Name: Drosophila Göz hayali Disk Glial Hücre Göç Canlı Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Öğrenin Drosophila göz hayali disklerinde glial hücre göçünü canlı görüntüleme yöntemiyle. GFP etiketli hücreler kullanılarak sinir sistemi gelişimi ve hücre davranışları detaylı şekilde incelenir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Patrick Cafferty Kanada Multipl Skleroz Derneği bir doktora sonrası burs tarafından desteklenmektedir.

Bölüm 1: Ön-deneysel set-up. <ol><li> Bir hafta önceden arkadaşı larva oluşturmak için uçar ifade GFP kontrolü altında özel bir glial organizatörü. Deneme için bir nükleer yerelleştirme sırası ile ters polarite (repo) organizatörü (3, 4) glial hücreleri kullanarak ifade etiketli GFP görüntülendi. </li><li> % 1 gecede kuru poli-L-lisin çözüm ve hava 10 dakika boyunca 18 mm yuvarlak kapak fişleri iliklerine tarafından en az bir gün önceden fişleri kapak hazırla. </li><li> Deney bir gün önce, bir gecede% 70 etanol bileşenleri iliklerine Chamlide manyetik kültür odası temiz. </li><li> Deney günü, Schneider böcek orta aseptik teknik kullanılarak 10 ml fetal sığır serumu, penisilin-streptomisin çözüm, ve insülin ekleyerek kültür ortamı hazırlamak. Çalışma konsantrasyonları: 1X fetal sığır serum; 100U/ml penisilin, 0.1mg/ml streptomisin ve 0.2 mg / ml Schneider böcek ortamda insülin (değiştirilmiş (5)). </li><li> Kültür odasının bir hücre kültürü kaputu kurumaya bırakın. Hazırlanan kültür ortamı ile durulama kültür odası artık etanol yıkayınız. </li></ol> Bölüm 2: Drosophila göz-beyin kompleks Diseksiyon. <ol><li> Birkaç dakika süreyle buz üzerinde soğutulmuş kültür ortamı bir petri açılan bir sinek şişe ve yerin yan tarafında bir üçüncü instar dolaşıp larva seçin. Larva Chilling diseksiyon kolaylığı için peristaltik vücut kasılmaları yavaş tavsiye edilir. </li><li> Diseksiyon mikroskop altında Sylgard kaplı çanak kültür ortamı bir damla soğuk larva yerleştirin. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında, larva arka ucundan yolu yaklaşık üçte birini sıkıca kavramak için Dumont ince forseps bir çift kullanın. Larva ön sonundan itibaren ağzında kanca extrudes kadar bekleyin. Ağız tam uzantısı üzerine ikinci bir çift forseps ile kanca kavrayın. Larva incelemek için, forseps, iki çift zıt yönlerde yavaşça çekin. Göz-beyin kompleksi, tükürük bezleri, yağ organları, ve hayali doku ile birlikte, larva vücuttan uzakta çeker. Ağız, göz-beyin kompleks yırttınız hızla aksi takdirde çok kanca çekmeyin. </li><li> Tükürük bezleri, yağ organları, ve ultra-ince clipper makas kullanılarak hayali diskler uzak kesin. Beyin ve göz-diskler iki yarımküresinin ventral sinir kablosu ve ağız çengelleri eklenecektir. </li><li> 18 mm kapak kayma bir cam slayt üzerine yerleştirin. Sonra kapak kayma pick up için slayt kenarına asılı kapak kayma bir kenar bırakın. 18 mm kapak kayma kültür ortamı üzerine bir damla ekleyin. Forseps ile ağız kanca tutarak, kültür ortamı içine göz-beyin kompleksi aktarın. Forseps veya doku hasar ile doğrudan göz-beyin kompleksi kavramak etmeyin. </li><li> Ince diseksiyon makas kullanmak, ağız, göz-beyin kompleksi ve atın kanca keserek. Ağız kancaları, doku mikroskopi sırasında taşımak için neden kültür ortamı sözleşme devam edecek gibi ağız kanca kaldırılması canlı görüntüleme için önemlidir. </li><li> Göz hayali disk içinde glial göç görselleştirmek için, dikkatlice kesilmiş ve optik sapı, beyin ve göz disk bağlayan ince bir doku (Şekil 1A) beyin uzağa itmek ya da atın. Optik sapı içindeki glia görselleştirmek için, beyin, optik sapı ve sağlam göz hayali disk (Şekil 1E) bırakın. </li><li> Forseps kullanarak lamel Pick up ve kalıcı bir kalem ile ilgi doku etrafında altında bir daire çizin. Bu daire Bölüm 4 mikroskobu için doku yerini yardımcı olacaktır. </li></ol> Bölüm 3: Manyetik bir kültür odasında göz hayali disk montajı. <ol><li> Forseps kullanarak, lamel asma kenarında kavrayın. Doku kültürü bozmadan Chamlide manyetik odasının alt plaka lamel aktarın. </li><li> Chamlide odasının ana gövde üzerine silikon O-ring yerleştirin. Alt plakası ana gövde üstüne yükleyin. </li><li> Odaya kültür ortamı yavaş yavaş ekleyin. Kültür ortamında çok hızlı ya da ilgi doku rahatsız olacak katmayın. Kapağın altında gaz değişimi için izin odası tamamen doldurmayın. </li><li> Chamlide odasının üstünde görünmez kapağını yavaşça yerleştirin. </li></ol> Bölüm 4: göz disk glial hücreleri göç Görselleştirme. <ol><li> Konfokal veya floresan mikroskobu aşamasında kültür odasına yerleştirin. Düşük büyütme bir referans olarak lamel daire kullanarak örnek bulun. </li><li> 40x bir lens kullanarak örnek üzerinde odaklanın. Doku lamel üzerine yerleşmek için izin verin. Göz disk veya optik sapı 3-4 saat boyunca her 10-15dk görüntüler yakalayın. Doku seğirme ve odak dışında hareket edebilir. El görüntü yakalama önce doku odaklanarak inci hafifletmekbir sorundur. </li></ol> Bölüm 5: Temsilcilik sonuçları: Doğru şekilde gerçekleştirilmemesi, protokol bize göz hayali disk (Şekil 1 BD) optik sapı göç GFP etiketli glial hücreleri görüntüler bir dizi toplamak için izin verdi. 60 dakikalık bir süre için canlı görüntüleme, vahşi bir tür göz hayali disk içinde glial çekirdeğinin pozisyonlarda değişiklikleri gözlemlemek için yeterli iken, glial hücre geçiş için gerekli bir genin mutant glial çekirdekleri tamamen optik sapı (oklar çıkmak için başarısız Şekil 1 FH). Biz kültür dokusunun bozulmasına gözlemleyerek önce 240 dakika gibi uzun süreler için kültürlü göz-beyin kompleksleri var. 240 dakikalık zaman noktası, GFP pozitif hücrelerin kültürlü göz-beyin kompleksler (ok Şekil 2 C) çevreleyen kültür ortamında gözlemlemek için başlar. Ayrıca GFP boyunca diffüz noktalar bir arıza doku bütünlüğü düşündüren dokularda birikir. <img src="/files/ftp_upload/1155/figure1.png" alt="" width="589" height="241" /> Şekil 1: gelişmekte olan yabani tip ve mutant ve görüntü sistemleri GFP etiketli glial çekirdekleri Canlı görüntüleme. A, E) Görüntüler diferansiyel girişim kontrast (DIC), kültürlü yabani tip ve mutant göz hayali diskler (ED) mikroskopi kullanılarak çekilen . Vahşi tip, glial hücreler doğumlu ve göz-disk, optik sapı (OS) göç. Beyin, düzleşme ve göz hayali disk görüntüleme kolaylaştırmak için kaldırılmıştır. BD) (A) 0, 30 ve 60 dakikalık zaman noktalarında GFP etiketli glial çekirdekleri göz disk içinde göç ortaya koymaktadır vahşi tip kültür göz hayali disk Floresan mikroskopi. FH) (E) 0, 30 ve 60 dakikalık zaman içinde GFP etiketli glial çekirdekleri durdurduklarını optik sapı (ok) gösteren mutant göz-beyin kompleks Floresan mikroskopi. (BR) beyin sapı içinde glia görüntüleme kolaylaştırmak için optik sapı bağlı bırakılmıştır. <img src="/files/ftp_upload/1155/Figure_2.png" alt="" width="600" height="156" /> Şekil 2: Canlı görüntüleme vahşi bir tür göz hayali disk GFP etiketli glial membranlarda. Biz başarıyla 240 dakikalık süreler için göz-beyin kültür kompleksleri var. Doku kültürü 240 dakikadan daha uzun yıkmak için başlar. 300 dakikalık bir zaman noktası (C) ile karşılaştırıldığında göz hayali disk çevresindeki kültür ortamı (ED), optik sapı (OS) ve 0 (A) ve 150 dakika (B) beyin lobu (BR), ücretsiz GFP pozitif hücreler, bir ok ile gösterilir.

<ol><li>Aigouy, B., Lepelletier, L., Giangrande, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+chain+migration+requires+pioneer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial chain migration requires pioneer cells.</a> J. Neurosci. 28, 11635-11641 (2008).</li>
<li>Silies, M., Yuva, Y., Engelen, D., Aho, A., Stork, T., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell+migration+in+the+eye+disc%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial cell migration in the eye disc.</a> J. Neurosci. 27, 13130-13139 (2007).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Sepp, K. J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+lacZ+enhancer+trap+lines+to+GAL4+lines+using+targeted+transposition+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Conversion of lacZ enhancer trap lines to GAL4 lines using targeted transposition in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 151, 1093-1101 (1999).</li>
<li>Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+geometric+order+in+proliferating+metazoan+epitheia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The emergence of geometric order in proliferating metazoan epitheia.</a> Nature. 442, 1038-1041 (2006).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Bu protokol canlı mikroskopi kullanılarak göz hayali disk glial hücre göç gözlem açıklar. Vahşi tip örnek (Şekil 1 MS), bir saat boyunca göz disk glial hücre hareketi gözlemlemek için bir nükleer GFP işareti kullanılır. Şu anda bizim laboratuvarda çalışma kapsamında, glial hücre göçü için gerekli bir aday gen için bir mutant, biz (Şekil 1 EH) bir saatlik bir süre boyunca bir optik sapı içinde glial hücre çekirdeğinin durdurduklarını gözlemlenmiştir. Bizim stratejimiz ilgi gen tarafından düzenlenen hücresel davr...

<table><tbody><tr><td>Poly-L-lysin</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s İnsekt Besiyeri</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Sığır pankreasından elde edilen insülin çözeltisi</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516</td><td></td></tr><tr><td>Chamlide Manyetik hazne</td><td>Araç</td><td>Live cell Instrument</td><td>CM-R-10</td><td>18 mm lamel için 35 mm kap tipi hazne</td></tr><tr><td>Ultra ince kesici makas</td><td>Araç</td><td>Fine Science Tools</td><td>15200-00</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pens</td><td>Araç</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskop</td><td>Mikroskop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>GFP için gerekli filtrelere ve eksitasyona sahip herhangi bir floresan görüntüleme sistemi kullanılabilir.</td></tr></tbody></table>

drosophila göz hayali disk glial hücre göç canlı görüntüleme

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Omurgalı ve omurgasız organizmaların hem de glial hücreleri ensheath için nihai hedef bölgelere göç ve ilişkili nöronlar desteği gerekir. Son ilerleme gelişmekte olan pupa kanat (1), çalışmaları glial hücreler canlı göç tanımlamak için yapılmış olsa da<em&gt; Drosophila</em&gt; Glial hücre göçü genellikle sabit dokusunun incelenmesi yer var. Canlı hareketli hücrelerin mikroskobik inceleme, oranı ve büyüme yönünde değişiklikler belirlenmesi de dahil olmak üzere göçmen süreci boyunca hücresel davranışlarını incelemek için yeteneği sunar. Genetik araçlarının kullanımı ile eşleştirilmiş, canlı görüntüleme, kalkınma sürecinde belirli genler için daha hassas rollerini belirlemek için kullanılabilir. Silies tarafından Önceki çalışma<em&gt; Ve ark.</em&gt; (2), sabit dokusunda göz hayali disk, optik sapı, gelişmekte olan beyin ve göz bağlayan bir yapı kaynaklanan göç glia tanımladı. Burada, glial hücrelerin canlı göç incelenmesi için bir protokol taslağını<em&gt; Drosophila</em&gt; Göz hayali disk. Biz gelişmekte olan glia yabani tip ve mutant hayvanlar glial hücre ilerlemesini takip etmek, GFP ifade eden Drosophila hattı yararlanmak.

Burada, glial hücreler göç GFP etiketli glial hücreler ile eşleştirilmiş canlı mikroskobik analizi ile gelişmekte olan Drosophila göz içine incelemek için bir protokol açıklar.

Drosophila Göz hayali Disk Glial Hücre Göç Canlı Görüntüleme

Hem omurgalı hem de omurgasız organizmaların glial hücreleri, ilişkili nöronları kılıflamak ve desteklemek için nihai hedef bölgelere göç etmek zorundadır. ...

Larvaları posterior ve anterior uçlarından tutarak ve ardından pensleri zıt yönlere çekerek disseke ediyoruz. Fazla dokular ultra ince makaslar kullanılarak temizlenir. Bu işlem, larval beyin göz imajinal disklerinin iki hemisferini açığa çıkaracaktır.Ventral sinir kordonu ve ağız kancaları. Larval göz beyin kompleksi bir kültür odasına aktarılır. Yabanıl tip bir göz imaginal diskinde glial hücrelerin migrasyonunu görüntülemek için beyin lobunu optik sapktan ayırırız.Bir mutantın optik sapındaki duraklamış glial hücreleri gözlemlemek için, beyin lobunu optik sapa bağlı bırakıyoruz. Ben British Columbia Üniversitesi Zooloji Bölümü'ndeki Vanessa Als Laboratuvarı'ndan Patrick Cafferty. Merhaba, ben Rin.Bugün, gelişmekte olan drosophila gözündeki göç eden glial hücrelerin görselleştirilmesine yönelik bir prosedürü size göstereceğiz. Glial hücre gelişimini incelemek için laboratuvarımızda bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.Deneyin başlangıcından bir hafta önce, glial hücreye özgü bir promotör kontrolü altında GFP eksprese eden larvalar üretmek için sinekler çiftleştirilir. Bu deney, glial hücrelerde eksprese edilen ve nükleer lokalizasyon dizisi ile etiketlenmiş GFP'nin görse

live-imaging-glial-cell-migration-drosophila-eye-imaginal

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz özellikle ifade edilir bir roman kırmızı floresan proteini (RFP) muhabiri...

Göz hayali Disk Görselleştirme Yardım Roman RFP Reporter Drosophila</em

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Geliştirilmesi ve Yetişkin hazırlanması Drosophila Brain ve Canlı Görüntüleme için Retinae

Bu video, glial hücrelerin tek hücreli görüntülenmesi için transgenik bir Drosophila beyninin immünofloresan boyamasını göstermektedir. Beyin, glial spesifik bir rekombinaz sisteminin kontrolü altında farklı antijenik epitop kombinasyonları ile kaynaşmış zar hedefli proteinleri eksprese eder. İzole ve sabit beyinler, antijenik epitoplara özgü primer antikorlarla boyanır, ardından florofor konjuge sekonder antikorlar gelir. Bu etiketleme, çeşitli beyin bölgelerinde farklı glial hücre alt...

Glial Hücrelerin Tek Hücreli Görüntülenmesi için Drosophila Beyinlerinin İmmünofloresan Boyaması

Source: Hellerman, M. B., et al. Drosophila Pupa Gözünün canlı görüntülemesi. J. Vis. Exp. (2015)Video, bir Drosophila melanogaster pupasında göz desenini incelemek için canlı görüntüleme tekniğini göstermektedir. Yeşil floresan proteini (GFP) etiketli belirteçler, gelişmekte olan göz yapısının oluşumu sırasında hücresel organizasyonun ve farklılaşmanın görselleştirilmesini sağlar.

Floresan mikroskobu kullanılarak Drosophila pupa gözünün canlı görüntülenmesi

Bu protokol, dokunulmamış larva beyin bağlamında canlı hücre görüntüleme yapmak için kullanılan akıcı bir yöntem göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları sürekli daha önce gözardı mekanizmaları ortaya çıkarılması, asimetrik nöral kök hücre bölünmeleri çalışmanın yanı sıra diğer nörolojik ve gelişimsel süreçleri için paha biçilmezdir.

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Drosophila'nın yetişkin yapıları, hayali diskler adı verilen kese benzeri yapılardan türetilmiştir. Bu disklerin analizi, doku tayini, kompartman sınırı oluşturma, hücre proliferasyonu, hücre kaderi spesifikasyonu ve düzlemsel hücre polaritesi dahil olmak üzere birçok gelişimsel süreç hakkında bilgi sağlar. Bu protokol, ışık/floresan mikroskobu için hayali diskleri hazırlamak için kullanılır.

Diseksiyon ve hayali Disklerin immün itibaren Drosophila melanogaster

Bu protokol, canlı Drosophila pupa göz nöroepitelini görüntülemek için etkili bir yöntem sunar. Bu yöntem, doku hareketini ve düzensiz topolojiyi telafi eder, birden fazla GFP etiketli bağlantı proteininin kullanılması yoluyla hücre sınırlarının görselleştirilmesini geliştirir ve kolayca monte edilebilen bir görüntüleme teçhizatı kullanır.

Canlı-görüntüleme Drosophila Pupa Göz

Bu protokol uzun vadeli ex vivo kültür ve Drosophila hayali diskin canlı görüntüleme için ayrıntılı bir yöntem tarif etmektedir. Göz diskin canlı görüntüleme 10 saat süre içinde fotoreseptör farklılaşma ve ommatidial dönüşünü gösterir. protokol basit ve pahalı kurulum gerektirmez.

Uzun süreli Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Göz Disk

Burada, Drosophila yumurtalık nişindeki germ hattı kök hücrelerinin (GSC'ler) asimetrik bölünmesinin canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Spektrozom proteini Par-1'in yeşil floresan proteini (GFP) füzyonunu her yerde ifade eden bir transgenik çizgi kullanıyoruz.

Kadın Drosophila melanogaster Germline Kök Hücre Nişlerinin Genişletilmiş Canlı Görüntülenmesi

Canlı Drosophila kanadı hayali disklerindeki bitişik epitel tabakalarındaki hücreler arasındaki temasları GFP sulandırma tabanlı bir yaklaşım kullanarak ölçmek için bir protokol açıklıyoruz.

Canlı Drosophila Wing Hayalinal Disklerde Sitonemlerin Aracılık Ettiği Hücre-Hücre Temasını Değerlendirmek için GFP Tamamlama Tabanlı Çift İfade Sistemi

Öğrenin Drosophila göz hayali disklerinde glial hücre göçünü canlı görüntüleme yöntemiyle. GFP etiketli hücreler kullanılarak sinir sistemi gelişimi ve hücre davranışları detaylı şekilde incelenir.

Drosophila Göz hayali Disk Glial Hücre Göç Canlı Görüntüleme

Daha fazla video keşfet