Name: Gen İfadesi Analizi Embriyonik Zebra balığı ve cDNA Sentezi RNA İzolasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-07T16:40:00.000+00:00
Duration: 15 min 21 s
Description: Öğrenin, zebra balığı embriyolarından yüksek kaliteli RNA izolasyonu ve cDNA sentezi yöntemlerini. Bu protokol gen ifadesi analizi için güvenilir bir temel sağlar ve moleküler biyoloji çalışmalarında uzun süreli saklama olanağı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bölüm 1: TRIzol Reaktif kullanarak Total RNA ekstraksiyonu RNA ile çalışırken RNAses serbest olduğu bir ortamda çalışmak çok önemlidir. Sadece RNA prosedürleri ile kullanım için ayrılmış pipetler ve prosedürü başlamadan önce bir dekontaminant reaktif (örneğin, RNAse Uzakta) ile çalışma alanı püskürtme gibi basit önlemler çok yararlı. <ol><li> 1,5 ml mikrofuge&#39;de tüpünde RNA havuzu 50 zebrafish embriyoların yeterli miktarda elde etmek ve bir pipet ile mümkün olduğunca çok su çıkarmak için. </li><li> Hemen TRIzol reaktif 1 250 ul embriyoları içeren mikrofuge&#39;de tüp ekleyin. TRIzol reaktif fenol içerir ve sadece davlumbaz altında kullanılmalıdır. </li><li> Pelet havaneli (yaklaşık 20 vuruş) ile embriyoların doku yeterince bozulur kadar Lyse ve homojenize. </li><li> Hücreleri yeterince homojenize zaman eşit, toplam hacim 1 ml 750 ul TRIzol reaktif ekleyin. </li><li> Nükleoprotein kompleksleri tam ayrılma izni için homojenize edilmiş örnekleri, oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Bu aşamada, örnek flaş sıvı nitrojen içinde dondurulmuş ve -80 ° C ya da protokol devam edilebilir saklanan olabilir. </li><li> 0.2 ml kloroform devam edecek ve 15 saniye karıştırın tüp rock. </li><li> Oda sıcaklığında 2 dakika sonra 15 dakika boyunca 12.000 xg&#39;de santrifüj 4 örnek inkübe ve ° C. </li><li> Karışım daha düşük bir kırmızı fenol-kloroform fazı, interfaz ve renksiz bir üst sulu faz ayırmak. Üst sulu faz RNA içerir. TRIzol (yaklaşık 0,6 ml) ilk hacminin yaklaşık% 60 üst tabaka oluşur. Interfaz tabakanın herhangi bir transfer için değil dikkatli olmak 1 ml pipet kullanarak yeni bir mikrofuge&#39;de tüpe üst sulu tabaka aktarın. </li><li> RNA 0.5 ml izopropanol eklemek çöktürmek için. </li><li> İzin örnek oda sıcaklığında 10 dakika oturup sonra 4 az 10 dakika 12.000 xg&#39;de örnek santrifüj ° C. RNA tüpün altındaki bir jel gibi pelet oluşturacaktır. </li><li> Pelet rahatsız olmadan, bir pipet ile süpernatantı kaldırmak ve 1 ml% 75 etanol pelet yıkayın. 4, 5 dakika boyunca 7.500 xg&#39;de hafifçe çevirerek ve santrifüj örnek karıştırın ° C </li><li> Santrifüj sonra, bir pipet ile etanol kaldırmak ve 10 dakika için ters örnek kurumasını bekleyin. </li><li> 100 ul RNAse ücretsiz su ekleyerek pelletini tekrar ve örnek inkübe 55 ° C&#39;de 10 dakika. Bu RNA rehidrasyon yardımcı olmak üzere kuluçka sırasında sık sık vorteks parmak tavsiye edilir. İsterseniz, örnek nitelik ve nicelik NanoDrop ND-1000 spektrofotometre kullanarak kontrol edebilirsiniz ya da doğrudan bir sonraki adıma geçin. </li></ol> Bölüm 2: Qiagen RNEasy Mini Kit kullanılarak RNA Temizleme Qiagen RNEasy Mini Kit 2, diğer yöntemlerle izole bir RNA örnek kirleticiler ve kirleri giderilmesinde yararlıdır . Bu işlem için, β-merkaptoetanol, etanol ve nükleaz ücretsiz su Set içinde yer alan bileşenlere ek olarak ihtiyaç vardır. Bu işlem sırasında, isteğe bağlı bir DNAz tedavi tavsiye edilir. <ol><li> Kitinin ilk kullanımdan sonra, Tampon RPE Tampon RPE 1 hacim% 100 etanol 4 cilt ekleyerek hazırlıklı olmak gerekir. </li><li> Tampon RLT prosedürü gün taze olarak hazırlanması gerekecektir. Tampon RLT gerekli olacak toplam tutarı hesaplayın. Numune başına 350 ul bir hacim gereklidir. Tampon RLT hazırlamak için, her 1 ml tampon için β-mercaptoethanol 10 ul ekleyin. Bu davlumbaz altında yapılmalıdır. </li><li> Her bir numune için 350 Tampon RLT ul ve% 100 etanol 250 ul ekleyin. Birkaç kez aşağı yukarı pipetleme iyi karıştırın. </li><li> Oda sıcaklığında 1 dakika için 8000 xg&#39;de 2 ml toplama tüpü ve santrifüj yerleştirilen bir RNEasy sütuna, yaklaşık 700 ul örnek aktarın. </li><li> Santrifüj sonra, üzerinden akış atmak ve Tampon RW1 700 ul RNEasy bir spin kolon eklemek. </li><li> Oda sıcaklığında 1 dakika için 8000 xg&#39;de örnek Santrifüj ve sonra akış atmak. </li><li> DNAz Qiagen RNAse-Alerjik DNAz Kiti ile tedavi: DNAz tedavi isteğe bağlıdır ancak son derece yüksek kalitede örnekleri için tavsiye edilir. <ol style="list-style-type:upper-alpha;"><li> DNAz tedavi kiti ilk aldığınızda, DNAz 550 ul nükleaz içermeyen su ekleyerek DNAz I stok solüsyonu hazırlamak için ihtiyacınız olacak. Evirerek yavaşça karıştırın ve vorteks yok. Tek kullanımlık flakon içine 10 ul stok solüsyonu içeren kısım. , 9 aya kadar -20 ° C&#39;de stok solüsyonu saklayabilirsiniz. Çözülmüş alikotları 4 ° C&#39;de 6 hafta için gerekirse saklanabilir, ancak çözülme sonra alikotları dondurursam yok. </li><li> DNAz I inkübasyon karışımı hazırlamak için, 10 ul DNAz I s RDD 70 ul Tampon eklemekörnek başına tak çözüm. Yavaşça tersine çevirerek karıştırın ve santrifüj tüpüne kısaca rezidüel sıvı formda tüp taraf toplamak için. Doğrudan RNEasy spin kolon 80 ul DNAz I inkübasyon karışımı ekleyin. DNAz tedavi oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. </li></ol></li><li> Aşağıdaki DNAz tedavi oda sıcaklığında 1 dakika için 8000 xg&#39;de spin kolon ve santrifüj 350 ul Tampon RW1 ekleyin. </li><li> Santrifüj yoluyla akışı atmak ve spin kolon 500 ul Tampon RPE ekledikten sonra. Örnek oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. </li><li> Santrifüj ve oda sıcaklığında 1 dakika için 8000 xg&#39;de örnek üzerinden akış atın. </li><li> 500 ul% 75 etanol santrifüj sonra spin kolon ekleyin. </li><li> 8.000 xg santrifüj yineleyin, ancak oda sıcaklığında 2 dakika boyunca. </li><li> Santrifüj yoluyla akışı atmak ve sütun 5 dakika kurumasını bekleyin sonra. </li><li> Hemen etanol izleri üzerinde herhangi bir sol kaldırmak için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 8.000 xg&#39;de santrifüj. </li><li> Santrifüj işlemi tamamlandıktan sonra transferi 1,5 ml yeni bir toplama tüpüne spin kolon ve 10 ul nükleaz içermeyen su ekleyin. 1 dakika boyunca inkübe ve sonra oda sıcaklığında 1 dakika 10.000 xg&#39;de santrifüj. RNA yoluyla akışı olacak. </li><li> Spin kolon başka bir 10 ul nükleaz ücretsiz su ekleyin ve 1 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Örnek oda sıcaklığında 1 dakika 10.000 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Santrifüj sonra çıkarın ve spin kolon silmek. RNA yoluyla akışı olacak. </li><li> Üreticinin talimatları izleyerek NanoDrop ND-1000 spektrofotometre kullanılarak RNA miktarını ve kalitesini kontrol edin. </li><li> Buna ek olarak, denatüre jel çalıştırmak veya RNA bütünlüğünü denetlemek için bir Agilent 2100 bioanalyzer kullanın. </li><li> CDNA sentezi yapılabilir Örnekleri -80 ° C ye kadar saklanabilir. </li></ol> Bölüm 3: İlk Strand Invitrogen Üst Simge Sistemi kullanılarak cDNA Sentezi RNA kolayca bozulmasına neden RNAses tarafından bölünme eğilimli. Bunun sonucunda birçok gen ekspresyonu protokolleri doğrudan RNA sentezlenir olmuştur daha istikrarlı cDNA bir ürünü kullanmak için geliştirilmiştir. Invitrogen Üst Simge İlk Strand Sentez Sistemi 3 kullanarak ilk iplikçik cDNA burada ayrıntılarıyla sentezi. Her cDNA sentezi reaksiyonu, RNA&#39;nın 5 mg kadar hizmet verebilir. <ol><li> Prosedürü karışımı başlamadan önce ve her bir bileşenin kısaca santrifüj. </li><li> Tablo 1&#39;de belirtildiği gibi 0,5 ml steril bir mikrofuge&#39;de tüp RNA / astar karışım hazırlayın. </li><li> Örnek 65 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edin. </li><li> Hemen 10 dakika boyunca buz bulamaç örnek aktarın. </li><li> Örnek Tablo 2&#39;de belirtilen bileşenleri ile bir ana karışımı hazırlamak soğutma iken. Miktarlar 1 reaksiyon başına listelenmiştir. Buna göre reaksiyon toplam sayısı için hacimleri ayarlayın. </li><li> Soğuduktan sonra, 9 ul 5. adımda her RNA / astar karışımı hazırlanan master karışımı ekleyin. Yavaşça karıştırın ve kısa süreli santrifüj toplamak. Her numunenin toplam hacmi 19 ul olmalıdır. </li><li> Örnek bir termalcycler 2 dakika 42 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 1 ul Üst Simge II RT (50 adet), her tüp karışımı, 42 inkübe ° C de 60 dakika bir termalcycler. </li><li> 70 reaksiyon sonlandırın sonra ° C ve 15 dakika boyunca 4 ° C&#39;ye kadar chill örnek PCR 8 ve 9 adımları için programlanmış olabilir. </li><li> Örnek 4 ° C ulaştıktan sonra, bir buz banyosunda reaksiyon aktarın. </li><li> Buz üzerinde her tüpe 1 RNAse H ul eklemek ve 37 az 20 dakika boyunca inkübe ° C Toplam hacmi 21 ul. RNAse H örnek eklenmesi RNA aşağılamak ve sadece tek iplikçik cDNA ürün bırakacaktır. </li></ol> Bölüm 4: cDNA İzolasyon ve Yağış <ol><li> 1,5 ml faz kilidi jel tüpü cDNA ürün izolasyonu kullanılır. 2 dakika boyunca 12.000 xg&#39;de santrifüj 1,5 ml faz kilidi jel tüpü hazırlayın. Jel tüpün alt kısmında olmalıdır. </li><li> (21 ul), (Tris-doymuş pH 8.0 tamponlu) 81.5 ul fenol 24:1 kloroform izoamil alkol 81.5 ul ve örnek faz kilidi jel tüpü içine ekleyin. Birkaç kez yavaşça tersine çevirerek karıştırın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 12.000 xg&#39;de örnek santrifüjleyin. </li><li> CDNA üst sulu faz olmalıdır. Üst faz temiz bir 1.5 ml mikrofuge&#39;de tüp içine aktarın. Toplam hacmi 20 ul civarında olmalıdır. </li><li> 3 M NaOAc, pH 5.2 1X hacmi ekleyin ve hafifçe karıştırın. Örneğin üst sulu faz hacminin 20 ul eşit ise, 3 M NaOAc, pH 5.2 2 ul eklemek gerekecektir. </li><li> 5 mg / ml glikojen 7 ul ekleyin ve hafifçe karıştırın. </li><li> 1X hacim izopropanol ekleyin ve hafifçe karıştırın. Genellikle bu yaklaşık 30 ul izopropanol. </li><li> Örnek oda ısısı inkübe izin versonra 10 dakika boyunca e ve oda sıcaklığında 20 dakika 12.000 xg&#39;de santrifüj. </li><li> Tüpün alt kısmında küçük bir cDNA pelet oluşturmalıdır. Süpernatantı bir pipet yardımıyla dikkatlice çıkarın. </li><li> % 70 etanol ve tersine çevirerek karıştırın 500 ul ekleyin. </li><li> Örnek 5 dakika 12.000 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Santrifüj bir pipet ile süpernatantı kaldırmak ve% 70 etanol yıkama ve santrifüj (10 ve 11. adımları) tekrarlayın sonra. </li><li> Santrifüj sonra bir pipetle süpernatant çıkarın. Tüp tarafta kalan sıvı varsa, kısaca tüp iplik elde edilebilir. Herhangi bir aşırı sıvı çıkarın ve pelet 5 dakika boyunca oda sıcaklığında kurumaya bırakın. </li><li> Pelet rehidrate 20 ul nükleaz içermeyen su ekleyin. Pelet rehidrasyon için 5 dakika süreyle 55 ° C&#39;de örnek yerleştirin. </li><li> CDNA ürün miktarı ve kalitesi daha sonra üreticinin talimatlarına aşağıdaki NanoDrop ND-1000 spektrofotometre kullanılarak kontrol edilir. CDNA -20 ° C&#39;de saklanabilir </li></ol> Temsilcisi Sonuçlar RNA temizleme sonra, yüksek kalitede toplam RNA yaklaşık 15 mikrogram 50 zebrafish embriyolardan beklenebilir. Toplam RNA kalite, spektrofotometre, jel elektroforezi, ve bir Agilent 2100 Bioanalyzer değerlendirmek için kullanılabilir. NanoDrop ND-1000 spektrofotometre, 260 nm&#39;de absorbans 280 nm (Şekil 1) absorbans karşılaştırma değerlendirmek için kullanılabilir. A 260 / A 280 oranı bulaşanların varlığının ortaya çıkarmak ve olası bir bozulma kanıt verebilir. Bir A 260 / A 280 oranı 1,9-2,0 arasında kabul edilir. Buna ek olarak, yüksek bir RNA denatürasyon jel RNA bütünlüğünü değerlendirmek için çalışılması tavsiye edilir. RNA ipliklerini jel küçük iplikçikler daha aşağı göç eden, onların büyüklük bazında ayrı olacaktır. Uğramamış bir örnek, iki güçlü bantları ile bir karalama olarak görünecektir. Smear, farklı büyüklükte mRNA ipliklerini bir nüfusun bir sonucudur ve bantları 28S ve 18S rRNA karşılık. 28S grup 18S bantlı (Şekil 2) olarak yaklaşık iki kat daha yoğun olmalıdır. Alternatif olarak, toplam RNA bütünlüğünü Agilent 2100 bioanalyzer kullanarak tespit edilebilir. 28S ve 18S rRNA temsil eden iki ayrı doruklarına beklenmektedir (Şekil 3). 28S tepe doruklarına altında kalan alan ile tepe 18S yaklaşık 02:01, sırasıyla daha büyük olmalıdır. İki farklı zirveleri bozulmuş örneklerde gözlenen olmayacaktır. RNA örnekleri sergileyerek bozulması sonraki deneysel prosedürleri ile yapılmamalıdır. Spektrofotometrik analiz (Şekil 4) cDNA ürün kalitesini değerlendirmek için kullanılabilir. A 260 / A 280 1.8 civarında olmalıdır. toplam RNA&#39;nın 5 mikrogram bir giriş ile cDNA reaksiyonlar laboratuvarda rutin olarak 1-2 mg cDNA ürün verir. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. RNA örnek NanoDrop spektrumu. RNA temizleme sonra, RNA miktarı ve kalitesi NanoDrop ND-1000 spektrofotometre kullanılarak değerlendirilmiştir olabilir. Yüksek kalite toplam RNA yaklaşık 15 mikrogram rutin 1,9-2,0 civarında bir A 260 / A 280 oranı ile 50 zebrafish embriyolar vermiştir. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2. Bir RNA denatürasyon jel toplam RNA izolasyonu bütünlüğünü değerlendirmek için, bir RNA denatürasyon jel koştu olabilir. 28S ve 18S rRNA karşılık gelen iki parlak bantlar ile smear bekleniyor. 28S grup 18S bantlı olarak yoğun olarak yaklaşık iki katı olmalıdır. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3. Toplam RNA izolasyonu bütünlüğünü değerlendirmek bir bioanalyzer. RNA örnek bir iz, örnekleri de bir Agilent 2100 bioanalyzer analiz olabilir. 28S ve 18S rRNA karşılık gelen iki sivri tepeler, görünür olmalıdır. 28S tepe doruklarına altında kalan alan ile tepe 18S yaklaşık 02:01, sırasıyla daha büyük olmalıdır. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4. CDNA bir örnek NanoDrop spektrumlu bir NanoDrop ND-1000 ile Spektrofotometrik analiz cDNA ürünün miktarı ve kalitesini değerlendirmek için kullanılabilir. A 260 / A 280 oranı 1.8 civarında olmalıdır. toplam RNA 5 ug bir giriş ile cDNA reaksiyonlar rutin laboratuvarda cDNA 1-2 ug verim. Tablo 1 Bileşenleri, cDNA sentezi 2. adım, RNA / astar karışımları için eklemek için. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Hacim </td></tr><tr><td> Toplam RNA (5 mg) </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP karışımı </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Oligo (dT) 12-18 (0.5 mg / ml) </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> DEPC-arıtılmış su </td><td> n ul </td></tr><tr><td> Toplam hacim </td><td> 10 ul </td></tr></tbody></table> Tablo 2. cDNA sentezi 5. adım Reaksiyon karışımı. Listelenen Hacimler tepki başına. Reaksiyon toplam sayısı için her bileşen hacimleri artırın. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Hacim </td></tr><tr><td> 10X RT Tampon </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> 25 mM MgCl2 </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> 0.1 mM DTT </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> RNAseOUT </td><td> 1 ul </td></tr></tbody></table>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22TRIzol+Reagent+Manual%22">TRIzol Reagent Manual</a>. , (2007).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22RNEasy+Mini+Handbook%22">RNEasy Mini Handbook</a>. , 4th ed, (2006).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22SuperScript+First-Strand+Synthesis+System+for+RT-PCR%22">SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR</a>. , Version E. (2003).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

RNA molekülü kırılganlık bu protokolü boyunca hatırlanması gereken gereken en önemli husustur. RNAse-ücretsiz steril laboratuvar RNAse serbest bölge her zaman kullanılmalıdır. Sadece RNA işlemleri için kullanılacak laboratuvar bir bölümünü ayırmak için yararlı olur. Bu alan, sık sık Away gibi RNAse RNAse kaldırarak ürün, püskürtülmüş olmalıdır. RNA örnekleri her zaman eldiven ile ele almış ve bozulmasını önlemek için buz üzerinde tutulmalıdır olmalıdır. Bu protokol, piyasada bulunan reaktifl...

<table><tbody><tr><td>Glikojen (5 mg/ml)</td><td>Ambion</td><td>9510</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-100</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj Tüplü Ezici Pestleler</td><td>VWR international</td><td>KT749520-0090</td><td></td></tr><tr><td>Phase Lock Gel Light, 1.5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>2302800</td><td></td></tr><tr><td>Fenol, Tris-doymuş</td><td>Roche Group</td><td>3117944001</td><td></td></tr><tr><td>RNAse Away</td><td>VWR international</td><td>17810-491</td><td></td></tr><tr><td>RNAz-Free DNaz Seti</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>RNEasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>RT-PCR için SuperScript&amp;#174; Birinci Zincir Sentez Sistemi</td><td>Invitrogen</td><td>11904-018</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr></tbody></table>

gen İfadesi analizi embriyonik zebra balığı ve cdna sentezi rna İzolasyon

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Birçok önemli ve karmaşık laboratuvar işlemleri, yüksek kaliteli, sağlam RNA bir giriş gerektirir. Bozulmuş bir örnek veya yabancı maddelerin varlığı downstream deneysel uygulamalar felaket sonuçlarına yol açabilir. , Bu nedenle üstün bir örnek sağlamak için çok sayıda güvence ve kalite kontrol katı tekniklerini kullanmak için büyük önem taşımaktadır. Burada, biz detay izleri ticari bir RNA izolasyon kiti kullanılarak DNA ve kirleri çıkarmak için, piyasada yaygın olarak bulunan kimyasal denaturant ve daha sonraki temizleme kullanarak tüm zebrafish embriyolar toplam RNA izole etmek için bir protokol. RNA nispeten istikrarsız ve RNAses tarafından bölünme kolayca eğilimli olduğu gibi, çoğu protokolleri tahlil gen ekspresyon doğrudan bir RNA sentezlenir bir cDNA ürün. Biz, ayrıntılı bir prosedür RNA ticari kiti kullanılarak, daha istikrarlı bir cDNA ürün haline dönüştürmek için. Bu işlemler boyunca örnek bozulmuş veya kontamine olmadığından emin olmak için birçok kalite kontrol vardır. Mikroarray analizi, RT-PCR veya uzun süreli depolama için uygun olup olmadığını bu protokollerin son ürün cDNA.

Yüksek kalitede izolasyonu, RNA bozulmamış birçok laboratuar protokolleri önemli bir adımdır. Burada, bütün zebrafish embriyolar ve gen ekspresyon mikrodizi analizi de dahil olmak üzere çeşitli deneysel prosedürleri müteakip uygulama için cDNA sentezi RNA ekstraksiyon göstermektedir.

Gen İfadesi Analizi Embriyonik Zebra balığı ve cDNA Sentezi RNA İzolasyon

Birçok önemli ve karmaşık laboratuvar prosedürü, girdi olarak yüksek kaliteli ve bozulmamış RNA gerektirir. Degrade olmuş bir örnek veya safsızlıkların varlığı şuna yol açabilir...

RNA izolasyonuna başlamak ve yeterli verim elde etmek için 50 zebrafish embriyosu mikro füzyonlu bir havan tüpüne alınır. RNA, önce tamamen homojenize edildikten sonra triol reajenti ve kloroform kullanılarak ekstrakte edilir. Daha sonra, gelecekteki uygulamalar ve uzun süreli saklama için yüksek kaliteli, degrade olmamış total RNA elde etmek amacıyla Qiagen RNEZ minikiti kullanılarak temizlenir ve saflaştırılır.RNA, daha kararlı olan cDNA ürününe sentezlenir. Orijinal RNA kalıp zincirini uzaklaştırmak için cDNA saflaştırılır. Merhaba, ben Purdue Üniversitesi Sağlık Bilimleri Bölümü'nde Dr. Jennifer Freeman'ın laboratuvarından Sam Peterson.Bugün sizlere, bütün zebrafish embriyolarından nasıl yüksek kaliteli RNA izole edileceğini ve bunun nasıl cDNA ürününe dönüştürüleceğini göstereceğiz. Tipik olarak bu prosedürü, gen ekspresyon profillerini incelemek için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.RNA ile çalışırken, RNA'lardan arındırılmış bir ortamda çalışmak çok önemlidir. Yalnızca RNA prosedürleri için ayrılmış pipet uçları kullanmak ve toplam RNA ekstraksiyonuna başlamadan önce çalışma alanını RNase uzaklaştırıcı ile püskürtmek gibi basit önlemler alın. Ekstraksiyon işlemine çeker ocakta başlayın ve 1,5 mililitrelik bir mikrofüj mortar tüpüne 50 zebra balığı embriyosu alın. Suyu mümkün olduğunca uzaklaştırın ve hemen fenol içeren 250 mikrolitre triol reaktif ekleyin.Dokular yeterince parçalanana kadar, embriyoları bir pellet havan eli kullanarak yaklaşık 20 vuruşla ezin ve homogenize edin. Ardından, nükleer protein komplekslerinin tamamen ayrışmasını sağlamak için 750 µL triazol reaktifi ekleyin ve oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Beş dakika sonunda, 0.2 mL kloroform ekleyip tüpü 15 saniye boyunca sallayarak karıştırın ve örneği oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin, ardından 4 °C'de 15 dakika boyunca 12,000 G'de santrifüjleyin.Karışım; altta kırmızı fenol kloroform fazı, bir ara faz ve üstte renksiz bir sulu faz olmak üzere ayrılacaktır. Üst katman yaklaşık 0,6 milimetredir ve RNA'yı içerir; yaklaşık 0,6 milimetrelik tüm üst sulu katmanı yeni bir mikro FÜZE tüpüne aktarın. Ara faz katmanından herhangi bir parçayı aktarmamaya dikkat ederek, RNA'yı çöktürmek için 0,5 mililitre isopropanol karışımı ekleyin.Ardından oda sıcaklığında 10 dakika bekletin, sonra örneği 4 °C'de 12.000 G'de 10 dakika santrifüjleyin. RNA, jel benzeri bir pelet oluşturmalıdır. Peleti bozmadan süpernatanı uzaklaştırın ve 1 mL %75 etanol ekleyip nazikçe ters çevirerek karıştırıp yıkama yapın; ardından 4 °C'de 7.500 G'de beş dakika santrifüjleyin.Santrifüjden sonra etanolü uzaklaştırın ve kurutmak için tüpü 10 dakika boyunca ters çevirin. 100 µL RNase'siz su ekleyerek ve 55 °C'de 10 dakika inkube ederek pelletini yeniden süspande edin. RNA rehidrasyonuna yardımcı olmak için sık sık parmak vortekslemesi yapın.RNA embriyolardan ekstrakte edildikten sonra, RNA temizleme ve D a tedavisine geçiniz. RNA'yı temizlemek için Rogen RN easy mini kit ile başlayınız. İlk kullanımda, çeker ocak içerisinde çalışarak bir birim RPE tamponuna dört birim %100 ethanol ekleyiniz.Her 1 mililitre buffer RLT için 10 mikrolitre beta merkaptoetanol ekleyin. Ardından, örneğe 350 mikrolitre buffer RLT ve 250 mikrolitre %100 etanol ekleyip pipetle birkaç kez yukarı aşağı karıştırın ve örneğin tamamını, iki mililitrelik bir toplama tüpüne yerleştirilmiş bir R and easy kolonuna aktarın. Oda sıcaklığında, 8.000 G'de bir dakika boyunca santrifüjleyin; santrifüjleme işleminden sonra süzüntüyü atın ve spin kolonuna 700 mikrolitre buffer RW 1 ekleyin.Numunedeki DA'yı uzaklaştırmak için tekrar 8,000 G'de bir dakika santrifüjleyin ve akış kısmını atın. Ardından, RNA'dan arındırılmış DNA kiti kullanarak DNA işlemini gerçekleştirin. Kiti aldıktan sonra, DNA'lara 550 µL nükleaz içermeyen su ekleyin ve stok çözeltiyi 10 µL'lik alikotlara bölerek saklamak için ters çevirerek nazikçe karıştırın ve -20 °C'de dondurun.Hafifçe ters çevirerek karıştırılmış 10 µL DNA stok çözeltisine 70 µL RDD tamponu ekleyin, kısa süreli santrifüjleyin ve doğrudan R ve easy spin kolon A'ya ekleyin. DNA işlemini oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, spin kolona 350 µL RW1 tamponu ekleyin, oda sıcaklığında 8.000 G'de bir dakika boyunca santrifüjleyin, akış sıvısını atın ve spin kolona 500 µL RPE tamponu ekleyin. Numuneyi oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin.Oda sıcaklığında 8.000 G'de bir dakika boyunca tekrar santrifüjleyin, akış sıvısını atın ve spin kolona 500 µL %75 etanol ekleyin. 8.000 G'de santrifüj işlemini tekrarlayın, ancak bu kez oda sıcaklığında iki dakika boyunca uygulayın; santrifüj sonrası akış sıvısını atın ve kolonun hemen beş dakika boyunca kurumasını sağlayın. Kalan etanol kalıntılarını gidermek için oda sıcaklığında 8.000 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.Şimdi spin kolonu yeni bir 1,5 mililitrelik toplama tüpüne aktarın ve RNA'yı elüe etmek için 10 µL nükleaz içermeyen su ekleyip bir dakika boyunca inkübe edin; ardından oda sıcaklığında 10.000 G'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. RNA, akış sıvısında (flow through) olacaktır. Elüsyon işlemini 10 µL daha su ile tekrarlayın.Üretici talimatlarını izleyerek, bir NanoDrop ND 1000 spektrofotometre kullanarak RNA miktarına ve kalitesine bakın. Ayrıca, RNA bütünlüğünü kontrol etmek için denatüre edici bir jel çalıştırın veya bir Agilent 2100 biyoanalizör kullanın. RNA kalitesi ve miktarı tatmin ediciyse, cDNA sentezine geçin.Son olarak, cDNA sentezi gerçekleştirilene kadar RNA'yı -80 °C'de saklayın. RNA primerinin her bir bileşenini karıştırıp kısa süreli santrifüj ederek cDNA sentezine başlayın. RNA, dNTP'ler ve oligo(dT)'yi karıştırın.Her bir bileşeni, toplam 10 µL olacak şekilde steril bir 0,5 mL mikro santrifüj tüpüne ekleyin. Spesifik hacimler için beraberindeki yazılı protokole bakınız. Ardından örneği 65 °C'de beş dakika boyunca inkübe edin.Numune soğurken, ekteki yazılı protokolde belirtildiği gibi toplam dokuz µL hacminde bir tampon ana karışım (buffer master mix) hazırlayarak numuneyi derhal 10 dakika boyunca buz kalıbına aktarın. Soğutma işleminden sonra, tampon ana karışımı ile RNA primer karışımını birleştirip nazikçe karıştırın ve kısa süreli santrifüjle toplayın. Ardından, birleştirilen numuneyi termosikletörde 42 °C'de iki dakika boyunca inkübe edin.Ters transkripsiyonu başlatmak için tüpe bir mikrolitre superscript two RT ekleyin ve karıştırın. 42 °C'de bir saat boyunca inkübasyona devam edin. Reaksiyonu 70 °C'de 15 dakika bekletilerek sonlandırın.Ardından örneği 4 °C'ye soğutun ve buz banyosuna aktarın. Örneğe 1 µL RNase H ekleyin ve 37 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edin; RNase H, RNA şablonunu parçalayarak geriye yalnızca tek sarmallı cDNA ürününü bırakır. cDNA sentezi böylece tamamlanmış olur ve yalnızca ek bir temizleme ve konsantrasyon adımı gerektirir. cDNA ürününü izole etmek için, 12.000 ×g'de iki dakika santrifüj ederek 1,5 mL'lik bir phase lock jel tüpü hazırlayın.Tüm jeller tüpün tabanında olmalıdır. 8,0 pH'e ayarlanmış 81,5 µL tris doygun fenol, 81,5 µL 24:1 kloroform:izoamil alkol ve örneği phase lock jel tüpüne ekleyip nazikçe ters çevirerek birkaç kez karıştırın; örneği oda sıcaklığında 12.000 ×g'de beş dakika santrifüjleyin. cDNA, üstteki sulu fazda olmalıdır.Yaklaşık 20 µL olan üst fazı temiz bir 1,5 mL mikro tüpe aktarın. cDNA'yı çöktürmek için pH 5,2'de 3 M sodyum asetatın 2 µL'sini ekleyin ve nazikçe karıştırın. 5 mg/mL glikojenin 7 µL'sini ekleyin ve nazikçe karıştırın.Ardından 30 µL izopropanol ekleyip hafifçe karıştırın ve örneği oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra oda sıcaklığında 12.000 G'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, tüpün dibinde küçük bir cDNA peleti oluşur.Süpernatantı bir pipet yardımıyla dikkatlice uzaklaştırın. Peleti 500 µL %70 etanol ekleyerek yıkayın ve ters çevirerek karıştırın; ardından örneği 12,000 G'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra süpernatantı pipetle uzaklaştırın.Yıkama işlemini tekrarlayın, etanol ekleyip santrifüjleyin ve üst fazı (süpernatantı) uzaklaştırın. İkinci yıkamanın ardından, kalan tüm sıvıyı toplamak için tüpü kısa süreliğine santrifüjleyin. Fazla sıvıyı uzaklaştırın ve peletin oda sıcaklığında beş dakika boyunca kurumasını sağlayın.Ardından, peleti yeniden hidrate etmek için 20 µL nükleaz içermeyen su ekleyin. Numuneyi beş dakika boyunca 55 °C'de bekletin. Yeniden hidratasyon için CD NA, -20 °C'de saklanabilir.Son olarak, üreticinin talimatlarını izleyerek nano drop ND 1000 spektrofotometresi ile cDNA ürününün miktarını ve kalitesini kontrol edin; 50 zebrafish embriyosundan rutin olarak yapılan RNA ekstraksiyonu ve temizleme işlemi, NanoDrop ND 1000 spektrofotometresi ile değerlendirildiğinde yaklaşık 15 µg yüksek kaliteli toplam RNA sağlar, 260/280 absorbans oranı ise yaklaşık 1,9 ile 2,0 arasındadır. Ekstrakt edilen RNA'nın bütünlüğü, denatüre edici bir RNA jeli kullanılarak değerlendirilir. RNA, 18 s ve 28 s ribozomal RNA'ya karşılık gelen iki parlak bant içeren bir yayılma (smear) şeklinde görünür.28 s bandı, 18 S bandından yaklaşık iki kat daha yoğun olmalıdır. Alternatif olarak, RNA bütünlüğü bir Agilent 2100 bioanalyzer kullanılarak değerlendirilir. 18 s ve 28 s ribozomal RNA'ya karşılık gelen iki keskin pik görülür.28 s piki, 18 s pikinden daha büyük olmalıdır. NanoDrop ND 1000 ile değerlendirildiğinde, beş mikrogram toplam RNA'nın ters transkripsiyonu rutin olarak bir ila iki mikrogram cDNA üretir. cDNA'nın 260'a 280 absorbans oranı yaklaşık 1,8'dir.Tüm zebrafish embriyolarından toplam RNA'yı nasıl izole edeceğinizi ve bu RNA'yı cDNA ürününe nasıl dönüştüreceğinizi az önce gösterdik. Bu prosedürü gerçekleştirirken, RNazlardan arındırılmış bir ortam sağlamayı hatırlamak önemlidir. Hepsi bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

rna-isolation-from-embryonic-zebrafish-cdna-synthesis-for-gene

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Gen mikroarray'ler genom düzeyinde gen ekspresyonu güçlü araçlardır. Bu teknoloji, gelişim biyolojisi ve toksikoloji de dahil olmak üzere biyolojik disiplinlerin çeşitli uygulaması vardır. Bu video zebrafish için kapsamlı bir oligonükleotid mikroarray platformunu kullanarak küresel gen ekspresyon analizi için detaylı bir protokoldür.

Zebra balığı Oligonükleotid Mikroarray Platformu kullanarak Global Gen İfadesi Analizi

Burada, geliştirmek için sistematik bir yaklaşım sunmak fizyolojik, ilgili duyarlı ve...

Br.rerio kullanarak Morbid İnsan Genomu İn Vivo Modelleme

Zebra balığı, küçük tropikal balık, omurgalı geliştirme ve hastalık sırasında gen fonksiyonu çalışmak için popüler bir model haline gelmiştir. Hedef genlerin uzaysal ve zamansal ifade ile tespit...

Yüksek Çözünürlüklü Tüm Dağı<em&gt; Yerinde</emGen İfade ve Fonksiyon Eğitim için Zebra balığı Embriyolar içinde&gt; Hibridizasyon

Zebra balığı kalp gelişimi sırasında kalp gen ekspresyon profillerini analiz etmek, toplam RNA izole kalpleri elde edilecek olan. Burada, biz kalp-özel mRNA elde etmek Zebra balığı embriyolarının gelen hızlı manuel diseksiyon ile işlevsel / yenerek kalpleri toplamak için bir protokol mevcut.

Transkripsiyonal Analiz Büyük ölçekli Zebra balığı Embriyonik Kalp Diseksiyon

Bu protokol, zebra balığı embriyolarından tek hücreleri izole etmek, ilgilenilen hücreleri zenginleştirmek, mikroakışkan tabanlı tek hücreli multipleks sistemlerde zebra balığı hücrelerini yakalamak ve tek hücrelerden gen ekspresyonunu değerlendirmek için bir yöntemi tanımlar.

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

Mitoz her canlı organizma için kritiktir ve kusurlar genellikle kansere ve gelişimsel bozukluklara yol açar. Araştırmacılar, bu görüntüleme protokolünü ve zebra balığını bir model sistem olarak kullanarak, canlı bir omurgalı organizmasında mitozu ve mitotik süreçler kusurlu olduğunda ortaya çıkan çok sayıda kusuru görselleştirebilirler.

Canlı Zebra balığı Embriyo Mitotik Bölümü ve Dinamikleri gözlemleme

Bu iletişim kuralı Zebra balığı embriyolar, larva, Bütün transcriptome analiz için bir yaklaşım sunar veya hücre sıralanır. RNA izolasyonu, RNASeq veri yolu çözümlemesi ve qRT PCR dayalı doğrulama gen ifade değişiklikleri içerir.

Numune hazırlama ve analiz RNASeq tabanlı gen ifadesi verileri Zebra balığı

Biz nöronlar, makrofajlar ve microglia larva Zebra balığı beyin fizyolojik ve patolojik şartlar altında gelen izole etmek için bir protokol mevcut. Yalıtım, RNA gen ifade profillerini analiz etmek için bu hücrelerden elde edilir. Bu iletişim kuralı için yüksek kaliteli RNA koleksiyonu aşağı akım analizi qPCR ve transcriptomics gibi gerçekleştirmek için izin verir.

Yalıtım ve RNA çıkarma larva Zebra balığı beyin sinir hücreleri, makrofajlar ve Microglia

Burada, zebra balığı embriyoları ve larvalarının tüm preparatlarında floresan antikor aracılı proteinlerin tespiti için bir protokol salıyoruz.

Zebrabalığı Embriyoları ve Larvalarında Tüm Mount Immunohistochemistry

Bu protokol, zebra balığı embriyonik kesitlerinin in situ hibridizasyonu ve immünohistokimyasını birleştirerek görüntülerin nasıl elde edileceğini açıklar. Kriyoseksiyondan önce in situ hibridizasyon yapıldı, bunu takiben antikor boyaması yapıldı. Zebra balığında iki genin ekspresyon kalıplarını, antikorların yetersizliği varsa tespit etmek yararlıdır.

In Situ Kriyokesitli Zebra Balığı Embriyolarında İmmünohistokimya ile Kombine Hibridizasyon

Burada, özellikle zebra balıklarında düşük bolluktaki proteinleri görselleştirmek için yararlı olan, yeni geliştirilen ve modifiye edilen bir in vivo sistem olan zebra balığı larvalarında proteinleri floresan protein etiketi ile etiketlemek için bir protokol sunuyoruz.

Zebra balıklarında düşük eksprese edilen proteinleri görselleştirmek için floresan etiketleme

Öğrenin, zebra balığı embriyolarından yüksek kaliteli RNA izolasyonu ve cDNA sentezi yöntemlerini. Bu protokol gen ifadesi analizi için güvenilir bir temel sağlar ve moleküler biyoloji çalışmalarında uzun süreli saklama olanağı sunar.

Gen İfadesi Analizi Embriyonik Zebra balığı ve cDNA Sentezi RNA İzolasyon

Daha fazla video keşfet