Bir In Vitro Cilt tahriş Testi (SIT) İnsan Epidermal (RHE) Model yeniden inşa

Epiderm, Matt Tech Corporation tarafından geliştirilen, normal insan hücrelerinden türetilmiş, in vitro rekonstrüktif bir insan epidermis modelidir. EC VM onaylı epiderm cilt iritasyon testi protokolü; kozmetik ürünler, ham maddeler ve endüstriyel ajanlar gibi insan cildiyle temas edecek ürünlerin geleneksel hayvan bazlı testlerinin yerini almaktadır. Bu test, cilt iritasyon kiti ve epiderm dokusunun laboratuvara ulaştığı sıfırıncı günde başlar ve ardından gece boyu süren bir inkübasyonun ardından bir assay ortamında ön koşullandırma işlemi uygulanır.

Birinci günde, epiderm dokusunun atipik yüzeyi bir saat boyunca potansiyel bir irritan bileşiğe maruz bırakılır ve ardından ikinci günde bir yıkama adımıyla irritan uzaklaştırılır. 24 saatlik inkübasyonun ardından, kültür inserti taze medyuma yerleştirilir ve eski medyum, salınan sitokinlerin ve kemokinlerin analizi için kullanılabilir. Doku, mitokondriyal redüktaz tarafından koyu mor renge dönüştürülen MTT olarak bilinen bir bileşik ile reaksiyona sokulur.

Hücre canlılığı için bir okuma sağlanır. Örnekte koyu mor rengin olmaması, canlılığın azaldığının bir göstergesidir. Bir test bileşiği için kolorimetrik okuma, negatif kontrollerin %50'sinden düşük olduğunda, test bileşiği iritan olarak sınıflandırılabilir.

Merhaba, ben Matt Corporation'dan Helena Kava. Bugün size, yeniden yapılandırılmış insan deri modeli epiderm kullanılarak yapılan in vitro cilt tahriş testi prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedür, düzenleyici gerekliliklere bağlı olarak, in vivo hızlı cilt tahriş testinin tamamı veya bir kısmı yerine kullanılabilir.

Bu yeni in vitro prosedür, kimyasalların ve ham kozmetik maddelerin tehlike tanımlaması ve etiketlemesi için kullanılabilir. Öyleyse başlayalım. Epiderm, insan epidermisinin üç boyutlu, çok katmanlı ve yüksek derecede farklılaşmış bir modelini oluşturmak için insan epidermal keratinosit kültüründen türetilmiştir.

Dokular mitotik ve metabolik olarak aktiftir; hem yapısal hem de biyokimyasal olarak in vivo karşılıklarını yakından taklit ederler ve bunu insan epidermisi gibi garanti edilmiş bir tekrarlanabilirlikle gerçekleştirirler. Epidermis; organize bazal, spinöz ve granüler tabakalar ile çok tabakalı bir stratum corneum'dan oluşur. Sonuncusu, in vivo'da bulunanlara benzer paternlerde düzenlenmiş hücreler arası lam Miller lipid tabakaları içerir.

Bu dokular serumsuz ortamda kültüre edilir. Her doku, ayrı bir hücre kültürü insertinde büyütülür. 96 kuyucuklu yüksek kapasiteli format dahil olmak üzere diğer konfigürasyonlar da mevcuttur.

Doku üretimi yaklaşık üç hafta sürer; bu sürecin belirli bir noktasında doku, hava-sıvı ara yüzeyine yükseltilir ve dokunun apikal yüzeyindeki tüm sıvı uzaklaştırılır. Dokular, MatTek'in tescilli kültür ortamıyla temas halinde kalan bazolateral yüzey aracılığıyla beslenir. Tipik bir Epiderm kiti, her biri doku kültürü insertinde yer alan dokuz milimetre çapında 24 doku ve bu cilt irritasyon testini gerçekleştirmek için yeterli miktarda analiz ortamı içerir.

24 eklem, standart bir 24 kuyucuklu plakadaki her bir kuyucukta bir doku olacak şekilde, orta infüzyonlu AGA gül jeline sıkıca yerleştirilmiştir; sevkiyat, kimyasal testlere başlamadan önce gece taşıyıcısı ile 3 ila 4 °C sıcaklıkta gerçekleştirilir. EPIDERM test sistemini kullanarak, analizde kullanılan tüm enstrüman ve araçları yazılı protokolde açıklandığı şekilde hazırlayın ve sterilize edin. Pamuklu çubuklar gibi malzemelerin bir kısmı steril paketlerde gelmeli veya otoklavlanmalıdır.

Pens gibi aletlerin sterilizasyonu için %70 etanol, yıkama şişelerinin sterilizasyonu için ise UV veya gama ışınlaması kullanılmalıdır. Analizde kullanılan iki kritik çözelti, önceden hazırlanmış DPBS ve %5 SDS çözeltisidir. 24 epiderm dokusu içeren bir kit ile gerçekleştirilecek analizde, distile su içerisinde yaklaşık iki litre steril pH 7 DPBS kullanılacaktır.

Steril DPBS, hem negatif kontrol hem de yıkama solüsyonu olarak kullanılır. Pozitif kontrol olarak %5 SDS hazırlanmalı ve kullanılmalıdır. Cilt irritasyon testi, EPIDERM EPI 200 SIT kitinin teslim alınmasıyla başlar.

Tüm kit bileşenlerinin bütünlüğünü kontrol ettiğinizden emin olun ve herhangi bir sorun olması durumunda derhal Mat Tech şirketi ile iletişime geçin; her şey tamamsa bir sonraki adıma geçin. Teste başlamak için, kit ile birlikte verilen assay ortamının oda sıcaklığına ulaşmasını bekleyin. Laminar akışlı kabin içerisinde ön ısıtma yapmayın.

Her üç epiderm doku inserti için bir adet steril altılı kuyucuklu plaka hazırlayın ve steril koşullar altında her kuyucuğa 0.9 mililitre analiz ortamı pipetleyin. Epidermal dokuları içeren 24 kuyucuklu plakanın bulunduğu plastik torbayı steril hava akışı altında açın. Steril gazlı bezi kaldırın ve epidermal doku içeren her bir inserti dikkatlice çıkarmak için steril pens kullanın.

İnsertin dış yanlarına yapışmış olan kalan tüm artıkları, steril gazlı bez veya filtre kağıdıyla hafifçe tamponlayarak temizleyin. Ardından, dokuları önümüzdeki beş dakika içinde boş, steril 24 kuyucuklu plakaya yerleştirin. İnsertleri görsel olarak kontrol edin.

Yüzeydeki doku defektlerini ve aşırı nemi kaydedin. Defektli dokuları veya tamamen sıvı ile kaplanmış dokuları kullanmayın.

Optimal doku insertleri. Yüzey kuru olmalı; ayrılmalar, düzensiz kısımlar veya yüzeyde fazla sıvı bulunmamalıdır. Ardından, steril bir pamuklu çubuk kullanarak dokuların yüzeyini dikkatlice kurulayın.

Dokuya doğrudan dokunmamaya çalışın. Yüzeyi kuruttuktan sonra, yüzeydeki nemi uzaklaştırmak için kılcal etkiler yeterlidir. Her altı dokunun üst sırasına üç doku aktarın.

Kuyucuk plakaları 0,9 mililitre analiz ortamı ile önceden doldurulur. İnsetlerin altında kalan hava kabarcıkları serbest bırakılır. Ardından, insetleri içeren altı kuyucuklu plakalar bir saat boyunca inkübatöre yerleştirilir.

37 °C'de ön inkübasyon. İlk ön inkübasyon süresinin sonunda, insertleri altı kuyucuklu plakanın üst kuyucuklarından alt kuyucuklarına aktarın. Plakaları gecelik ön inkübasyon için tekrar inkübatöre yerleştirin.

Kalan analiz ortamını buzdolabına yerleştirin. Gece boyu süren ön inkübasyonun ardından, test kimyasalları epiderm doku insertlerine uygulanabilir. Kimyasal maruziyet analizine başlamadan önce, gerekli tüm cihazları, solüsyonları ve test kimyasallarını oda sıcaklığına getirin.

Steril kabin içerisinde, steril olmayan tüm materyal şişelerini kabine yerleştirmeden önce %70 etanol ile silin. Negatif kontrol steril DPBS, pozitif kontrol, %5 SDS ve distile su da oda sıcaklığında kabine yerleştirilmelidir. Atıklar için büyük bir flakon kenara ayrılmalıdır.

Her bir kimyasal için bir adet altılı kuyucuklu plaka hazırlayarak, yalnızca üst sıradaki her bir kuyucuğa 0,9 ml analiz ortamı doldurun. Her plakayı doku numarası ve kimyasal adı ile etiketleyin.

Planlanan kimyasal maruziyetinden yaklaşık beş dakika önce, ön koşullandırma dokularını içeren altı kuyucuklu plakaları inkübatörden çıkarın. Ardından dokuların yüzeyini görsel olarak değerlendirin.

Steril pamuklu çubuklar kullanarak tüm nemi alın ve doku yüzeyine baskı uygulamayın. Son olarak, altılı kuyucuklu plaka kapaklarını test materyali kodları veya isimleri ile etiketleyin. Tek bir test döngüsünde, negatif ve pozitif kontroller de dahil olmak üzere, her biri üç tekrarlı altıdan fazla kimyasalı test etmeyin.

Bilinen test maddeleriyle çalışırken bir dakikalık kimyasal uygulama ve yıkama aralığı kullanın. Kodlanmış veya bilinmeyen numuneler için malzeme güvenlik bilgi formunda veya MSDS'de verilen talimatları izleyin. Kimyasal güvenlik yönergelerine uyun ve havalandırmalı bir kabin kullanın.

Eldiven takın; gözlerinizi ve yüzünüzü koruyun. Maruziyet sonrası test kimyasallarının durulanmasını kolaylaştırmak için dokuları bir dakikalık zaman aralıklarıyla kimyasallara maruz bırakın; dozlanan dokuların bulunduğu plakaları, son doku dozlanana kadar laminar akışlı kabinde tutun. Prosedür boyunca dokuları ve test bileşiklerini manipüle etmek için ucu ampul şeklinde bir pipet kullanılacaktır. Sıvı kimyasalları test etmek için ampul şeklinde uç oluşturmak amacıyla Bunsen beki alevi kullanılabilir.

Sıvı test maddesinin 30 µL'sini doğrudan dokunun üzerine damlatın ve süreyi ölçmek için zamanlayıcıyı hemen başlatın. Naylon ağı dokunun yüzeyine yerleştirin. Zamanlayıcı bir dakikaya ulaştığında, ikinci sıvı bileşiği ekleyin. Her test kimyasalı için üç doku kullanın ve her bir bileşiği birer dakika aralıklarla eklemeyi unutmayın.

Yarı katıların testi için, 30 µL maddeyi doğrudan dokunun üzerine damlatmak amacıyla pozitif deplasmanlı bir pipet kullanın. Gerektiğinde, kimyasalı doku boyutuna uygun hale getirmek için pastör pipeti ile yayın. Katı maddenin uygulanmasından kısa süre önce, doku yüzeyinin test kimyasalıyla temasını artırmak için yüzeyi 25 µL steril DPBS ile nemlendirin; ardından 25 mg'lık keskin uygulama kaşığını ince öğütülmüş test materyali ile doldurun.

Katı test kimyasalını doku yüzeyine uygulayın. Gerekirse, kaşığı tamamen boşaltmak için pipetinizin ucuna takılmış steril bir lastik pompasını kullanın. Katının yüzeye daha iyi yayılmasını sağlamak için insertleri hafifçe sallayın.

Doku boyutuna uygun hale getirmek için pipetinizin ucuna balon uç da takabilirsiniz. Doku yüzeyine baskı uygulamayın. Son olarak, son doku dozlamasından sonra, negatif kontrol olarak DPBS ve pozitif kontrol olarak %5 SDS'yi doku insertlerine yine üç tekrarlı olarak uygulayın; ardından tüm plakaları 35 ± 1 dakika boyunca nemlendirilmiş 37 °C inkübatöre yerleştirin.

Bu inkübasyon sırasında, yıkama adımları için gerekli tüm malzemeleri çeker ocak içerisine yerleştirdiğinizden emin olun. 35 dakikalık inkübasyonun ardından tüm plakaları inkübatörden çıkarın. Plakaları steril çekere ocağa yerleştirin ve ilk doz doku için 60 dakikalık kimyasal maruziyet süresinin tamamlanmasını bekleyin.

Ardından, yıkama prosedürüne başlayın. Dokuları steril DPBS ile 15 kez durulayın. Herhangi bir kalıntı test materyalini uzaklaştırmak için, doku yüzeyinden 1,5 santimetre uzaklıktan sabit bir DPBS akışı kullanarak doku insertini doldurun ve boşaltın.

DPBS akışının çok zayıf olmadığından emin olun, aksi takdirde test maddesi uzaklaştırılamaz. Dört dokunun naylon ağ ile beş kez yıkanması için bir dakikalık zaman aralığını korumayı ve ağı sivri uçlu pensle dikkatlice çıkarmayı unutmayın. Ardından, 15. yıkamadan sonraki kalan 10 yıkama ile devam edin; yıkama şişesini kullanarak inserti üç kez tamamen daldırın ve 150 milliliters DPBS ile test materyalinin kalıntılarını uzaklaştırmak için çalkalayın.

Son olarak, dokuyu durulayın. Steril DPBS ile bir kez içeriden ve bir kez dışarıdan yıkayın. İnseti hafifçe sallayarak ve steril emici kâğıda bastırarak doku üzerindeki fazla DPBS'yi uzaklaştırın.

Ardından, blotting işlemi yapılmış doku insertlerini, daha önce assay medyumu ile doldurulmuş olan yeni altı kuyucuklu plakaya aktarın. Her bir örnek için 60 dakikalık maruziyet süresini korumak adına, tüm bu adımların bir dakikalık ara ile tamamlanması gerektiğini tekrar hatırlatırız. Son doku durulandıktan sonra, her bir dokunun yüzeyini steril pamuklu bir swab ile dikkatlice kurulayın.

Yüzeyde hala kimyasal kalıntıları mevcutsa, bunları steril pamuklu çubuk kullanarak temizlemeye çalışın. Son olarak, dokuları önümüzdeki 24 saat boyunca inkübatörde inkübe edin. İnkübasyonun başlangıç saatini yöntem dokümantasyon formuna kaydedin.

Ayrıca, yöntem dokümantasyon formuna tüm farklı uygulamaları kaydedin. Plakaların çeker ocakta taşınmasıyla ilgili Mat Tech Corporation tarafından sağlanan standart uygulama prosedürünün ekine ekleyin. İnseti, 0.9 mL besiyeri ile önceden doldurulmuş altı kuyucuklu plağın alt kısmına aktarın.

Üst sıradaki besiyerini toplayın ve önceden etiketlenmiş bir 24 kuyucuklu plakaya aktarın, ardından plakayı -20 °C'ye yerleştirin. Analize kadar, kültür besiyerine salınan sitokinlerin ve/veya kemokinlerin analizi isteğe bağlı bir adımdır. İnkübasyona MTT analizi için 18 ± 3 saat daha devam edin ve iki adet 24 kuyucuklu plağı kimyasal isimleri veya kodlarıyla etiketleyin.

MTT'nin toksik olduğunu unutmayın, bu nedenle işlem sırasında koruyucu eldiven giydiğinizden emin olun. MTT konsantresini çözdürüp MTT dilüenti ile seyrelterek MTT çözeltisini hazırlayın.

MTT ışığa duyarlı olduğu için ışıktan koruyun ve iki ila üç saat içinde kullanın. MTT zamanla degrade olduğu için 24 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna 300 µL MTT medyumu pipetleyin. Şimdi altı kuyucuklu plakaları inkübatörden çıkarın.

İnsertlerin alt kısmını bir emici kağıtla kurulayın ve MTT ile önceden doldurulmuş 24 kuyucuklu plakaya aktarın. 24 kuyucuklu plakayı inkübatöre yerleştirin ve üç saat boyunca inkübe edin. Farklı MTT okumaları almayı önlemek için MDS'ye MTT inkübasyonunun başlangıç saatini kaydetmeyi unutmayın ve üç saatlik inkübasyon süresine kesinlikle uyun. MTT inkübasyonu tamamlandığında, tüm kuyucuklardaki MTT ortamını nazikçe aspire etmek için toksik atık tuzağına sahip bir vakum pompası kullanın.

Kuyucukları DPBS ile tekrar doldurun ve aspire edin. Bu durulama işlemini iki kez daha tekrarlayın ve son aspirasyondan sonra dokuların kuru olduğundan emin olun. Yıkama işlemlerinin ardından insertleri yeni bir 24 kuyucuklu plakaya aktarın; her bir insertin içine nazikçe iki mililitre ekstraksiyon çözeltisi pipetleyerek insertleri daldırın.

Sıvı seviyesi insertin üst kenarlarının üzerine çıkacak ve böylece dokuları her iki taraftan tamamen kaplayacaktır. Ekstrakt kaybını ve buharlaşmayı önlemek için 24 kuyucuklu plakayı bir ısı mühürleyici veya parafilm kullanarak mühürleyin. Ekstraksiyonun başlangıç saatini yöntem dokümantasyon sayfasına kaydedin ve bir plaka çalkalayıcı üzerinde hafif çalkalama ile oda sıcaklığında en az iki saat boyunca ekstraksiyonu gerçekleştirin. Ekstraksiyon süresi tamamlandıktan sonra, insertleri bir enjeksiyon iğnesi veya pipet ucunuzla delerek ekstraktın, insertin alındığı kuyucuğa akmasını sağlayın.

Delinmiş insertleri atın ve kuyucuktaki çözeltiyi homojen hale gelene kadar pipetle üç kez aşağı yukarı çekin. Her bir doku için 120 RPM'ye ayarlanmış bir plakka çalkalayıcı da kullanılabilir. Mavi forma ve çözeltiden iki adet 200 µL'lik alikotu 96 kuyucuklu düz tabanlı bir mikro titer plağına aktarın.

Kopyaları, bu video protokolüne eşlik eden hesap tablosunda boşlar için verilen sabit plaka tasarımına göre aktarın. ISO propanol kullanın, referans filtresi kullanmadan 570 nanometre dalga boyunda 96 kuyucuklu plaka spektrofotometresi ile optik yoğunluğu veya OD'yi okuyun. Sonuçların otomatik hesaplanması için verileri hesap tablosuna girin.

Eşlik eden protokolde belirtildiği üzere, test kimyasal girişimi kaynaklı düzeltmeleri dikkate alın; bir test kimyasalı tahriş edici olarak etiketlenir. Spektrofotometrik analiz sonucunda doku canlılık yüzdesi %50 veya daha düşükse, NC dokularının OD 570 değeri 1'e eşit veya büyük ve 2,5'e eşit veya küçükse; negatif kontrol dokularının yüzdesi olarak ifade edilen PC dokularının ortalama canlılığı %20'den azsa ve özdeş şekilde işleme tabi tutulmuş üç tekrarlayan örneğin bireysel doku canlılık yüzdelerinden hesaplanan SD %18'den azsa; hücre canlılık değerleri %50'den düşük olan bileşikler tahriş edici olarak kabul edilebilir.

Rekonstrükte insan deri modeli Epiderm ile valide edilmiş 60 dakika ve 42 saatlik deri irritasyon testinin nasıl gerçekleştirileceğini size göstermiş olduk. Bu prosedürü uygularken, testin büyük bir kısmının steril veya aseptik koşullar altında gerçekleştirildiğini hatırlamak önemlidir. Herhangi bir yöntem modifikasyonuna ihtiyaç duyarsanız veya prosedür adımlarından herhangi birinin daha detaylı açıklanmasını isterseniz, lütfen yardım ve tavsiye için bizimle iletişime geçmekten çekinmeyin.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkür ederiz, deneylerinizde başarılar dileriz.