Name: Fare Oosit içine Nükleer Transfer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 17 s
Description: Öğrenin fare oosit içine nükleer transfer tekniğini; farklılaşmış çekirdeklerin embriyonik duruma yeniden programlanmasını keşfedin. Bu yöntem kök hücre araştırmaları ve rejeneratif tıpta ilerlemeler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

DE Dr. Gizle Akutsu protokol eleştirel okuma onun NT hile ve Dr. Stephen Sullivan ve Garrett Birkhoff paylaşımı için teşekkür etmek istiyorum.

Hazırlıklar: <ol><li class="jove_step"> Süperovulasyon ve embriyo kültürü microdrop ayrıntılı bir açıklama, başka bir yerde 2 bulunabilir . </li><li class="jove_step"> Petri embriyo kültür ortamı microdrops (örneğin KSOM, Chemicon) ile hazırlayın. Mineral yağ (mineral yağ toplu embriyo kültürü ile uyumluluk için test edilmelidir) ile kaplayın. 37 ° dengeye ° C hava artı% 5 CO 2. (Thermo-Elektron 3110 su ceketli inkübatör veya eşdeğeri) </li><li class="jove_step"> Oositlerin izolasyonu için bir yemek hazırlayın: Hepes Yeri damla diğer yarısı çanağı ve HCZB bir yarısında (% 0.1 w / v, Sigma) hiyalüronidaz CZB tamponlu. Mineral yağ ile kaplayın. Diseksiyon mikroskobu ısıtılmış bir sahnede çanak sıcak tutun. </li><li class="jove_step"> Yeri bir dış çapı yaklaşık 50 μ m (oosit çapı biraz daha küçük) bir holding pipet ve bir pipet tutucu yaklaşık 20 μ m bir açılış: mikroskop hazırlayın. Holding, pipetler, gerekli ekipman, bir iğne çektirmesi (Sutter Instruments) ve bir microforge (Narishige) ile yapmak kolaydır, ama onlar da Humagen satın alınabilir. Mikropipet (iç çapı 8 μ m) kuyruk 3-5 μ l cıva yükleyin. Cıva dökülen kaçının. Birkaç küçük damla her HCZB% 11 w / v PVP (Polyvinylpyrrolidone) ve 5 μ g / ml cytochalasin B HCZB bir yemek hazırlayın. Petri kabı kapağı yerine çanak kendisi tutarak ve enükleasyon pipetler hareketine engel olmayacak kısa bir jant kapağı gibi kullanın. Bir HCZB damla holding pipet ve enükleasyon pipet hizalayın. Holding pipet ucu içine biraz HZCB aspire. </li><li class="jove_step"> Donör hücrelerinin hazırlanması, hücre tipi ve araştırmacı gerçekleştirmek niyetinde deney büyük ölçüde bağlıdır. Genel olarak, donör hücreleri gibi tripsin gibi proteolitik bir enzim ile tedavi ve yapışkanlık transferi kadar azaltmak için buz üzerinde tutulmalıdır olmalıdır. </li><li class="jove_step"> Insancıl, hCG uygulandıktan sonra fareler 14-15 saat euthanize. Hasat siyon hatası ve onları sıcak HCZB-hiyalurinidaz damla teşrih. Daha sonra yaklaşık 5 dakika, oosit kümülüs hücreleri çoğunlukla ücretsiz olacak. Daha sonra, daha sonra ön dengelenmiş KSOM damla yıkanmış, HCZB birkaç kez yıkanmış ve enükleasyon kadar inkübatör muhafaza edilmelidir. </li></ol> Enükleasyon Nikon TE200 gibi ters bir mikroskop hidrolik mikromanipülatörler (Narishige), manipülasyonlar yapılmaktadır. Piezo mikromanipülatör (Primetech) zona pellusida delmek için kullanılır. Düz uçlu enükleasyon ve transferi pipetler Humagen satın alınabilir. Mikroskobik cıva damlacıkları atarak ve PVP aspire atarak temizleyin ve PVP damla enükleasyon pipet yağlayın. Iğne yapışkanlık önlemek için, aynı prosedür ya enükleasyon veya transfer oositlerin her grup arasında yapılmalıdır. HCZB-cytochalasin B açılan küçük bir grup oosit yerleştirin. Grubun büyüklüğüne araştırmacının deneyim seviyesine adapte edilmelidir. Oosit 20-30 dakika daha uzun süre sahnede saklanmamalıdır. HCZB cytochalasin B damla aletleri taşıyın. Holding pipet ve enükleasyon pipet oosit ekvator düzleminde ile hizaya getirilmelidir. Holding pipetle oosit kendisi biraz daha küçük bir dış çapı varsa bu mümkün olacaktır. Farklı refraktif metafaz mili görülebileceği kadar bir oosit döndürün. Bir acemi mili göremiyorsanız, metafaz plaka verimli embriyonik gelişim ile uyumlu değildir ancak DNA boya Hoechst ve UV aydınlatma, kullanılarak tespit edilebilir. 3 saat metafaz mili yerleştirin ve holding pipet ile tutun. Zona pellusida nüfuz piezo darbeleri uygulayın. Enükleasyon pipet ile metafaz plaka dokunun. Metafaz mili direniş &#39;hissettim&#39; olabilir sonra, iş mili aspirat ve iğneyi çıkartın. Pipet ile dokundu oosit sitoplazma sıvısı, metafaz mili ancak bir yığın olarak hareket eder. Mili ile kaldırılır sitoplazma miktarı azaltmayı deneyin. Oosit bir grup enükleasyon edildikten sonra, embriyo kültür ortamı ile yıkayın ve transferi kadar inkübatör içine yerleştirin. Bazı enükleasyon oosit transfer edilebilir olmalıdır ancak aktif olmalıdır ve enükleasyon için bir denetim görevi. Bu birkaç saat içinde oosit parçası, başarılı enükleasyon gösterir. Nükleer transfer PVP çözümü (11% HCZB nunda) içine yerleştirin hücreleri. 1-hücreli aşamada birçok klonlar tutuklama, PVP konsantrasyonu% 5 veya daha az düşürülmelidir. Mix hücreleri de zekâh PVP. Hücre çapı biraz daha küçük bir iç çapa sahip bir pipet ile hücreleri seçin. Hücre zarı, aspirasyon üzerine ayrılmalıyız. Bazı durumlarda, tekrarlayan kovma ve aspirasyon gibi nazik piezo bakliyat uygulama donör hücre kırmak için kullanılabilir. Donör hücreler bir süre sonra yapışkan hale donör hücreleri yeni bir düşüş, her grup aktarılan oosit ile yapılmalıdır. Membran kırarak kısa bir süre sonra kırık donör hücre enjekte edilir. Transferi için, ekvator düzleminde oosit zona pellusida kendisi yerine ekvator düzleminde odaklanmak ve aynı düzlemde transferi ve holding pipet pozisyon. Oosit sitoplazmasında bir parçası dahil sıkıca tutun. Piezo darbeleri kullanarak zona pellusida nüfuz. Pipet ucu donör çekirdeği getirin, sonra oosit derin bir karık, yakın holding pipet pipet ucu neredeyse enükleasyon oosit karşı tarafa itmek. Oosit sitoplazmasında pipet içine çok küçük bir miktar aspire, oosit zarı kırmak için tek bir zayıf piezo darbe uygulamak, donör çekirdeği çıkarma hızla karık sağ ucunda sitoplazmik membran aspire ederken iğneyi çıkartın. Aynı anda iğne çekilerek aspire, NT tarafından geride bıraktığı deliği kapatmak mümkün olmalıdır. Bu &#39;delik kaldırma tekniği NT sırasında lyse oosit sayısını azaltacaktır. KSOM yeniden inşa oosit yıkayın ve 1-3 saat süreyle inkübatör onları geri. Oosit aktivasyonu Bir yarım kalsiyum ücretsiz MCZB damlacıkları ve kalsiyum ücretsiz MCZB artı 10mM Sr 2 damlacıkları ile diğer yarısı ile bir yemek hazırlayın + ve kutup vücut ekstrüzyon inhibe için 5 μ g / ml cytochalasin B. 30 dakika dengelenmesi. hava altında% 5 CO 2. Kalsiyum ücretsiz MCZB iyi yıkayın ve NT embriyolar daha sonra küçük gruplar halinde kalsiyum ücretsiz MCZB farklı damla koyun. 5-6 saat için kuvöz ve kültüre çanak dönün. Yapay aktivasyon protokol ve embriyo kültür koşulları kontrol etmek için, non-enükleasyon oosit kullanılmalıdır. Parthenogenetic embriyolar gibi gelişecektir. Aktivasyon ardından, uzun vadeli bir kültür KSOM ve yer embriyolar inkübatör ile embriyoların yıkayın. Pronuclei başarılı transferi belirten, bu kez noktada görünür olmalıdır. Embriyo Kültürü Medya Yemek Tarifleri Ana Tuzlar Steril 1 L şişe 980 mL ultra saf H 2 O ile başlayın . Kuru bileşenlerini ekle: NaCl 4760 mg (81mm) Sigma S-5886 KCl 360 mg (5mM) Sigma P-5405 MgSO 4 • 7H 2 O 290 mg (1.18mM) Sigma M-2773 KH 2 PO 4 160 mg (1.17mM) Sigma P-5655 EDTA 2NA 40 mg (0.1mm) Sigma E-6635 Glikoz (D) 1000 mg (5.5mm), Sigma G-6152 Sıvı Bileşenleri Ekle Na-laktat (laktik asit) 5.3 mL &amp; nbsp; Sigma 44.263 Pen&#39;Strep 10 ml Gibco 15.140-122 MCZB Stok Tuzlar için: Sterilize Filtre 500 ml ana tuzları (4 mağaza ° C için iyi bir 3-4 ay) HCZB Stok Tuzlar için: 500 ml ana tuzları ile başlayın (Sigma P-8136 soğuk çözünür) 50 mg PVA 30-60 dk ve filtre steril (4 mağaza ° C 3 ay için iyi) karıştırın Ca + + Ücretsiz MCZB (% 5 CO 2 oosit aktivasyonu için) 99 ml MCZB stok tuzları ile başlayın Kuru bileşenlerini ekle: NaHCO 3 211 mg Sigma S-5761 Na-piruvat (pirüvik asit) 3 mg Sigma P-4562 L-Glutamine 15mg Sigma G-8540 Sığır serum albumini (BSA) 500 mg Sigma A-3311 Tüm bileşenlerin kadar Swirl çözülür, steril filtre. HCZB (ortam atmosferde mikromanipülasyon için) 99 ml HCZB stok tuzları ile başlayın Kuru bileşenlerini ekle: HEPES-Na 520 mg Sigma H-3784 NaHCO 3 42 mg Sigma S-5761 Sıvı bileşenlerini ekle: 128 mM CaCl 2 (18.8g / l) 1 ml Sigma C-7902 1 N HCl ile pH 7.5 &#39;e ayarlayın. Swirl eriyene kadar steril filtre.

<ol><li>Eggan, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEggan%2C+K+%22Mammalian+and+Avian+Transgenesis-+New+Approaches%22">Mammalian and Avian Transgenesis- New Approaches</a>. Pease, S., Lois, C. , Springer. (2006).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo%22">Manipulating the mouse embryo</a>. Press, C. S. H. L. , (2003).</li>
<li>Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-term+development+of+mice+from+enucleated+oocytes+injected+with+cumulus+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei.</a> Nature. 394, 369-374 (1998).</li>
</ol>

Yazarların beyan edeceği herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Protokol bölümünde ek tamponlar kompozisyonlar için kontrol edin.

fare oosit içine nükleer transfer

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Döllenmemiş bir oosit içine Nükleer transfer farklılaşmış hücre gelişim potansiyeli geri yükleyebilirsiniz. Bu gelişme, farklılaşma ve yaşlanma altında yatan süreçlerin genetik süreçleri yerine epigenetik olduğunu göstermektedir. Bu süreçlerin reversibilite rejeneratif tıp, temel araştırma heyecan verici perspektifler açılır ve daha uzak bir gelecekte. Fare embriyonik kök hücreleri, klonlanmış preimplantasyon aşamasında embriyolardan elde edilebilir. Bu embriyonik kök hücreleri, yetişkin organizmanın tüm hücre tiplerinin yol vermek için yeteneği var. Önemlisi, bu hücrelerin genetik donör aynıdır. Varsa insan, bu, bir hastadan alınan kök hücrelerin türetme izin verecek. Bu hücreler daha sonra hastanın etkilenen hücre tipi içine farklılaştırılmış ve in vitro okudu veya zarar görmüş veya kaybolmuş hücreler değiştirmek için kullanılan olabilir. Nükleer yeniden programlama ilkeleri hakkında bizi bilgilendirmek gibi fare nükleer transfer çalışmaları önemini korumaktadır. Bu film ve beraberindeki protokol, fare nükleer transfer öğrenme yardımcı olmak için tasarlanmıştır, başlangıçta grup Prof. Yanagimachi (Wakayama ve ark 1998) bir yöntem geliştirdi.

Bu film ve protokol nükleer transfer öğrenmeye yardımcı olmayı amaçlamaktadır.

Fare Oosit içine Nükleer Transfer

Dölletilmemiş bir oosite çekirdek transferi, diferansiye olmuş bir hücrenin gelişim potansiyelini geri kazandırabilir. Bu durum, ... altında yatan süreçlerin göstergesidir.

Grubumuz yeniden programlamaya ilgi duyduğu için NU nükleer transfer işlemini gerçekleştiriyoruz. Diferansiye olmuş bir çekirdeğin embriyonik bir duruma yeniden programlanabilmesi, bu süreci büyüleyici kılmaktadır. Bunlar SUM ve HCCV reaktifleridir ve bu da hyaluronidazdır.Öncelikle, CO2 ile dengelemek için inkübatörlere yerleştirilecek bir kap hazırlıyorum. Bunlar, mineral yağı ile kaplanmış birkaç damladır. Böylece CO2 atmosferini kalibre ederler.Şimdi bir damla HCZB hazırlayın. Bu, yıkama işlemi için kullanılacaktır. Bu işlem günlerce sürer ve ardından tekrar bu mineral yağ ile kaplanır.Bu yüksek, hyaluronidaz ile düşer. Buradaki bu kısım sadece HCCP damlalarıdır. Bunlar yıkama içindir.Bu işlem, O tarafındaki ulu hücrelerin uzaklaştırılması içindir. Bu aşama ısıtılmaktadır, böylece ben geri gelip farelerden yağ işaretlerini alana ve her şeyi mineral yağı ile kaplayana kadar sıcak kalacaktır. Buradakiler, iğneyi temizlemek ve hücreleri içine yerleştirmek için kullanılan PVP damlalarıdır ve şurası ise HCCB artı Cyla B'dir. Manipülasyonları burada gerçekleştireceğim.Tamam, burada bir iğne rengi var. Şu an yaptığım şey bir iğne çekmek. Tamam, şimdi elimde çok güzel, çok ince bir iğn

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Somatik Hücre Nükleer Transferi (SCNT) üzerinden epigenetik yeniden programlama önceden tanımlanmış T hücre reseptör (TCR) özgüllükleri fare modelleri oluşturmak için bir araç olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Bu transnuclear fareler, endojen endojen organizatörü kontrol altında lokus karşılık gelen TCR ifade eder.

Karşı Önceden tanımlanmış T Hücre Reseptör özgüllükleri Transnuclear Fare Toxoplasma gondii SCNT ile Elde Edilen

Oosit mayotik olgunlaşması sırasında kromozom segregasyon hataları nedeniyle anöploidi yatkındır. Anöploid yumurta, kısırlık, düşüklere veya gelişimsel bozukluklar, Down sendromu gibi neden olabilir. Burada, yumurta ve mayotik olgunlaşma incelemek ve Ploidi değerlendirmek için yöntemler seçim malzemeleri tanıtmak için yöntemler açıklanmaktadır.

Fare Oosit Mikroenjeksiyon, olgunlaşması ve ploidi Değerlendirmesi

Bu video, lentiviral vektörlerin döllenmiş bir fare embriyosunun perivitellin boşluğuna pronükleer enjeksiyonunu açıklar. Lentivirüs, döllenmiş embriyonun genomuna dahil edilen ve sonunda transgenik farelere yol açan transgeni içerir.

Lentiviral Vektör Bazlı Perivitellin Enjeksiyonu: İlgilenilen Geni Döllenmiş Tek Hücreli Fare Oositlerine Dönüştürmek İçin Bir Yöntem

Burada Nükleolar organizasyon dayalı fare antral oosit karakterizasyonu için bir protokol mevcut.

Nucleolar Kromatin Teşkilatı dayanarak Fare Antral OOSİT İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Biz fare klonlama trichostatin A, C vitamini ve deiyonize sığır serum albümin kullanarak büyük ölçüde geliştirilmiş bir yöntem açıklanmaktadır. Verimli klonlanmış embriyo gelişimini destekleyen bir basitleştirilmiş, tekrarlanabilir protokol gösteriyoruz. Bu nedenle, bu yöntemi fare klonlama için standart bir prosedür haline gelebilir.

Kombinasyon tedavisi Trichostatin A ve C vitamini fareler somatik hücre nükleer Transfer tarafından klonlama daha etkili olmasını sağlar.

İnsan hastalığı ile ilişkili genetik varyantların ele haline başladığınızda, sistemler ile tanımlanan bu değişik biyolojik önemi hızla değerlendirileceği geliştirmeye giderek önem kazanmaktadır. Bu iletişim kuralı insan gen işlevi kadın mayoz sırasında ben fare yumurta kullanarak değerlendirilmesi yöntemlerini açıklar.

Mayoz sırasında insan gen işlevini değerlendirmek için fare yumurta kullanarak ben

Yakın kızılötesi femtosaniye lazer kullanılarak metafaz I sırasında fare oositlerinde sitoplazmik mikrotübül düzenleme merkezlerinin tükenmesini sağlayan optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır.

Fare Oositlerinde Sitoplazmik Mikrotübül Düzenleme Merkezlerinin Multi-Foton Lazer Ablasyonu

Kromozom ayrışmasında hata, oositlerde yaygın bir özelliktir. Bu nedenle, iş mili montaj kontrol noktasının incelenmesi, sağlıklı yumurta üretmek için gereken mekanizmalar hakkında önemli ipuçları verir. Mevcut protokol, fare oositlerinde iş mili montaj kontrol noktası bütünlüğünü değerlendirmek için üç tamamlayıcı tahlil tanımlamaktadır.

Fare Oositlerinde İş Mili Montaj Kontrol Noktası Bütünlüğünün Değerlendirilmesi

Bu protokol, hücre iskeletinin nükleer şekil ve fare oosit sistemindeki iç zarsız organeller üzerindeki fiziksel etkisini belgelemek için deneysel bir çerçeve sağlar. Çerçeve, diğer hücre türlerinde ve bağlamlarında kullanılmak üzere uyarlanabilir.

Fare Oosit Çekirdeğinin Hücre İskeleti Tabanlı Ajitasyonunun Uzamsal Ölçeklerde Yakalanması

Bu protokol, farelerde yumurtalık açılan oosit ve erken evre döllenmiş embriyolar tekniği göstermektedir. Infindibulum belirlemek ve künt bir sonu iğne içine girmek için doğru işlemi gerçekleştirmeden yeteneği esastır.

Fare Oosit alımı

Öğrenin fare oosit içine nükleer transfer tekniğini; farklılaşmış çekirdeklerin embriyonik duruma yeniden programlanmasını keşfedin. Bu yöntem kök hücre araştırmaları ve rejeneratif tıpta ilerlemeler sağlar.

Fare Oosit içine Nükleer Transfer

Daha fazla video keşfet