Name: Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 4 s
Description: Öğrenin yüksek içerik analizi ile nöron-astrosit ko-kültürlerinde nörotoksisite değerlendirmesi yapmayı. Bu hassas yöntem, nörotoksik etkileri detaylı morfolojik ölçümlerle nicelendirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarların Dr teşekkür etmek istiyorum. Rick Ryan, Umesh Patel, Jeff Till Matthew Hsu, Jehangir Mistry ve bu projeler ve protokoller geliştirilmesi sırasında destek Michele Hatler.

Cep Hazırlanışı: <ol><li> Büyüme ortamı içinde tahlil, kültür nöronlar / astrositler hücre ekim öncesinde ~% 70-80 kadar konfluent (hücre çözülme veya izolasyon doğrudan ekim sürece). </li><li> Ilgi hücre tipi için uygun yöntemi ile kültür şişeler / plakaları hücreleri ayırın. Gerekirse, poli-D-lizin veya ekstrasellüler matriks protein ile kat tahlil plaka kuyu hücre yapışmasını geliştirmek için. Astrositler ve nöronlar Co-kültürler, aynı anda veya sırayla numaralı seribaşı olabilir. Sıralı turlar için, &quot;bazal&quot; katmanı olarak ilk astrositler kaplama, gerekirse nöronal kaplama ve farklılaşma takip önerilir. , Hücre tipi, daha sonraki kültür, ilgi parametreleri uygun olarak hücre yoğunluğunu ayarlayın vb kültür yaşına bağlı olarak, hücre kaynağı ve ekim yoğunluğu, birincil kültürlerin çoğalması, GFAP ifade veya neurite akıbet oranı büyük ölçüde değişebilir önemlidir karakterize ve deneysel model için en biyolojik önemi yanı sıra, HCS (bkz. Şekil 1) kullanarak etkili görüntüleme, segmentasyon ve analiz sağlamak için sağlamak için hücre sisteminizi optimize. Plaka (hücrelerin toksin tedavisi kolaylaştırmak için, aşağıda Adım 3 açıklandığı gibi 90 mcL medya numaralı seribaşı olabilir) hücreler ekledikten sonra, hatta hücre dağılımı sağlayarak, plaka, 15-30 dakika süreyle oda sıcaklığında düz bir yüzey üzerinde oturmak için izin verir. Bu dönemin ardından, en az 24 saat inkübe hücreler için büyüme ortamı (37 ° C /% 5 CO 2), daha sonra farklılaşma kültür koşullarına geçiş (örneğin, PC12 hücreleri düşük serum / NGF), uygun şekilde. Hücreleri, hücre tipi için uygun aralıklarla değişen medya, izdiham ya da farklılaşma istenilen seviyeye ulaşıncaya kadar kültür devam edin. </li><li> Hücre tedavileri (kontrol bileşikler, test bileşikleri, vb.) Ilgi tedavi süresi kurs uygun olarak, bu kültürün döneminde herhangi bir noktada tanıtıldı olabilir. Akrilamid, hidrojen peroksit ve K-252a, nörotoksik kontrolü bileşikler olarak verilmektedir. Yeterli reaktifler, beş 96-kuyucuğu yinelenen 12-nokta doz cevap eğrileri (doz cevabı içinde bir dH 2 O veya DMSO kontrol seti de dahil olmak üzere) sağlanır. Bileşikler 250X konsantrasyonu (K-252a için, 1 mcM maksimum tedavi varsayarak) veya 10X (akrilamid ve hidrojen peroksit, sırasıyla 100 mM ve 10 mM, maksimum tedavi varsayarak) verilmektedir. Önerilen tedavi hazırlık yarım günlük içerir: (1 √ 10) Bileşik Sulandırma Tamponu seyreltme tarafından takip DMSO 250X bileşik seri seyreltme, 10X 10X kontrolü bileşikler (dH 2 O menşeli seri steril dH 2 O doğrudan seyreltilmiş olabilir veya Bileşik Sulandırma Tamponu). 10 mcL her tedavinin ardından nihai 1X konsantrasyonu (% 0.4 DMSO veya% 10 dH 2 O) için, her bir kuyunun zaten mevcut kültür ortamı 90 mcL eklenebilir . Örnek veri az 37 ° C fiksasyon için önce 24 ya da 96 saat boyunca bileşik tedavi sağlanır. </li></ol> Hücre Fiksasyon ve Immunofluorescent Boyama: Not: Boyama süresi ~ 2.5 saat sonrası fiksasyon. Kuyu boyama adımları arasında kurumasına izin vermeyin. Aspirasyon ve muafiyet reaktifler, sıvı kayma nedeniyle herhangi bir hücreyi kaybını azaltmak için, düşük akış hızlarında yapılmalıdır. Önerilen tüm birimlerinin yanı başına &#39;96-iyi mikroplak iyi tek bir bakın. Hacimleri &#39;96-plaka başına&#39; tüm önerilen sıvı taşıma hacim kaybı% 25 fazla. Tüm boyama adımları oda sıcaklığında (RT) yapılmaktadır. Tüm tamponları ve antikor çözümleri RT en az 24 saat süreyle stabildir. <ol start="4"><li> Kültür dönemi sonunda, oda sıcaklığında (RT) veya 37 º C ön sıcak HCS Fixation Çözüm (2X) istenirse (12 mL/96-well plaka). De, doğrudan / kültür ortamı kimyasal bir davlumbaz, 100 mcL ekleyin ve 30 dakika oda sıcaklığında düzeltmek için izin. (MSDS) fiksatif / toksin içeren medya çıkarın ve tehlikeli atıkların yönetmeliklere uygun olarak bertaraf. Boyamadan hemen geçmeden, HCS İmmünofloresan Tampon 200 mcL ile iki kez iyice durulayın. Alternatif olarak, plakalar daha sonraki bir zamanda boyanmış isteniyorsa, kuyu ve boyama kadar 4 º C&#39;de sıkıca mühürlenmiş plakları ikinci durulama hacmi bırakın, daha sonra iki kez 200 Wash Buffer mcL ile durulayın. </li><li> Boyamadan önce 4 ° C sabit örnekleri saklanan varsa, 200 mcL HCS İmmünofloresan Tampon boyama protokol ile devam etmeden önce iki kez yıkayın. </li><li> Tavşan anti-βIII tubulin / Fare Anti-GFAP HCS Primer Antikorlar (6 mL/96-well plaka) çözümü şu şekilde hazırlayın: 5.88 mL HCS İmmünofloresan Tampon her çözülmüş birincil antikor 60 mcL ekleyin. İyice karıştırın. Önceki İmmünofloresan Tampon durulama çıkarın. İlköğretim Antikor çözüm iyi 50 mcL ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. </li><li> İlköğretim Antikor çıkarınçözüm. 200 mcL HCS İmmünofloresan Tampon ile üç kez durulayın. </li><li> HCS İkincil Antikor / Hoechst HCS Nükleer Leke (6 mL/96-well plaka) çalışma çözüm aşağıdaki gibi hazırlayın: 30 mcL her çözülmüş ikincil antikor ve çözülmüş Hoechst HCS Nükleer 30 mcL HCS İmmünofloresan Tampon 5.91 mL Leke ekleyin. Çözüm ışıktan korunması, iyice karıştırın. Önceki HCS İmmünofloresan Tampon durulama çıkarın. HCS İkincil Antikor / Hoechst HCS Nükleer Leke çözüm 50 mcL ekleyin ve ışıktan korumalı RT, 1 saat boyunca inkübe edin. </li><li> HCS İkincil Antikor / Hoechst HCS Nükleer Leke çözüm çıkarın. 200 mcL HCS İmmünofloresan Tampon ile iki kez durulayın. </li><li> Önceki HCS İmmünofloresan Tampon durulama çıkarın. Kuyularda ikinci durulama hacmi bırakarak, HCS Yıkama Tamponu 200 mcL ile iki kez durulayın. </li><li> 4 º C&#39;de hemen Seal plaka ve görüntü veya mağaza plaka görüntüleme için hazır olana kadar ışıktan korunmalıdır. </li></ol> Görüntü Alma ve Analiz: <ol start="12"><li> Hücre Analyzer IN (GE Healthcare) dahil olmak üzere mevcut HCS platformlar, ArrayScan (ThermoFisher Bilimsel) veya Opera (Perkin Elmer) çeşitli üzerine lekeli plakaların görüntüleme ve analiz yapılabilir. Görüntüleme ve analiz için bazı kurallar Tablo 1&#39;de verilmiştir: </li></ol><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4"> HCS222 Görüntü Toplama Kuralları </td></tr><tr><td> Algılama Reaktif </td><td> Objektif </td><td> Uyarıcı filtre Aralığı [pik / bant genişliği (nm)] </td><td> Emisyon Filtre Aralığı [tepe / bant genişliği (nm) ] </td></tr><tr><td> Hoechst HCS Nükleer Leke </td><td> 20X </td><td> 360/40 </td><td> 460/40 (veya gerekirse 535 / 50) </td></tr><tr><td> HCS İkincil antikor FITC-Eşek, anti-tavşan IgG </td><td> 20X </td><td> 480/40 </td><td> 535/50 </td></tr><tr><td> HCS İkincil Antikor Cy3-Eşek, anti-fare IgG </td><td> 20X </td><td> 535/50 </td><td> 600/50 </td></tr></tbody></table> <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td style="background:#000000; color:#FFFFFF;" colspan="4" width="545"> HCS222 Görüntü Analiz Rehberi </td></tr><tr><td> Hücre Parametre </td><td> Bulma </td><td> Segmentasyon / Ölçme </td><td> Gerekçe </td></tr><tr><td> Hücre sayısı, Nükleer Özellikleri </td><td> Hoechst HCS Nükleer Leke </td><td> Nükleer bölge (460 nm emisyon kanal). Çekirdeklerin sayısını sayın. DNA içeriği (nükleer yoğunluğu) ya da nükleer alan analizler de mümkündür. </td><td> ΒIII-tubulin veya GFAP ifade ile ilişkili ayrı nöronal ve astrositik hücre sayımı / karakterizasyonları (şiddetle önerilir) elde etmek için bu çekirdekleri &quot;filtre&quot; hücre sayısı, nükleer özellikleri, hücre kaybı, toksisite fenotipleri, vb belirlemek için kullanın. </td></tr><tr><td> βIII tubulin İfade, Neurite akıbet </td><td> HCS İkincil antikor FITC-konjuge </td><td> Sitoplazmik bölgesi (535 nm emisyon kanal). FITC sinyali neurites (örneğin, asgari / ortalama hücre vücut bölgeleri, minimum / maksimum neurite uzunlukları ve genişlikleri ile) nöronal hücre gövdeleri ayırmak için kullanılan olabilir. Toplam neurite uzunluğu, neurite sayar / hücre, vb gibi parametreleri belirleyin </td><td> Neurite akıbet ölçümler nöronal farklılaşma sırasında veya kimyasal yaralanma, hastalık durumları, vb. Bir sonucu olarak modüle olabilir farklı nöronal karakterizasyonu (şiddetle önerilir) elde etmek için βIII-tubulin ekspresyonu ile ilişkili olanlar için &quot;filtre&quot; hücre gövdeleri. </td></tr><tr><td> GFAP İfade, Astrosit Hücre Alanı </td><td> HCS İkincil Antikor, Cy3-konjuge </td><td> Sitoplazmik bölge (600 nm emisyon kanal). Cy3 sinyal astrositik sitoplazmik segmentasyon tanımlamak için kullanılan olabilir. Ortalama sitoplazmik sinyal yoğunluğu, hücre alanı, vs gibi parametreleri belirleyin </td><td> GFAP ifade ve astrosit hücre alanı astrosit gelişimi sırasında ya da kimyasal yaralanma, hastalık durumlarının bir sonucu olarak modüle olabilir, vb hücre gövdeleri farklı astrositik karakterizasyonu (şiddetle önerilir) elde etmek için GFAP ifade ile ilişkili olanlar için &quot;filtre&quot;. </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Resim Alma ve Analiz Yönergeleri - HCS222 βIII-Tubulin/GFAP (Co-Culture) Testi Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/1173/figure31173.png" alt="Şekil 3" /> Şekil 1. βIII-tubulin ve GFAP immunofluorekarışık sıçan sinir hücre kültürleri scence. Birincil sıçan hipokampal nöron veya sıçan PC12 hücreleri ya primer sıçan hipokampal astrositler Co-kültürler nöronal tohumlama kültür birkaç gün ön-kaplama astrositler tarafından üretildi. PC12s farklılaşma koşulları (düşük serum / NGF) altında ek bir 2 gün süreyle kültüre iken primer nöronlar, ek bir 11 gün kültüre edildi. Hücre işleme, fiksasyon ve immün HCS222 tahlil protokollere göre yapılmıştır. Hücreler Hücre Analyzer 1000 (3.3) 20X (primer nöronların) veya 10X (PC12) amacı büyütme IN GE görüntülü ve GE IN Hücre Analyzer 1000 İstasyonu (3.4) Neurite üremeyi ve Çoklu Hedef Analizi algoritmaları kullanılarak analiz Üst panel. Hoechst HCS Leke Nükleer (mavi), βIII-tubulin (yeşil) ve GFAP (kırmızı) floresan Sigortalı görüntüler. (Mavi (birincil nöronların hücre gövdeleri özetlendiği gibi) ve sarı (PC12), yeşil (birincil nöronların) ya da açık mavi (PC12) neurites orta panel) βIII tubulin floresan kanalı ayrı ayrı analiz neurite akıbet segmentasyon için izin verir. GFAP kanal analizi astrosit segmentasyon (yeşil çekirdekleri mavi, sitoplazma ana hatlarıyla alt panel) sağlar. Için ayrı hücre sayımı sağlayan, (kırmızı) (-) birincil sıçan hipokampal nöron / astrosit ortak kültür GFAP segmentasyon çekirdekleri / hücre GFAP (+) (yeşil özetliyor) organları ve GFAP olduğunu ayırt etmek yeteneğini gösteriyor nöronlar ve karışık bir kültür ortamda astrositler. <img src="/files/ftp_upload/1173/figure41173.png" alt="Şekil 4" /> <img src="/files/ftp_upload/1173/figure4.51173.png" alt="Şekil 4 part2" /> Şekil 2. Doz yanıtları birincil sıçan hipokampal nöron / toksik streslere karşı ortak kültürler astrosit. İlköğretim sıçan hipokampal astrositler büyüme ortamı (P6) 96-kuyucuğu kaplama ve 6 gün boyunca kültüre edildi. İlköğretim sıçan hipokampal nöron (çözülme doğrudan) daha sonra ön kaplama astrositler üstüne numaralı seribaşı ve 11 gün boyunca büyüme medyada kültüre edildi. Hücreler seri dilüsyonları kültürünün son 24 saat akrilamid ya da hidrojen peroksit (maksimum konsantrasyonları = 100 mM ve 10mM, sırasıyla) ile tedavi edildi. Hücre işleme, fiksasyon ve immün HCS222 tahlil protokollere göre yapılmıştır. Hücreler Hücre Analyzer 20X (10 alanlar / iyi) 1000 (3.3) GE IN görüntülü ve Hücre Analyzer 1000 İstasyonu (3.4) Neurite üremeyi ve Çoklu Hedef Analizi algoritmaları GE IN (sitoplazmik / / nükleer neurite segmentasyon) analiz edildi. Sunulan veriler ortalama ± SEM, n = 3. Çoklu parametreleri (neurite akıbet, GFAP yoğunluğu, astrosit alan ve nöronal veya astrositik hücre sayımı) doza bağımlı eğilimleri araştırıldı.

<ol><li>Radio, N. M., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+neurotoxicity+testing+in+vitro%3A+models+for+assessing+chemical+effects+on+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Developmental neurotoxicity testing in vitro: models for assessing chemical effects on neurite outgrowth.</a> Neurotoxicology. 29, 361-376 (2008).</li>
<li>Richards, G. R., Smith, A. J., Parry, F., Platts, A., Chan, G. K., Leveridge, M., Kerby, J. E., Simpson, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+morphology-+and+kinetics-based+cascade+for+human+neural+cell+high+content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">A morphology- and kinetics-based cascade for human neural cell high content screening.</a> Assay Drug Dev Technol. 4, 143-152 (2006).</li>
<li>Evans, N. A., Facci, L., Owen, D. E., Soden, P. E., Burbidge, S. A., Prinjha, R. K., Richardson, J. C., Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abeta%281-42%29+reduces+synapse+number+and+inhibits+neurite+outgrowth+in+primary+cortical+and+hippocampal+neurons%3A+A+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Abeta(1-42) reduces synapse number and inhibits neurite outgrowth in primary cortical and hippocampal neurons: A quantitative analysis.</a> J Neurosci Methods. 175, 96-103 (2008).</li>
<li>Breier, J. M., Radio, N. M., Mundy, W. R., Shafer, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+high-throughput+screening+assay+for+chemical+effects+on+proliferation+and+viability+of+immortalized+human+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Development of a high-throughput screening assay for chemical effects on proliferation and viability of immortalized human neural progenitor cells.</a> Toxicol Sci. 105, 119-133 (2008).</li>
<li>Radio, N. M., Breier, J. M., Shafer, T. J., Mundy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+chemical+effects+on+neurite+outgrowth+in+PC12+cells+using+high+content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Assessment of chemical effects on neurite outgrowth in PC12 cells using high content screening.</a> Toxicol Sci. 105, 106-118 (2008).</li>
<li>Harry, G. J., Tiffany-Castiglioni, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+neurotoxic+potential+by+use+of+in+vitro+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Metab+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of neurotoxic potential by use of in vitro systems.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 1, 701-713 (2005).</li>
<li>Prockop, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+allegory+of+a+mountain%3A+an+environmental+introduction+to+neurotoxicology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">The allegory of a mountain: an environmental introduction to neurotoxicology.</a> J Neurol Sci. 262, 7-14 (2007).</li>
<li>Woehrling, E. K., Hill, E. J., Coleman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+neurotoxicity+test-system%2C+using+human+post-mitotic%2C+astrocytic+and+neuronal+cell+lines+in+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Development of a neurotoxicity test-system, using human post-mitotic, astrocytic and neuronal cell lines in co-culture.</a> Toxicol In Vitro. 21, 1241-1246 (2007).</li>
<li>Holden, L. J., Coleman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+astrogliotic+responses+of+three+human+astrocytoma+cell+lines+to+ethanol%2C+trimethyltin+chloride+and+acrylamide%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Assessment of the astrogliotic responses of three human astrocytoma cell lines to ethanol, trimethyltin chloride and acrylamide.</a> Toxicology. 241, 75-83 (2007).</li>
<li>Röhl, C., Lucius, R., Sievers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+activated+microglia+on+astrogliosis+parameters+in+astrocyte+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The effect of activated microglia on astrogliosis parameters in astrocyte cultures.</a> Brain Res. 1129, 43-52 (2007).</li>
<li>Eng, L. F., Ghirnikar, R. S., Lee, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+fibrillary+acidic+protein%3A+GFAP-thirty-one+years+%281969-2000%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Glial fibrillary acidic protein: GFAP-thirty-one years (1969-2000).</a> Neurochem Res. 25, 1439-1451 (2000).</li>
<li>Gadea, A., Schinelli, S., Gallo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-1+regulates+astrocyte+proliferation+and+reactive+gliosis+via+a+JNK%2Fc-Jun+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endothelin-1 regulates astrocyte proliferation and reactive gliosis via a JNK/c-Jun signaling pathway.</a> J Neurosci. 28, 2394-2408 (2008).</li>
<li>O'Callaghan, J. P., Sriram, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+fibrillary+acidic+protein+and+related+glial+proteins+as+biomarkers+of+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Saf%22%5BJournal%5D)">Glial fibrillary acidic protein and related glial proteins as biomarkers of neurotoxicity.</a> Expert Opin Drug Saf. 4, 433-442 (2005).</li>
<li>Mead, C., Pentreath, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+toxicity+indicators+in+rat+primary+astrocytes%2C+C6+glioma+and+human+1321N1+astrocytoma+cells%3A+can+gliotoxicity+be+distinguished+from+cytotoxicity%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of toxicity indicators in rat primary astrocytes, C6 glioma and human 1321N1 astrocytoma cells: can gliotoxicity be distinguished from cytotoxicity?</a> Arch Toxicol. 72, 372-380 (1998).</li>
<li>Balls, M., Walum, E. Chapter 11: towards the acceptance of in vitro neurotoxicity tests. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBalls%2C+M+%22Neurotoxicology+In+Vitro%22">Neurotoxicology In Vitro</a>. , Taylor and Francis. London. 269-283 (1999).</li>
<li>Yokosuka, M., Ohtani-Kaneko, R., Yamashita, K., Muraoka, D., Kuroda, Y., Watanabe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+and+environmental+estrogenic+chemicals+exert+developmental+effects+on+rat+hypothalamic+neurons+and+glias%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Estrogen and environmental estrogenic chemicals exert developmental effects on rat hypothalamic neurons and glias.</a> Toxicol In Vitro. 22, 1-9 (2008).</li>
<li>Weible, M. W., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+of+neural+stem+cells+from+human+fetal+spinal+cord%3A+synergistic+effect+of+LIF+and+BMP4+to+generate+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization of neural stem cells from human fetal spinal cord: synergistic effect of LIF and BMP4 to generate astrocytes.</a> Glia. 55, 1156-1168 (2007).</li>
<li>Casulari, L. A., Melcangi, R. C., Piva, F., Martini, L., Maggi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+released+by+rat+type+1+astrocytes+exert+different+effects+on+the+proliferation+of+human+neuroblastoma+cells+%28SH-SY5Y%29+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Relat+Cancer%22%5BJournal%5D)">Factors released by rat type 1 astrocytes exert different effects on the proliferation of human neuroblastoma cells (SH-SY5Y) in vitro.</a> Endocr Relat Cancer. 7, 63-71 (2000).</li>
<li>Dringen, R., Gutterer, J. M., Hirrlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+metabolism+in+brain+metabolic+interaction+between+astrocytes+and+neurons+in+the+defense+against+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glutathione metabolism in brain metabolic interaction between astrocytes and neurons in the defense against reactive oxygen species.</a> Eur J Biochem. 267, 4912-4916 (2000).</li>
<li>Cristòfol, R. M., Gassó, S., Vílchez, D., Rodríguez-Farré, E., Sanfeliu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxic+effects+of+trimethyltin+and+triethyltin+on+human+fetal+neuron+and+astrocyte+cultures%3A+a+comparative+study+with+rat+neuronal+cultures+and+human+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Lett%22%5BJournal%5D)">Neurotoxic effects of trimethyltin and triethyltin on human fetal neuron and astrocyte cultures: a comparative study with rat neuronal cultures and human cell lines.</a> Toxicol Lett. 152, 35-46 (2004).</li>
</ol>

Yazarlar Millipore Corporation&#39;ın tüm çalışanların.

Bugüne kadar astrositler nöronlar ve karışık kültürlerin kullanıldığı nörotoksisite risk değerlendirme çalışması için tasarlanmış, in vitro deneyler sınırlı kalmıştır. Glial hücreleri nöronlar için mekansal ve metabolik destek sağlayan ayrılmaz bir parçasıdır ve nöronal göç, farklılaşma ve sinaptik aktivite de dahil olmak üzere modüle birçok nöronal fonksiyonları, kritik bir rol oynadığı iyi kabul edilir. Glial astrositler birçok toksinler de nöronal doku çevresindeki olumsuz tepkiler inducing yanı sıra teşvik nöronal hoşgörü yeteneğine sahiptir sitokinler ve diğer çözünür faktörlerin de bırakın. Antioksidan savunma bakım ve hücresel enerji düzeyleri gibi astrositik fonksiyonları, değer düşüklüğü görülmüştür ise nöronal-glial etkileşimleri derinliği gösterilmesi, ko-kültür çalışmaları, astrositler nöronlar oksidatif stres toksisite karşı korumak için gösterilen edilmiştir eleştirel nöronal hayatta kalma etkiler. Son çalışmalar, in vitro nörotoksisite test sistemi bir astrositler kullanımı tek başına nöronal hücrelerin daha insan merkezi sinir sisteminin yapısı ve fonksiyonu için daha uygun ispat edebilir ileri sürmüşlerdir. Nöronal astrositik etkileşimleri fizyolojik önemi artan farkındalık rağmen, daha önce sağlam hücreleri bu etkileşimlerin kantitatif analizleri gerçekleştirmek için zor olmuştur. Yüksek İçerik Tarama gelişiyle yeni ve güçlü testlerinin geliştirilmesi bu adrese sağlar. Bu çalışmada, kantitatif analizleri tek bir tahlil içinde birden çok nöronal ve astrositik fenotipleri HCA ile mümkün olduğunu göstermiştir. Primer nöronlar, nöron sayısı, neurite sayısı ve neurite uzunluk olarak nörotoksisite belirteçlerin kantitatif ölçümler gerçekleştirdik. Astrositler, reaktif gliozis nörotoksisite bilinen bir biyomarker, GFAP ifade astrosit numarası ve astrosit morfolojisi değişiklikler ile karakterizedir. Biz bu uç noktalarının her biri kolay HCA ile değerlendirilebilir göstermiştir. Bu çalışmalar, sinir-özgü biyobelirteçlerin HCA nörotoksik uç noktaları kimyasalların hızla çok sayıda ekrana in vitro testler bir pil parçası olarak kullanılan olabilir bu kavramı destekler . Millipore astrositler nöronlar ve ortak kültür HCS222 Yüksek İçerik Analizi kiti yüksek kaliteli algılama reaktifler ve aynı anda nörotoksisite cep telefonu modelleri çok çeşitli βIII-tubulin ve glial fibriller asidik protein (GFAP) profil için protokolleri oluşur. Bu kit ile sağlanan yüksek geçerliliği reaktifler kullanıcı testleri standardize tahlil-tahlil değişkenliği en aza indirmek ve tekrarlanabilir yüksek bir sinyal-zemin oranı ile görüntü oluşturmak için izin verir.

<table><tbody><tr><td>Tavşan Anti-&amp;#946;III-Tubulin HCS Birincil Antikoru, 100X</td><td></td><td>Parça No. CS201672</td><td>300 &amp;#x03BC;L içeren 1 flakon&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Bileşeni</td></tr><tr><td>HCS İkincil Antikor (eşek anti-tavşan IgG, FITC konjuge), 200X</td><td></td><td>Parça No. CS201649</td><td>150 &amp;#x03BC;L içeren 1 flakon&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Bileşeni</td></tr><tr><td>Fare Anti-GFAP HCS Birincil Antikoru, 100X</td><td></td><td>Parça No. CS201671</td><td>300 &amp;#x03BC;L içeren 1 flakon&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Bileşeni</td></tr><tr><td>HCS İkincil Antikor (eşek anti-fare IgG, Cy3 konjuge), 200X</td><td></td><td>Parça No. CS200437</td><td>150 &amp;#x03BC;L içeren 1 flakon&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Bileşeni</td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst HCS Nükleer Boya, 200X</td><td></td><td>Parça No. CS200438</td><td>150 &amp;#x03BC;L içeren 1 flakon&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Bileşeni</td></tr><tr><td>Fenol Kırmızılı HCS Fiksasyon Solüsyonu, 2X</td><td></td><td>Parça No. CS200434</td><td>100 mL içeren 1 şişe&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Bileşeni</td></tr><tr><td>HCS İmmünofloresan Tamponu, 1X</td><td></td><td>Parça No. CS200435</td><td>1000 mL içeren 1 şişe&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Bileşeni</td></tr><tr><td>HCS Yıkama Tamponu, 1X</td><td></td><td>Parça No. 2007643</td><td>500 mL içeren 1 şişe&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Bileşenleri</td></tr><tr><td>Akrilamid (Kontrol Bileşiği), 10X</td><td></td><td>Parça No. CS201679</td><td>dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O içinde 1M akrilamidden oluşan 500 &amp;#x03BC;L içeren 1 flakon&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Bileşeni</td></tr><tr><td>Hidrojen Peroksit (Kontrol Bileşiği), 10X</td><td></td><td>Parça No. CS201730</td><td>dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O içinde 100 mM hidrojen peroksitten oluşan 500 &amp;#x03BC;L içeren 1 flakon&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Bileşenleri</td></tr><tr><td>K-252a (Kontrol Bileşiği), 250X</td><td></td><td>Parça No. CS201741</td><td>DMSO içinde 250 &amp;#x03BC;M K-252a'dan oluşan 100 &amp;#x03BC;L içeren 1 flakon&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Bileşeni</td></tr><tr><td>Bileşik Seri Dilüsyonu için DMSO</td><td></td><td>Parça No. CS200441</td><td>10 mL içeren 1 şişe&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Bileşeni</td></tr><tr><td>Bileşik Dilüsyon Tamponu</td><td></td><td>Parça No. CS200442</td><td>25 mL içeren 1 şişe&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Bileşeni</td></tr><tr><td>Plaka Sızdırmazlık Kapakları</td><td></td><td>Parça No. CS200443</td><td>10 adet&lt;br/&gt;Millipore HCS222 Kit Bileşenleri</td></tr><tr><td>doku kültürü işlemi görmüş siyah/şeffaf tabanlı mikroplakalar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCS görüntüleme/analiz sistemi</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nörotoksisite yüksek İçerik analizi nöronal ve astrosit hücre co-kültür testi

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Yüksek İçerik Analizi (HCA) testleri tek bir tahlil içinde birden çok hücre fenotipleri ölçümü sağlayan hücreleri ve algılama reaktifleri otomatik görüntüleme ve güçlü görüntü analizi algoritmaları ile birleştirir. Bu çalışmada, nörotoksisite için yeni bir tahlil geliştirmek için HCA kullandı. Nörotoksisite değerlendirme, önemli bir ilaç güvenliği değerlendirmesi bir parçası olarak, çevre koruma çabalarının önemli bir odak olmanın yanı sıra temsil eder. Ayrıca, nörotoksisite de iyi kabul edilir<em&gt; In vitro</emAlzheimer ve Parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkların gelişimi&gt; belirteç. Son zamanlarda, HCA nöronal tarama uygulaması bildirilmiştir. ΒIII-tubulin nöronal hücrelerin etiketleme, HCA deneyleri nöron sayısı, neurite sayısı ve neurite uzunluğu, nörotoksik etkileri olduğunu göstermemektedir bütün bunlar gibi parametrelerin yüksek verimli olmayan öznel, nicel ölçümleri sağlayabilir. Ancak, astrositler rolü bu modellerin keşfedilmemiş kalır. Astrositler, merkezi sinir sistemi (MSS) homeostazının bakım tamamlayıcı bir rol var ve bunlar toksik maddeler veya hastalık durumlarında tepki aktive nöro ve neurodegradation ile ilişkilidir. GFAP CNS astrositler ağırlıklı olarak ifade bir ara filament proteindir. Astrositik aktivasyonu (gliozis) yaygın astrosit proliferasyon ve hipertrofi eşlik GFAP upregülasyonunun yol açar. Reaktif gliozis Bu işlem, sinir sistemi hasarı erken belirteci olarak öne sürülmüştür. Immunoassay ile GFAP kantitatif için geleneksel yöntem. Bu yaklaşım, hücresel lokalizasyonu, morfolojisi ve hücre sayısı hakkında bilgi sağlamak için bir yetersizlik ile sınırlıdır. Biz HCA bu sınırlamaları aşmak için, ve aynı anda birden çok özellik gliozis ile ilişkili ölçmek için kullanılan olabilir tespit GFAP ifade değişiklikleri, astrosit hipertrofisi ve astrosit proliferasyonu - tek bir tahlil içinde. Ko-kültür çalışmaları, astrositler nöronlar çeşitli toksik hakaret karşı korumak ve eleştirel nöronal hayatta kalma etkisi görülmüştür. Son çalışmalar önerilen olduğunu bir astrositler kullanımı<em&gt; In vitro</em&gt; Nörotoksisite test sistemi sadece nöronal hücrelerin daha insan MSS yapısı ve fonksiyonu için daha uygun ispat edebilir. ΒIII-tubulin ve glial fibriller asidik protein (GFAP) profil Dolayısıyla, biz, bir HCA testi astrositler nöronlar ve ortak kültürü için geliştirilen protokolleri oluşan ve valide, hedef özel algılama reaktifleri. Bu testte, nörotoksisite değerlendirmesi olmayan öznel, yüksek verimli test bir roman temsil nörotoksisite aynı anda analiz, neurite akıbet, gliozis, cep modelleri çok çeşitli nöronal ve astrositik morfoloji ve nöronal ve astrositik gelişim sağlar. Testi, nörolojik araştırma ve ilaç keşfi nörotoksisite ve geliştirilmiş verimlilik gelişmiş algılama için büyük bir potansiyele sahiptir.

Bu makale, bir roman protokol ve reaktif bileşikler ve tedavilerin yüksek içerik analizi kullanarak nöronlar ve astrositler ortak kültürleri üzerinde nörotoksik etkileri hassas ölçümü için tasarlanmıştır ayarlamak açıklamaktadır. Sonuçlar yüksek bir içerik analizi nörotoksisite değerlendirmesi için heyecan verici yeni bir teknoloji temsil ettiğini göstermektedir.

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

Yüksek İçerikli Analiz (HCA) assayleri; hücreleri ve tespit reaktiflerini, otomatik görüntüleme ve güçlü görüntü analiz algoritmalarıyla birleştirerek ...'e olanak tanır.

<a class="grey_button" href="/video/1498">
Japonca
</a>

a-neuronal-astrocyte-co-culture-assay-for-high-content-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

In vitro MSS akson glia etkileşim araştırmaları için bir roman çok bölmesi nöron ko-kültür mikrosistem platformu geliştirdi. Platform altı paralel olarak bağımsız deneyler yapma yeteneğine sahiptir ve yeni geliştirilmiş bir makro / mikro hibrid imalat yöntemi kullanılarak imal edildi.

Çok bölmesi MSS Nöron glia Co-kültür mikroakışkan Platformu

Bu çalışma, bir roman nöronal akson ve (astro) glia ko-kültür platformu kurma prosedürleri açıklar. Bu ko-kültür sisteminde, bir tek akson (ve tek bir glial hücre) arasındaki doğrudan etkileşim manipülasyon glial sinyalleşme karşılıklı nöronların mekanik analiz izin veren, uygun olur.

Mikroakışkan Kültür Platformu Glia Etkileşimi (MCP) tabanlı Nöronal Akson ve Glia Co-kültür Sistemi Nöron görüntülenmesi Analizi

Bu video, bölümlere ayrılmış bir yaklaşım kullanarak dolaylı bir nöron-astrosit ko-kültürü oluşturmak için bir yöntemi göstermektedir. Bu kurulumda, nöronlar ve astrositler uzamsal olarak ayrılır, ancak şartlandırılmış bir ortamı paylaşırlar. Astrositler tarafından salınan nörotrofik faktörler, nöron farklılaşmasını ve sinaptik bağlantıların oluşumunu teşvik ederek nöron-glia etkileşimlerini düşündürür.

Nöron-glia etkileşimlerini incelemek için dolaylı bir nöron-astrosit ko-kültür tekniği

Bu video, nöronal ağ aktivitesini kaydetmek için bir nöron-astrosit ko-kültürü oluşturmayı göstermektedir. Motor nöronların ve astrositlerin ko-kültürü bir çoklu elektrot dizisi (MEA) plakası üzerinde kurulduktan sonra, nöronal ağın senkron ritmik elektriksel aktivitesi MEA kullanılarak hücre dışı olarak kaydedildi.

Bir Nöron-Astrosit Ko-Kültüründe Nöronal Ağın Elektrofizyolojik Aktivitesinin Kaydedilmesi

Bu video, çok elektrotlu dizilere sahip bir mikroakışkan cihaz kullanılarak hiPSC'den türetilmiş kortikal glutamaterjik nöronların ve glioma hücrelerinin bir ko-kültüründe nöronal elektriksel aktivitenin değerlendirmesini göstermektedir.

Bir ko-kültürde glutamaterjik nöronlar ve glioma hücreleri etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Bu protokol nöron glia etkileşimlerinin bölümlere analizi için dolaylı nöron astrosit kokültürü açıklar.

Dolaylı nöron astrosit Coculture Deneyi: Bir<em&gt; İn Vitro</em&gt; Nöron glia Etkileşimleri Detaylı Soruşturma Set-up

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreler (hiPSC), ilaç ve kimyasal tarama için ve nörotoksisiteyi de içeren toksisite testi için yeni in vitro modellerin geliştirilmesi için güçlü bir araç olarak düşünülür. Burada, hiPSC'lerin nöronlara ve glia'ya diferansiyelleştirilmesi için ayrıntılı bir protokol anlatılmıştır.

Nörotoksisite Testi İçin İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Nöronlar ve Glia Karışık Kültürlerine Ayrıştırılması Protokolü

Nöronal uyarılabilirlik endo-dinamik bir süreçtir ve ekzositozu eksitatör ionotropic glutamat reseptörlerinin modülasyonlu. Burada açıklanan yüzey ve iç reseptör nüfus havuzları miktarının için erişilebilir, yüksek içerikli bir tahlil olduğunu.

AMPA izlemek için bir yüksek-içerik tahlil reseptör ticareti

Sunulan protokol, küçük molekül bileşiklerinin nörat dışı büyüme testini ve nörotoksisite değerlendirmesi için bir yöntem tanımlamaktadır.

İnsan Nöral Progenitor Hücre Kaynaklı Nöronlar ile Bir Neurite Outgrowth Assa ve Nörotoksisite Değerlendirmesi

Burada, nöron ve astrositle zenginleştirilmiş kültürlerin veya embriyonik korteksten nöron-glia kültürlerin kurulmasını sağlayan, yüksek verim ve tekrarlanabilirlik ile özel kültür ortamı nı kullanarak basit bir yaklaşım salıyoruz.

İskemide Nöron-Glia Etkileşimlerinin Rolünü Nörade İncelemek İçin Hücre Kültürü Modeli

Öğrenin yüksek içerik analizi ile nöron-astrosit ko-kültürlerinde nörotoksisite değerlendirmesi yapmayı. Bu hassas yöntem, nörotoksik etkileri detaylı morfolojik ölçümlerle nicelendirir.

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

Daha fazla video keşfet