Periferik Sinir Aşılama ve Matrix Modülasyon birleştiren Yaralı Rat Spinal Kord Onarım

Periferik bir sinirin omurilik yaralanması bölgesine greftlenmesi için hazırlık, greftlemeden yedi ila 10 gün önce PNG'nin ön dejenerasyonu ile başlar. Donör sıçandan alınan tibial sinir dalı trasekt edilir. Aspirasyon yoluyla servikal seviye beş veya C beş hemiseksiyonu gerçekleştirilir.

PNG donör sıçandan çıkarılır, lezyon boşluğunun rostral duvarına karşı konumlandırılır ve altın sütürlerle dura matere sabitlenir. Üç hafta sonra, C7 seviyesinde dorsal kuadrant lezyonu oluşturulur; glial skar proteoglikanlarını sindirmek amacıyla C-H-A-B-C ile doyurulmuş jel sünger 15 dakika boyunca boşluğa yerleştirilir. İki gün sonra, lezyon bölgesinin bitişiğine C-H-A-B-C mikroenjeksiyonu yapılır ve PNG'nin distal ucu dorsal kuadrant lezyonuna karşı konumlandırılır.

Merhaba, ben John Hula. Drexel Üniversitesi Tıp Fakültesi Omurilik Yaralanması Araştırma Merkezi'nin direktörüyüm. Ben Hula laboratuvarından Dr. Veronica Tom ve ben de Martha Mean.

Hula laboratuvarından selamlar. Bugün, yetişkin bir sıçanın hasar görmüş omuriliğine periferik sinir segmenti transplantasyonu prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, omurilik yaralanması sonrası akson rejenerasyonunu ve fonksiyonel iyileşmeyi incelemek için kullanıyoruz.

Tamam, başlayalım. Mikroskobik cerrahiye hazırlanmak için cerrahi istasyonu sterilize edin ve tüm cerrahi aletleri otoklavlayın. Termal bariyeri ve mikro hemostaz için iki milimetreküpten küçük jel köpük parçalarını hazırlayın.

Pamuklu çubuklar, gazlı bezler ve cerrahi aletleri hazırlayın. Ayak parmağı sıkıştırma testi ile hayvanın tamamen anestezi altında olduğunu doğruladıktan sonra, anestezi uygulanmış sıçanı hazırlama masasına yerleştirin. Planlanan cerrahi alanın geniş bir bölgesindeki tüyleri tıraşlayın ve cerrahi bölgeyi, beraberindeki metin protokolünde açıklanan aseptik yıkama tekniğini takip ederek yıkayın.

Ardından sıçanı termal bariyer üzerine yerleştirin, burnunu ve ağzını inhalasyon konisiyle kapatın ve izofluranı %3'e, akış hızını ise dakikada 0,2 litreye düşürün. Uygun dozda ampisilin antibiyotiğini deri altı enjeksiyonla ve buprenorfin analjeziğini kas içi enjeksiyonla uygulayın. Periferik sinir veya PN, çıkarılmadan yedi ila 10 gün önce, taze bir sinir preparasyonuna göre aksonal büyüme için daha uygun bir ortam sağlayan dejenerasyonu teşvik etmek amacıylale kese edilmiştir.

pn transekte etmeye başlamak için hayvanı yan yatırın. Steril eldivenlere geçin ve cerrahi bölgenin etrafına steril bir cerrahi örtü yerleştirin. Femur başından dize kadar, femura paralel ve yaklaşık üç milimetre mesafede düz bir çizgi şeklinde insizyon yapın; alttaki vastus lateralis kasını açığa çıkarmak için deri insizyonuyla aynı hat boyunca yüzeysel biceps fems kaslarını kesin.

Vastus lateralis kası açığa çıkarıldıktan sonra, makas kullanarak dizin yakınında küçük bir kesi yapın ve bu kesiyi femur başına doğru yukarıya doğru uzatın. Femura paralel seyreden siyatik sinirin birleşik tibial ve perineal sinir dalları görüntülenene kadar vastus lateralis kasını ekartörlerle nazikçe ayırın. Ardından, siyatik sinirin ana gövdesi tanımlanana kadar bu sinir dallarını femur başına doğru takip edin.

Siyatik sinirin çatallanmasının hemen altından, tibial sinir dalını çevreleyen bağ dokusunu veya epineuryumu ince pensle dikkatlice ayırın. Bu, daha büyük olan daldır. Tibial sinir dalı izole edildikten sonra, etrafına 6-0 ipek bir ligatür geçirin ve sıkın.

Sinir kütüğünü ligatüre kadar kesmek için mikro makas kullanın. Sütür hattını vastus lateralis kasından geçirin ve bir düğümle bağlayın. Bu işlem, tibial sinirin kesilen ucunun kolayca tespit edilebilmesi için bir hat sağlayacaktır.

Sinir hasat edildiğinde. Daha sonra, vastus lateralis kasını 6-0 ipek sütürlerle kapatın. Ardından, biceps femoris kasını 6-0 ipek sütürlerle kapatın.

Son olarak, cildi Michelle yara klipsleriyle kapatın. İzofluran akışını kapatın ve inhalasyon burun konisini çıkarın. Hayvanı, termal bir bariyer üzerindeki tutma kafesine yerleştirin.

Hayvanı kendi kafesine geri koyun. Hayvan uyanık ve aktif hale geldiğinde, yedi ila 10 gün sonra, PN segmenti hasat edilmeye hazır olacaktır. Transplantasyon işlemine başlamak için anestezi altındaki hayvanı termal bariyerin üzerine yerleştirin.

Hayvanın tamamen anestezi altında olduğu onaylandıktan sonra, yara klipslerini çıkarın ve cilt insizyonunu ayırın. Cilt kolayca birbirinden ayrılabileceği ve böylece kontaminasyondan kaçınılabileceği için bölgenin önceden tıraş edilmesi gerekli olmayabilir. Kürk arasından kesme gerekliliğini ortadan kaldırarak, vastus lateralis kaslarını açığa çıkarmak için yüzeysel kasın sütürünü kesin ve bu kasın içindeki sütürü kesin.

Sütür hattını tibial sinirin kesik ucuna kadar takip edin ve sütürü sinirden çıkarın. Tibial sinirin 15 milimetrelik bir uzunluğundan epineuryumu diseke etmek için ince forseps kullanın ve bu distal ucu kesin. Sinir segmentini çıkarın ve steril Hank dengeli tuz çözeltisine daldırın.

Şimdi, PN transplantasyonu için omurilik yaralanması oluşturacağımız bir sonraki adıma hazırız; transplantasyon otolog veya heterolog olabilir. Anestezize edilmiş sıçanı termal bariyer üzerine yerleştirin ve HEMİ seksiyon omurilik yaralanması oluşturmak için önceki bölümde açıklandığı şekilde antibiyotik ve analjezikleri uygulayın. İlk olarak, oksipital çentik ile belirgin T2 dorsal vertebral çıkıntısını tespit edin.

Bu dış işaretçiler arasındaki tüm uzunluk boyunca bir insizyon yapın. Yüzeysel trapezius kasının orta hattı boyunca kesin ve alttaki servikal ardis kaslarını ayırın. Kasları ayrı tutmak için bir ekartör yerleştirin.

Derin supraspinal kaslar C4, C5 ve C6 dorsal vertebrall süreçlerinden kesilmelidir. Rujörler kullanarak, spinal kordun tüm sağ tarafını ve sol tarafının medial kısmını açığa çıkarmak için C5'e kısmi laminektomi uygulayın. Spinal kord orta hattı için belirgin dorsal veni referans noktası olarak kullanın.

Ardından, dura mater'i delmek ve insizyonu C5 spinal kord boyunca genişletmek için bir mikro skalpel bıçağı kullanın. Çekilmiş cam bir mikro kanül ile altındaki subaraknoid ve pia mater'de küçük bir insizyon yapın. Dokuyu ayırmak ve çıkarılmasını kolaylaştırmak için hafif basınç ve mikro forsepsler kullanarak spinal kordun dorsal sağ tarafını aspire etmeye başlayın.

Dorsalden ventrale ve orta hattan lateral meningelere kadar tam bir boşluk oluşturmak için spinal kordun ara ve ventral kısımları boyunca devam ederek iki milimetre uzunluğunda bir kavite oluşturun. HEMI bölgesi lezyon kavitesine salinle ıslatılmış jel sünger yerleştirin. Hemostaz sağlamak için, daha önce toplanan periferik sinir segmentini Hank solüsyonundan çıkarın.

Sinir segmentinin proksimal üç milimetresindeki epi'yi nazikçe hissedin ve bu ucu HEMI kesi lezyon boşluğunun rostral duvarına karşı konumlandırın. Segmenti, epi uum üzerinden dura mater'e 10 oh süturlarla sabitleyin. Ardından, greftin implante edilen ucunun üzerine durayı süturla kapatarak grefti iki parça cel elastik membran arasına sıkıştırın.

Grefti C6, C7 ve T1 vertebral çıkıntıların yanına yerleştirin. Distal sinir ucunu spinal korda veya kas dokusuna temas ettirmeyin. Kasları 4-0 sütürlerle katmanlar halinde kapatın ve cilt insizyonunu yara klipsleriyle kapatın.

Son olarak, hayvanı termal bir bariyer üzerindeki bekleme kafesine yerleştirin ve ardından kendi kafesine geri götürün. Hayvan uyanık ve aktif hale geldiğinde, PN greftinin distal ucuna ulaşan rejeneratif aksonlar genellikle spinal korda geri uzanamazlar. Bu nedenle, yaralanma bölgesini çevreleyen skar dokusunu degrade etmek için kondroitin ACE mikro enjeksiyonları kullanırız.

Bu prosedür, PN transplantasyonundan 21 gün sonra gerçekleştirilir; başlarken hayvanın tamamen anestezi altında olduğundan emin olun. Ardından yara kliplerini çıkarın ve daha önce gösterildiği gibi antibiyotik ve analjezikleri uygulayın. Sinir greftini çevreleyen elastik membranı açığa çıkarmak için ince penset ve yaylı makas kullanarak yüzeysel sütürleri kesin.

Sinirin uzunluğunu elastik membranlardan dikkatlice kurtarın. Siniri cerrahi alandan uzaklaştırın. C7 vertebra çıkıntısının sağ tarafında parsiyel laminektomi gerçekleştirin.

Meninges'i mikro bistüri ucuyla delin ve aspirasyon yoluyla C seven omurilikte bir milimetreküp boyutunda dorsal kadran lezyon boşluğu oluşturun. Hemostazı sağlamak için lezyon boşluğuna salinle ıslatılmış jel sünger yerleştirin. Ardından, jel süngeri kondroitin sülfat ile ıslatılmış olanla değiştirin.

A BC. Lezyon bölgesini 15 dakika boyunca tedavi edin ve her beş dakikada bir taze kondroitin emdirilmiş jel sünger sağlayın. Sinir greftinin dış uzunluğunu scholastik membran ile kapatın. Yüzeyel kasları 4-0 sütürlerle ve cilt insizyonunu yara klipsleriyle kapatın.

Hayvanı termal bir bariyer üzerindeki tutma kafesine yerleştirin ve hayvan uyandığında ve aktif hale geldiğinde kendi kafesine geri koyun. İki gün sonra, PN transplantasyonundan 23 gün sonra, omuriliğe kondroitin NA mikro enjeksiyonu yapmak için hayvana tekrar cerrahi işlem uygulanır. Daha önce olduğu gibi, anestezi altındaki hayvandan yara klipsleri çıkarılır ve antibiyotikler ile analjezikler uygulanır.

Sinir greftini çevreleyen elastik membranı açığa çıkarmak için yüzeysel dikişleri kesin. Grefti rahatsız etmeden C7 greft bölgesini açığa çıkarın. Ardından, çekilmiş bir cam kanül içeren Hamilton şırıngasını kullanarak, omuriliğin sağ tarafına, greftin omuriliğe temas noktasının yaklaşık 1 mm distaline bir mikrolitre kondroitinaz ABC mikroenjekte edin.

EUR'yi sinir segmentinin distal iki milimetresinden nazikçe soyun ve bu ucu C seven lezyon boşluğuna karşı getirin. Segmenti, epineuryum üzerinden dura mater'e 10 oh sütürlerle sabitleyin. Yüzeyel kasları dört oh sütürlerle, cilt insizyonunu ise yara klipsleri ile kapatın.

Hayvanı termal bir bariyer üzerindeki tutma kafesine yerleştirin ve uyandığında ve aktif hale geldiğinde kendi kafesine geri koyun. Bu prosedür optimize edildiğinde, periferik sinir segmenti, grefte doğru rejenerasyon gösteren spinal aksonları görüntülemek için konakçı omuriliği ile yakın bir şekilde entegre olacaktır. Grefti, yükselen ve inen biotinize dekstrin amin (BDA) ile difüzyon yoluyla doldurduk.

Spinal aksonlar genellikle grefte girerek greft uzunluğuna paralel, nispeten düz bir hat üzerinde büyür ve günde yaklaşık bir milimetre hızla greftin distal ucuna kadar uzanır. Periferik sinir aksonları ise komşu omuriliğe nüfuz eder. Çevredeki skar dokusundaki inhibitör proteoglikanları uzaklaştırmak için kondroitin NACE kullanıldığında, distal uca ulaştıktan sonra, taşıyıcı (vehicle) ile işlem görenlere kıyasla, tedavi sonrası çok az sayıda periferik sinir aksonu konak dokuya uzanır.

Bununla birlikte, distal arayüz kondroitin ile tedavi edildiğinde, omuriliği yeniden sinirlandırmak için greftten çok daha fazla akson çıktığı görülmüştür. Aksonal büyümenin gözlemlendiği, hayvan başına 15 ila 20 kesitten seçilen bu temsilî kesitte gösterildiği üzere, bu sütun grafiği conjoin nace A BC tedavisi sonrası aksonal büyümede anlamlı bir artış olduğunu kanıtlamaktadır. Greft içindeki aksonların elektriksel stimülasyonuna yanıt olarak omurilik nöronlarındaki sinaptik belirteçlerin immünokimyasal tespiti, transplant edilen greft ile konakçı omurilik arasındaki fonksiyonel bağlantısallığı değerlendirmek için kullanılabilir.

Distal aplikasyon bölgesini içeren bu omurilik bölgesi, hem yeşil renkte biotinillenmiş dekstrin amin hem de kırmızı renkte sinaptik belirteç sinapsin için immünositokimyasal olarak boyanmıştır; ok başları, belirteçlerin kolokalizasyonunun olduğu alanları göstermekte olup, bu durum greftten yeniden büyüyen bazı liflerin fonksiyonel sinaptik temaslar kurduğunu belirtmektedir. Greft ile omurilik nöronları arasındaki fonksiyonel bağlantı, CFOs ekspresyonu analizi ile de gösterilmiştir. Konak nöronların distal arayüzün ötesinden sinaptik stimülasyonunu takiben, bu trans-sinaptik aktivasyon belirteci, greft bölgesinin ipsilateralindeki dokuda çok sayıda CFOs pozitif nöron ile tanımlanabilir ve daha yüksek büyütmede, greftin kontralateralindeki dokuda çok az sayıda CFOs pozitif nöron gözlemlenebilir.

Spinal kord yaralanması sonrası rejenerasyonu desteklemek amacıyla, periferik sinir grefti transplantasyonuna hazırlık için bir spinal kord yaralanma bölgesinin nasıl hazırlandığını göstermiş olduk. Bu prosedürü gerçekleştirirken, greftleme öncesinde yeterli sinir uzunluğuna sahip olmanın ve greftin spinal kord yaralanma bölgesine yakın bir şekilde yerleştirilmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.