Name: Meme Görüntüleme Penceresi yoluyla Dendra2 Photoswitching (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Öğrenin, meme görüntüleme penceresi kullanarak Dendra2 etiketli tümör hücrelerinin intravital photoswitching ve izleme protokolünü. Bu yöntem, fare meme yağ yastığında metastatik davranışları günler boyunca incelemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

(; JC, JES ve JW CA100324; JvR için U54GM064346 JES CA77522, JC ve BG U54CA126511) Bu çalışma, ABD Savunma Bakanlığı&#39;nın (BG ve DK BC061403 BC075554), ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. D. Entenberg mikroskopi, görüntüleme kutusu ve J. Pollard (Albert Einstein Tıp Koleji) F4/80 antikor üretiminde yardım M. Rottenkolber ile yardım için teşekkür ederim.

1. Floresan tümörlerin meme yağ yastığı içine tümör hücrelerinin enjeksiyonu kullanarak Üretimi: <ol><li> % 80 confluency - 40 Dendra2 protein (sitoplazmik bir belirteci olarak) ifade eden bir hücre hattı büyütün. </li><li> PBS w / o Ca 2 yemekleri en az 3 kez durulayın + veya Mg 2 +. </li><li> 37 10 cm çanak ve inkübe başına 3 ml tripsin ekle ° C hücrelerinin çoğu ayırmak ve daha sonra düz bir yüzeye karşı çanak vurmak sallamak kadar. </li><li> Çanak kapalı tüm hücreleri durulayın ve matris de toplamak için bir kazıyıcı (kauçuk polis) kullanın. 5 ml PBS ekleyin. Santrifüj sırasında saymak için bir kısım. </li><li> 5 dakika boyunca 800 g santrifüjleyin. </li><li> Aspire ve 5 &#39;lik bir konsantrasyon için PBS içinde tekrar süspansiyon - 10x 10 6 / ml. Enjekte kadar (30 dakika içinde enjekte) buz üzerinde saklayın. </li><li> 4-5 haftalık kadın bağışıklık eksikliği olan farelerde (örneğin SCID) içeren steril bir kaput içinde bir kafes yerleştirin. </li><li> % 70 etanol ile 4. (karın) meme başı etrafındaki alanı püskürtün. </li><li> Meme yağ yastığı içine 0.1 ml enjekte edilir. Eğer bir asistan, bir kişi bir yerde fare tutabilir, diğer meme yağ yastığı içine iğne ekler. Kendinize enjekte ederek, izofluran kullanarak hafif anestezi altında fare koymak. </li><li> Tümör 5-7 mm büyüdü sonra, Meme Görüntüleme Pencere (MIW) takılmalıdır. Not: Alternatif olarak, bazı uygulamalar için MIW, sağlıklı meme yağ yastığı üstüne yerleştirilir ve daha sonra hücreler enjekte edilebilir. Bu yaklaşım, fizyolojik bir ortamda geçici transfekte hücreler görüntüleme sağlar. </li></ol> 2. Meme Görüntüleme Pencere (MIW) Manuel imalat: <ol><li> MIWs (Şekil 1A) biyouyumluluk garanti doku sınıf plastikten yapılır. Manuel inşaat için, 5 veya 10 cm çanak kullanmanızın. </li><li> Lateks eldiven koyun. </li><li> Bir doku kültürü çanak Isı ve ısıtmalı çanak (Bunun için 1-inç dremmel bit kullanımı) karşı bir yuvarlak, sert bir cisim basarak kavisli bir yüzeye ibaret. </li><li> Merkezi ısıtmalı bir jilet kullanarak çanak kesin. </li><li> Kubbe şeklinde plastik taban (çapı 6-7mm) merkezinde bir delik yapmak için küçük, şeklinde koni dremmel biraz kullanın. </li><li> Dremmel ile kumlama ve daha da dosyalama plastik taban kenarları tamamen düz olun. </li><li> Dosya cam lamel için düz bir yüzeye plastik taban üst. Başvurarak, düz bir yüzey çapı 9-10mm olmalıdır. </li><li> Tutkal superglue kullanarak basık yüzey üzerine 8mm yuvarlak cam lamel (1 numara) (siyanoakrilat yapıştırıcı). </li><li> Kuru tutkal (15 dakika) bekleyin. </li><li> Tabanının içine dışarıdan (cam) delinmesiyle sekiz sütür delik açmak için ısıtmalı bir 26g iğne kullanın. Delikler, lamel kenarından 0,5-1mm uzaklıkta, eşit lamel etrafında dağıtılmış olmalıdır. </li><li> 5-0 sütür iğnesi kullanarak delikler genişletin. </li><li> Plastik tabanı delik delme, iç yüzeyi pürüzlü hale getirecektir. Zımpara kağıdı kullanarak, yüzeyi tamamen düz olun. </li><li> Küçük bir fırça kullanarak MIW küçük plastik parçacıkların eldiven ve fırça değiştirin. </li><li> MIW deiyonize su ile yıkayın. </li><li> % 70 etanol kullanarak MIW yıkayın. Q-ucu tamamen şeffaf cam temizlemek için kullanın. Tutkal buhar sisli lekeler varsa, bir Q-tip ile aseton dikkatli kullanın. </li><li> Yanlardan en az 3 saat süreyle UV ışınlarına maruz kalma MIW sterilize edin. </li></ol> Meme Görüntüleme Pencere (MIW) Yarı Manuel fabrikasyon Plastik taban imal etmek için, şu anda silikon kauçuk döküm kalıpları kullanarak el yapımı MIWs kullanarak oluşturdu. Kalıp silikon kauçuk, sonra hemen araya polyester reçine ile doldurulur ve tekrar orijinal ön ve her ikisi de tam bir kopyasını yapmak üzere iki kısımdan oluşur. Sıvı polyester reçine birlikte 09:10 karıştırılır ve sert bir yapı içinde 48 saat içinde tam olarak tedavi sonuçları. Plastik parçalayarak ya da zaman içinde sarı olma UV korumalı ve arşiv. Sonra, temel tedavi adımları 2,8-2,16 el yapımı MIWs için aynı şekilde yapılır. 3. MIW yerleştirilmesi: <ol><li> 4. meme etrafında küçük bir (5-7 mm çapında), tümör hücre tipi (Şekil 1B) bağlı olarak tümör hücrelerinin enjeksiyonu sonrasında birkaç gün / hafta Dendra2 photoswitchable protein veya diğer floresan proteinleri ifade hücre enjeksiyonu kullanılan hücre hattı bağlıdır sonra ne kadar zaman geçti. Gözle görülür nekrotik tümör ve tümörün üstüne saç ile sağlam bir cilde sahip olmalıdır. Nekrotik tümörleri olan farelerin ötenazi olmalı. </li><li> Için steril alanda steril bez hazırlayın steril bir kaput içinde bir parça aşağı cerrahi yatıyordu. G steril bir parçası koyunortasında auze ve onun etrafında bir kaç MIWs ve steril aletler yatıyordu: küçük standart makas, yaylı makas, microdissecting cımbız, microdissecting forseps, iğne tutucu kullanın. Q-ipuçları% 70 etanol ve kaput köşesinde steril eldiven, bir şişe steril tutun. </li><li> Fare HBSS% 2.5 AVERTIN IP enjeksiyon (20 ul / g) kullanarak steril kaput anestezi veya alternatif olarak 10 mikrogram / kg ketamin + 10 mg / g ksilizin (onayları ve sipariş için Hayvan Bakım Enstitüsü ile temas). Not: Avertin çözüm hazırlanmalıdır iki haftada bir, filtre 0.22 mikron filtre ve 4 500 ul alikotları olarak saklanır kullanarak sterilize ° C (koyu). </li><li> Saç, küçük bir hayvan tıraş makinesi kullanarak tümör üzerindeki alana tıraş tarafından çıkarın. </li><li> Nair epilasyon kremi (herhangi bir eczane mevcuttur) kullanarak saç geri kalanı çıkarın. Etanol-daldırma Q-ipuçları kullanarak cilt temizleyin. </li><li> Hayvan steril gazlı bez üzerine aktarın ve kurutma ve enfeksiyon onları tutmak için gözlerine oftalmik merhem uygulayın. </li><li> Betadin ile cilt sterilize ve% 70 etanol ile temizleyin. </li><li> Steril kaput içinde steril cerrahi bir beze hayvan aktarın. </li><li> Cilt, cilt ve kesme ~ 2mm kesi forseps kullanarak meme hemen medial çekin. </li><li> Diseksiyon makas ve forseps kullanarak deri altında yatan meme yağ yastığı ayırın. MIW ekleme ağırlayacak bir boyutu bu ayrılık adım sırasında cilt ve delik streç. </li><li> Yanlışlıkla bir gemi sugery sırasında isabet ederse, üretilen / aşırı haline gelen kanamayı durdurmak için herhangi bir kan kaldırmak için steril bir Q-ipuçlarını kullanın. </li><li> MIW yerinde MIW taban ve sütür üst deri emilmeyen parçacığı kullanarak ve iğne kesme ters olduğu gibi yerleştirin. </li><li> Sütür delikleri doldurmak ve cilde MIW güvenli bir doku yapıştırıcısı veya siyanoakrilat kullanın. </li><li> TMP-SMX antibiyotik karışımı ekleyin: (Sulfamethoxazole 0.6 mg / ml, Trimetoprim 0.12 mg / ml), ameliyat öncesi ve sonrası 3 gün boyunca kafes su şişesi. </li><li> Hayvan AVERTIN IP enjeksiyondan sonra 1-4h anestezi altında kalır. Ameliyat genellikle ~ 45dakika sürer, hayvan daha sonra kurtarmaya yardımcı olması için önemlidir: </li><li> Bir yandan ısıtma yastığı kafesinin altındaki (37 ° C) (eczane mevcut) yerleştirin ve gazlı bez ile örtün. </li><li> Onun mide döner ve yürümeye başlayana kadar yastık üstünde hayvan tutun. </li><li> Hayvan 3h daha fazla bilinçsiz ise, rehidrasyon için 0.3 ml HBSS intraperitoneal enjekte edilir. </li><li> Hayvan sonraki 3-4 gün içinde ilk görüntüleme oturumu gerçekleşmeden önce kurtarmak için izin verilir. </li></ol> 4. Görüntüleme Kutusu İnşaatı Görüntüleme kutusu MIW mikroskop amacı sağ üstünde, düz oturma olduğunu garanti eder. Ayrıca izofluran sürekli hava akımı sayesinde sıcaklık ve anestezi kontrolünü kolaylaştırır. Kutusu pleksiglas ve plastik kaynak kullanarak birbirine yapıştırılmış. Bu özel mikroskop aşaması için donatılmıştır ve bu yüzden kendi alt şekil (Şekil 2 Leica SP5 mikroskop sahne monte kutu düzenini gösterir) kullanılan mikroskop bağlı olarak değişir. Santimetre olarak kutu boyutları l = 11,4 cm, w = 7,6 cm, h = 4,4 cm (Şekil 2A). Leica SP5 mikroskop sahne içinde uygun çukur bir tabak, 12.7x8.4 cm boyutunda, ve iki sürgülü &quot;kapılar&quot;, dairesel bir açılış (formu 5.7 X 5.7 cm_each, kutunun altındaki oluşur d = 2.22 cm kapatıldığında.) Bu açılış MIW sığar. Ön parça yan parçaları bir vakum yol açan bir çıkış deliği içerir anestezi teslimat için giriş deliği içerir. Kondansatör ve slayt tutucu görüntüleme kutusu yerleştirme önce kaldırılması gerektiğini unutmayın. 5. Görüntüleme Kutusu kullanın. <ol><li> Izofluran ile anestezi altında hayvan koyun ve gözleri oftalmik merhem uygulayın. </li><li> Giriş deliği (Şekil 2B) dışında, anestezi makine görüntüleme kutusu ön izofluran egzoz takın. </li><li> Görüntüleme kutusunun çıkış deliği ikinci bir tüp takın. Bu tüp gaz filtre ve ardından vakum eklenmelidir. </li><li> Kutusunun kapağını açın ve kutusu kapıları açmak ve hayvan, MIW yan bakan alt yerleştirin ve kutuya sürgülü kapılar. </li><li> Kutusunu tutun ve MIW üssüne düzenlenen ve aralarında hareketsiz böylece alt kapı ayarlayabilirsiniz. MIW lamel bu seviyenin altında sadece birkaç milimetre olmalıdır MIW tabanı, görüntüleme kutusu kapıları olarak aynı düzeyde olmalıdır. Alt kapı kutusu paralel sürgülü kapılar alt kenarı arasındaki MIW konumlandırma lamel (MIW cam kısım) düz yatıyor olmasını sağlar emin olun. Bu doğru odaklama sağlayacaktır. </li><li> Kutusunun yerleştirilmesi için uzay izin vermek için, mikroskop hedefi Altmikroskop aşamasının. </li><li> Mikroskop sahnede kutu yerleştirin ve MIW lamel amacı yukarıda böylece sahne ayarlamak. </li><li> Odak amaç ve görüntüleme başlatmak. </li><li> Izofluran kullanırken, hayvan solunum frekansı görsel muayene ile takip edilmelidir. Bu, görsel veya görüntüleme toplama (bu veri toplama ile müdahale) sırasında görünen solunum eserler frekans izleme yapılabilir. MouseOx pulse oksimetre sistemi (Starr yaşam Bilimler Corp) başarıyla kullanılmaktadır. Bu şekilde hayvan kontrol odasında ışıkları dönüm olmadan sürekli veri elde edilebilir. Not: Her görüntüleme seanstan sonra, hayvan kurtarma, küçük bir gazlı bez ya da Kimwipes el ısıtma yastığı sarma ve hayvan kafesine altına koyarak kolaylaştırılması gerekmektedir. Not: bir daldırma amacı MIW ile görüntü için kullanılır ise, daldırma orta (gliserol, su, yağ) görüntüleme penceresi temizlenir olmalıdır. MIW görüntüleme sırasında meydana gelmiş olabilecek herhangi bir çatlak ya da diğer hasarlar açısından kontrol edilmelidir. Bu çoklu görüntüleme oturumları sırasında veri toplamak için kritik öneme sahiptir. </li></ol> 6. Dendra2 etiketli hücrelerinin Photoswitching ve görüntüleme Leica SP5 konfokal mikroskop için prosedürü tarif; optimize etmek için bir rehber olarak kullanılması gereken diğer konfokal mikroskoplar kullanarak veya multiphoton görüntüleme kurarken odak düzlemli lazer gücü, hedefleri ve yazılım seçenekleri değişir ve bu nedenle aşağıda açıklanan protokol mikroskopta deneme. <ol><li> Yeşil floresan filtre ile gözmerceği (10x) ile tümör gözlemleyerek, büyük kan damarları gözle görülür bir şekilde akan ve aynı odak düzlemli düz döşeme bulun. </li><li> PMT tespiti için alan ve anahtar merkezi damarlarının bir konum. </li><li> Iki kanal için sıralı görüntüleme toplama ayarlayın. Kanallardan biri 488nm lazer çizgisi (% 10 güç) kullanır ve Dendra2 (505-540nm) yeşil formu ekstrasellüler matriks (480-495nm) ve emisyon saçılma toplar. Ikinci kanal 543nm lazer çizgisi (% 90 güç) kullanır ve Dendra2 kırmızı formu (555-600Nm) emisyon toplar. 3D görüntü ön photoswitching toplayın. </li><li> 405nm lazer çizgisi (% 30 güç, 20-40 taramaları) kullanarak hücrelerin seçilmiş bir nüfus photoswitch ROI tarama seçeneği kullanın. Anahtarlama izlemek için protein kırmızı formu emisyon toplayın. </li><li> 6.3 &#39;de aynı sıralı rutin kullanarak 3 boyutlu görüntüleri, post-anahtarlama toplamak. </li><li> Eğer tümör birden fazla bölge photoswitching, hem yeşil ve kırmızı kanalları (Şekil 3A, B), bir dijital kamerayı kullanarak Okülerin üzerinden fotoğraf çekmek için tavsiye edilir. Bu yönde, daha sonraki görüntüleme oturumları sırasında yardımcı olacaktır. Not: Ayrıca, kan damarlarının geçici olarak floresan dekstran (Cascade Mavi veya Alexa Fluor 647, hem de 10kDa) kuyruk ven enjeksiyon kullanarak etiketli olabilir. Dextrans enjeksiyon Birkaç saat sonra kan damarları terk ve kalıcı makrofajlar etiket. </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 3C kan damarı (hiç floresan) göre dikey olarak odaklı bir dikdörtgen photoswitched bölgesi (kırmızı) gösterir. Sigara photoswitched hücrelerin ekstrasellüler matriks saçılma mor, yeşil. Resim dört görüntülerin maksimum yoğunluk projeksiyon Z-ekseni boyunca (20-50 mikron derinliğinde).

<ol><li>Farina, K. L., Wyckoff, J. B., Rivera, J., Lee, H., Segall, J. E., Condeelis, J. S., Jones, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+motility+of+tumor+cells+visualized+in+living+intact+primary+tumors+using+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cell motility of tumor cells visualized in living intact primary tumors using green fluorescent protein.</a> Cancer Res. 58, 2528-2532 (1998).</li>
<li>Naumov, G. N., Wilson, S. M., MacDonald, I., Schmidt, E. E., Morris, V. L., Groom, A. C., Hoffman, R. M., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+expression+of+green+fluorescent+protein%2C+coupled+with+high-resolution+in+vivo+videomicroscopy%2C+to+monitor+steps+in+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cellular expression of green fluorescent protein, coupled with high-resolution in vivo videomicroscopy, to monitor steps in tumor metastasis.</a> J Cell Sci. 112, 1835-1842 (1999).</li>
<li>Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+gene+expression%2C+angiogenesis+and+physiological+function+in+tumors+using+multiphoton+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy.</a> Nature Med. 7, 864-868 (2001).</li>
<li>Wang, W., Wyckoff, J. B., Frohlich, V. C., Oleynikov, Y., Huttelmaier, S., Zavadil, J., Cermak, L., Bottinger, E. P., Singer, R. H., White, J. G., Segall, J. E., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+behavior+in+metastatic+primary+mammary+tumors+correlated+with+gene+expression+patterns+revealed+by+molecular+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Single cell behavior in metastatic primary mammary tumors correlated with gene expression patterns revealed by molecular profiling.</a> Cancer Res. 62, 6278-6288 (2002).</li>
<li>Sidani, M., Wyckoff, J., Xue, C., Segall, J. E., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+microenvironment+of+mammary+tumors+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Probing the microenvironment of mammary tumors using multiphoton microscopy.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 151-163 (2006).</li>
<li>Wyckoff, J. B., Wang, Y., Lin, E. Y., Li, J. F., Goswami, S., Stanley, E. R., Segall, J. E., Pollard, J. W., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+macrophage-assisted+tumor+cell+intravasation+in+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors.</a> Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).</li>
<li>Egeblad, M., Ewald, A. J., Askautrud, H. A., Truitt, M. L., Welm, B. E., Bainbridge, E., Peeters, G., Krummel, M. F., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).</li>
<li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Adrian, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2604-2609 (2003).</li>
<li>Kedrin, D., Gligorijevic, B., Wyckoff, J., Verkhusha, V. V., Condeelis, J., Segall, J. E., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nat. Methods. 5, 1019-1021 (2008).</li>
<li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nat. Protocols. 2, 2024-2032 (2007).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Ca ve Mg içermeyen PBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM besiyeri (MDA-MB-231 hücreleri)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran(Aerrane)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td># NDC 10019-773-40</td><td></td></tr><tr><td>SCID fare</td><td>National Cancer Institute</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kültür kapları</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td>Özel Sipariş</td></tr><tr><td>Dairesel lamell 8 mm</td><td>Scientific, Inc.</td><td>8CIR-1-FIS</td><td></td></tr></tbody></table>

meme görüntüleme penceresi yoluyla dendra2 photoswitching

Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

Tek hücreli çözünürlükte fare ve sıçanlarda son on yıl içinde, meme tümörlerinin intravital mikroskopi<sup&gt; 1-4</sup&gt; Mekanizmaları, göç, istila ve tümör hücrelerinin intravasation gibi metastatik davranışı önemli bilgiler sonuçlandı<sup&gt; 5, 6</sup&gt; Anjiyogenez<sup&gt; 3</sup&gt; Ve bağışıklık hücrelerinin tepki<sup&gt; 7-9</sup&gt;. Biz son zamanlarda birden çok intravital görüntüleme oturumda yaşayan farelerde görüntü ortotopik meme karsinomları için bir teknik bildirdin<sup&gt; 10</sup&gt;. Bunun için, biz Dendra2 Meme Görüntüleme Pencere (MIW) ve optimize edilmiş görüntüleme parametreleri geliştirdik<sup&gt; 11</sup&gt; Photoswitching ve görüntüleme<em&gt; In vivo</em&gt;. Burada, biz, özel bir görüntüleme kutusunu kullanarak Dendra2 etiketli tümör hücrelerinin bir tümör görüntüleme ve üstüne MIW ekleme MIW üretim için protokol tanımlar. Bu protokol görüntü metastatik tümörlerde belirgin mikroçevrelerde tümör hücrelerinin davranış için kullanılır ve kan damarları, tümör hücreleri ve ana hücreleri uzun süreli görüntüleme sağlar.

Meme Görüntüleme Penceresi ile Dendra2 etiketli tümör hücrelerinin intravital photoswitching ve izleme, bize görüntü gün bir zaman ölçeği üzerinde seçilen tümör mikroçevrelerde tümör hücrelerinin metastatik davranış sağlayan bir tekniktir.

Meme Görüntüleme Penceresi yoluyla Dendra2 Photoswitching

Son on yılda, fare ve sıçanlardaki meme tümörlerinin tek hücre çözünürlüğünde intravital mikroskopisi1-4, ... hakkında önemli içgörüler sağlanmasını sağlamıştır.

Bu video, floresan protein eksprese eden bir tümör hücre hattının fare meme yağ pedine enjeksiyonu ile başlayan bir protokolü örneklendirmektedir. İn vivo görüntüleme için özel bir bölme oluşturulur ve ardından cerrahi olarak hayvana implante edilir; bu noktadan itibaren görüntüleme verileri elde edilebilir. Merhaba, ben Albert Einstein Tıp Koleji Biyofotonik Merkezi'nden Dr. John Condi ve Dr. Jeffrey Siegel'ın laboratuvarından Dr. Vic.Bugün size, bellek görüntüleme penceresi aracılığıyla DRA iki ile işaretlenmiş kanser hücrelerinin intravital foto-anahtarlama ve görüntüleme prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, tümör mikroçevresinin tümör hücrelerinin motilitesi üzerindeki etkisini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse, lateks eldivenlerimizi giyerek başlayalım.Beş ila 10 santimetrelik bir doku kültürü kabını ısıtarak ve bir inçlik Dremel ucu gibi yuvarlak, sert bir nesneyi kaba bastırarak kavisli bir yüzey oluşturup meme görüntüleme penceresinin (MIW) hazırlanmasına başlayın. Kabın merkezini ısıtılmış bir jilet kullanarak kesin. Ardından, kubbe şeklindeki plastik tabanın merkezinde altı ila yedi milimetre çapında bir delik açmak için küçük, koni şeklinde bir Dremel ucu kullanın.Plastik tabanın kenarlarını Dremel ile zımparalayıp ardından eğeyle düzelterek tamamen pürüzsüz hale getirin. Cam lamel için düz bir yüzey oluşturmak amacıyla plastik tabanın üst kısmını eğeleyin. Eğelenmiş düz yüzeyin çapı 9 ila 10 mm olmalıdır.Ardından, sekiz milimetrelik dairesel cam kapağı yapıştırın. Hızlı yapıştırıcı kullanarak düzleştirilmiş yüzeye yerleştirin ve 15 dakika boyunca kurumaya bırakın. Isıtılmış 26 G iğne kullanarak, tabanın dışından içine doğru delikler açarak sekiz adet sütür deliği oluşturun; delikler kapak çevresine eşit şekilde dağıtılmalıdır.Lameli kenardan 0,5 ile bir milimetre uzağa kaydırın. MIW'yi deiyonize suyla, ardından tekrar %70 etanol ile yıkayın. Cam tamamen şeffaf hale gelene kadar temizlemek için bir kulak çubuğu kullanın.Yapıştırıcı buharından kaynaklanan kalan tüm puslu lekeleri temizlemek için aseton kullanın. Son olarak, MIW'yi her iki tarafı üç saat boyunca ultra viyole ışığa maruz bırakarak sterilize edin. MIW yerleştirilmeden önce, tümör hücrelerinin enjeksiyonu sonucunda dördüncü meme ucu çevresinde beş ila yedi milimetre çapında küçük bir tümör gelişmiş olmalıdır.Birinci bölümde, tümörün görünür şekilde nekrotik olmadığından emin olun. Çevresindeki bölgede kıllarla birlikte sağlam deri bulunmalıdır. Başlamak için, steril bir kabin içerisinde steril bir bez sererek cerrahi işlem için steril bir alan hazırlayın.Ortaya steril bir gazlı bez parçası yerleştirin ve cerrahi için ihtiyacınız olan malzemeleri hazırlayın. Bir çift küçük ve bir çift büyük diseksiyon makası, yaylı makas, mikro diseksiyon pensleri ve forsepsler ile bir iğne tutucuya ihtiyacınız olacak. Fareyi %2,5 averting ile anestezi ettikten sonra, tümörün üzerindeki bölgeyi tıraş etmek için küçük hayvan tıraş makinesi kullanın. Kalan tüyleri temizlemek için tüy dökücü krem kullanın ve cildi temizleyin.Etanola batırılmış pamuklu çubuklar kullanın. Hayvanı steril gazlı bezin üzerine transfer edin ve gözlerin kurumasını ve enfekte olmasını önlemek için gözlere oftalmik pomad uygulayın. Cildi Betadine ile sterilize edin ve ardından %70 ethanol ile temizleyin.Yıllık ve steril cerrahi örtü ile, meme ucunun hemen medialindeki deriyi pens yardımıyla çekin ve yaklaşık iki milimetrelik bir insizyon yapın. Alttaki meme yağ yastığını diseksiyon, makas ve pens kullanarak deriden ayırın. Ayrıldığında, deri ve delik, MIW yerleşimine olanak tanıyacak boyuta kadar genişleyecektir.MIW tabanının üzerinde deri kalacak şekilde MIW'yi yerleştirin ve dikişle sabitleyin. Dikiş deliklerini doldurmak ve MIW'yi deriye sabitlemek için doku yapıştırıcısı veya siyanoakrilat kullanın. İlk görüntüleme seansı gerçekleşmeden önce hayvanın önümüzdeki üç ila dört gün boyunca iyileşmesi beklenmelidir.Görüntüleme oturumuna hazırlık kapsamında, görüntüleme kutusundan faydalanabilmek için kutunun özelliklerini açıklayabiliriz. İlk olarak, hayvanı isofloran ile anestezi edin ve gözlere oftalmik pomad uygulayın. Anestezi cihazından gelen isofloran egzozunu görüntüleme kutusunun önüne bağlayın.Giriş deliğinin dış kısmına. Görüntüleme kutusunun çıkış deliğine ikinci bir tüp takın. Bu tüp, önce gaz filtresine ve ardından vakuma bağlanmalıdır.Ardından, MIW alt tarafa bakacak şekilde hayvanı yerleştirin. Kutuyu tutun ve MIW tabanı aralarında tutulup sabitlenecek şekilde alt kapıları ayarlayın. MIW tabanı, görüntüleme kutusu kapılarıyla aynı seviyede olmalıdır.MIW lamı bu seviyenin sadece birkaç milimetre altında olması gerekirken, alt sürgülü kapaklar arasındaki MIW konumlandırmasının, lamın kutunun alt kapaklarına paralel ve düz bir şekilde durmasını sağladığından emin olun. Bu, mikroskop objektifini kutuyu mikroskop tablasının üzerine yerleştirmek için yeterli alan bırakacak şekilde aşağı indirerek doğru odaklama yapılmasına olanak tanır. Tablayı, MIW lamı objektifin üzerinde olacak şekilde ayarlayın.Artık objektifi odaklayabilir ve görüntüleme işlemine başlayabiliriz. Burada açıklanan görüntüleme prosedürü Leica SP five konfokal mikroskobu içindir ve kullanılan belirli bir mikroskopla deneyi optimize etmek için bir kılavuz olarak kullanılmalıdır. İşleme, tümörü okülerden yeşil floresan filtre ile gözlemleyerek başlayın.Görünür şekilde akış gösteren ve aynı odak düzleminde düz yatan ana kan damarlarını bulun. Damarlardan birini alanın merkezine konumlandırın ve PMT deteksiyonuna geçiş yapın. İki kanal için ardışık görüntüleme toplama işlemini ayarlayacağız.Bir kanal 488 nanometre lazer hattını kullanır ve hücre dışı matristen gelen saçılmayı ve dendra two'nun yeşil formundan gelen emisyonu toplar. İkinci kanal 543 nanometre lazer hattını kullanır ve dendra two'nun kırmızı formundan gelen emisyonu toplar. Foto-anahtarlamadan önce 3D görüntüler toplayın.Ardından, seçilen bir hücre popülasyonunu 405 nanometre lazer hattı ile foto-anahtarlamak için ilgi bölgesi tarama seçeneğini kullanın. Anahtarlamayı izlemek amacıyla proteinin kırmızı formundan emisyon toplayın. Şimdi, anahtarlama sonrası 3D görüntüleri, anahtarlama öncesi görüntülerin toplandığı yöntemle aynı şekilde toplayın.Ardından, bu alanı foto-anahtara dönüştürmek için UV kanalında %20 lazer gücü kullanarak tümörde birden fazla bölgeyi dönüştürün ve okülerler aracılığıyla dijital bir kamera kullanarak hem yeşil hem de kırmızı kanallarda fotoğraflar çekin. Bu, sonraki görüntüleme seansları sırasında yönlendirmenize yardımcı olacaktır. Bu görüntüde, kan damarına dik olarak yönlendirilmiş ve floresans göstermeyen dikdörtgen bir foto-anahtar bölgesi gözlemlenmektedir.Foto-anahtarlama yapılmamış hücreler yeşil görünürken, hücre dışı matriksten gelen saçılma mor renktedir. Görüntü, Z ekseni boyunca dört görüntünün maksimum yoğunluk projeksiyonudur. Size, bellek görüntüleme penceresi aracılığıyla RA tool etiketli hücrelerin nasıl foto-anahtarlandığını ve görüntülendiğini göstermiş olduk.Bu prosedürün kullanılması, tümör hücrelerinin tümörün farklı bölgelerindeki davranışlarını günler boyunca karşılaştırmak için önemlidir. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneyinizde başarılar dileriz.

dendra2-photoswitching-through-the-mammary-imaging-window

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu videoda, implante edilmiş bir kraniyal pencere aracılığıyla bir fare modelinde önceden enjekte edilmiş kanser hücrelerinin intravital görüntülemesini gerçekleştiriyoruz. Bu yüksek çözünürlüklü hızlandırılmış görüntüleme tekniği, canlı faredeki kanser hücrelerinin dinamik davranışının incelenmesini sağlar.

Bir Fare Modelinde Kranial Pencere Tabanlı İntravital Görüntüleme: Bir Murin Modelinin Beynindeki Önceden Enjekte Edilmiş Kanser Hücrelerinin Davranışını İncelemek İçin Bir Görüntüleme Tekniği

Burada, reaktiflerin intraduktal enjeksiyon yoluyla tavşan meme bezine lokalize olarak verilmesi için bir teknik açıklıyoruz. Ek olarak, kontrast maddelerin yüksek çözünürlüklü ultrason görüntülemesi ile görselleştirme ve teslimatın onaylanması için bir protokol açıklıyoruz.

Rabbit Meme Bezi için İntraduktal Teslimat

Burada, doğrudan ilgilenilen dokuya/organa ve cilde yapıştırılabilen optik olarak net, silikon pencereler kullanılarak uzun süreli intravital görüntüleme için bir yaklaşım sunulmuştur. Bu pencereler şu anda sahada kullanılan diğerlerinden daha ucuz ve çok yönlüdür ve cerrahi yerleştirme hayvanlarda sınırlı iltihaplanma ve sıkıntıya neden olur.

Şeffaf Silikon Pencerelerle Uzunlamasına İntravital Görüntüleme

Bu protokol, değiştirilebilir kapaklı (R.MIW) yeni bir meme görüntüleme penceresini tanımlar. R.MIW'nin implantasyonundan sonra intravital mikroskopi, farklı gelişim aşamalarında sağlıklı ve hastalıklı meme bezinin hücresel çözünürlükle uzunlamasına ve çok günlük görüntülenmesini sağlar.

Değiştirilebilir Kapaklı Meme Görüntüleme Penceresi Kullanarak Boyuna İntravital Mikroskopi

Burada tarif edilen intravital görüntüleme yöntemi, 4D intravital görüntülerin derinlemesine analizi için etiketlenmemiş bir tümör mikroçevresini tümör, stromal ve vasküler kompartmanlara invaziv olmayan bir şekilde segmentlere ayırmak için metabolik ko-faktör NAD (P) H'den kollajen ikinci harmonik jenerasyonu ve endojen floresanı kullanır.

Meme Tümörü Mikroçevresinin İntravital Görüntülemesi için Etiketsiz Bir Segmentasyon Yaklaşımı

Mevcut protokol, lazer taramalı konfokal ve multifoton mikroskobu ile emziren fare meme bezinin intravital görüntülenmesi için kolay bir tekniği tanımlamaktadır.

Meme bezinin intravital hücre altı mikroskobu

Sağlıklı ve hastalıklı pankreasın seri ve uzunlamasına çalışmalarına izin veren, murin pankreasın hücre altı çözünürlüklü görüntülenmesi için stabilize kalıcı bir optik pencerenin cerrahi implantasyonu için bir protokol sunuyoruz.

Murin Pankreasın İntravital Görüntülenmesi için Stabilize Pencere

Kortikal kan akımı dinamikleri 2-foton mikroskobu ile kemirgen kuyruk damar içine enjekte görüntüleme floresan dekstran boyalar in vivo olarak incelenebilir. Bu video görüntü kan akışını dinamikleri ile farelerin bir cam kaplı kafatası pencere hazırlama neokorteks nasıl gösterir.

Kranial Pencere üzerinden neokorteks Kan Akış 2-Foton Görüntüleme Bir Yöntem

Işık mikroskobu nasıl çalıştığına dair bir anlayışa sahip olmalıdır hücre biyoloğu için temel bir araçtır, nasıl farklı uygulamalar için uyumlu olmalı ve maksimum görüntü oluşturan kapasite ve çözünürlük elde etmek için gerektiği şekilde muhafaza edilmelidir. Mikroskop bileşenleri burada ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Işık Mikroskobu Binbaşı Bileşenleri

Lusiferaz ifade Meme tümör hücrelerini farelerde subkütan implant ve uzunlamasına bir çalışmada non-invaziv tümör büyümesini ve gelişimini izlemek için optik görüntüleme ile görüntülendi.

Meme Tümörleri IVIS Spektrum kullanarak in vivo Bioluminescent Görüntüleme

Öğrenin, meme görüntüleme penceresi kullanarak Dendra2 etiketli tümör hücrelerinin intravital photoswitching ve izleme protokolünü. Bu yöntem, fare meme yağ yastığında metastatik davranışları günler boyunca incelemenizi sağlar.

Meme Görüntüleme Penceresi yoluyla Dendra2 Photoswitching

Daha fazla video keşfet