Floresan In situ İnsan Sperm hibridizasyon (FISH) Protokolü

İnsan sperm çekirdeklerinde floresan in situ hibridizasyon protokolü, klinik tanı alanına yaygın olarak dahil edilmiştir. Bu metodolojinin uygulamalarından biri, spermatozoon ploidi taramasıdır. İnfertil erkeklere verilen üreme danışmanlığının bir parçası olarak, nümerik anomalilerin varlığı bu bireylerde genel popülasyona göre daha yüksektir ve bu kişilerde sıklıkla anormal seminal parametreler görülür.

Bu durum, söz konusu anomalilerin her türlü yavruya aktarılma riskinin arttığını gösterir. Bugün, 13, 18, 21, X ve Y kromozomlarının analizi için dekondense sperm çekirdeklerinde floresan yerinde hibritleme protokolünü göstereceğiz. Örnek toplandıktan sonra, sıvılaşma gerçekleşene kadar 20 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletilmelidir. Protokole başlamak için örnek bir santrifüj tüpüne aktarılmalıdır.

Deneyin ilk bölümünde kullanacağımız çözeltiler, 37 °C'de ön ısıtmaya tabi tutulmuş hipertonik çözeltiler ile üçe bir oranında metanol asetik asittir. Bunlar taze olarak hazırlanmalıdır. Ardından numune, 1000 ×g'de beş dakika santrifüj edilmeye hazır hale gelir.

Şimdi, süpernatanı nazikçe uzaklaştırın ve yaklaşık 10 mililitre hacme ulaşana kadar hipertonik çözeltiyi damla damla ekleyin. Bu tüp 30 dakika boyunca 37 °C'de bekletilmeli ve ardından örnek tekrar santrifüj edilmelidir. Santrifüj işlemi, spermatozoonların tüpün dibinde toplanmasını sağlayarak hipotonik çözeltiyi metanol ile değiştirmemize olanak tanır.

Beyaz bir pelet elde edilene kadar, metanol asetik asit değişimi için asetik asit santrifüjasyonu gerektiği kadar tekrarlanmalıdır. Bu durum gerçekleştiğinde, daha fazla metanol asetik asit eklenmelidir. Final hacmi, sonraki aşamalarda elde etmek istediğiniz hücresel dağılıma göre ayarlanmalıdır.

Son adım, sabitlenmiş örneği -20 °C'de metanol içinde saklanan Reed lamlarının üzerine damlatarak yaymalar hazırlamaktır. Gelecekteki yer tespitleri için lamın sperm yaymasını içeren bölgesini işaretlemek faydalıdır. Bu işlem, lamın diğer tarafında bir elmas kalem kullanılarak kolayca yapılabilir. Optimal hücresel dağılım doğrulandıktan sonra, lamlar minimum 24 saat boyunca -20 °C'de saklanmalıdır.

Protokole devam etmeden önce. Deneyin bu kısmında, salin sodyum sitrat çözeltisi, etanol serisi, DRE fat ve fide kullanacağız. Lamlar çözündüğünde, tespit edilmiş numuneler, iki kez SSC içeren iki ardışık coplan kavanozuna daldırılarak yıkanmalı ve liyofilize edilmelidir.

Bu işlem her bir coplan için üç dakika sürecektir. Ardından lamlar, artan konsantrasyon sırasına göre etanol coplan kavanozlarının her birinde iki dakika boyunca bekletilmelidir. Bu noktada, sonraki aşamalarla devam edebilmek için lamların kurutulması gerekir.

Sperm çekirdeğindeki DNA'nın yüksek derecede kompakt olması nedeniyle, denatüre etmeden önce kromatinin decondense edilmesi gereklidir. Bu işlem 37 °C'de bir DTT çözeltisi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu ürün, spermatozoa çekirdeğindeki DNA'yı saran protaminin disülfür köprülerini kırarak etki eder. Lamın DTT içindeki inkübasyon süresi, semen örneğinin bu ürüne karşı reaktivitesine göre ayarlanmalıdır.

Bu süre genellikle sekiz dakika civarındadır, ancak bu zamandan sonra iki ile 15 dakika arasında değişebilir; ardından lamlar derhal üç dakika boyunca iki kat SSC'ye ve tekrar üç dakika daha aktarılmalı, bunu her bir etanol coplan kavanozunda ikişer dakika bekleme süreci takip etmelidir. Prob hibridizasyonu için tekli DNA zincirleri ile çalışmak esastır. Bu durum, propların eklenmesinden önce, 73 °C'de formamid çözeltisi içinde beş dakikalık bir inkübasyon süresini içeren bir denatürasyon aşaması gerektirir. Lam işlemini tamamlamak için, lamların her bir coplan kavanozunda birer dakika daldırıldığı son bir etanol çözeltisi transferi gereklidir.

Slaytlar, klinik tanı için gerçekleştirilen FISH çalışmalarında hibridizasyona hazır hale getirilmiş olur. En yaygın olarak analiz edilen kromozomlar arasında seks kromozomları ile 13, 18 ve 21. kromozomlar yer alır. Bu kromozomları analiz etmek için Vysis marka çok renkli bir DNA prob kiti kullanacağız.

Bu paket; kromozomların alfa uydu bölgeleri için sırasıyla yeşil ve aqua ile işaretlenmiş X, Y ve 18 prob kombinasyonunu içeren bir flakon ile 13. ve 21. kromozomlar için sırasıyla yeşil ve turuncu ile işaretlenmiş prob kombinasyonunu içeren başka bir flakon içerir. Eklenecek prob karışımının hacmi, hibritlemesini yapmak istediğiniz alanın boyutuna göre değişiklik gösterecektir; 15 x 15 boyutundaki bir lamel için referans olarak beş mikrolitre hacim yeterlidir.

Her iki prob karışımı, kullanım kolaylığı sağlamak amacıyla bir hibridizasyon tamponunda önceden denatüre edilmiştir; böylece karışımları, kondanse edilmiş ve denatüre edilmiş lamlara doğrudan ekleyebilirsiniz. Ayrıca, bu deneylerde kullanılabilecek geniş bir kromozom ve lokus yelpazesi için mevcut diğer ticari problar da bulunmaktadır. Ancak bu problar genellikle, karışımın hedef örneğe eklenmesinden önce bir ön denatürasyon işlemi gerektirir.

Bu durumlarda, üreticinin talimatlarını takip etmek yeterlidir. Hedeflenen bölge bir kapatma lamı ile örtülmeli ve kauçuk çimentosu ile mühürlenmelidir. Ardından lamlar, 37 °C'ye önceden ısıtılmış hibridizasyon odasına yerleştirilmeye hazır hale gelir ve bu sıcaklıkta altı ila 24 saat boyunca inkübe edilir.

Protokolün son bölümünde, farklı konsantrasyonlarda salin sodyum sitrat çözeltisi ve NP 40 deterjanından oluşan bu iki yıkama çözeltisini kullanacağız. İnkübasyon süresinin ardından, kauçuk çimentoyu temizlemek için lamlar hibridizasyon odasından çıkarılabilir. Ardından lamel dikkatlice çıkarılır.

Gösterildiği gibi, lamlar önceden 73 °C'ye ısıtılmış olan birinci yıkama solüsyonuna iki dakika boyunca daldırılır. Ardından, oda sıcaklığındaki ikinci yıkama solüsyonuna aktarılarak bir dakika daha bekletilirler. Bu iki yıkama işlemi, spesifik olmayan hibridizasyon sinyallerini ortadan kaldırmaya yardımcı olacaktır. Bu iki yıkamanın ardından, protokolün son adımını tamamlamak için lamların kurumasını beklememiz gerekir.

Bu noktada, hücre çekirdeklerinin görselleştirilmesini kolaylaştırmak için bir karşıt boyama ürünü eklenir. Bu amaçla kullanılan en yaygın ürünlerden biri dpi'dır. Eklenen hacim, 18 by 18'lik bir lam referans alınarak, hibridize edilen alanın boyutuna göre ayarlanmalıdır.

Sekiz µL DPI hacmi yeterlidir. Kapak lamı oje ile mühürlenebilir ve böylece preparatlar görüntüleme için hazır hale gelir. Aksi takdirde, analizleri yapılana kadar -20 °C'de saklanabilirler.

Görselleştirme için kullanacağımız mikroskop, dpi, Texas Red ve FITC için üçlü bant filtresi ile aqua, FITC ve Texas Red için tekli bant filtreleri donanımlı bir Olympus BX 60 epi floresan mikroskoptur. Üçlü bant filtresi aracılığıyla, x, Y ve 18 ile hibridize edilmiş preparat, bu üç kromozom için sinyalleri görüntüler. Aqua için tekli bant filtresini kullanarak, yalnızca 18. kromozoma ait floresan sinyalleri görebiliriz. Her normal spermatozoonda bu sinyallerden bir tane görmeyi beklemeliyiz.

Ancak, sadece FITC için tek bantlı filtre kullanıldığında, bazı spermatozoalar X kromozomuna karşılık gelen floresan yeşil bir sinyal gösterir. Yeşil sinyali olmayan spermatozoalar, Texas red filtresi aracılığıyla spesifik olarak görselleştirilebilen Y kromozomu için kırmızı bir sinyal sergilemelidir. Üçlü bantlı filtre üzerinden 1321 hibridizasyonunu görselleştirerek bu iki kromozoma ait sinyalleri ayırt edebiliriz.

Yeşil sinyal kromozom 13'e karşılık gelir ve FITC için tek bantlı filtre kullanılarak özel olarak görselleştirilebilir. Texas Red için tek bantlı filtre, kromozom 21 sinyallerini özel olarak görselleştirmemize olanak tanır. Tüm normal spermatozoalar, bu iki probun her biri için birer sinyal göstermelidir.

Özetlemek gerekirse, protokolün ana aşamaları şunlardır. Yüksek kaliteli uzamalar elde etmek için fiksasyon işlemi, metil asetik asidin damla damla eklenmesiyle titizlikle gerçekleştirilmelidir. Dekondansasyon sürecinde sperm agregatlarının oluşumunu önlemek için, DTT çözeltisindeki inkübasyon süresi, semen örneğinin bu ürüne olan reaktivitesine göre ayarlanmalıdır.

Spermatozoaların DTT'ye aşırı maruz kalması, protokol sonunda dağılmış sinyallere yol açarken; yetersiz maruz kalma, sıfır prob hibridizasyonu ve bazı sinyallerin eksikliği ile sonuçlanacaktır. Sperm örneğinin denatürasyonu zorunlu olduğundan, prob denatürasyonu üreticinin talimatlarına göre uyarlanmalıdır. İki hibridizasyon sonrası yıkamanın süresi ve sıcaklığı üzerinde sıkı kontrol sağlamak önemlidir.

Daha yüksek bir sıcaklık veya aşırı yıkama süresi bazı sinyallerin yok olmasına neden olabilirken, bunun tersi spesifik olmayan sinyalleri ortadan kaldırmayacaktır. Son olarak, iyi bir görselleştirme ve sinyal yorumlaması için uygun spesifik filtrelerle donatılmış bir epi floresan mikroskobun kullanımı gereklidir. Hepsi bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.