Drosophila Göz hayali Disk Glial Hücre Göç Canlı Görüntüleme

Larvaları posterior ve anterior uçlarından tutarak ve ardından pensleri zıt yönlere çekerek disseke ediyoruz. Fazla dokular ultra ince makaslar kullanılarak temizlenir. Bu işlem, larval beyin göz imajinal disklerinin iki hemisferini açığa çıkaracaktır.

Ventral sinir kordonu ve ağız kancaları. Larval göz beyin kompleksi bir kültür odasına aktarılır. Yabanıl tip bir göz imaginal diskinde glial hücrelerin migrasyonunu görüntülemek için beyin lobunu optik sapktan ayırırız.

Bir mutantın optik sapındaki duraklamış glial hücreleri gözlemlemek için, beyin lobunu optik sapa bağlı bırakıyoruz. Ben British Columbia Üniversitesi Zooloji Bölümü'ndeki Vanessa Als Laboratuvarı'ndan Patrick Cafferty. Merhaba, ben Rin.

Bugün, gelişmekte olan drosophila gözündeki göç eden glial hücrelerin görselleştirilmesine yönelik bir prosedürü size göstereceğiz. Glial hücre gelişimini incelemek için laboratuvarımızda bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.

Deneyin başlangıcından bir hafta önce, glial hücreye özgü bir promotör kontrolü altında GFP eksprese eden larvalar üretmek için sinekler çiftleştirilir. Bu deney, glial hücrelerde eksprese edilen ve nükleer lokalizasyon dizisi ile etiketlenmiş GFP'nin görselleştirilmesini içerir. Ters polarite promotörü kullanarak, deneyden en az bir gün önce 18 milimetrelik yuvarlak lamel camları %1'lik poli-L-lizin çözeltisinde 10 dakika bekleterek hazırlayın ve ardından deneyden önceki gün boyunca gece boyu havada kurumaya bırakın.

Deney gününde, bileşenlerini gece boyunca %70 etanol içinde bekleterek zincir şeklinde dizilmiş manyetik kültür odasını temizleyin. Kültür ortamını hazırlamak için aseptik teknikler kullanın. 10 mililitre Schneider böcek ortamına fetal bovine serum, penisilin, streptomisin çözeltisi ve insülin ekleyin.

Temizlenmiş zincir yataklı manyetik kültür odasını, kalıntı etanolü hazırlanmış kültür medyumu ile durulayarak temizlemeden önce bir hücre kültürü davlumbazında hava ile kurumaya bırakın. Bu hazırlıklar tamamlandıktan sonra, drosophila göz-beyin kompleksinin diseksiyonuna başlayabiliriz. Bu prosedüre başlamak için, bir sinek şişesinin kenarından üçüncü instarda gezici bir larva seçin ve soğutma amacıyla birkaç dakika boyunca buz üzerindeki bir Petri kabında, soğutulmuş kültür medyumu damlası içine yerleştirin.

Diseksiyonun kolaylaştırılması için larvaların peristaltik vücut kasılmalarının yavaşlaması önerilir. Ardından, soğutulmuş larvaları bir diseksiyon mikroskobu altında, sard kaplı bir kap içindeki bir damla kültür ortamına yerleştirin; larvaları sıkıca tutmak için bir çift dumont ince pens kullanın. Arka uçtan yaklaşık üçte bir mesafe uzaklıktan, larvanın ağız kancalarını ön uçtan dışarı çıkarmasını bekleyin ve ağız kancaları tamamen uzandığında onları ikinci bir pens çiftiyle kavrayın.

Larvaları diseke etmek için, iki çift pensi yavaşça zıt yönlere doğru çekin. Göz-beyin kompleksi, tükürük bezleri, yağ cisimcikleri ve imaginal doku ile birlikte larval gövdeden ayrılacaktır. Ağız kancalarını çok hızlı çekmeyin, aksi takdirde iBrain kompleksinden kopabilirler.

Ultra ince uçlu makas kullanarak tükürük bezlerini, yağ cisimciklerini ve imaginal diskleri temizleyin; beynin iki hemisferi ve göz diskleri ventral sinir kordonuna ve ağız kancalarına bağlı kalacaktır. Ardından, bir kenarı lamın dışına taşacak şekilde, cam lam üzerine 18 milimetrelik bir lamelle yerleştirin. Lamelli daha sonra kaldırabilmek için üzerine bir damla kültür ortamı ekleyin.

Ağız kancalarını pensle kavrayın ve iBrain kompleksini lamel üzerindeki kültür ortamına aktarın. Göz-beyin kompleksi lamel üzerine aktarıldıktan sonra, ağız kancalarını göz-beyin kompleksinden kesip çıkarmak için ince diseksiyon makası kullanın.

Ağız kancalarının çıkarılması, canlı görüntüleme için önemlidir çünkü ağız kancaları kültür ortamında kasılmaya devam ederek mikroskopi sırasında dokunun hareket etmesine neden olur. Optik sap içindeki GL'yi görselleştirmek için beyin optik sapını ve göz imajinal diskini sağlam bırakın. Göz imajinal diski içindeki glial göçü görselleştirmek için, beyni ve göz diskini birbirine bağlayan ince doku olan optik sapı dikkatlice kesin ve beyni uzaklaştırın veya atın.

Son olarak, lamelini pens yardımıyla kaldırın ve kalıcı bir markör ile ilgilenilen dokunun altına bir daire çizin. Bu daire, daha sonra mikroskopi sırasında dokunun konumunun belirlenmesine yardımcı olacaktır. Artık göz imaginal diski, manyetik bir kültür odasına yerleştirilmeye hazırdır.

Göz imaginal diskini manyetik bir kültür odasına monte etmek için, pens yardımıyla lamelin sarkan kenarından tutun ve kültürdeki dokuyu rahatsız etmeden lameli zincir hat manyetik odasının alt plakasına aktarın. Ardından, silikon o-ringi zincir hat odasının ana gövdesine yerleştirin. Ana gövdeyi alt plakanın üzerine yavaşça monte edin.

Kültür ortamını hazneye ekleyin. Gaz değişimine izin vermek için kültür ortamını çok hızlı eklemeyin, aksi takdirde doku rahatsız olabilir. Hazneyi tamamen doldurmayın ve görünmez kapağı dikkatlice zincir hattı haznesinin üzerine yerleştirin.

Göç eden glial hücreleri görüntülemek için, kültür odasını konfokal veya floresan mikroskobun tablasına yerleştirin. Düşük büyütmede, lamel üzerindeki daireyi referans alarak numuneyi bulun. 40x objektif kullanarak numuneye odaklayın.

Dokunun yerleşmesini bekleyin ve işlem doğru şekilde gerçekleştirildiyse üç ila dört saat boyunca her 10 ila 15 dakikada bir göz diskinin veya optik sapın görüntülerini yakalayın. Bu protokol, GFP ile işaretlenmiş glial hücrelerin optik saptan göz imaginal diskine göç ettiği bir dizi görüntüyle sonuçlanacaktır. 60 dakikalık bir canlı görüntüleme süresi, vahşi tip bir göz imaginal diskindeki glial çekirdeklerin konumlarındaki değişiklikleri gözlemlemek için yeterliyken, glial hücre göçü için gerekli bir genin mutasyonuna sahip bir mutantta glial çekirdekler optik saptan çıkışta tamamen başarısız olmuştur.

Kültürlenen dokuda bozulma gözlemlenmeden önce, göz beyin komplekslerini 240 dakikaya kadar olan süreler boyunca kültüre ettik. 240 dakikalık zaman noktasının ardından, kültürlenen göz beyin komplekslerini çevreleyen kültür ortamında GFP pozitif hücreler gözlemlemeye başlıyoruz. Ayrıca, doku bütünlüğünde bir bozulmaya işaret eden GFP'nin dokular genelinde yaygın lekeler şeklinde biriktiği görülmektedir.

Glial hücre migrasyonunu incelemek amacıyla imaginal disklerin nasıl kültüre edileceğini size gösterdik. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.