Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila

Drosophila melanogaster içinde gelişmekte olan organların rekonstrüksiyonlarını gerçekleştirmek için, pupa içinde ışığın yayılmasını en iyi tanımlayan ileri modeli belirlememiz gerekiyor. Prosedür, beyaz bir pre pupa seçilmesi ve poppanın ön arka ekseni tüpe paralel olarak yönlendirilecek şekilde bir kılcal borunun ucuna yapıştırılmasıyla başlar. Küçük bir kılcal tüp bir miktar floresan boya ile doldurulur ve öğrenci kutusuna yerleştirilir.

Dikkatli bir eksen ayarlamasından sonra, pupa 360 derece döndürülür. Görüntüler farklı açılardan elde edilir. Elde edilen floresan trans aydınlatma verileri, görüntü organı gelişimi için kullanılacak ileri modeli belirlemek için kullanılır.

Merhaba, benim adım Claudia ve Harvard Tıp Okulu, Massachusetts General Hospital'da Yardım Biyolojisi Merkezi'ndeyim. Ben Harvard Tıp Okulu'ndaki Paramount Laboratuvarı'ndan Ula Petou ve ben Münih Teknik Üniversitesi Biyolojik ve Tıbbi Görüntüleme Enstitüsü'nden ve Münih Heliman Merkezi'nden Daniel Rozanski. Bugün size Oph Melano Casta'da tüm vücudun üç boyutlu rekonstrüksiyonu için bir prosedür göstereceğiz.

Bu prosedürü laboratuvarımızda, öğrenci durumu sırasında gelişmekte olan organların in vivo görselleştirmesi için kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım Başlamadan önce. Optik projeksiyon tomografisinin bazı teknik yönlerinin burada olduğundan daha ayrıntılı olarak açıklandığı bu videodan önce izlenmesi gereken bir video olmadığını lütfen unutmayın.

Ek olarak, diğer video, daha büyük hayvanların hazırlanmış dokularının veya organlarının görüntülenmesini açıklar. Bu videoda ele alınan tüm deneyler için sahte drosophila transgenleri kullanılacaktır. Bunlar, tükürük bezlerinde eksprese edilen EL A gal dört, yetişkin kanadının larva öncü dokularında ve floresan proteini yapan transgen olan toraks göğüs kafesinde eksprese edilen apteris gal dörttür.

U-A-S-G-F-P ve beyaz 1118 olarak adlandırılan gal dördüne yanıt olarak, UAS transgenlerini taşıyan floresan olmayan kontrol erkekleri, doku elde etmek için GAL dört transgenini taşıyan bakire dişilere çaprazlanır. GFP çaprazlamalarının spesifik ifadesi, bir tutam ekmek mayası ile standart sinek ortamında sekiz ila 10 bakire dişi ve erkek arasında kurulur. Yüzeyde, şişeler 12 saatlik açık karanlık bir döngü altında nemlendirilmiş bir inkübatörde 25 santigrat dereceye yerleştirilir.

Haçın başlamasından iki gün sonra, ebeveynler taze bir şişeye aktarılır ve beş ila altı gün sonra PUI, şişe beyaz PrepU'yu doldurmaya başlar. Floresan diseksiyon kapsamı altında GFP ekspresyonu için seçildim. Beyaz pre pui seçimi, hayvanların yaklaşık bir saat beyaz kaldıkları için uygun şekilde sahnelenmesini sağlar.

Gözbebeği olduktan sonra pigmentli veya kahverengimsi hale gelirler. GFP eksprese eden pui, ıslak bir boya fırçası kullanılarak şişelerden nazikçe toplanır ve bir Petri kabında bir damla suya veya PBS'ye yerleştirilir, satın alınan otofloresan malzemelerden silinerek temizlenmelidir. Boya fırçasını kullanarak artık tomografik görüntüleme için hazır olmalıdırlar.

PrepU I'in doğru gelişim aşamasına ulaşmak için yaşlanmaya devam etmesi gerekiyorsa, ıslak bir kağıt havluyla birlikte bir Petri kabında veya temiz bir gıda şişesinde bırakılabilir. Bu, görüntüleme için yeterli nem ve uygun gelişmeyi sağlayacaktır. PrepU, 800 mikron çapında bir cam kılcal borunun iç kısmına yapıştırılmalıdır.

Öğrencinin arka ucunu süper yapıştırıcı ile boyayın, ön pupanın yapıştırılmış yüzeyini, sineğin ön arka erişimi tüpe paralel olacak şekilde tüpe yönlendirin. Hayvanın ön kısmı kılcal borudan sarkacaktır. Kılcal boru şimdi mikroskobun dönme aşamasına sabitlenmiştir.

Dikey konumda, dönme aşamasının eğilme eksenini, tüpün dönme ekseni görüntüleme CCD'sinin piksel sütunlarına paralel olacak şekilde ayarlayın. Sineğin konumu ayarlandıktan sonra, görüntülemeye devam edin. Bu örnekte, floresan tükürük bezlerine sahip hayvanlar, tükürük bezlerinde GFP'yi ifade eden oph'ye görüntülenecektir, EAG dört ve U-A-S-G-F-P stokları arasındaki bir çaprazlamadan üretilebilir.

Monte edilmiş bir pre pupa ile başlıyoruz, pre pupa'yı bir uyarma ışını ile aydınlatıyoruz ve GFP floresan sinyalini topluyoruz. Transillüminasyonda, PrepU'yu dikey ekseni boyunca 360 derece döndürün ve trans aydınlatma görüntülerini elde edin. Her görüntü 10 derecelik dönüşe karşılık gelir.

Toplam alım süresi, floresan miktarına ve uyarma ışınının yoğunluğuna bağlıdır. Tipik süreler bir dakika mertebesindedir. Bu örnekte, kanat hayali disklerinde GFP'yi ifade eden bir DSO pupası görüntülenecektir.

Bu pupa, Aus GAL dört ve U-A-S-G-F-P stokları arasındaki bir çaprazlama şişesinden toplanabilir. Pre pupa daha önce tarif edildiği gibi monte edilir. Bununla birlikte, bu deney için görüntüleme süresi yaklaşık sekiz saat olduğundan, ortamın nemli ve oda sıcaklığında kalması çok önemlidir Hayvanın dehidrasyonunu ve ölümünü önlemek için, ilgilenilen dokudaki çiçek dörtlüsünün sönmesini önlemek ve hayvanın daha önce olduğu gibi lazer ışını tarafından yanmamasını sağlamak için uyarma ışınının üzerine bir panjur yerleştirilir, Uyarma ışını ile aydınlatın ve trans aydınlatma ile GFP floresan sinyalini toplayın.

Pre pupa tamamen dikey ekseni boyunca döndürülür. Veri toplama sırasında, döndürme yalnızca bir dakika sürer ve farklı zaman aralıklarında tekrarlanır. Geliştirme sırasında kanatların hızlandırılmış bir dizi görüntüsünü oluşturmak için, saatte 100 görüntü hızında en az altı saat boyunca veri elde edilebilir.

Zarar görmesini veya fotoğraf ağarmasını önlemek için toplam ışık maruziyetinin bu deklanşör ile kontrol edilmesi hayati önem taşır. Bu film, PrepU aşaması ile öğrenci kafasından kaçınma arasında elde edilen görüntüleri göstermektedir. Üç boyutlu görüntüyü yeniden yapılandırırken, hesaba katılması gereken, difüzyonla yaklaşılamayan güçlü bir ileri saçılma vardır.

Bu nedenle, rekonstrüksiyonu ileriye doğru bir saçılma yapmak için, ışık yayılımının bir modeli belirlenmelidir Basitlik için, absorpsiyonu ihmal ediyoruz. Saçılma miktarı deneysel olarak test edilir. Bunu yapmak için, floresan olmayan beyaz 1118 pre pupa'ya standartlaştırılmış floresanslı yabancı bir nesne yerleştirilir ve daha sonra 100 mikronluk bir silika kılcal tüpü PS 5.5 floresan boya ile doldurarak başlayan ileri model verilerini oluşturmak için taranır.

Kılcal hareket kullanarak, kılcal boruyu ön eksene 45 derecelik bir açıyla pupanın içine itin, PrepU'yu bir kılcal boruya monte edin ve daha önce tarif edildiği gibi dönen aşamaya uygun şekilde yerleştirin. Şimdi pre pupa'yı düşük sayısal açıklıklı bir lense sahip bir uyarma lazer ışını ile aydınlatın ve pre pupa'nın floresan trans aydınlatma görüntülerini toplayın. Daha önce açıklandığı gibi, MATLAB yazılımı, verileri açık teorik ileri modele sığdırmak için kullanılır Yeniden yapılandırma sürecini kolaylaştırmak için, ileri saçılma rejimini tanımladığı ve aynı zamanda deneysel verilere uyduğu için taşıma denklemine firma e yaklaşımı seçilir.

Doğru ileri modeli belirledikten sonra, tükürük bezlerini yeniden yapılandırabilir ve zaman atlamalı tomografik rekonstrüksiyonları elde edebiliriz. Boş alan tomografisi kullanmayı planlıyorsanız, indeks eşleştirme için konfigürasyon algoritmaları da ayarlanabilir. İlk olarak, gelişimin erken dönemlerinde tükürük bezlerinin 3 boyutlu rekonstrüksiyonunu gösteriyoruz.

Karşılaştırma için, tükürük bezlerinin histolojik boyanması, rekonstrüksiyonların histoloji ile iyi bir şekilde ilişkili olduğunu göstermektedir. Kanat hayali disklerinin gelişiminin bu hızlandırılmış filmi, tek bir canlı örnekten elde edildi. Karşılaştırma için, kanat diskinin aynı zaman noktalarında histolojik olarak boyanması, rekonstrüksiyonların histoloji ile iyi bir şekilde ilişkili olduğunu göstermektedir.

Az önce size oph içinde in vivo olarak ve zaman içinde üç boyutlu yapıları görüntülemek için bir sistemin nasıl oluşturulacağını gösterdik. Bu, bizi, Drosophila'daki morfogenezi takip etmemize ve art arda altı saat boyunca kanatların gelişimini takip etmemize izin verir. Bu prosedürü yaparken, drosophila içinde ışık yayılımı için doğru ileri modeli seçmek çok önemlidir.

Bu yöntem, oph pupil aşamalarında organ gelişimine ışık tutmak için histolojik tekniklerle birlikte kullanılabilir ve benzer büyüklükteki farklı organizmaların incelenmesi için modifiye edilebilir. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.