Name: Floresan In situ İnsan Sperm hibridizasyon (FISH) Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 19 s
Description: Öğrenin, insan spermatozoa aneuploidi taraması için floresan in situ hibridizasyon protokolünü. Kromozom 13, 18, 21, X ve Y analizi ile infertil erkeklerde üreme sağlığını değerlendirin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, onun teknik yardım için denetlemek ve teşvik edilmesi, ve J. Lucas J. Blanco ve F. Vidal için teşekkür ederiz.

I. Örnek işleme ve hücre sabitleme <ol><li> Semen örneği oda sıcaklığında steril kaplarda sıvılaşma kadar 20 dakika bekletin. </li><li> Örnek bir santrifüj tüpüne aktarın ve 5 dakika 1000g çok spin. </li><li> Pasteur pipeti kullanarak süpernatant yavaşça çıkarın ve atın. </li><li> Hipotonik çözüm (KCl, 0.075M) önceden ısıtılmış 10 ml nihai hacmi elde etmek için bir girdap karıştırma, 37 ° C, damla damla. </li><li> 37 bir su banyosunda tüp Yeri ° C 30 dakika. </li><li> 5 dakika 1000g santrifüjleyin. Dikkatle pelet rahatsız olmadan, decantation süpernatantı atın. </li><li> 8 ml nihai hacmi elde etmek için bir girdap karıştırma sırasında damla damla: pelet resuspending sonra, taze Carnoy sabitleştirici (asetik asit 03:01 metanol) hazırlanan ekleyin. </li><li> Beyaz bir pelet elde etmek için gerekli olduğu birçok kez olarak 6 ve 7 noktaları tekrarlayın. </li><li> Birkaç damla taze hazırlanmış metanol ekle: asetik asit (3:1) (Bu gibi durumlarda küçük bir pelet ile yayılıyor iyi hücre elde etmek için gerekli olan hücresel konsantrasyonu son ses seviyesini ayarlamak için damla damla, yüksek miktarda örnekleri ise yeterli olacak sperm, son hacim) 1-2 ml ulaşabilirsiniz. Bir test slayt ungreased bir slayt üzerine yeniden süspanse örnek bırakarak ve bir faz kontrast mikroskop altında inceleyerek yapılabilir. Bu elde edilen hücresel dağılımı kontrol etmek ve gerekirse daha fazla slaytlar, bunu düzeltmek izin verecek. </li><li> Uzantıları, en az 40 cm yükseklikten düşüş unfrosted slaytlar merkezi haline hücre süspansiyonu iki veya üç damla (daha önce onları yağlanmalıdır, -20 ° C&#39;de metanol saklanır). Protokol boyunca örnek yerini etkinleştirmek için, karşı tarafta bir elmas kalem kullanarak slayt sperm uzantısı içeren alan işaretleyin. </li><li> Slaytlar, en az 24 saat süreyle -20 ° C&#39;de saklayın. Not: metanol ek: asetik asit (3:1) karıştırma, sperm agregaların oluşumunu önlemek için çok önemli bir adım ise damla damla . </li></ol> II. Decondensation <ol><li> Slaytlar -20 saklanan ° C (oda sıcaklığında bekletin) protokol ile devam etmek için çözülmüş olmalıdır. </li><li> Her biri için 3 dakika 2x tuzlu su, sodyum sitrat solüsyonu (2xSSC) ile iki yıl üst üste coplin kavanoz slayt yerleştirin. </li><li> 2 dakika boyunca her coplin kavanoza etanol yıkar bir dizi slayt aktarın. % 70 etanol ile başlayın,% 90 ile takip ve% 100 ile bitiriyoruz. Oda sıcaklığında bırakarak slayt kurulayın. </li><li> Dithiothreitol çözüm slayt (1,4-dithiothreitol 5mM,% 1 Triton X-100, 2-Amino-2-(hidroksimetil) -1,3-propanediol 50mm) inkübe 37 ° C inkübatör kromatin decondense. Bu ürün, spermatozoa çekirdeğinde protamines disülfit köprüleri o bobin DNA kırarak davranır. Sperm çekirdeğinde bulunan DNA yüksek oranda sıkıştırılmış, çünkü bu çok önemli bir adım. Dithiothreitol çözüm slaytları (DTT) inkübasyon süresi, bu ürün için örnek reaktivite göre ayarlanması gerekir. Genellikle 2 ila 15 dakika arasında değişir, ancak bu kez, yaklaşık 8 dakika. </li><li> Hemen her coplin 3 dakika 2xSSC iki ardışık coplin kavanoz slayt aktarın. </li><li> 2 dakika boyunca her coplin kavanoz (% 70,% 90 ve% 100 etanol) etanol yıkar bir dizi slayt koyarak devam edin. Oda sıcaklığında kurumaya slayt olsun. Not: çok kısa maruz kalma, bazı sinyallerin eksikliği neden olur ise DTT aşırı maruz kalma, prosedürün sonunda BALIK sinyalleri dağıtmak neden olacaktır. </li></ol> III. Melezleme <ol><li> 73 formamid çözüm (70% Formamide/2xSSC) ° C de 5 dakika ile bir coplin kavanoza slayt kuluçka sperm DNA denatüre. </li><li> Coplin kavanoz başına 1 dakika (% 85,% 70 etanol ile başlar ve% 100 ile bitirmek) için etanol çözümleri üzerinden slayt aktarın. Slayt, oda sıcaklığında kurumaya bırakın. </li><li> 5 l doğrudan ilgili hazır kullanımı prob karışımı bir 15x15 kapağı kayma (AneuVysion Testi Çok renkli Probe Panel: CEP 18/X/Y veya LSI 13/21). </li><li> Bu videoda gösterildiği gibi, hedef bölge ve prob karışımı bir araya getirmek için kapak kayma üzerine slayt dikkatlice yerleştirin. Kauçuk çimento ile Seal. </li><li> Slayt koyun önceden ısıtılmış 37 ° C hibridizasyon odası (HYBrite ™) ve 6-24 saat süreyle 37 ° C&#39;de inkübe edin. Not: sperm örneği denatürasyon zorunlu olduğunu dikkate alarak, problar denatüre gereği üretici firma tarafından belirlenir. Bu protokolde kullanılan prob karışımları kullanıma hazır olup, bu durumda, prob denatürasyon gerekli değildir. Sondası karışımın hacmi melezleşmiş alanın büyüklüğüne göre değişecektir. </li></ol> IV. Yıkarpost-hibridizasyon <ol><li> Slayt hibridizasyon odasından çıkarın. </li><li> Kauçuk çimento kaldırın ve yavaşça yan sürgülü kapak kayma dikkatlice dışarı çekin. </li><li> NP-40 0.4xSSC/0.3% belirsiz hibridizasyon sinyalleri ortadan kaldırmak için bir coplin kavanoza 2 dakika boyunca slayt önceden ısınmış 73 az ° C su banyosu. </li><li> 1 dakika boyunca oda sıcaklığında bir 2xSSC/0.1% NP-40 yıkama solüsyonu slayt aktarın. Oda sıcaklığında kurumaya slayt olsun. </li><li> Counterstaining ürün, hedef bölge (18x18 kapak kaymayı 8 l) ekleyin. Kullanılan en yaygın ürün 4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Vysis Inc.). </li><li> Bu videoda gösterildiği gibi, bir kapak kayma (tırnak cilası ile mühürlü kapak kayma olabilir hibridizasyon korumak için) melezleşmiş bölgeyi kapsar. </li><li> Melezleşmiş slaytlar onların umudu analizi kadar -20 ° C&#39;de karanlıkta saklayın. Bu koşullar altında, slaytlar floresan sinyal yoğunluğunda önemli bir kayıp olmadan 12 aya kadar saklanabilir. Not: tersi belirsiz prob döllemeler yıkayın olmaz ise, yüksek sıcaklık veya aşırı yıkama süresi, bazı sinyalleri ortadan kaldırılmasına neden olabilir . Eklenen counterstaining ürünün hacmi kapsayacak şekilde hibridizasyon alanının büyüklüğüne göre değişecektir. </li></ol> V. Görselleştirme Hazırlıkları DAPI / Texas Red / FITC ve tek bant Aqua, FITC ve Texas Red için filtreler için tri-band filtresi ile donatılmış bir Epifloresans mikroskop altında değerlendirilebilir. Standart değerlendirme kriterleri sperm çekirdekleri 1 doğru değerlendirilmesi için takip edilmelidir. Bu üç kromozom kromozomlar X, Y ve 18 probları melezleşmiştir hazırlık sinyalleri görüntüleyebilir. Her normal sperm bir mavi sinyal (18 kromozom karşılık), ve yeşil bir sinyal (X taşıyan sperm) veya kırmızı sinyali (Y taşıyan spermatozoa) göstermek gerekir. 13 ve 21, kromozom, kromozom 13 ve 21 kromozom için kırmızı sinyal yeşil bir sinyal sondaları ile melezleşmiştir hazırlanmasında her normal sperm ayırt edilmelidir.

<ol><li>Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+of+chromosome+21+disomy+in+human+spermatozoa+as+determined+by+fluorescent+in-situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization.</a> Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Bu protokol, sperm FISH preparatları elde etmek için insan semen süreci anlatılmaktadır. Bu protokolü kullanmak, erkek gamet kromozom anormallikleri analiz etmek mümkündür. Spermatozoa anöploidi taraması kapsamında temel araştırma ve infertil erkeklere verilen üreme tavsiye veya uygulamalar vardır. Klinik tanısında en yaygın çalışılan kromozomları X, Y, 13, 18 ve 21, kromozomlar ve lokusların geniş bir yelpazede diğer ticari problar mevcuttur ve bu deneylerde de kullanılabilir olmasına rağmen.

<table><tbody><tr><td>1,4-Ditiotreitol (DTT)</td><td>Materyal</td><td>Roche Grubu</td><td>10197777001</td><td></td></tr><tr><td>2-Amino-2-(hidroksimetil)-1,3-propandiyol</td><td>Materyal</td><td>Roche Grubu</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Materyaller</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>100.063</td><td></td></tr><tr><td>AneuVysion&amp;#174; Çok Renkli DNA Prob Kiti&lt;ul style=&quot;dolgu:2px;&quot;&gt;&lt;li&gt;20x Salin-Sodyum Sitrat&lt;/li&gt;&lt;li&gt;4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI II)&lt;/li&gt;&lt;li&gt;CEP 18/X/Y DNA probu&lt;/li&gt;&lt;li&gt;NP-40&lt;/li&gt;&lt;li&gt;LSI 13/21 DNA probu&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td><td>Materyal</td><td>Vysis Inc.</td><td>32-161075 &lt;ul style=&quot;dolgu:2px;&quot;&gt;&lt;li&gt;30-805850&lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-804941 &lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-171077&lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-804820&lt;/li&gt;&lt;li&gt;30-171078&lt;/li&gt;&lt;/ul&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5804R</td><td>Araç</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj tüpü</td><td>Materyal</td><td>Nalge Nunc international</td><td>347856</td><td></td></tr><tr><td>Coplin kavanozu (cam)</td><td>Materyal</td><td>Barloworld Scientific</td><td>Hellendahl (ZCT278)</td><td></td></tr><tr><td>Coplin kabı (plastik)</td><td>Materyal</td><td>Deltalab</td><td>191087</td><td></td></tr><tr><td>Lameller (15x15)</td><td>Materyal</td><td>Knittel Glaser</td><td>4600115</td><td></td></tr><tr><td>Lameller (18x18)</td><td>Materyal</td><td>Knittel Glaser</td><td>4600118</td><td></td></tr><tr><td>Elmas kalem</td><td>Materyal</td><td>Hammacher</td><td>335117010</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Materyal</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>100.983</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Materyal</td><td>Roche Grubu</td><td>11814320001</td><td></td></tr><tr><td>Dondurucu</td><td>Araç</td><td>Zanussi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eldivenler</td><td>Materyal</td><td>Sanyo</td><td>101/3300</td><td></td></tr><tr><td>HYBrite&amp;#8482;</td><td>Araç</td><td>Vysis Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İmmerziyon Yağı</td><td>Materyal</td><td>Olympus Corporation</td><td>35505</td><td></td></tr><tr><td>İnkübatör</td><td>Araç</td><td>Heraeus Cihazları</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Materyaller</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>106.009</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet</td><td>Materyal</td><td>Laboratuvar sistemleri</td><td>Finnpipette (4500000)</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet yedek ucu</td><td>Materyal</td><td>Daslab</td><td>16-2001</td><td></td></tr><tr><td>Tırnak cilası</td><td>Materyaller</td><td>Quo-kozmetikler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX60 epifloresan mikroskobu</td><td>Araç</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td>DAPI/Texas Red/FITC için üç bantlı bir filtre ve Aqua, FITC ile Texas Red için tek bantlı filtrelerle donatılmıştır.</td></tr><tr><td>Pasteur Pipeti</td><td>Materyaller</td><td>Rubilabor</td><td>211.0230</td><td></td></tr><tr><td>Faz kontrast mikroskobu</td><td>Araç</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastik pipet (3 ml)</td><td>Materyal</td><td>Deltalab</td><td>200007</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür (KCl)</td><td>Materyal</td><td>Fluka</td><td>60128</td><td></td></tr><tr><td>Kauçuk çimentosu</td><td>Materyal</td><td>En iyi test</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slaytlar</td><td>Materyal</td><td>Knittel Glaser</td><td>4520022</td><td></td></tr><tr><td>Lam Saklama Kutuları</td><td>Materyaller</td><td>Deltalab</td><td>19276.1</td><td></td></tr><tr><td>Steril kap</td><td>Materyal</td><td>Deltalab</td><td>409726</td><td></td></tr><tr><td>Enjektör</td><td>Materyal</td><td>PentaFerte</td><td>002022300</td><td></td></tr><tr><td>Termometre</td><td>Materyal</td><td>Comark Instruments, Inc</td><td>KM12</td><td></td></tr><tr><td>Üç kez distile edilmiş su</td><td>Materyaller</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Materyaller</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Penset</td><td>Materyaller</td><td>B. Braun Medical</td><td>Aesculap (BD224R)</td><td></td></tr><tr><td>Dikey laminer &lt;Sizden herhangi bir kaynak metin gelmedi. Lütfen çevirmemi istediğiniz İngilizce metni gönderin; JoVE standartlarına uygun, akademik düzeyde ve teknik doğruluğu korunmuş Türkçe çevirisini hemen gerçekleştireyim.&gt;laminer akış kabini&lt;/em&gt;</td><td>Araç</td><td>Burdinola</td><td>OR-ST 1500</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı</td><td>Araç</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB15012</td><td></td></tr><tr><td>Benmari banyosu</td><td>Araç</td><td>Raypa&amp;#174;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

floresan in situ İnsan sperm hibridizasyon (fish) protokolü

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Anöploidiler insanlarda en sık görülen kromozom anomalileri. Bu anormalliklerin çoğu anne gametogenic işlemi sırasında mayotik hataları sonucu. Insan erkek, bu hataları yavrular bu anomaliler bulaştırma riski temsil eden sayısal kromozom anomalileri ile sperm üretimine yol açabilir. Bu nedenle, floresan in situ hibridizasyon (FISH) sperm çekirdekleri tekniği yaygın klinik tanı çerçevesinde kurulmuş bir protokol haline gelmiştir. Bu uygulama, frekansların sayısal kromozom anomalileri, genetik üreme tavsiye için arayan hastaların gamet bir tahmin sağlar. Bugüne kadar, en sık sperm FISH analizi dahil kromozom kromozomlar X, Y, 13, 18 ve 21. Bu video-makale, mikroskop sonuçları nasıl görselleştirmek için decondense ve nasıl elde etmek için sperm FISH preparatları devam etmek sperm kromatin, doğasını, nasıl bir insan semen örneği süreci ve düzeltmek için nasıl adım adım ve açıklar. En iyi sonuçları elde etmek için en uygun adımları özel açıklamalar verilmiştir.

Bu video-makale, semen örneği nasıl işleneceğini, iyi kalite floresan elde etmek için adım adım açıklanmaktadır<em&gt; In situ</em&gt; Insan sperm hibridizasyon. Elde hazırlıklar bağlamında klinik tanı anöploidi tarama için kullanılabilir.

Floresan In situ İnsan Sperm hibridizasyon (FISH) Protokolü

Aneuploidiler, insanlarda en sık görülen kromozomal anomalilerdir. Bu anomalilerin çoğu, gametogenez sırasındaki mayotik hatalardan kaynaklanır...

İnsan sperm çekirdeklerinde floresan in situ hibridizasyon protokolü, klinik tanı alanına yaygın olarak dahil edilmiştir. Bu metodolojinin uygulamalarından biri, spermatozoon ploidi taramasıdır. İnfertil erkeklere verilen üreme danışmanlığının bir parçası olarak, nümerik anomalilerin varlığı bu bireylerde genel popülasyona göre daha yüksektir ve bu kişilerde sıklıkla anormal seminal parametreler görülür.Bu durum, söz konusu anomalilerin her türlü yavruya aktarılma riskinin arttığını gösterir. Bugün, 13, 18, 21, X ve Y kromozomlarının analizi için dekondense sperm çekirdeklerinde floresan yerinde hibritleme protokolünü göstereceğiz. Örnek toplandıktan sonra, sıvılaşma gerçekleşene kadar 20 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletilmelidir. Protokole başlamak için örnek bir santrifüj tüpüne aktarılmalıdır.Deneyin ilk bölümünde kullanacağımız çözeltiler, 37 °C'de ön ısıtmaya tabi tutulmuş hipertonik çözeltiler ile üçe bir oranında metanol asetik asittir. Bunlar taze olarak hazırlanmalıdır. Ardından numune, 1000 ×g'de beş dakika santrifüj edilmeye hazır hale gelir.Şimdi, süpernatanı nazikçe uzaklaştırın ve yaklaşık 10 mililitre hacme ulaşana kadar hipertonik çözeltiyi damla damla ekleyin. Bu tüp 30 dakika boyunca 37 °C'de bekletilmeli ve ardından örnek tekrar santrifüj edilmelidir. Santrifüj işlemi, spermatozoonların tüpün dibinde toplanmasını sağlayarak hipotonik çözeltiyi metanol ile değiştirmemize olanak tanır.Beyaz bir pelet elde edilene kadar, metanol asetik asit değişimi için asetik asit santrifüjasyonu gerektiği kadar tekrarlanmalıdır. Bu durum gerçekleştiğinde, daha fazla metanol asetik asit eklenmelidir. Final hacmi, sonraki aşamalarda elde etmek istediğiniz hücresel dağılıma göre ayarlanmalıdır.Son adım, sabitlenmiş örneği -20 °C'de metanol içinde saklanan Reed lamlarının üzerine damlatarak yaymalar hazırlamaktır. Gelecekteki yer tespitleri için lamın sperm yaymasını içeren bölgesini işaretlemek faydalıdır. Bu işlem, lamın diğer tarafında bir elmas kalem kullanılarak kolayca yapılabilir. Optimal hücresel dağılım doğrulandıktan sonra, lamlar minimum 24 saat boyunca -20 °C'de saklanmalıdır.Protokole devam etmeden önce. Deneyin bu kısmında, salin sodyum sitrat çözeltisi, etanol serisi, DRE fat ve fide kullanacağız. Lamlar çözündüğünde, tespit edilmiş numuneler, iki kez SSC içeren iki ardışık coplan kavanozuna daldırılarak yıkanmalı ve liyofilize edilmelidir.Bu işlem her bir coplan için üç dakika sürecektir. Ardından lamlar, artan konsantrasyon sırasına göre etanol coplan kavanozlarının her birinde iki dakika boyunca bekletilmelidir. Bu noktada, sonraki aşamalarla devam edebilmek için lamların kurutulması gerekir.Sperm çekirdeğindeki DNA'nın yüksek derecede kompakt olması nedeniyle, denatüre etmeden önce kromatinin decondense edilmesi gereklidir. Bu işlem 37 °C'de bir DTT çözeltisi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu ürün, spermatozoa çekirdeğindeki DNA'yı saran protaminin disülfür köprülerini kırarak etki eder. Lamın DTT içindeki inkübasyon süresi, semen örneğinin bu ürüne karşı reaktivitesine göre ayarlanmalıdır.Bu süre genellikle sekiz dakika civarındadır, ancak bu zamandan sonra iki ile 15 dakika arasında değişebilir; ardından lamlar derhal üç dakika boyunca iki kat SSC'ye ve tekrar üç dakika daha aktarılmalı, bunu her bir etanol coplan kavanozunda ikişer dakika bekleme süreci takip etmelidir. Prob hibridizasyonu için tekli DNA zincirleri ile çalışmak esastır. Bu durum, propların eklenmesinden önce, 73 °C'de formamid çözeltisi içinde beş dakikalık bir inkübasyon süresini içeren bir denatürasyon aşaması gerektirir. Lam işlemini tamamlamak için, lamların her bir coplan kavanozunda birer dakika daldırıldığı son bir etanol çözeltisi transferi gereklidir.Slaytlar, klinik tanı için gerçekleştirilen FISH çalışmalarında hibridizasyona hazır hale getirilmiş olur. En yaygın olarak analiz edilen kromozomlar arasında seks kromozomları ile 13, 18 ve 21. kromozomlar yer alır. Bu kromozomları analiz etmek için Vysis marka çok renkli bir DNA prob kiti kullanacağız.Bu paket; kromozomların alfa uydu bölgeleri için sırasıyla yeşil ve aqua ile işaretlenmiş X, Y ve 18 prob kombinasyonunu içeren bir flakon ile 13. ve 21. kromozomlar için sırasıyla yeşil ve turuncu ile işaretlenmiş prob kombinasyonunu içeren başka bir flakon içerir. Eklenecek prob karışımının hacmi, hibritlemesini yapmak istediğiniz alanın boyutuna göre değişiklik gösterecektir; 15 x 15 boyutundaki bir lamel için referans olarak beş mikrolitre hacim yeterlidir.Her iki prob karışımı, kullanım kolaylığı sağlamak amacıyla bir hibridizasyon tamponunda önceden denatüre edilmiştir; böylece karışımları, kondanse edilmiş ve denatüre edilmiş lamlara doğrudan ekleyebilirsiniz. Ayrıca, bu deneylerde kullanılabilecek geniş bir kromozom ve lokus yelpazesi için mevcut diğer ticari problar da bulunmaktadır. Ancak bu problar genellikle, karışımın hedef örneğe eklenmesinden önce bir ön denatürasyon işlemi gerektirir.Bu durumlarda, üreticinin talimatlarını takip etmek yeterlidir. Hedeflenen bölge bir kapatma lamı ile örtülmeli ve kauçuk çimentosu ile mühürlenmelidir. Ardından lamlar, 37 °C'ye önceden ısıtılmış hibridizasyon odasına yerleştirilmeye hazır hale gelir ve bu sıcaklıkta altı ila 24 saat boyunca inkübe edilir.Protokolün son bölümünde, farklı konsantrasyonlarda salin sodyum sitrat çözeltisi ve NP 40 deterjanından oluşan bu iki yıkama çözeltisini kullanacağız. İnkübasyon süresinin ardından, kauçuk çimentoyu temizlemek için lamlar hibridizasyon odasından çıkarılabilir. Ardından lamel dikkatlice çıkarılır.Gösterildiği gibi, lamlar önceden 73 °C'ye ısıtılmış olan birinci yıkama solüsyonuna iki dakika boyunca daldırılır. Ardından, oda sıcaklığındaki ikinci yıkama solüsyonuna aktarılarak bir dakika daha bekletilirler. Bu iki yıkama işlemi, spesifik olmayan hibridizasyon sinyallerini ortadan kaldırmaya yardımcı olacaktır. Bu iki yıkamanın ardından, protokolün son adımını tamamlamak için lamların kurumasını beklememiz gerekir.Bu noktada, hücre çekirdeklerinin görselleştirilmesini kolaylaştırmak için bir karşıt boyama ürünü eklenir. Bu amaçla kullanılan en yaygın ürünlerden biri dpi'dır. Eklenen hacim, 18 by 18'lik bir lam referans alınarak, hibridize edilen alanın boyutuna göre ayarlanmalıdır.Sekiz µL DPI hacmi yeterlidir. Kapak lamı oje ile mühürlenebilir ve böylece preparatlar görüntüleme için hazır hale gelir. Aksi takdirde, analizleri yapılana kadar -20 °C'de saklanabilirler.Görselleştirme için kullanacağımız mikroskop, dpi, Texas Red ve FITC için üçlü bant filtresi ile aqua, FITC ve Texas Red için tekli bant filtreleri donanımlı bir Olympus BX 60 epi floresan mikroskoptur. Üçlü bant filtresi aracılığıyla, x, Y ve 18 ile hibridize edilmiş preparat, bu üç kromozom için sinyalleri görüntüler. Aqua için tekli bant filtresini kullanarak, yalnızca 18. kromozoma ait floresan sinyalleri görebiliriz. Her normal spermatozoonda bu sinyallerden bir tane görmeyi beklemeliyiz.Ancak, sadece FITC için tek bantlı filtre kullanıldığında, bazı spermatozoalar X kromozomuna karşılık gelen floresan yeşil bir sinyal gösterir. Yeşil sinyali olmayan spermatozoalar, Texas red filtresi aracılığıyla spesifik olarak görselleştirilebilen Y kromozomu için kırmızı bir sinyal sergilemelidir. Üçlü bantlı filtre üzerinden 1321 hibridizasyonunu görselleştirerek bu iki kromozoma ait sinyalleri ayırt edebiliriz.Yeşil sinyal kromozom 13'e karşılık gelir ve FITC için tek bantlı filtre kullanılarak özel olarak görselleştirilebilir. Texas Red için tek bantlı filtre, kromozom 21 sinyallerini özel olarak görselleştirmemize olanak tanır. Tüm normal spermatozoalar, bu iki probun her biri için birer sinyal göstermelidir.Özetlemek gerekirse, protokolün ana aşamaları şunlardır. Yüksek kaliteli uzamalar elde etmek için fiksasyon işlemi, metil asetik asidin damla damla eklenmesiyle titizlikle gerçekleştirilmelidir. Dekondansasyon sürecinde sperm agregatlarının oluşumunu önlemek için, DTT çözeltisindeki inkübasyon süresi, semen örneğinin bu ürüne olan reaktivitesine göre ayarlanmalıdır.Spermatozoaların DTT'ye aşırı maruz kalması, protokol sonunda dağılmış sinyallere yol açarken; yetersiz maruz kalma, sıfır prob hibridizasyonu ve bazı sinyallerin eksikliği ile sonuçlanacaktır. Sperm örneğinin denatürasyonu zorunlu olduğundan, prob denatürasyonu üreticinin talimatlarına göre uyarlanmalıdır. İki hibridizasyon sonrası yıkamanın süresi ve sıcaklığı üzerinde sıkı kontrol sağlamak önemlidir.Daha yüksek bir sıcaklık veya aşırı yıkama süresi bazı sinyallerin yok olmasına neden olabilirken, bunun tersi spesifik olmayan sinyalleri ortadan kaldırmayacaktır. Son olarak, iyi bir görselleştirme ve sinyal yorumlaması için uygun spesifik filtrelerle donatılmış bir epi floresan mikroskobun kullanımı gereklidir. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

fluorescence-in-situ-hybridization-fish-protocol-in-human-sperm

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

In situ hibridizasyon Tüm montaj, gelişim biyolojisi en yaygın olarak kullanılan teknikleri biridir. Burada, tek bir genin kesin ifadelerde desen analiz ve iki genin ifadesi etki çakışma belirlenmesi için çift floresan in situ hibridizasyon protokol yüksek çözünürlüklü sunuyoruz. Biz bir doku organizasyon vurgulamak için propidium iyodür nükleer karşı leke içerir.

Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Bu makale, tek hücreli FISH, blastomer çekirdeklerinin yayılmasını teknikleri, in situ hibridizasyon ve klinik bir ortamda pre-implantasyon genetik tanı (PGD) uygulanan sinyal puanlama için uygun probların seçim açıklamaktadır.

Pre-implantasyon Genetik Tanı için FISH

Floresan<em&gt; In situ</emSivrisinekler ve Mitotik Kromozomlar üzerinde&gt; Hibridizasyon

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Burada 3D mikroskopi ve analizler (3D immuno-DNA FISH) izledi DNA FISH immünofloresan ve DNA dizileri tarafından histon modifikasyonları eşzamanlı tespiti için bir protokol açıklar.

3D Nükleer teşkilatında değişiklikler Eğitim için 3D-korunmuş Tane Çekirdekle ilgili Kombine İmmünofloresan ve DNA FISH

Biz doğrudan etiketli floresan problar kullanarak 3D DNA FISH ile nükleer mimarisi analiz için sağlam ve çok yönlü protokol açıklar.

Doğrudan Etiketli Problar kullanarak Sağlam 3D DNA BALIK

Zebra balığı, küçük tropikal balık, omurgalı geliştirme ve hastalık sırasında gen fonksiyonu çalışmak için popüler bir model haline gelmiştir. Hedef genlerin uzaysal ve zamansal ifade ile tespit...

Yüksek Çözünürlüklü Tüm Dağı<em&gt; Yerinde</emGen İfade ve Fonksiyon Eğitim için Zebra balığı Embriyolar içinde&gt; Hibridizasyon

In situ hibridizasyon (FISH) floresan hücre içinde kendi doğal ortamında nükleik asitlerin saptanmasını sağlar. Burada fare embriyonik kök hücreleri X kromozomu inaktivasyon incelemek için kullanılabilir FISH vasıtasıyla RNA ve DNA birleşik, eş zamanlı olarak saptanması için bir protokol açıklar.

Kombine DNA-RNA Floresan<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH) Farklılaştırılmış Kadın Fare Embriyonik Kök Hücreleri X kromozomu inaktivasyonu Eğitim için

Bu protokol, zebra balığı embriyonik kesitlerinin in situ hibridizasyonu ve immünohistokimyasını birleştirerek görüntülerin nasıl elde edileceğini açıklar. Kriyoseksiyondan önce in situ hibridizasyon yapıldı, bunu takiben antikor boyaması yapıldı. Zebra balığında iki genin ekspresyon kalıplarını, antikorların yetersizliği varsa tespit etmek yararlıdır.

In Situ Kriyokesitli Zebra Balığı Embriyolarında İmmünohistokimya ile Kombine Hibridizasyon

Basit anatomileri göz önüne alındığında, Anofel testisleri spermatogenezi incelemek için iyi bir sitolojik model sunar. Bu protokol, bu biyolojik süreci araştırmak için kullanılan bir teknik olan tam montajlı floresan in situ hibridizasyonun yanı sıra sperm üretiminde yer alan genlerde mutasyonları barındıran transgenik suşların fenotipini açıklar.

Anofel Sivrisineklerinde Spermatogenezi İncelemek için Tam Montajlı Floresan In Situ Hibridizasyon

Öğrenin, insan spermatozoa aneuploidi taraması için floresan in situ hibridizasyon protokolünü. Kromozom 13, 18, 21, X ve Y analizi ile infertil erkeklerde üreme sağlığını değerlendirin.

Floresan In situ İnsan Sperm hibridizasyon (FISH) Protokolü

Daha fazla video keşfet