Meme Görüntüleme Penceresi yoluyla Dendra2 Photoswitching

Bu video, floresan protein eksprese eden bir tümör hücre hattının fare meme yağ pedine enjeksiyonu ile başlayan bir protokolü örneklendirmektedir. İn vivo görüntüleme için özel bir bölme oluşturulur ve ardından cerrahi olarak hayvana implante edilir; bu noktadan itibaren görüntüleme verileri elde edilebilir. Merhaba, ben Albert Einstein Tıp Koleji Biyofotonik Merkezi'nden Dr. John Condi ve Dr. Jeffrey Siegel'ın laboratuvarından Dr. Vic.

Bugün size, bellek görüntüleme penceresi aracılığıyla DRA iki ile işaretlenmiş kanser hücrelerinin intravital foto-anahtarlama ve görüntüleme prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, tümör mikroçevresinin tümör hücrelerinin motilitesi üzerindeki etkisini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse, lateks eldivenlerimizi giyerek başlayalım.

Beş ila 10 santimetrelik bir doku kültürü kabını ısıtarak ve bir inçlik Dremel ucu gibi yuvarlak, sert bir nesneyi kaba bastırarak kavisli bir yüzey oluşturup meme görüntüleme penceresinin (MIW) hazırlanmasına başlayın. Kabın merkezini ısıtılmış bir jilet kullanarak kesin. Ardından, kubbe şeklindeki plastik tabanın merkezinde altı ila yedi milimetre çapında bir delik açmak için küçük, koni şeklinde bir Dremel ucu kullanın.

Plastik tabanın kenarlarını Dremel ile zımparalayıp ardından eğeyle düzelterek tamamen pürüzsüz hale getirin. Cam lamel için düz bir yüzey oluşturmak amacıyla plastik tabanın üst kısmını eğeleyin. Eğelenmiş düz yüzeyin çapı 9 ila 10 mm olmalıdır.

Ardından, sekiz milimetrelik dairesel cam kapağı yapıştırın. Hızlı yapıştırıcı kullanarak düzleştirilmiş yüzeye yerleştirin ve 15 dakika boyunca kurumaya bırakın. Isıtılmış 26 G iğne kullanarak, tabanın dışından içine doğru delikler açarak sekiz adet sütür deliği oluşturun; delikler kapak çevresine eşit şekilde dağıtılmalıdır.

Lameli kenardan 0,5 ile bir milimetre uzağa kaydırın. MIW'yi deiyonize suyla, ardından tekrar %70 etanol ile yıkayın. Cam tamamen şeffaf hale gelene kadar temizlemek için bir kulak çubuğu kullanın.

Yapıştırıcı buharından kaynaklanan kalan tüm puslu lekeleri temizlemek için aseton kullanın. Son olarak, MIW'yi her iki tarafı üç saat boyunca ultra viyole ışığa maruz bırakarak sterilize edin. MIW yerleştirilmeden önce, tümör hücrelerinin enjeksiyonu sonucunda dördüncü meme ucu çevresinde beş ila yedi milimetre çapında küçük bir tümör gelişmiş olmalıdır.

Birinci bölümde, tümörün görünür şekilde nekrotik olmadığından emin olun. Çevresindeki bölgede kıllarla birlikte sağlam deri bulunmalıdır. Başlamak için, steril bir kabin içerisinde steril bir bez sererek cerrahi işlem için steril bir alan hazırlayın.

Ortaya steril bir gazlı bez parçası yerleştirin ve cerrahi için ihtiyacınız olan malzemeleri hazırlayın. Bir çift küçük ve bir çift büyük diseksiyon makası, yaylı makas, mikro diseksiyon pensleri ve forsepsler ile bir iğne tutucuya ihtiyacınız olacak. Fareyi %2,5 averting ile anestezi ettikten sonra, tümörün üzerindeki bölgeyi tıraş etmek için küçük hayvan tıraş makinesi kullanın. Kalan tüyleri temizlemek için tüy dökücü krem kullanın ve cildi temizleyin.

Etanola batırılmış pamuklu çubuklar kullanın. Hayvanı steril gazlı bezin üzerine transfer edin ve gözlerin kurumasını ve enfekte olmasını önlemek için gözlere oftalmik pomad uygulayın. Cildi Betadine ile sterilize edin ve ardından %70 ethanol ile temizleyin.

Yıllık ve steril cerrahi örtü ile, meme ucunun hemen medialindeki deriyi pens yardımıyla çekin ve yaklaşık iki milimetrelik bir insizyon yapın. Alttaki meme yağ yastığını diseksiyon, makas ve pens kullanarak deriden ayırın. Ayrıldığında, deri ve delik, MIW yerleşimine olanak tanıyacak boyuta kadar genişleyecektir.

MIW tabanının üzerinde deri kalacak şekilde MIW'yi yerleştirin ve dikişle sabitleyin. Dikiş deliklerini doldurmak ve MIW'yi deriye sabitlemek için doku yapıştırıcısı veya siyanoakrilat kullanın. İlk görüntüleme seansı gerçekleşmeden önce hayvanın önümüzdeki üç ila dört gün boyunca iyileşmesi beklenmelidir.

Görüntüleme oturumuna hazırlık kapsamında, görüntüleme kutusundan faydalanabilmek için kutunun özelliklerini açıklayabiliriz. İlk olarak, hayvanı isofloran ile anestezi edin ve gözlere oftalmik pomad uygulayın. Anestezi cihazından gelen isofloran egzozunu görüntüleme kutusunun önüne bağlayın.

Giriş deliğinin dış kısmına. Görüntüleme kutusunun çıkış deliğine ikinci bir tüp takın. Bu tüp, önce gaz filtresine ve ardından vakuma bağlanmalıdır.

Ardından, MIW alt tarafa bakacak şekilde hayvanı yerleştirin. Kutuyu tutun ve MIW tabanı aralarında tutulup sabitlenecek şekilde alt kapıları ayarlayın. MIW tabanı, görüntüleme kutusu kapılarıyla aynı seviyede olmalıdır.

MIW lamı bu seviyenin sadece birkaç milimetre altında olması gerekirken, alt sürgülü kapaklar arasındaki MIW konumlandırmasının, lamın kutunun alt kapaklarına paralel ve düz bir şekilde durmasını sağladığından emin olun. Bu, mikroskop objektifini kutuyu mikroskop tablasının üzerine yerleştirmek için yeterli alan bırakacak şekilde aşağı indirerek doğru odaklama yapılmasına olanak tanır. Tablayı, MIW lamı objektifin üzerinde olacak şekilde ayarlayın.

Artık objektifi odaklayabilir ve görüntüleme işlemine başlayabiliriz. Burada açıklanan görüntüleme prosedürü Leica SP five konfokal mikroskobu içindir ve kullanılan belirli bir mikroskopla deneyi optimize etmek için bir kılavuz olarak kullanılmalıdır. İşleme, tümörü okülerden yeşil floresan filtre ile gözlemleyerek başlayın.

Görünür şekilde akış gösteren ve aynı odak düzleminde düz yatan ana kan damarlarını bulun. Damarlardan birini alanın merkezine konumlandırın ve PMT deteksiyonuna geçiş yapın. İki kanal için ardışık görüntüleme toplama işlemini ayarlayacağız.

Bir kanal 488 nanometre lazer hattını kullanır ve hücre dışı matristen gelen saçılmayı ve dendra two'nun yeşil formundan gelen emisyonu toplar. İkinci kanal 543 nanometre lazer hattını kullanır ve dendra two'nun kırmızı formundan gelen emisyonu toplar. Foto-anahtarlamadan önce 3D görüntüler toplayın.

Ardından, seçilen bir hücre popülasyonunu 405 nanometre lazer hattı ile foto-anahtarlamak için ilgi bölgesi tarama seçeneğini kullanın. Anahtarlamayı izlemek amacıyla proteinin kırmızı formundan emisyon toplayın. Şimdi, anahtarlama sonrası 3D görüntüleri, anahtarlama öncesi görüntülerin toplandığı yöntemle aynı şekilde toplayın.

Ardından, bu alanı foto-anahtara dönüştürmek için UV kanalında %20 lazer gücü kullanarak tümörde birden fazla bölgeyi dönüştürün ve okülerler aracılığıyla dijital bir kamera kullanarak hem yeşil hem de kırmızı kanallarda fotoğraflar çekin. Bu, sonraki görüntüleme seansları sırasında yönlendirmenize yardımcı olacaktır. Bu görüntüde, kan damarına dik olarak yönlendirilmiş ve floresans göstermeyen dikdörtgen bir foto-anahtar bölgesi gözlemlenmektedir.

Foto-anahtarlama yapılmamış hücreler yeşil görünürken, hücre dışı matriksten gelen saçılma mor renktedir. Görüntü, Z ekseni boyunca dört görüntünün maksimum yoğunluk projeksiyonudur. Size, bellek görüntüleme penceresi aracılığıyla RA tool etiketli hücrelerin nasıl foto-anahtarlandığını ve görüntülendiğini göstermiş olduk.

Bu prosedürün kullanılması, tümör hücrelerinin tümörün farklı bölgelerindeki davranışlarını günler boyunca karşılaştırmak için önemlidir. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneyinizde başarılar dileriz.