Name: Yüksek Saflaştırılmış Alınması Toxoplasma gondii Süreksiz Sezyum Klorür Gradient ookistleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-03T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Öğrenin, Toxoplasma gondii ookistlerini yüksek saflıkta izole etmek için modifiye edilmiş sezyum klorür gradyan yöntemini. Bu teknik, moleküler biyoloji ve doku kültürü deneyleri için güvenli ve etkili bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Taslağın teknik incelemesi için Nichole Brinkman ve Michael Ware'e; teknik ve idari destekleri için Dr. Abu Sayed ve Linda Ransick'e teşekkür ederiz. Amerika Birleşik Devletleri Çevre Koruma Ajansı, Araştırma ve Geliştirme Ofisi aracılığıyla, Dynamac, Inc. ile yapılan EP-D-06-096 numaralı sözleşme ve USDA ile yapılan DW-12-92289801-0 numaralı kurumlar arası anlaşma kapsamında, burada açıklanan araştırmayı kısmen finanse etmiş ve araştırmaya iş birliği yapmıştır. Çalışma, Ajans incelemesine tabi tutulmuş ve yayınlanmak üzere onaylanmıştır. Ticari markaların veya ticari ürünlerin belirtilmesi, kullanım için onay veya tavsiye teşkil etmez. MJS güncel adresi: Dynamac, Inc. Cincinnati, OH.

1. T. gondii ookistleri ile çalışırken dikkat edilmesi gereken genel güvenlik önlemleri
 <ol>
 <li>T. gondii ookistleri ile çalışırken tüm güvenlik önlemlerine uymak önemlidir. Çoğu sağlıklı bireyde T. gondii enfeksiyonu bağışıklık sistemi tarafından kolayca kontrol altına alınır; ancak bu durum, yaşam boyu süren bir enfeksiyonla sonuçlanır. Bağışıklık sistemi baskılanmış kişiler toksoplazmoza karşı özellikle hassastır ve T. gondii ookistleriyle çalışmamalıdırlar. Enfeksiyon ciddi doğum kusurlarına yol açabileceği için hamile kadınlar da T. gondii ookistleriyle çalışmamalıdır8.</li>
 <li>T. gondii ookistleri yalnızca belirlenmiş bir alanda ve eğitimli personel tarafından işlenmelidir. Belirlenen alana giren diğer kişileri uyarmak için T. gondii ookisti çalışmasının devam ettiğini belirten levhalar asılmalıdır.</li>
 <li>T. gondii ookistlerini işlerken laboratuvar önlüğü, tek kullanımlık önlük, tek kullanımlık eldivenler ve uygun göz koruması veya yüz siperliği gibi uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) kullanın.</li>
 <li>Sık eldiven değişimi önerilir. T. gondii ookisti kontamine olmuş eldivenlerle hiçbir laboratuvar ekipmanına dokunmayın.</li>
 <li>T. gondii ookistleri ile çalışırken her zaman tek kullanımlık emici astarlarla kaplanmış, otoklavlanabilir metal tepsiler kullanın. Kullanılan tüm rafların, tüplerin vb. ya tek kullanımlık ya da otoklavlanabilir olduğundan emin olun.</li>
 <li>Tüm T. gondii atıkları en az bir saat boyunca iki kez otoklavlanmalıdır.</li>
 <li>Tüm tek kullanımlık olmayan ekipmanlar (raflar, tepsiler vb.) da en az bir saat boyunca iki kez otoklavlanmalıdır.</li>
 <li>Sıvıları aspire etmek için kullanılan vakum hatları, vakum pompasının kontaminasyonunu önlemek için bir Vacushield™ filtreye bağlanmalıdır.</li>
 <li>T. gondii ookistleriyle çalışma tamamlandıktan sonra etkilenen tüm laboratuvar tezgahları dezenfekte edilmelidir. Çalışma alanına taze hazırlanmış %10 hipoklorit bolca uygulanmalı ve kurumaya bırakılmalıdır. Ardından alan suyla iyice durulanmalıdır.</li>
 </ol>
2. Tamponların ve çözeltilerin hazırlanması
 <ol>
 <li>752,66 g sükrozu 600 ml ddH2O içinde çözerek 1 L 2,2 M sükroz çözeltisi hazırlayın. Sükrozu çözmek için ısıtmalı bir manyetik karıştırıcı kullanarak hafifçe ısıtın ve karıştırın. Tamamen çözündüğünde, hacmi ddH2O ile 1 L'ye tamamlayın. Ardından çözelti, en az 20 dakika boyunca otoklavlanarak sterilize edilmelidir.</li>
 <li>700 ml ddH2O içine 6,05 g Tris-HCl ve 3,7 g EDTA ekleyerek 1L TE tamponu (50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA), pH 7,2 hazırlayın; pH'ı 7,2'ye ayarlayın ve ardından hacmi ddH2O ile 1 L'ye tamamlayın.</li>
 <li>CsCl gradyanı için, 103,25 ml TE tamponuna 21,75 g CsCl ekleyerek 1,15 özgül ağırlığa sahip bir CsCl stok çözeltisi (1,15-CsCl) hazırlayın. Çözelti A için 30 ml TE'yi 20 ml 1,15-CsCl ile karıştırın. Çözelti B için 20 ml TE'yi 30 ml 1,15-CsCl ve 12,5 μl fenol kırmızısı çözeltisi ile karıştırın. Çözelti C için 10 ml TE'yi 40 ml 1,15-CsCl ile karıştırın (Tablo 1).</li>
 <li>40 g NaOH'ı 800 ml ddH2O içinde çözerek 1L 1 N sodyum hidroksit (NaOH) çözeltisi hazırlayın. Çözündüğünde, hacmi ddH2O ile 1 L'ye tamamlayın.</li>
 <li>20 ml H2SO4'ü 980 ml ddH2O ile karıştırarak 1 L %2'lik (hacimce) H2SO4 çözeltisi hazırlayın.</li>
 </ol>
 3. Sakkaroz flotasyonu
 <ol>
 <li>50 ml'lik konik santrifüj tüpüne, %2 H2SO4 içeren 10 ml T. gondii oosist dışkı süspansiyonu ekleyin. Dışkı süspansiyonu ile daha önce tanımlandığı üzere8 sükroz flotasyon prosedüründen ön işlem görmüş örneklerin kastedildiği belirtilmelidir. Dışkı örnekleri enfekte kedilerden ilk alındığında, referans 8'de açıklandığı gibi sükroz flotasyon işleminden geçirilirler. Bu ek sükroz flotasyonu, CsCl saflaştırma sürecine taşınan dışkı kalıntılarını daha da minimize etmek ve mümkün olan en saf T. gondii oosistlerini elde etmek için gereklidir.</li>
 <li>Dışkı süspansiyonuna 6 ml (3/5 hacim) 1 N NaOH ekleyerek %2 H2SO4 çözeltisini nötralize edin. Vorteksleyerek iyice karıştırın.</li>
 <li>Dışkı süspansiyonuna, nihai konsantrasyonu 1.1 M olacak şekilde eşit hacimde (16 ml) 2.2 M sükroz ekleyin ve vorteksleyerek iyice karıştırın.</li>
 <li>10 ml'lik bir pipet kullanarak sükroz/dışkı süspansiyonunun üzerine dikkatlice 10 ml ddH2O tabakası ekleyin. Süspansiyonu oda sıcaklığında, frenleme yapmadan 1.200 x g'de 20 dakika santrifüjleyin.</li>
 <li>Üstteki su ve ara faz tabakalarını, pipeti çevirmeden hava-su ara yüzeyinden pipetleyerek dikkatlice toplayın ve yeni bir 50 ml'lik konik santrifüj tüpüne aktarın. Ara faz tabakası toplanırken sükroz taşınımını minimize etmek önemlidir.</li>
 <li>Kalan sükroz/dışkı pelet çözeltisini tüpü vorteksleyerek karıştırın.</li>
 <li>3.4 ve 3.5 numaralı adımları tekrarlayın.</li>
 <li>İki oosist ara faz çözeltisinin hacmini ddH2O ile 50 ml'ye tamamlayın ve tüpleri oda sıcaklığında 2.000 x g'de 10 dakika santrifüjleyin.</li>
 <li>Her tüpteki süpernatanı aspire edin, peletleri 5 ml TE tamponu ile yeniden süspanse edin ve oosist süspansiyonlarını birleştirin. Toplam birleştirilmiş hacim 10 ml olmalıdır.</li>
</ol>
4. CsCl gradyanı
<ol>
 <li>50 ml'lik bir polikarbonat Oak Ridge tüpünde, 18 gauge küt uçlu, otoklavlanabilir çelik iğneye sahip 50 ml'lik bir şırınga ve 2 yollu bir stopcock kullanarak her katmanı dikkatlice alt alta ekleyerek süreksiz bir CsCl gradyanı hazırlayın. Not: Gradyan katmanlarını kolayca ayırt edebilmek için Çözelti B'ye fenol kırmızısı eklenmiştir (Tablo 1).</li>
 <li>Aşağıda listelenen sırayla şu çözeltileri tüpe yavaşça ekleyin. Akış hızının 0,5 ml/sn değerini geçmemesi gerektiği unutulmamalıdır.
<ol>
 <li>10 ml TE/ookist süspansiyon örneği</li>
 <li>8 ml Çözelti A</li>
 <li>8 ml Çözelti B</li>
 <li>8 ml Çözelti C</li>
</ol>
</li>
 <li>Oak Ridge tüpünü, fren olmadan, 4 °C'de 60 dk boyunca 12,000 x g'de santrifüjleyin. Sabit açılı rotor kullanımı kabul edilebilirdir, ancak yüksek hızlı salınımlı kova (swinging bucket) rotoru, tüp kenarlarında minimum fekal debris yayılmasıyla ookistlerin süspansiyon örneğinden daha iyi ayrılmasını sağlar. Yayılmanın derecesi fekal süspansiyonun bileşimine bağlıdır ve bu nedenle, fekal süspansiyon aşırı kirliyse iki kez CsCl gradyanı uygulamak gerekebilir.</li>
 <li>Santrifüj işleminin ardından, çözelti A ve B arasındaki opak/beyaz ookist içeren bandı toplayın. Fekal debris kontaminasyonunu en aza indirmek için gradyanı bozmadan doğrudan ookist bandına gidin ve ookist interfazını 10 ml'lik bir pipet kullanarak toplayın. Ookist interfazını yeni bir 50 ml'lik konik santrifüj tüpüne aktarın. Ookist interfazını toplarken aspire edilen CsCl çözeltisi miktarını en aza indirmeye çalışın; çünkü bu miktar, yıkama basamağında ookistlerin çöktürülmesi sırasında sorun yaratabilir.</li>
 <li>Ookistleri 30-40 ml ddH2O ile yıkayın. Tüpü, fren olmadan, oda sıcaklığında 10 dk boyunca 2,000 x g'de santrifüjleyin. Ookist pelletini bozmadan süpernatanı dikkatlice aspire edin. Yıkama işlemini 2 kez daha tekrarlayın.</li>
 <li>Son yıkamanın sonunda süpernatanı dikkatlice aspire edin ve pelletini 10 ml %2 sülfürik asit içinde yeniden süspande ederek kullanıma kadar 4 °C'de saklayın. Ookistler artık ileri manipülasyonlar için hazırdır. Ookist saflığı, örnekteki fekal debris yokluğuyla mikroskobik olarak kontrol edilebilir.</li>
</ol>

<ol><li>Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+viable+Toxoplasma+gondii+in+beef%2C+chicken%2C+and+pork+from+retail+meat+stores+in+the+United+States%3A+risk+assessment+to+consumers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Prevalence of viable Toxoplasma gondii in beef, chicken, and pork from retail meat stores in the United States: risk assessment to consumers.</a> J. Parasitol. 91, 1082-1093 (2005).</li>
<li>Tenter, A. M., Heckeroth, A. R., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+from+animals+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: from animals to humans.</a> Int. J. Parasitol. 30, 1217-1258 (2000).</li>
<li>Bowie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreak+of+toxoplasmosis+associated+with+municipal+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Outbreak of toxoplasmosis associated with municipal drinking water.</a> Lancet. 350, 173-177 (1997).</li>
<li>Moura, L. de <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waterborne+toxoplasmosis%2C+Brazil%2C+from+field+to+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Waterborne toxoplasmosis, Brazil, from field to gene.</a> Emerg. Infect. Dis. 12, 326-329 (2006).</li>
<li>Jones, J. L., Dubey, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Waterborne+toxoplasmosis+-+Recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Waterborne toxoplasmosis - Recent developments.</a> Exp. Parasitol. doi: 10.1016/j.exppara.2009.03.013, (2009).</li>
<li>Dumetre, A., Darde, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+detect+Toxoplasma+gondii+oocysts+in+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">How to detect Toxoplasma gondii oocysts in environmental samples.</a> FEMS Microbiol. Rev. 27, 651-661 (2003).</li>
<li>Dumetre, A., Darde, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Toxoplasma+gondii+oocysts+by+cesium+chloride+gradient%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Purification of Toxoplasma gondii oocysts by cesium chloride gradient.</a> J. Microbiol. Methods. 56, 427-4230 (2004).</li>
<li>Dubey, J. P. Toxoplasmosis of Animals and Man. , 2nd Edition, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL. (2009).</li>
</ol>

yüksek saflaştırılmış alınması toxoplasma gondii süreksiz sezyum klorür gradient ookistleri

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondiiinsanlarda yaygın olarak enfeksiyona neden olan zorunlu bir intrasellüler protozoon patojenidir. Gıda ve su kaynaklı salgınlarla ilişkili iyi karakterize edilmiş bir apikomplekstir. Kesin konak kedigiller olup, cinsel çoğalma burada gerçekleşir ve sonucunda yüksek oranda bulaşıcı ve çevresel olarak dirençli olan oosist gelişir. Enfeksiyon, kontamine etten alınan doku kistlerinin veya toprak ya da sudan alınan oosistlerin sindirilmesi yoluyla meydana gelir. Enfeksiyon genellikle sağlıklı bireylerde asemptomatiktir, ancak bağışıklık sistemi baskılanırsa tekrar aktive olabilen ve toksoplazmik ensefalite ve ölüme neden olabilen ömür boyu süren gizli bir enfeksiyonla sonuçlanır. Toksoplazma gondii kistleriyle kontamine olmuş et,T. gondiikistler Avrupa ve Amerika Birleşik Devletleri'nde enfeksiyonun birincil kaynağı olmuştur, ancak hayvan yönetimi ve yetiştiricilik uygulamalarında yapılan son değişiklikler ile gıda işleme ve hazırlama prosedürlerindeki iyileştirmeler kistlerin yaygınlığını önemli ölçüde azaltmıştırT. gondiietlerdeki kistler1, 2. Yine de, insanlarda seroprevalans nispeten yüksek kalmaktadır ve bu durum, oosit ile kontamine toprak veya sudan maruziyetin olası olduğunu göstermektedir. Gerçekten de, dünya çapında su kaynaklı toksoplazmoz salgınları bildirilmiştir ve bu, çevresel oosit formuna maruz kalmanın önemli bir sağlık riski oluşturduğu teorisini desteklemektedir.3-5. Bugüne kadar, çevredeki T. gondii oositlerinin yaygınlığını anlamaya yönelik araştırmalar, çevrede oositleri tespit etmeye yönelik araçların olmaması nedeniyle sınırlıdır.T. gondiisuda ve çevredeki ookistlerin tespiti ile ilgili çalışmalar, çevredeki ookistleri tespit etmeye yönelik araçların eksikliği nedeniyle sınırlıdır5, 6. Bu, büyük miktarda yüksek saflıkta elde etmek için verimli saflaştırma protokollerinin olmamasından kaynaklanmaktadırT gondiiinfekte kedelerden araştırma amaçlı kullanılacak ookistler. Bu çalışma, kolayca T. gondii ookistlerini saflaştıran değiştirilmiş bir CsCl yöntemini tanımlarT. gondiiinfekte kedilerin dışkısından elde edilen ve moleküler biyolojik ile doku kültürü işlemlerine uygun oositler7.

Bu çalışma, enfekte kedi dışkılarından, moleküler biyolojik ve doku kültürü manipülasyonlarına uygun olan T. gondii ookistlerini kolayca saflaştıran modifiye bir CsCl yönteminin geliştirilmesini tanımlamaktadır

Yüksek Saflaştırılmış Alınması Toxoplasma gondii Süreksiz Sezyum Klorür Gradient ookistleri

Toxoplasma gondii, insanları yaygın olarak enfekte eden zorunlu hücre içi bir protozoon patojendir. ... ile ilişkili, iyi karakterize edilmiş bir apikompleksandır.

Toxoplasma Goia Osis genellikle enfekte kedi dışkılarından elde edilir ve kısmen saflaştırılmış bir süspansiyonla sonuçlanan flotasyon prosedürü kullanılarak izole edilir, ardından moleküler ve doku kültürü uygulanır. Ancak, bu parazit üzerindeki deneyler, bunu başarmak için yüksek derecede saflaştırılmış osis gerektirir. Osisler, osislerin yeniden süspanse edildiği, üzerine su eklenmiş sükroz tabakasının yerleştirildiği ve osisleri dışkı maddelerinin çoğundan ayırmak için santrifüjleme işleminin yapıldığı bir sükroz flotasyon adımı ile daha fazla saflaştırılır.Ardından osis tabakası, altına sezyum klorür yerleştirilmiş yeni bir tüpe aktarılır ve santrifüj edilir. Oluşan belirgin OSIS bandı toplanır ve yıkanarak yüksek derecede saflaştırılmış teon io assist gerektiren deneylerde kullanılmaya hazır hale getirilir. Merhaba, ben Dr. Sarah Staggs; ABD Çevre Koruma Ajansı'na bağlı Ulusal Maruziyet Araştırma Laboratuvarı'nın yüklenicisi olan Dynam şirketinde çalışmaktayım.Bugün size, laboratuvarda enfekte edilmiş kedilerin dışkılarından kesikli sezyum klorür gradyanı kullanarak Toxoplasma gondii oositlerini saflaştırma prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedür, moleküler biyoloji ve doku kültürü deneylerinde kullanılmak üzere oositleri izole etmek için laboratuvarımızda rutin olarak uygulanmaktadır. Öyleyse başlayalım.TG O Osis ile herhangi bir çalışmaya başlamadan önce, önemli güvenlik hususları dikkate alınmalıdır. Bağışıklık sistemi baskılanmış kişiler, hamile olanlar veya aktif olarak hamile kalmaya çalışanlar, hastalığa ve ciddi doğum kusurlarına yol açabilen toksoplazmozis edinme riski nedeniyle patojenle çalışmamalıdır. Enfeksiyon riskini azaltmak için bu işlem için belirlenmiş bir alan ayırın ve diğerleri odaya girmeden önce onları uyarmak için tabelalar asın.T-One IO kistleri ile çalışırken laboratuvar önlüğü, tek kullanımlık önlük, tek kullanımlık eldiven ve uygun göz koruyucu veya yüz siperliği takmayı unutmayın. Eldivenlerinizi sık sık değiştirdiğinizden emin olun ve kontamine olmuş eldivenlerle herhangi bir ekipmana dokunmaktan kaçının. Ayrıca, tek kullanımlık emici astarlarla kaplanmış, metal ve otoklavlanabilir tepsiler üzerinde çalışmak önemlidir.Buna ek olarak, kullanmayı planladığınız tüm rafların, tüplerin ve diğer ekipmanların tek kullanımlık veya otoklavlanabilir olduğundan emin olmak için biraz vakit ayırın. Tek kullanımlık olmayan malzemeler kullanıyorsanız, bunları kullandıktan sonra iki adet bir saatlik döngü ile otoklavladığınızdan emin olun. Ayrıca, vakum pompasının kontamine olmasını önlemek için tüm vakum hatlarını bir vakum koruma filtresine bağlamanız gerekecektir.Kist izolasyonunu tamamladığınızda, çalışma yüzeyine taze %10'luk hipoklorit çözeltisi uygulamanız gerekecektir. Çözeltinin kurumasını bekleyin ve ardından bölgeyi birkaç kez suyla durulayın. Gerekli güvenlik önlemleri alındıktan sonra deneylerinize devam edebilirsiniz.T Guni OYS toplama işleminden önce, sükroz, yüzdürme ve sezyum klorür gradyanı için gerekli tüm çözeltiler hazırlanmalıdır. Santrifüjleme basamakları. İhtiyacınız olacak çözeltiler şunlardır: otoklavda 20 dakikalık bir döngü ile sterilize edilmiş 2,2 molar sükroz çözeltisi, bir litre pH 7,2 TE tamponu, bir normal sodyum hidroksit çözeltisi, %2'lik sülfürik asit çözeltisi ve 1,15 özgül ağırlığa sahip bir sezyum klorür stok çözeltisi.Sezyum klorür gradyanını hazırlamak için kullanılacak olan A, B ve C çözeltilerini oluşturmak amacıyla 1,15 sezyum klorür stok çözeltisi kullanılır. Çözelti A, 30 mililitre TE ile 20 mililitre 1,15 sezyum klorür stok çözeltisinin karıştırılmasıyla hazırlanır; çözelti B, 20 mililitre TE ile 30 mililitre 1,15 sezyum klorür stok çözeltisinin karıştırılması ve ardından 12,5 mikrolitre fenol kırmızısı çözeltisi eklenmesiyle hazırlanır. Son olarak çözelti C, 10 mililitre TE ile 40 mililitre 1,15 sezyum klorür çözeltisinin karıştırılmasıyla hazırlanır.Sükroz floatasyon hazırlığımıza, %2 sülfürik asit içerisindeki 10 mililitrelik T osis dışkı süspansiyonunu alıp 50 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktararak başlayacağız. Dışkı materyali, Dr. JP Duby tarafından yazılan Toxoplasmosis of Animals and Humans başlıklı ders kitabında daha önce açıklanan sükroz floatasyon prosedüründen geçirilmiş enfekte kedilerin dışkılarından elde edilmiştir. Bu ek adım, sezyum klorür saflaştırma sürecindeki dışkı kalıntısı miktarını daha da azaltır ve T goi kistlerinin en yüksek saflıkta elde edilmesine yardımcı olur.Ardından, dışkı süspansiyonuna hacminin beşte üçü kadar bir normal sodyum hidroksit çözeltisi ekleyerek sülfürik asidi nötralize ederiz. Süspansiyonu vorteksle iyice karıştırın. Sonra, eşit hacimde sükroz ekleyin ve süspansiyonu vorteksle iyice karıştırın.Evcil hayvan başına 10 mililitre kullanarak, sükroz dışkı süspansiyonunun üzerine dikkatlice 10 mililitre çift distile su ekleyin. İşlemi dikkatlice tamamladıktan sonra, tüpleri santrifüje yerleştirin ve oda sıcaklığında, santrifüj sonrası bekleme süresi olmadan 20 dakika boyunca 1200 ×g hızında döndürün. Pipeti şişirmemeye dikkat ederek, üstteki su ve ara yüzey tabakalarını toplamak için pipeti hava-su ara yüzeyinden nazikçe çekin.Arayüz tabakasını toplarken, beraberinde taşınan sakroz tabakası miktarını minimize etmeye çalışmak çok önemlidir. Bu tabakaları yeni bir 50 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın. Kalan sakroz fekal pelet çözeltisini karıştırmak için tüpü vorteksleyin.Önceki santrifüj aşamalarındaki su üst katmanlama işlemini bir kez daha tekrarlayın. Döndürme işleminden sonra, üstteki su ve arayüz katmanlarını toplayarak yeni bir tüpe aktarın. İki oh oh kist arayüz çözeltisinin hacmini 50 mililitreye tamamlamak için çift distile su kullanın.Ardından tüpleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 2000 ×g'de santrifüjleyin. Son olarak, her tüpteki S süpernatanını aspire edin. Peletleri beş mililitre tea tamponunda yeniden süspande edin ve osis süspansiyonlarını çekin.Osisler artık sezyum klorür gradyan adımı için hazırdır. İlk olarak, 50 mililitrelik bir polikarbonat Oak Ridge tüpünde süreksiz bir sezyum klorür gradyanı hazırlayarak başlayacağız. 18 gauge küt uçlu otoklavlanabilir çelik iğneye sahip 50 mililitrelik bir şırınga kullanarak, TE ve osis içeren süspansiyondan 10 mililitreyi polikarbonat tüpe ekleyin.Ardından, iki yollu bir stop kok yardımıyla aşağıdaki çözeltileri tüpün tabanına yavaşça ekleyin. 8 ml çözelti A, 8 ml çözelti B ve 8 ml çözelti C. Akış hızının 0,5 ml/s değerini aşmadığından emin olun. Çözelti B'deki fenol kırmızısının, gradyan katmanlarının ayırt edilmesine yardımcı olduğunun belirtilmesi önemlidir.Artık Oak ridge tüpünü, sabit açılı yüksek hızlı bir rotor kullanarak, ara vermeden, 4 °C'de, 12.000 ×g hızında 60 dakika boyunca santrifüj etmeye hazırsınız. Santrifüj işlemi tamamlandığında, A ve B çözeltileri arasındaki opak beyaz bandı topluyoruz. Bu bant oositleri içerir. Gradyanı bozmadan, 10 mL'lik bir pipet yardımıyla doğrudan oosit bandına giderek oositleri toplayın.Kistleri toplarken aspire ettiğiniz sezyum klorür çözeltisi miktarını minimumda tutmaya çalışın; çünkü fazla sezyum klorür, yıkama sırasında kistlerin çöktürülmesini zorlaştırabilir. Sonraki adımda, OSIS'i yeni bir 50 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın. Şimdi O kistlerini 30 ila 40 mililitre çift distile su ile yıkayın ve ardından tüpü oda sıcaklığında, frenleme olmadan, 10 dakika boyunca 2000 ×g hızında santrifüjleyin; O kisti peletini dağıtmamaya dikkat ederek süpernatantı dikkatlice aspire edin.Yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın. Son yıkamalar tamamlandığında, süpernatanı dikkatlice aspire edin ve pelletini 10 mililitre %2 sülfürik asitte yeniden süspande edin. Tüm dışkı kalıntılarının örnekten başarıyla uzaklaştırıldığından emin olmak için OSIS'i mikroskop altında kontrol edin.Oositler artık daha ileri manipülasyonlar için hazırdır veya kullanmaya hazır olana kadar onları dört degrees Celsius sıcaklıkta saklayabilirsiniz. İşte 400 x büyütmede diferansiyel girişim kontrast mikroskobu kullanılarak saflaştırılmamış oositlerin nasıl göründüğüne dair bir bakış. Alan içerisinde çok miktarda fekal kontaminasyonun bulunduğunun ve bunun OSI kistlerini tanımlamayı oldukça zorlaştırdığının farkına varın.Sezyum klorür gradyan saflaştırma protokolünden sonra OISS'nin 400 x altında görünümü buradadır. Fekal döküntülerin yokluğuna dikkat edin. Laboratuvar ortamında enfekte edilmiş kedilerin dışkısından, süreksiz bir sezyum klorür gradyanı kullanarak Toxoplasma gondii oositlerini nasıl saflaştıracağınızı gösterdik.Bu prosedürü gerçekleştirirken, tüm güvenlik kılavuzlarına uymanız ve her bir katmanı çok yavaşça ekleyerek sezyum klorür gradyanını oluştururken gradyanı bozmamaya veya karıştırmamaya dikkat etmeniz önemlidir. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

obtaining-highly-purified-toxoplasma-gondii-oocysts-discontinuous

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

İleri genetik, moleküler düzeyde nasıl aydınlatmak için güçlü bir...

Isolate A Genetik Ekran Toxoplasma gondii Host-hücre çıkış Mutants

Bu protokol, su bazlı tespiti için alternatif adımlar olarak teğet akış boş elyaf ultrafiltrasyon numune konsantrasyonu sisteminin kullanımı ve ısı ayrışma...

Su bazlı Algılamak için Teğet Akış Hollow-fiber Ultrafiltrasyon ve Isı Disosiyasyon Adımlar kullanır A Modifiye EPA Method 1623<em&gt; Cryptosporidium</em&gt; Ve<em&gt; Giardia spp.</em

Bu video, böcek hücresi protein lizatından rekombinant proteini izole etmek için katyon değişim kromatografisi tekniğini göstermektedir.

Katyon Değişim Kromatografisi: Net Yüzey Yüküne Dayalı Olarak Böcek Hücresi Lizatından Hedef Rekombinant Proteini İzole Etme Tekniği

Bu videoda, patojenik parazit Cryptosporidium parvum'un kalın duvarlı ookistlerinden sporozoitleri saflaştırmak için in vitro bir yöntem gösteriyoruz. İzole edilen sporozoitler enfeksiyon çalışmaları için kullanılabilir.

Cryptosporidium parvum Ookistlerinden İn Vitro Sporozoit İzolasyonu

Bu videoda, insan bağırsağı organoid enfeksiyonu modeli geliştirmek için bir mikroenjeksiyon tekniği gösterilmektedir. Parazit Cryptosporidium parvum'un enfeksiyöz sporozoit aşaması organoid lümene mikroenjekte edilir. Organoidin epitel hücrelerini istila ettikten sonra, yaşam döngüsünü tamamlamak için eşeysiz ve eşeyli üreme geçirir ve enfeksiyonu yayar.

Mikroenjeksiyon yoluyla bağırsak organoidlerinde parazit enfeksiyonu geliştirme tekniği

Antikor fonksiyonu Ölçme Plasmodium falciparum sıtma dokunulmazlık anlamanın anahtarıdır. Bu yöntem, uygun bir merozoit saflaştırılmasını ve akış sitometresi ile opsonizasyon bağımlı fagositoz ölçümünü açıklamaktadır.

Yüksek Kapasiteli saflaştırılması<em&gt; Plasmodium falciparum</emOpsonizing Antikor Analizlerde kullanım için&gt; merozoitler

Bu yöntem kan trypanosome ayrılma memeli kan hücreleri daha az negatif olmak onların yüzey şarj bağlı olarak değişir. Enfekte kan yerleştirilir ve bir anyon değiştirici sütun tedavi. Bu yöntem, en uygun teşhis için Afrika tripanozomiyasına, immünolojik, biyolojik, biyokimyasal, ilaç ve moleküler biyoloji İncelemeler için saflaştırılmış parazitler sağlar.

Afrika, anyon-değiştiriciler (Diethylaminoethyl-selüloz sütunlar) tarafından kandan da dahil olmak üzere hücre dışı Tripanozomlar arıtma

Bu yazıda hala, floresan görüntüler ve yüksek çözünürlüklü iletim elektron mikroskop görüntüleri kullanılarak incelenmiştir kripokal hücreler ve amipler bir ortak kültürü hazırlamak için bir protokol ayrıntıları. Burada gösterildiği gibi nicel veriler bu tür niteliksel bilgileri tamamlayabilir.

Kripokus-Amoeba etkileşimlerinde mikroskobik teknikler ve floresans okuma tamamlayıcı kullanımı

Biz cryptosporidium parvum tarafından insan bağırsak ve hava yolu organoidleri enfeksiyonu incelemek için ookistler hazırlamak ve sporozoitler arındırmak için protokoller açıklar. Parazitlerin bağırsak organoid lümenine mikroenjeksiyon ve organoidlerin immünboyamı ile ilgili prosedürleri gösteriyoruz. Son olarak, organoidlerden üretilen ookistlerin izolasyonu tarif.

Mikroenjeksiyon ile 3Boyutlu Doku Kaynaklı İnsan Organoid Kültür Sistemlerinde Cryptosporidium Enfeksiyonunun İncelanması

Burada, Echinococcus granulosus'tan in vitro kültür koşullarını, izolasyonu ve hücre dışı veziküllerin (EV'ler) artan oluşumunu açıklıyoruz. Küçük EV'ler, dinamik ışık saçılımı ve transmisyon elektron mikroskobu ile karakterize edildi. Kemik iliği kaynaklı dendritik hücrelerin tutulumu ve fenotipik modülasyonları, konfokal mikroskopi ve akış sitometrisi kullanılarak incelendi.

Echinococcus granulosus'tan Küçük Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Dendritik Hücre Alımı

Öğrenin, Toxoplasma gondii ookistlerini yüksek saflıkta izole etmek için modifiye edilmiş sezyum klorür gradyan yöntemini. Bu teknik, moleküler biyoloji ve doku kültürü deneyleri için güvenli ve etkili bir protokol sunar.

Yüksek Saflaştırılmış Alınması Toxoplasma gondii Süreksiz Sezyum Klorür Gradient ookistleri

Daha fazla video keşfet