Name: Yaşlı Hücre akıbet tarafından Maya Kronolojik Ömrü miktarının (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-06T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Keşfedin maya kronolojik yaşlanma ölçüm yöntemini, yüksek verimli biyoscreen CMBR makinesi ile optik yoğunluk ölçümleri kullanarak. Bu teknik, hücre canlılığını nicel olarak değerlendirir ve ökaryotik yaşlanma süreçlerini anlamaya katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü, Hibe 1R21AG031965-01A1 tarafından desteklenen oldu. MK Yaşlanma Ellison Tıp Vakfı Yeni Scholar.

Bölüm 1: yaşlanma kültürlerin Hazırlık <ol><li> YEPD agar plakları üzerine donmuş stokları (% 1 maya özü,% 2 bacto-pepton,% 2 agar,% 2 glukoz) faiz Streak suşları. </li><li> 30 ˚ C&#39;de 48 saat veya tek koloniler görünene kadar hücrelerin inkübe edin. </li><li> 5 ml (% 1 maya özü,% 2 bacto-pepton,% 2 glukoz) test tüplerinde YEPD sıvı ortamın içine tek koloniler ve inokülasyon seçin. </li><li> Grow 30 geceleme kültürleri ˚ C çalkalayıcı veya rulo davul kullanarak sürekli ajitasyon korurken. </li><li> 50 mcL gecelik kültür sentetik tam (SC) orta (Tablo 1) 5 ml inoküle edin. Genellikle üç SC kültürler incelendiğinde her bir suş için üç nüsha ömrü analiz biyolojik çoğaltma sağlamak için her bir suş için hazırlanmıştır. </li><li> 30 kültürlerin koruyun ˚ C (genellikle 2 veya daha fazla hafta) tüm deney için silindir tambur üzerinde sabit ajitasyon. </li></ol> Bölüm 2: bir canlılığı yaş noktası alarak SC medya kültürünün iki gün sonra, hücreler sabit faz olmalı ve ilk yaş noktası alınacak hazırdır. Daha sonraki yaş-iki hafta en az 2-3 gün her gün alınmalıdır. Her yaş noktası için: <ol><li> YEPD 145 mcL her kuyu doldurarak aşılama için Bioscreen 100-iyi Petek tabak hazırlayın. Sadece veri analizi için hiçbir hücre sonra YEPD ve en az bir sıra dolu bıraktığınızdan emin olun. </li><li> Inkübatör yaşlanma kültürler çıkarın. </li><li> Kısaca vorteks kültürünün herhangi bir dökmemeye dikkat ederek, Petek plaka inoküle ilk kültür. </li><li> Karışık kültür 5 mcL çıkarın ve Petek plaka ilk kuyuya pipetle. 5 mcL kısım çıkarmadan önce ve sonra her bir test tüpünde ağız Alev. </li><li> Her yaşlanma kültür her kültüre uygun iyi bir konuma dikkat emin olmak için bu yordamı tekrarlayın. Özdeş iyi pozisyonlar tüm deney boyunca nokta sonraki her yaş için kullanılmalıdır. </li><li> 30 ˚ C inkübatör içine kültürleri aşılar bittiğinde değiştirin. </li></ol> Bölüm 3: Bioscreen C MBR makine yükleme <ol><li> Inkübatör bölmesi kapağı kaldırarak teşhir etmek ve örnek tepsisi kapağı çıkarın. </li><li> Yeni inoküle Petek plaka örnek tepsi (tek bir plaka okuma, soldaki yuvanın) içine yerleştirin. </li><li> Örnek tepsi kapağını değiştirin ve inkübatör bölmesi kapağı düşük. </li><li> Isı transfer akışkanı minimum dolum seviyesi üzerinde olduğundan emin olmak için kontrol edin. Düşük, sağlanan ısı transferi sıvısı ile 1000 mcL pipet kullanarak daha fazla eklemek. </li><li> &quot;EZExperiment&quot; Bioscreen yazılım kullanarak, Saccharomyces cerevisiae için uygun büyüme eğrileri elde etmek için aşağıdaki parametreleri ayarlayın: <ul><li> Numune sayısı: medya ya da 200 kuyu sayısını girin </li><li> Filtre: 420-580nm, Geniş Bant </li><li> Sıcaklık: 30 ˚ C </li><li> Deneme Uzunluğu: 1 Gün, 0 saat, 0 saniye </li><li> Ölçüm Aralığı: 30 dakika </li><li> Çalkalamalı, Sürekli sallayarak, Yüksek </li></ul></li><li> Okuma başlamak için &quot;Başlat&quot; düğmesini tıklayın. </li></ol> Bölüm 4: Veri Analizi Genellikle iki hafta boyunca, altı yaş noktaları alınır. Gün 2, 4, 6, 9, 11 ve 13 yaş noktaları alınır. Deneysel tasarım ve test edilen suşların bağlı olarak, yaş puan daha fazla veya daha az sıklıkla veya 2 haftadan daha uzun süre almak için istenebilir. Bu veri analizi çok daha kolay hale getirecek her yaşlanma kültür, her yaş noktada aynı iyi konumuna karşılık geldiği gibi, her yaş noktası için aynı sırayla Petek plaka yüklemek için önemlidir. <ol><li> Bioscreen C MBR makineden çıktı dosyalarını alın. &quot;EZExperiment&quot; yazılım, Microsoft Excel gibi diğer yazılımları ile uyumlu bir sekme ile sınırlandırılmış dosya olarak Bioscreen veri çıkışı. Ilk sütun gösterir OD ölçümü ne zaman Bioscreen Petek levhalar (Şekil 1) Her iyi temsil sonraki sütunlar, deney sırasında çekildi. </li><li> Her sütundaki ilk OD okuma silin. Bu okuma &quot;gürültü&quot;. </li><li> Her sütunun tüm OD değerleri yalnız YEPD iyi OD değeri çıkarılarak veri Normale. Bu medya tarafından arka plan absorbans kaldırır. </li><li> Akıbet eğrileri çizilir. Eğrileri, yaş bir fonksiyonu (Şekil 2) olarak kayacak. Örneğin, altı kez puan üzerinden sütun 1 (Petek plaka 1) akıbet eğrilerinin çizilmesi, zamanla eğrilerin ayrı bir sağa kayma var. </li><li> Her gün 2 yaş noktası büyüme kinetiği dayalı katlama süresi (δ) hesaplayın. Denklemin iki katına zaman hesaplamak için kullanılan as: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat.png" alt="Denklem" /> OD 1 ve OD 2 ardışık OD ölçümleri ve t 1 ve t 2 ölçümler arasındaki zaman temsil nerede. 0,5 OD değerleri arasında 0.2 kat, sadece iki katına hesaplayın. Bu değerlerin ortalaması çok iyi iki katına zaman. 0,5 OD değerleri arasında 0.2 kat, sadece iki katına hesaplayın. Bu değerlerin ortalaması çok iyi iki katına zaman. Çoğu yabani tip maya suşları iki katına çıkma süresi 85 ila 90 dakika arasında bir değer vermek gerekir. </li><li> Her yaş noktası için, yaş başlangıç ​​noktası (2 gün) göre akıbet virajlarda zaman kaydırma (¨ t) hesaplar. Bunu yapmanın kolay bir yolu, yaş noktası ilk ve sonraki her yaş noktası arasındaki 0.3 OD ulaşmak için her bir kuyu için aldı süresini farkı belirlemek için. Ln karşılık gelen lineer regresyon denklemini (OD) belirli bir sıra 0.3 OD ulaştığı zaman, iki zaman noktaları braketi OD = 0.3 arasındaki zamanın bir fonksiyonu olarak hesaplanabilir. </li><li> Sağkalım eğrisi Şekil 3. üretmek için her yaş noktası hayatta kesir hesapla. % 100 canlılığı ilk yaş noktası (2 gün) tanımlayın. Birbirini izleyen her yaş noktası için denklem kullanılarak yüzde hayatta kalma hesaplayın: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat2.png" alt="İkinci Denklemi" width="245" height="115" /> s n hayatta kalma yüzdesi, ¨ t n zaman kaydırma ve δ n katlama süresi . </li><li> Yaş bir fonksiyonu olarak canlı hücrelerin fraksiyonu (veya yüzde) planlamakla sağkalım eğrileri (Şekil 3B) olarak her iyi (veya çoğaltmak kuyu) için istenen oluşturun. </li><li> Her bir kuyu için hayatta kalma ayrılmaz (SI) hesaplayın. SI hayatta kalma eğrisi altında kalan alan olarak tanımlanır ve formül ile tahmin edilebilir: <img src="/files/ftp_upload/1156/equat3.png" alt="Denklem 3" width="400" height="79" /> nerede yaş n yaş noktası (örneğin 2, 4, 6, 9, 11, ve 13) ve s n bu yaş noktada hayatta kalma değerdir . </li><li> SI ve sağkalım verileri çoğaltmak kuyuların istatistiksel parametreler belirleyin. Ortak ilgi istatistiksel parametreleri ortalama, medyan, ve her set biyolojik çoğaltır için varyans içerir. Bir t-testi ya da benzeri analiz SI farklı deney ve kontrol grupları için ikili karşılaştırma için kullanılabilir. Aynı zamanda biyolojik çoğaltır ortalama 4,8 olarak açıklanan sağkalım eğrileri oluşturmak için istenebilir. </li></ol> Bölüm 5: Temsilci sonuçları Deney bitiminde, birkaç farklı suşları veya koşullar için kronolojik yaşlanma potansiyelini belirlemek için yeterli sağkalım eğrisi ve yapılan veri analizi çizilen olacaktır. Eğer düzgün bir şekilde gerçekleştirilir, Bioscreen C MBR makine elde edilen büyüme eğrileri Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi benzer görünmelidir ve sağkalım eğrileri Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi olmalıdır. Genel olarak, burada açıklanan koşullar altında kültür yabani tip hücrelerin 7 gün sipariş üzerine medyan kronolojik ömrü olacak. Farklı suşları ve% 0.05 glukoz medya büyüme gibi bazı koşullar altında hayatta kalma arasında önemli farklılıklar görülmektedir, medyan sağkalım 30 gün aşabilir. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig1.png" alt="" /> Bioscreen programı &quot;EZExperiment&quot; Şekil 1. Veri çıkışı. Sütun absorbans okuma alındığı zaman görüntüler. Ardışık sütunlar yaşlanma kültürleri alınan hücreleri ile inoküle Petek plaka kuyulardan temsil eder. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig2.png" alt="" /> Şekil 2 bir deney boyunca tek bir biyolojik çoğaltıldıktan sonucudur eğrileri. Yaşlanma kültür hücreleri canlılığını kaybettiği zamanla eğrileri belirgin bir değişim vardır. Başlangıç ​​noktası (2 gün) ve ardışık bir zaman noktası arasındaki zaman uzunluğu, o belirli bir yaşta canlılığı belirler. <img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3a.png" alt="" /><img src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3b.png" alt="" /> Şekil 3. A) Şekil 1 akıbet verileri kullanılarak oluşturulan bir sağkalım eğrisi. Gün 2 zaman noktası% 100 canlılığı noktası olarak ayarlanır. B) iki suşunun Nihai sağkalım eğrileri aynı deneyi test. Bu sağkalım eğrileri, biyolojik ve her bir suş için çoğaltır üç ortalama canlılığı temsil eder. Hata çubukları biyolojik çoğaltır içinde standart sapmasını temsil eder. Sağkalım eğrisi altında gölgeli alanda 1 suşu için hayatta kalma ayrılmaz (SI) temsil eder. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Tablo 1. Kronolojik Yaşlanma Araştırmaları kullanılır Sentetik Tanımlı Orta (suşu background BY4743) </td></tr><tr><td> Bileşen </td><td> Konsantrasyon (g / L) </td></tr><tr><td> D-glukoz </td><td> 20 </td></tr><tr><td> Maya azot taban (-AA/AS) </td><td> 1,7 </td></tr><tr><td> (NH 4) 2 SO 4 </td><td> 5,0 </td></tr><tr><td> Adenin </td><td> 0,04 </td></tr><tr><td> L-Arginin </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-Aspartik asit </td><td> 0,1 </td></tr><tr><td> L-Glutamik asit </td><td> 0,1 </td></tr><tr><td> L-Histidin </td><td> 0,1 </td></tr><tr><td> L-Leucine </td><td> 0,3 </td></tr><tr><td> L-Lizin </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> L-Methionine </td><td> 0,02 </td></tr><tr><td> L-Fenilalanin </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> L-Serine </td><td> 0,375 </td></tr><tr><td> L-Threonine </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> L-Triptofan </td><td> 0,04 </td></tr><tr><td> L-Tyrosine </td><td> 0,03 </td></tr><tr><td> L-Valin </td><td> 0,15 </td></tr><tr><td> Urasil </td><td> 0,1 </td></tr></tbody></table> Not: Bu tarif diploid BY4743 suşu auxotrophies için hesaplar. Amino asit auxotrophies sentetik tam orta 5X bir final konsantrasyon ekleyerek telafi edilmelidir.

<ol><li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+aging+in+yeast%3A+the+means+to+the+end%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29(2008).</li>
<li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaeberlein%2C+M+%22Handbook+of+models+for+human+aging%22">Handbook of models for human aging</a>. Conn, P. M. , Elsevier Press. Boston. 109(2006).</li>
<li>Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Aging Cell. 2 (2), 73(2003).</li>
<li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (2), 113(2008).</li>
<li>Piper, P. W., Harris, N. L., MacLean, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preadaptation+to+efficient+respiratory+maintenance+is+essential+both+for+maximal+longevity+and+the+retention+of+replicative+potential+in+chronologically+ageing+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Preadaptation to efficient respiratory maintenance is essential both for maximal longevity and the retention of replicative potential in chronologically ageing yeast.</a> Mech Ageing Dev. 127 (9), 733(2006).</li>
<li>Fabrizio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+is+a+mediator+of+an+altruistic+aging+program+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 166 (7), 1055(2004).</li>
</ol>

Burada açıklanan yüksek verim kronolojik ömrü tahlil, yaşlanma, yüksek doğruluk ve hassasiyet ile suşlarının çok sayıda potansiyel ölçülmesi için etkili bir yöntemdir. Bu yöntemin birincil önceden koloni oluşturan birim (örneğin 3 görmek) sayarak hayatta kalma belirlenmesi için klasik yöntemleri üzerinde, yüksek çözünürlüklü büyüme eğrileri elde etmek için bu Bioscreen C MBR makine olarak bir çalkalayıcı / inkübatör / plaka okuma cihazı kullanımı Her yaş noktası. Düşük verimlilik kronolojik ömrü testleri ile ...

<table><tbody><tr><td>Bacto Pepton</td><td>Reaktif</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Maya Ekstraktı</td><td>Reaktif</td><td>BD Biosciences</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar</td><td>Reaktif</td><td>BD Biosciences</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base A.A. ve A.S. içermeyen</td><td>Reaktif</td><td>MidSci</td><td>J630-500G</td><td></td></tr><tr><td>Amino Asitler</td><td>Reaktif</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Sülfat</td><td>Reaktif</td><td>Spectrum</td><td>AM185</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroz</td><td>Reaktif</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-10</td><td></td></tr><tr><td>Bioscreen C MBR cihazı</td><td>Araç</td><td>Growth Curves USA</td><td>5101370</td><td></td></tr><tr><td>Bioscreen 100 kuyucuklu Honeycomb plaka</td><td>Araç</td><td>Growth Curves USA</td><td>9502550</td><td></td></tr></tbody></table>

yaşlı hücre akıbet tarafından maya kronolojik Ömrü miktarının

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

Maya<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Yaşlanma araştırma alanında önemli bir model organizma olarak kanıtlanmıştır<sup&gt; 1</sup&gt;. Replikatif ve kronolojik ömürleri maya yaşlanma incelemek için kullanılan iki kurulan paradigmalar. Replikatif yaşlanma tek bir maya anne hücre yaşlanması önce ürettiği kızı hücrelerinin sayısı olarak tanımlanır; kronolojik yaşlanma zaman hücrelerinin uzunluğu ile tanımlanır olmayan bir bölme, sükunet gibi hayatta.<sup&gt; 2</sup&gt;. Biz kronolojik ömrü kantitatif ölçümü için yüksek verimli bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, ajitasyon altında tanımlanan orta ve sabit sıcaklıkta hücrelerin yaşlanma içerir. Her yaş noktada, hücrelerin bir alt nüfusun yaşlanma kültürünün kaldırılır ve zengin besi inoküle. Bioscreen C MBR makine kullanan yaşlı hücreleri bu alt nüfus için yüksek çözünürlüklü bir büyüme eğrisi elde edilir. Canlı hücreler, her yaş noktada büyüme kinetiği dayalı, her bir alt-nüfus oranı belirlemek için bir algoritma uygulanır. Bu yöntem, tekrarlanabilirlik ve hassas korurken diğer kronolojik ömrü testleri karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha az zaman ve kaynak gerektirir. Bu testte yüksek verimlilik doğa daha karmaşık organizmalar daha fazla test için yeni uzun ömürlü değiştiriciler tanımlamak için, büyük ölçekli, genetik ve kimyasal ekranlar için izin vermelidir.

Maya Kronolojik yaşlanma, sabit faz zaman ile ilişkili hücre canlılığı kaybı anlamına gelmektedir. Burada maya kronolojik ömrü kantitatif olarak belirlenmesi için yüksek verimli bir yöntem açıklanmaktadır.

Yaşlı Hücre akıbet tarafından Maya Kronolojik Ömrü miktarının

Tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae, yaşlanma araştırmaları alanında önemli bir model organizma olduğunu kanıtlamıştır 1. Replikatif ve...

Yaşlanan kültürler, 30 °C'de sabit ajitasyonla test tüplerinde muhafaza edilir. Bir döner tambur aracılığıyla, her bir yaşlanan kültürden alınan hücre alikotları, YEPD besiyeri içeren bir bio screen honeycomb plakanın kuyucuklarına inoküle edilir. Bio screen CMBR cihazı, her bir kuyucuğun optik yoğunluğunu ölçerken honeycomb plakayı 24 saat boyunca inkübe eder ve çalkalar.Biyo ekran tarafından verilen veri çıktılarından her 30 dakikada bir büyüme eğrileri oluşturulabilir ve bunlar her bir yaşlanan kültürün canlılığını hesaplamak için kullanılabilir. 24 saatlik inkübasyonun ardından, petek plakadaki kuyucuklardaki hücre yoğunlukları, orijinal yaşlanan kültürün canlılığına bağlı olarak değişiklik gösterebilir. Merhaba, ben Washington Üniversitesi Patoloji Bölümü'nden ve Dr. Matt Capline'ın laboratuvarından Chris Murakami.Bugün size, yaşlı hücrelerin büyüme kapasitesi kullanılarak mayaların kronolojik yaşam süresinin belirlenmesi prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda hem genetik hem de çevresel faktörlerin mayaların uzun ömürlülüğünü nasıl etkilediğini incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Hadi başlayalım.Yaşlandırma kültürlerini hazırlamak için öncelikle dondurulmuş stoklardan maya suşlarını YEPD agar plaklarına ekimleyin ve hücreleri 30 °C'de 48 saat boyunca veya tekil koloniler oluşana kadar inkübe edin. Tekil koloniler oluştuktan sonra, tekil kolonileri seçin ve beş mL YEPD sıvı besiyerine inoküle edin.Kültürleri, sürekli ajitasyonu sağlamak için bir döner tamburda, 30 °C'de gece boyunca deney tüplerinde büyütün; gece boyunca süren inkübasyonun ardından, sentetik komple medyumun beş mililitresini inoküle etmek için her kültürden 50 µL kullanın. Genellikle, incelenen her suş için yaşam süresi analizinin üçlü biyolojik replikasını sağlamak amacıyla her suş için üç SC kültürü hazırlanır. Kültürleri, iki günlük kültürleme süresinin ardından genellikle iki veya daha fazla hafta süren tüm deney boyunca, bir döner tambur üzerinde sürekli ajitasyonla 30 °C'de muhafaza edin.SC besiyerinde, hücreler stasyoner fazda olmalı ve ilk yaş noktası alınmaya hazır hale getirilmelidir. Sonraki yaş noktaları, minimum iki hafta boyunca her iki ila üç günde bir alınmalıdır. Bu prosedüre başlamak için biyotaramayı hazırlayın.İnokülasyon için kullanılan 100 kuyucuklu honeycomb plakalarının her bir kuyucuğu 145 µL YEPD ile doldurun. Daha sonraki veri analizleri için en az bir kuyucuğun sadece YEPD ile doldurulduğundan ve hücre içermediğinden emin olun. Yaşlandırma kültürlerini inkübatörden çıkarın.Kısaca, honeycomb plakaya inoküle edilecek ilk kültürü vorteksleyin. Kültürün dökülmemesine dikkat edin. Test tüpünün ağzını yakarak sterilize edin ve kültürden beş µL alarak honeycomb plakanın ilk kuyucuğuna pipetleyin.Deney tüpünün ağzını yakmayı unutmayın. Beş µL'lik alikotu aldıktan sonra, bu inokülasyon prosedürünü her bir yaşlandırılmış kültür için tekrarlayın. Her bir kültüre karşılık gelen kuyucuk konumunu aynı şekilde not ettiğinizden emin olun.Tüm deney boyunca, sonraki her yaş noktası için kuyucuk konumları kullanılmalıdır. Kültürleri 30 °C'lik inkübatöre geri yerleştirin. İnokülasyonlar tamamlandığında ve kültürler petek plakaya inoküle edildiğinde, plak bio screen CMBR cihazına yüklenir.Bunu yapmak için kapağı kaldırarak inkübatör bölmesini açın. Ardından örnek tepsisinin kapağını çıkarın. Yeni ekim yapılmış petek plakayı örnek tepsisine yerleştirin.Sol yuvayı kullanın. Eğer sadece tek bir plaka okuyorsanız, örnek tepsisinin kapağını kapatın ve kapağı inkübatör bölmesine doğru indirin. Isı transfer sıvısının minimum dolum seviyesinin üzerinde olduğundan emin olmak önemlidir.Eğer değilse, 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak daha fazla ısı transfer sıvısı ekleyin. Bio screen yazılımındaki Easy experiment özelliğini kullanın. croce visi için uygun büyüme eğrileri elde etmek amacıyla aşağıdaki parametreleri ayarlayın. Örnek sayısı için, besi ortamı içeren kuyucukların sayısını veya 200 değerini girin; filtreyi 420 ila 580 nanometre genişliğindeki bant olarak ayarlayın.Sıcaklığı 30 °C olarak ayarlayın. Deney süresi bir gün, sıfır saat, sıfır saniye olmalıdır. Ölçüm aralığı 30 dakika olmalıdır.Son olarak, sarsma ayarı sürekli sarsmaya (continuous shaking) getirilmeli ve okumaları başlatmak için yüksek (high) seçeneğine tıklanıp başlat (start) denilmelidir. Çıktı dosyaları Bio Screen CMBR cihazından alınır. Easy Experiment yazılımı, Bio Screen verilerini Microsoft Excel ve diğer yazılımlarla uyumlu, sekme ile ayrılmış (tab delimited) bir dosya olarak dışa aktaracaktır.Birinci sütun olan A sütunu, deney sırasında OD ölçümünün yapıldığı zamanı göstermektedir. Sonraki sütunlar, yaşlandırılmış kültürlerden hücreler ekilen petek yapılı bio screen plakalarındaki her bir kuyuyu temsil eder. İlk OD okuması gürültü olduğu için her sütundaki ilk OD okumasını siliniz.Yalnızca YEPD içeren kuyucuğun optik yoğunluk değerini her sütundaki optik yoğunluk değerlerinden çıkararak verileri normalize edin. Bu işlem, besiyerinin neden olduğu arka plan absorbansını ortadan kaldırır. Büyüme eğrileri.Eğriler yaşın bir fonksiyonu olarak kayacaktır; örneğin, petek plakanın birinci sütun, birinci kuyusundan elde edilen büyüme eğrileri altı zaman noktası üzerinden çizildiğinde, eğrilerde zamanla belirgin bir sağa kayma olduğu görülür. İlk zaman noktası olan ikinci gün ile takip eden bir zaman noktası arasındaki süre, o belirli yaştaki canlılığı belirler. İkinci gün yaş noktasına ait büyüme kinetiğine dayanarak her kuyucuk için ikiye katlanma süresini hesaplayın.İkiye katlanma süresini hesaplamak için kullanılan denklem şu şekildedir; burada OD bir ve OD iki ardışık optik yoğunluk ölçümlerini, T bir ve T iki ise ölçümler arasındaki süreyi temsil eder. İkiye katlanma sürelerini yalnızca 0,2 ve 0,5 OD değerleri arasında hesaplayın. Bu değerlerin ortalaması, ilgili örnek için ikiye katlanma süresidir.Çoğu yabani tip maya suşunun her yaş noktası için 85 ila 90 dakika arasında bir ikiye katlanma süresi değeri vermesi gerekir. Büyüme eğrilerindeki zaman kayması delta T değerini, ikinci gün olan başlangıç yaş noktasına göre hesaplayın. Bunu yapmanın kolay bir yolu, başlangıç yaş noktası ile sonraki her yaş noktası arasında, her kuyunun 0.3 OD değerine ulaşması için geçen süre farkını belirlemektir.Belirli bir kuyucuğun 0.3 OD değerine ulaştığı süre, doğal logaritmik optik yoğunluğa karşılık gelen doğrusal regresyon denkleminden hesaplanabilir. İlk gün iki yaş noktasını %100 canlılık olarak temsil ederek, sonraki her yaş noktası için bir sağkalım eğrisi oluşturmak amacıyla her yaş noktasındaki sağkalım oranını hesaplayın. Yüzde sağkalımı aşağıdaki denklemi kullanarak hesaplayın.Burada SN sağkalım yüzdesini, Delta TN zaman kaymasını ve Sigma N ise iki katlanma süresini temsil eder. Her biri için istendiği şekilde sağkalım eğrileri oluşturun.Ardından, canlı hücre oranını yaşa bağlı olarak grafiğe dökerek her kuyu için hayatta kalma integralini hesaplayın; SI, hayatta kalma eğrisinin altında kalan alan olarak tanımlanır ve yaş noktasının N ve bu yaş noktasındaki hayatta kalma değerinin SN olduğu şu formülle tahmin edilebilir: SI verileri ve hayatta kalma verilerinden yola çıkarak tekrar eden kuyuların istatistiksel parametrelerini belirleyin. İlgi duyulan yaygın istatistiksel parametreler arasında, her bir biyolojik tekrar seti için ortalama, medyan ve varyans bulunur. Farklı deney ve kontrol gruplarının SI değerlerinin ikili karşılaştırması için bir T-testi veya benzeri bir analiz kullanılabilir.Ortalamalardan biyolojik tekrarlara doğru sağkalım eğrileri oluşturmak da istenebilir. Deney tamamlandığında, sağkalım eğrisini çizmiş ve birkaç farklı suş veya koşul için kronolojik yaşlanma potansiyelini belirlemek adına yeterli veri analizini gerçekleştirmiş olacaksınız. Doğru şekilde uygulandığında, bio screen CMBR cihazından elde edilen büyüme eğrileri bu eğriye benzer görünmelidir. Genel olarak, burada açıklanan koşullar altında kültüre edilen yabanıl tip hücreler, yedi gün civarında bir medyan kronolojik yaşam süresine sahip olacaktır.Farklı suşlarda hayatta kalma oranlarında önemli varyasyonlar gözlemlenmektedir ve %0.05 Glikoz ortamında büyüme gibi bazı koşullar altında medyan hayatta kalma süresi 30 günü aşabilmektedir. Size, mayanın kronolojik yaşam süresini nicel olarak belirlemek için yüksek verimli bir yöntem göstermiş olduk. Croce visier.Bu prosedür uygulanırken, hem tekrarlanabilir veriler hem de doğruluk için bio screen CMBR cihazının rutin bakımının önemli olduğunu unutmamak gerekir. İşte bu kadar. Deneylerinizde başarılar dileriz.

quantifying-yeast-chronological-life-span-by-outgrowth-of-aged-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu yazıda, maya anne hücreleri replikatif ömrü ölçümü için genel bir protokol mevcut.

Geliştirici Maya replikatif Ömrü Ölçüm

Burada bir dizi maya kronolojik yaşlanma sırasında düzenleyen veya genomik DNA istikrarsızlığa katkıda genlerin / yolları çalışma ömrü modeli ile kombine edilebilir DNA mutasyon deneyleri açıklar.

Yaşa bağımlı Genomik İstikrarsızlık incelenmesi S. cerevisiae Kronolojik ömrü Modeli

Biz burada onların tam replikatif ve / veya kronolojik ömrü boyunca tek tomurcuklanan maya hücreleri sürekli ve yüksek çözünürlüklü mikroskopik görüntüleme sağlayan bir mikroakışkan cihazın çalışmasını gösterir.

Replikatif sürekli yüksek çözünürlüklü Mikroskobik Gözlem geliştirici Maya Yaşlanma

Dalgalanması testleri ile ölçülen genç Saccharomyces cerevisiae hücrelerinde mutasyon oranları farklı Replikatif yaştan annesi hücrelerinin mutasyon frekansları tahmin etmek için kullanılır. Manyetik ayırma ve akım sitometri sonra tahmin mutasyon sıklıkları sapmaları tespit etmek, gerçek mutasyon frekansları ve anne hücrelerin yaşını ölçmek için kullanılır.

Anne Hücreleri ve dalgalanma Testleri Manyetik orting birleştiren Mitotic Hücre Yaşlanma sırasında Genom istikrarsızlık Analiz için Saccharomyces cerevisiae

Bu makalede, mikro akışkan cips üretim ve kullanım ömrü ve tek bir maya hücrelerinin hücresel fenotipleri ölçmek için mikro-akışkan deney kurulumu için optimize edilmiş bir protokol sunulur.

Mikroakışkan Aygıtlar Kullanma Tek Budding Maya Hücreleri ömrü ve Hücresel fenotipleri Ölçmek için

Maya mayalarındaki canlı hücrelerin bir hücreli katlanarak değerlendirilmesi (ODELAY) olarak adlandırılan zaman atlamalı mikroskobi kullanarak katı miyar üzerinde kolonilere dönüşürken tek tek maya hücrelerinin büyüme fenotiplerini ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Kolonilere dönüşen genetik olarak özdeş hücrelerin popülasyon heterojenliği doğrudan gözlemlenebilir ve nicelenebilir.

ODELAY: Maya Büyümesinin Çok Parametreli Niceleşmesi İçin Büyük Ölçekli Bir Yöntem

Burada solunum ve fermantatif metabolizma Saccharomyces cerevisiae üstel büyüme üstel büyüme Denklem için yaklaştırarak tahmin etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Kinetik parametrelerin hesaplanması maddeler/bileşikler etkileri fermantasyon veya mitokondrial solunum testi ile taranması için izin verir.

Saccharomyces cerevisiae Üstel büyüme kinetik solunum ve fermantatif metabolizma analiz etmek için toplu iş kültüründe

Burada, floresan mikroorganizma ve tomurcuklanan Maya hücrelerinin floresans mikroskopisi görüntülerinin otomatik algılama ve niceliksel tanımı ile ilgili bir MATLAB uygulaması sunuyoruz.

Otomatik görüntü Işleme kullanarak Fission ve budding yeasts lipid damlacık Içeriğinin Analizi

Burada Saccharomyces cerevisiaeartan bir kopya numarası bastırıcı ekran aracılığıyla genetik etkileşimleri belirlemek için bir protokoldür. Bu yöntem araştırmacılar, klon ve kısa ömürlü maya mutantlar test bastırıcılar sağlar. SIR2'nin kopya sayısı artışının otofaji null mutantında kullanım ömrü üzerindeki etkisini test ediyoruz.

Saccharomyces cerevisiae Kronolojik Yaşam Süresini Düzenleyen Genetik Bağlantıların Karakterizasyonu için Bastırıcı Ekran

Bu yazıda, UV öldürüldü bakteriyel gıda ile sağlam bir medya üzerinde muhafaza nematod ömrü ölçmek için genel bir protokol mevcut.

Ölçme Caenorhabditis elegans Katı Medya Ömrü

Keşfedin maya kronolojik yaşlanma ölçüm yöntemini, yüksek verimli biyoscreen CMBR makinesi ile optik yoğunluk ölçümleri kullanarak. Bu teknik, hücre canlılığını nicel olarak değerlendirir ve ökaryotik yaşlanma süreçlerini anlamaya katkı sağlar.

Yaşlı Hücre akıbet tarafından Maya Kronolojik Ömrü miktarının

Daha fazla video keşfet