Fare Oosit içine Nükleer Transfer
November 30th, 2006
Bu film ve protokol nükleer transfer öğrenmeye yardımcı olmayı amaçlamaktadır.
Bu yüzden NU Nuclear transferini yapıyoruz çünkü grubumuz yeniden programlamayla ilgileniyor. Bu, farklılaşmış çekirdeğin embriyonik bir duruma yeniden programlanabilmesi açısından büyüleyici bir süreçtir. Bunlar SUM ve HCCV reaktifleridir ve bu hyaluronidazdır.
Ve önce bir yemek hazırlıyorum ve bu bir CO2 ile eşitlemek için kuluçka makinelerine gidecek. Bunlar damlalar, Turing için mineral yağ ile kaplanmış birkaç damla. Böylece CO2 atmosferini kalibre ederler.
Şimdi HCZB'yi bir damla yapın. Bu yıkama için kullanılacaktır. Bu günlerde yüksektir ve yine bu mineral yağ ile kaplıdır.
Bu kadar yüksek, bu hyaluronidaz ile düşer. Buradaki bu kısım sadece HCCP damlalarıdır. Bunlar yıkamak içindir.
Bu, ulu hücreleri O tarafından çıkarmak içindir. Bu aşama ısıtılır, böylece geri dönüp farelerden yağ işaretlerini alana kadar ısınır ve her şeyi mineral yağ ile kaplar. Bu, iğnenin temizlenmesi ve hücrelerin içine yerleştirilmesi için PVP damlaları ve bu HCCB artı Cyla B. Ve burada manipülasyonları yapacağım.
Tamam, bu bir iğne rengi. Şu an yaptığım şey bir iğne çekmek. Tamam, şimdi çok güzel bir iğnem var, çok ince.
Ve şimdi bu bir mikro demirhane. Doğru boyutta tutma pipetine sahip olmak için iğneyi belirli bir konumda kesmem gerekiyor. Cam topu ısıtıyorum, iğne eriyerek aşağı iniyorum, ve şimdi kırıldı.
Bunu bir kenara itiyorum. Kırık iğnenin mükemmel olduğunu görüyorsunuz. Şimdi buraya iniyorum, ısıyı arttırıyorum.
Şimdi cam top kırmızıya dönecek, eriyecek, cam topu itecek ve bir eğri yapacak. Bu kadarı yeter. Onu kaldırıyorum.
Görüyorsunuz, sonra iğneyi batırıyorum. Az önce tutma pipetini bu kafaya yerleştirdik. Şimdi tekrar mikroskoba yerleştirin.
Mikro pipet, kılcal damar ve ben cıva yüklüydü. Bu ipucuna yükledim. Cıva bu kılcal damarı buraya cıva ile yükler.
İçeri giriyor. İğneyi bu kafaya yerleştirin. Sıkıca vidalayın, geri çekin.
Burada saat yönünde çevirmek, buradaki cıvayı görebilmeniz için öne doğru itecektir. Ve şimdi yağın ucuna. Görmek? Bu yüzden şimdi vizyonu elde etmek için iğneden aşağı iniyorum.
Bazı cıva damlacıklarını dışarı atın ve bir miktar QVP'yi emdirin. Sorun değil. Ve sonra tekrar yukarı hareket ettirin.
HCCB'ye gidiyorum ve delikten aşağı iniyorum. Kafamda, fare pipeti olan P'ye gidiyorum. Buraya yerleştirmek için bir kılcal damar hazırlamam gerekiyor. Teşekkürler.Zaten.İyi.
Bu yüzden biraz kılcal damar yapın. Tamam. Ve boruda. Ben ley.
İsviçre'den geliyorum ve bu işe bir yıl önce başladım ve K'S laboratuvarına geldim ve nükleer transferi öğrenmeye başladım. Gerçekten, burası harika bir yer ve burada çalışmak harika. Ve tabii ki bu çok karmaşık bir deneydir ve bunu yaparken birçok sorun ortaya çıkabilir.
Bu nedenle, başladığınızda, çekirdek oluştururken veya transferi yaparken birçok hücrenin parçalanması gibi sorunlarla karşılaşabilirsiniz. Ya da başarılı bir şekilde transfer olmanıza rağmen gelişmediklerini fark edersiniz. Ve her zaman, sayısız neden olabilir.
Demek istediğim, tüm sitelerin kültür sisteminden başlayabilirsiniz. Bu nedenle, kültür sistemini test etmek için her zaman genetik kontrolün parçaları veya bazı döllenmiş imparatorlar, kuluçka makineleri gibi bazı kontrollere ihtiyaç duyulur. Ve sonra mikroskobun becerilerini de geliştirmeniz gerekiyor.
Bu nedenle, tarafı güvenilir bir şekilde yiyebilene ve ardından geri aktarana kadar çok fazla pratik yapmanız gerekir. Bu sadece bir pratik meselesidir ve siz bu konuda iyi olana kadar birkaç hafta veya veya ay alacağız. Aksi takdirde, uzun deneyler için hazırdır.
Bu yüzden bunun için bütün bir gün ayırmak iyidir. Ve sonra başlangıçta zor olan bir şey de fare pipetlemesidir. Yani baloncuk yapmamak, onu iyi kontrol etmek ve gözetimi kaybetmemek için ya da özellikle bir klona da zarar verebilirsiniz, özellikle dış katman, lucita'nın yani açık olduğu için, aslında ağzınızı aldığınızda mümkündür, o klona zarar verirsiniz ve o sonar lucita'dan bir tür sızar.
Bu yüzden o ağız borusunda yağ olmamasına da dikkat etmek gerekir. Çok fazla emmemek ve çok fazla üflememek, ancak bu nispeten kolay elde edilir, bu beceri.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu film ve protokol, farklılaşmış bir çekirdeğin embriyonik bir duruma yeniden programlanması olan nükleer transfer öğrenmeye yardımcı olmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Gelişimsel Biyoloji
Arka Plan
- Nükleer transfer, klonlama ve rejeneratif tıpta kullanılan bir tekniktir.
- Nüklelerin yeniden programlanması, hücresel farklılaşmayı anlamak için kritik öneme sahiptir.
- Bu süreç kök hücre araştırmalarında ilerlemelere yol açabilir.
- Başarılı nükleer transfer koşullarının anlaşılması, uygulanması için esastır.
Çalışmanın Amacı
- Nükleer transfer tekniğini göstermek.
- Öğrenme sürecine yardımcı bir protokol sağlamak.
- Farklılaşmış hücrelerin yeniden programlanma potansiyelini keşfetmek.
Kullanılan Yöntemler
- Spesifik reaktiflerle bir kap hazırlama.
- Nükleer transfer sürecinde hyaluroridaz kullanımı.
- Optimal koşullar için CO2 atmosferinin kalibre edilmesi.
- İşlem sırasında damlaları kapatmak için mineral yağın uygulanması.
Ana Sonuçlar
- Nükleer transfer tekniğinin başarılı gösterimi.
- Kullanılan reaktifler yeniden programlama sürecinde etkili oldu.
- Nükleer transfer için optimal koşullar belirlendi.
- Verilen protokol daha fazla araştırma ve öğrenmeye yardımcı olabilir.
Sonuçlar
- Nükleer transfer, nükleleri yeniden programlamak için uygun bir yöntemdir.
- Metodoloji anlaşılması, araştırmada uygulanması için kritik öneme sahiptir.
- Protokol, alanda gelecekteki çalışmalar için bir temel oluşturabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Nuclear transfer enables reprogramming of differentiated nuclei to an embryonic state, offering a mechanistic model for epigenetic de-risking in target validation. This approach supports predictive confidence in cellular reprogramming strategies relevant to regenerative medicine and stem cell-derived therapies. Understanding nuclear reprogramming principles informs early-stage discovery by clarifying the reversibility of differentiation and aging processes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Provides a system to interrogate therapeutic hypotheses by testing nuclear reprogramming capacity.
- Operational Value: Enables functional target validation through assessment of epigenetic reversibility in differentiated cells.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by modeling the feasibility of restoring developmental potential to patient-derived cells.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes standardized conditions using mineral oil-covered drops and CO2 calibration for reproducible nuclear transfer.
- Quantitative Outputs: Enables measurement of developmental potential as a functional readout of reprogramming success.
- Platform Reuse: Supports scalable preparation of reagents like hyaluronidase and SUM/HCCV for consistent experimental workflows.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Offers a pathway to generate patient-matched embryonic stem cells for in vitro disease modeling.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase reprogramming to preclinical validation via derivation of genetically identical stem cells.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs decisions on stem cell differentiation and replacement strategies based on nuclear transfer efficiency.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly in epigenetic mechanism validation and cellular reprogramming assays.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on whether differentiated nuclei can be reprogrammed to an embryonic state.
- Screening: Describes assay readiness through standardized drop preparation and mineral oil overlay to maintain culture stability.
- Analytics: Highlights developmental potential as a key quantitative readout for comparing reprogramming conditions.
- Translational Research: Links to preclinical work by enabling derivation of embryonic stem cells capable of generating all adult cell types.
- Enterprise Reuse: Frames nuclear transfer as a reusable platform for evaluating reprogramming factors across multiple cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Mechanistic de-risking of epigenetic targets through demonstration of nuclear reprogramming feasibility.
- Operational Value: Standardization via CO2 calibration, mineral oil use, and reagent preparation (e.g., hyaluronidase, SUM/HCCV).
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in regenerative medicine by validating cellular plasticity early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of stem cell-based approaches using genetically identical, patient-matched cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in micromanipulation, including needle pulling and microforge techniques.
- Depends on instrumentation such as microscopes with microinjectors and mercury-loaded capillaries for visualization.
- Necessitates cross-team standardization of culture conditions, including CO2 equilibration and oil-overlay protocols.
- Involves adaptation considerations across model systems, particularly in oocyte handling and zona pellucida integrity.
- Limited by technical challenges such as cell lysis during transfer and developmental failure post-transfer, requiring extensive practice.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
2:23
Dish for enucleation and nuclear transfer HCZB/cytocholazin
4:53
Injection pipette
7:07
Oocyte isolation
3:31
Holding pipette
3:30
Preparation of pipettes
10:31
Collection of donor cells
9:43
Nuclear transfer
11:50
Discussion
11:05
Transfer
9:58
Enucleation
6:30
Mouth pipette for oocyte isolation
0:18
Dish for oocyte incubation KSOM
0:00
Introduction
0:17
Preparation of dishes
1:08
Dish for oocyte isolation HCZB and HCZB/hyaluronidase
