1 ml% 1.8 çamaşır suyu çözeltisi *% 0.1 Tween-20 içeren. 10 dakika karıştırın. Tohum ve aspirat çamaşır suyu çözeltisi aşağı spin. </li><li> Bu adım, bir laminer akış kaputu yapılmalıdır. Tohum için 1 ml steril su ekleyin, iyice karıştırın. Su aspire, tohumlar aşağı Spin. Bu adımı 5 kere tekrarlayın. </li></ol></li><li> Adım 1 tabak (100 tohum / plaka) hazırlanan üzerine tohumlarını yaymak. </li><li> 24-48 saat boyunca 4 numaralı seribaşı plakaları tutun ° C tabakalaşma için karanlık. </li><li> 23/19 ° C açık / koyu sıcaklık rejimi büyüme odasında 14 gün 8 saat light/16 h koyu fotoperiyodun (250 mmol m -2 s -1 fotosentetik bir foton akı yoğunluğu) ile bitkilerin büyümesi ve% 75 bağıl nem. </li></ol> İpucu 1: Bleach çözüm seyreltme bir ev Clorox,% 6 oranında sodyum hipoklorit içeren ve bir final konsantrasyon% 0.1 Tween-20 ekleyerek. Bölüm 3. Arabidopsis fidecilikten protoplast izolasyonu. <ol><li> Dilim 2 filtre ile sterilize edilmiş TVL Çözüm 15 ml taze bir jilet ile 14 günlük fide gr. Biz tek kullanımlık steril Petri kutularına bitki materyali doğrayın. </li><li> 200 ml beher içine doğranmış dokuların Transferi, filtre ile sterilize edilmiş Enzim Çözüm girdap Enzim Çözümü ile dokuların karışımı, parafilm ve alüminyum folyo ile kaplayın izin beher 20 ml ekleyin. </li><li> 16-18 saat boyunca karanlıkta, oda sıcaklığında 35 dak bitki dokularında çalkalayınız </li><li> 50 ml Falcon tüp içine peynir bez 8 kat, W5 Çözüm öncesi ıslak üzerinden eleme yayımlanan protoplast toplayın. </li><li> W5 Çözüm 15 ml bez yıkama peynir bez bir kez daha Elek protoplast. </li><li> Bindirme protoplast dikkatlice W5 Çözüm 10 ml, şeker degrade, kimseyi rahatsız etmeyecek; santrifüj 7 dk 100 g. </li><li> Enzim Çözüm ve W5 Çözümü (Şekil 1B) arayüzü protoplast 10 ml toplayın ve yeni bir 50 ml Falcon tüp transferi. </li><li> 60 gr az 5 dakika için 15 ml W5 Çözüm, santrifüj Süpernatantı. </li><li> 60 g 5min Enzim Çözüm Çözüm, santrifüj 15ml W5 protoplast resuspending ücretsiz protoplast yıkayın </li><li> 1-3ml W5 Çözüm supernatant, tekrar süspansiyon pelet protoplast çıkarın. </li><li> Bir hemasitometre ile hücre sayımı protoplast verim değerlendirin. </li></ol> Bölüm 4. Reaktifler: TVL: sorbitol 0.3 M, 50 mM CaCl 2 Filtre sterilize ve -20 depolamak ° C Enzim Çözüm: 0.5 M sakkaroz, 10 mM MES-KOH [pH 5.7, 20 mM CaCl 2, 40 mM KCl,% 1 selülaz (Onozuka R-10),% 1 Macerozyme (R10). Filtre sterilize ve taze olarak kullanabilirsiniz. W5 Çözüm:% 0.1 (w / v) glikoz,% 0,08 (w / v) KCl,% 0.9 (w / v) NaCl,% 1,84 (w / v) CaCl 2, 2 mM MES-KOH pH 5.7. Filtre sterilize ve oda sıcaklığında muhafaza. Bölüm 5: Temsilcilik Sonuçları: Bölüm 1 ve 2 olarak açıklanan Arabidopsis kültür koşulları kullanarak sağlıklı fide, protoplast (Şekil 1A) izole etmek için uygun hale getirir. Protoplast sakaroz yoğunluk farkı görülmektedir saflaştırılmışent santrifüj ve W5 ve Enzim çözümleri (Şekil 1B) arayüzü toplanır. Bölüm 3&#39;te açıklanan protoplast izolasyon prosedürü kullanarak tipik bir gram taze fide sağlam protoplast 5-10 10 6 (Şekil 1C) hasat. <img src="/files/ftp_upload/1149/Fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Arabidopsis fidecilikten protoplast izolasyonu. A, Dokular Arabidopsis, 14 günlük fide değiştirilmiş bir yordam (Chen ve Halkier, 2000) tarafından toplanan ve protoplast dönüştürülür. B, protoplast sakaroz yoğunluk gradiyenti santrifüj saflaştırılmış ve enzim çözeltisi arayüz toplanır. W5 uffer (Beyaz oklar). C, protoplast Parlak alan mikroskobu. Microphotographs Zeiss Axioscope 2 artı mikroskop ile arabirim soğutmalı bir CCD kamera kullanılarak toplanmıştır.

<ol><li>Cocking, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+the+Isolation+of+Plant+Protoplasts+and+Vacuoles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles.</a> Nature. 187, 962-963 (1960).</li>
<li>Chen, S., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+glucosinolate+uptake+by+leaf+protoplasts+of+Brassica+napus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of glucosinolate uptake by leaf protoplasts of Brassica napus.</a> J Biol Chem. 275, 22955-22960 (2000).</li>
<li>Robert, S., Zouhar, J., Carter, C., Raikhel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+intact+vacuoles+from+Arabidopsis+rosette+leaf-derived+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of intact vacuoles from Arabidopsis rosette leaf-derived protoplasts.</a> Nat. Protocols. 2, 259-262 (2007).</li>
<li>Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+a+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat Protoc. 2, 1565-1572 (2007).</li>
<li>Zhai, Z., Sooksa-nguan, T., Vatamaniuk, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+RNAi+as+a+reverse+genetic+approach+for+gene+functional+analysis+in+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Phys%22%5BJournal%5D)">Establishing RNAi as a reverse genetic approach for gene functional analysis in protoplasts.</a> Plant Phys. 149, 642-652 (2009).</li>
</ol>

Teknoloji Enterprise ve Ticarileştirme için Cornell Merkezi (CCTEC), Haziran 2008 ile bitki genlerinin fonksiyonel analizlerde kullanmak için bu yordamı açıklayan geçici patent davaları açmışlardır. Tamam Vatamaniuk, Zhai, bitki genlerinin hızlı fonksiyonel analizler için Z. Yöntemi: Hulasa yok 50341/015001.

Sağlıklı bitkiler ile sağlam protoplast yüksek verim sağlamak için start-up için çok önemlidir. Protoplast izole etmek için, filtre sterilize çözümleri kullanın. Protoplast kırılgan olduğunu unutmayın. Bu nedenle, protoplast ele pipetlemeyin veya onları fren şiddetle beri girdap onları karıştırmak yok. Bunun yerine, yavaş yavaş dönen veya santrifüj tüpüne taping protoplast karıştırın. En az 96 saat boyunca canlı açıklanan prosedür verim sağlam protoplast Bu nedenle, protoplast hücre içi proteinler lokalizasyonu, izolasy...

<table><tbody><tr><td>Murashige ve Skoog Bazal Tuz Karışımı (MS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Petri Kapları (100x15mm)</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>82-4001</td><td></td></tr><tr><td>Selülaz (OnozukaR&amp;#8208;10)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>C32200</td><td></td></tr><tr><td>Maserozim (R10)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>M22010</td><td></td></tr><tr><td>Peynir bezi silecekleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-665-29</td><td></td></tr><tr><td>Laboratuvar Rotatörü</td><td>Fisher Scientific</td><td>1167152Q</td><td></td></tr><tr><td>AllegraX&amp;#8208;15R Santrifüj</td><td>VWR international</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>Axioskop 2 Plus Mikroskobu</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

14 gün eski fideler dokular protoplast izolasyonu arabidopsis thaliana</em

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplast bitki hücrelerinin hücre duvarlarının enzimatik çıkarmıştı. Farklı bitki dokularında protoplast izolasyonu ilk 40 yıldan fazla bir zaman önce bildirilmiştir<sup&gt; 1</sup&gt; Ve o zamandan beri, hücre içi proteinler lokalizasyonu, sağlam organelleri izolasyonu ve çift iplikli RNA enterferans (RNAi) tarafından hedeflenen gen inaktivasyonu gibi hücresel süreçleri, çeşitli çalışma adapte edilmiştir<sup&gt; 2-5</sup&gt;. Protoplast yalıtım protokollerin çoğu olgun Arabidopsis yaprak dokularında (örneğin 35 gün bitkiler)<sup&gt; 2-4</sup&gt;. Biz 14 gün eski Arabidopsis fide kullanılarak mevcut protokoller değiştirilebilir. Bu yöntemde, bir gram 14 günlük fide 5 10 vermiştir<sup&gt; 6</sup&gt; -10<sup&gt; 7</sup&gt; En az 96 saat bozulmadan kalır protoplast. Fidecilikten protoplast verimi olgun Arabidopsis yaprakları hazırlıkları ile karşılaştırılabilir, ancak 35-36 gün yerine 15 gün içinde, protoplast izolasyonu tamamlandı. Bu olgun bitkiler kullanılır protoplast izole etmek için gerekli olan zaman ve büyüme odası alanı azaltarak sağlar ve sağlam protoplast gerektiren mansap çalışmaları hızlandırır.

Bu video 14 günlük fide Arabidopsis dokuları bozulmadan protoplast izole etmek için bir prosedür gösterir. Izole protoplast en az 96h bozulmadan kalır ve bir aylık olgun bitkilerin yerine fide izole olduğunu göz önüne alındığında, bu yordamı sağlam protoplast gerektiren testleri hızlandırır.

14 gün eski Fideler Dokular protoplast izolasyonu Arabidopsis thaliana</em

Protoplastlar, hücre duvarları enzimatik olarak uzaklaştırılmış bitki hücreleridir. Farklı bitki dokularından protoplast izolasyonu ilk kez ...

Bu prosedür, 14. günde Arabidopsis tohumlarının MS Agarlı ortama ekilmesiyle başlar. Tohumlar çimlendikten sonra fideler toplanır ve dilimlenir. Ardından bitki materyali, hücre duvarını parçalayan bir enzim çözeltisi ile digeste edilir.Elde edilen karışım, protoplastları diğer bitki materyallerinden ayırmak için bir tülbentten süzülür. Toplanan protoplastlar, W beş çözeltisi ile katmanlandırılarak bir sükroz yoğunluk gradyanı üzerinde daha fazla saflaştırılır. Protoplastlar, enzim ve W beş çözeltisinin ara yüzeyinde yoğunlaşır.Deneyden önce toplanıp yıkanırlar. Merhaba, ben Cornell Üniversitesi Bitki ve Toprak Bilimleri Bölümü'ndeki Lina Wauk laboratuvarından Jang Ja. Bugün size 14 günlük aro Ana TH'lerinden sağlam fotoğraf izolasyonu için bir prosedür göstereceğiz.Laboratuvarımızda bu prosedürü, ilgilenilen proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu incelemek, sağlam organelleri izole etmek ve çift zincirli RNA interferans yoluyla genlerin fonksiyonel analizini yapmak için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım. Prosedüre, bir litre besiyeri için %1 sükroz ve %0,7 agar eklenmiş 0,5 kat MS plakaları hazırlayarak başlıyoruz.2.15 gram MS tozu tartın. İçinde manyetik balık bulunan 1,5 litrelik

isolation-protoplasts-from-tissues-14-day-old-seedlings-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bitki materyali belirli hücre türlerini izole etmek için kullanılan bir yöntem olduğunu göstermiştir. Bu teknik, özellikle hücre tipleri, hücresel bölünmeler ve Floresans Aktif Hücre Sıralama floresan proteinleri ifade transgenik işaretleyici hatları kullanmaktadır. Ayrıca, büyüme kurulumu kolaylaştıran tedavisi burada...

Bitki protoplast Floresan Aktif Hücre Ayırma

Mekansal özel Fitokrom yanıtlar moleküler temeli, doku ve organ spesifik Fitokrom eksiklikleri gösteren transgenik bitkiler kullanılarak araştırılmaktadır. Belirli hücrelerin izolasyonu mikroarray analizleri takip Sıralama mekansal özel Fitokrom yanıtları yer genleri tanımlamak için kullanılmaktadır Floresan-Aktif Hücre tarafından uyarılan Fitokrom kromofor tükenmesi sergiliyor.

Hücre tipi Özgül gösterilmeden FACS yardımlı kullanarak Doku ve Organ spesifik Fitokrom Yanıtları incelenmesi Arabidopsis thaliana</em

Biz stoma farklılaşma belgeleyen, gelişme birkaç gün içinde epidermis konfokal görüntüleme için bitki kotiledon hareketsiz odası slaytlar ve medya kullanarak bir protokol açıklar. Fluorofor etiketli proteinlerin hücre bölünmesi ve hücre tipi farklılaşması esnasında olası rollerini anlamayı arttırıyor, ifade ve hücre içi lokalizasyonu dinamik izlenebilir.

Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme<em&gt; Arabidopsis Kotiledon</emÇimlenme sırasında&gt; Epidermis

Biz gelen geliştirmenin erken aşamalarında embriyo izole için etkili ve basit bir yöntem...

Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Tohumlar

sirkadiyen saat Arabidopsis transcriptome yaklaşık üçte düzenler, ancak timekeeping içine geri besleme genlerin yüzdesi bilinmemektedir. Burada hızla geçici protoplastlar ifade bir sirkadiyen muhabiri Işıklı görüntüleme kullanarak Arabidopsis herhangi mutant doğrultusunda sirkadiyen fenotipleri değerlendirmek için bir yöntem görselleştirmek.

Bir Lüminesans Saat Reporter ile Arabidopsis Protoplasts transfekte içinde Sirkadiyen fenotipleri Hızlı Analizi

Burada, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastlarına uygulanan bir etkileşimli yakalama protokolünü sunuyoruz. Bu yöntem kritik olarak in vivo UV çapraz bağlanmaya dayanır ve fizyolojik bir ortamdan bitki mRNA'ya bağlanan proteinlerin izole edilmesine ve tanımlanmasına izin verir.

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

Biz canlı hücrelerdeki karmaşık düzenleyici ve sinyal mekanizmaları incelemek soya önceki büyük miktarlarda hazırlanması için basit ve etkili iletişim kuralı geliştirilmiştir.

Soya önceki ve geçici gen ifade analiz için uygulama yalıtım için basit bir yöntem

Yüksek verimli scRNA-seq yöntemlerinin fizibilitesi ve etkinliği, bitki araştırmalarında tek hücreli bir çağın habercisidir. Burada, spesifik Arabidopsis thaliana kök hücre tiplerinin izole edilmesi ve ardından transkriptom kütüphanesi yapımı ve analizi için sağlam ve eksiksiz bir prosedür sunulmaktadır.

Bitki Hücre Tiplerinin İzolasyonu ve Transkriptom Analizi

Bu protokol, Arabidopsis thaliana tohumlarında endosperm hücre tabakasının sağlam örneklerinin hazırlanmasını açıklar. Yöntem, yalnızca enjeksiyon iğnesi ve hassas forseps gibi yaygın laboratuvar ekipmanı gerektirir ve hem gelişmekte olan hem de olgun tohumlardaki endosperm hücrelerinin yüksek çözünürlüklü floresan canlı hücre görüntülemesini sağlar.

Gelişmekte Olan ve Olgun Arabidopsis Tohumlarında Endosperm Hücre Tabakasının Mikroskobik Analizi için Sağlam Dokunun Hazırlanması

Bu makale, çiçek-daldırma yöntemi göstermektedir.

Floral-daldırma Dönüşüm Arabidopsis thaliana Inceleyin PTSO2: β-glucuronidase Reporter Gen İfadesi

Öğrenin, Arabidopsis thaliana fidelerinden canlı protoplast izolasyonu için bu güvenilir yöntemi. 14 günlük fideler kullanılarak elde edilen protoplastlar en az 96 saat bozulmadan kalır ve bitki biyolojisi çalışmaları için uygundur.

14 gün eski Fideler Dokular protoplast izolasyonu Arabidopsis thaliana

Daha fazla video keşfet