Dekstran Sülfat Sodyum (DSS) kullanarak murin Kolit Modelleme

Farelere dört gün boyunca libidoda% 3 DSS verilir. Her gün ağırlık ve ishal ve dışkı kanı varlığı kaydedilirken, TSS dördüncü günden sonra otoklav suyu ile değiştirilir. Suda üç gün geçirdikten sonra, farelere ötenazi yapılır ve kolonları çıkarılır.

Kolonlar ölçülür ve tartılır. Kolonlar daha sonra ya İsviçre ruloları ya da sosisler haline getirilir ve mikroskop altında incelenir. Bu video makalesi, bir murn kolit modelinde kolonların toplanmasını ve işlenmesini gösterecektir.

Bu prosedür, dekstrin sülfat sodyum tedavisine başlamadan önce Vanderbilt Üniversitesi Kanser Biyolojisi Bölümü'nden Dr. Christopher Williams'ın laboratuvarında koliti incelemek için kullanılır. Temel ağırlıklar, deney boyunca elde edilir. Fareler tartıldıktan sonra günlük ağırlıklar alınır, hacim başına% 3 ağırlık, dekstrin sülfat sodyum tuzu çözeltisi veya suda DSS yapılır.

Bu modelin etkili olabilmesi için DSS'nin düşük moleküler ağırlığa sahip olması, her fare kafesi için bir su şişesini doldurmak için yeterli DSS çözeltisi yapması ve çözeltiyi 0.45 mikrometre selüloz asetat filtresi ile filtrelemesi gerekir. Fare kafesindeki içme suyu şişesini %3 DSS solüsyonu içeren bir şişeyle değiştirin. Kurumunuz otomatik bir sulama sistemi kullanıyorsa, farelerin başka herhangi bir su kaynağına erişimi olmadığından emin olmak için sulama musluklarına dışlama ipuçları yerleştirin.

Dört gün sonra, kolitin sistemik sonuçlarını ölçmek için fareler tekrar tartılır. Kilo kaybı ciddi yaralanmalarda yaygındır, ancak aynı gün içinde birkaç gün daha belirgin olmayabilir. Dördüncü gün, bir miktar kolonik epitel iyileşmesine izin vermek için DSS solüsyonunu üç gün daha su ile değiştirin.

Üç gün sonra, yedinci gün, fareler tekrar tartılır. Kolon daha sonra bir sonraki bölümde gösterildiği gibi ötenazi yapılmış farelerden hasat edilebilir. Kolonu hasat etmek için, karın bölgesine engelsiz erişim sağlamak için ötenazi yapılan farenin ventral tarafını açığa çıkarın.

Karnı tamamen% 70 etanol ile ıslatın. Doku forseps ile karın orta hattını kavrayın ve yükseltin. Böylece ince uçlu makas kullanarak cildi çadır haline getirir.

Karın içeriğini ortaya çıkarmak için karnı kesin. İnsizyonu orta hattaki ksifoid sürecin ucuna kadar uzatın ve ardından kostal kenarların alt yönü boyunca bilateral olarak uzatın. İnce bağırsak, çekum ve kolonu tanımlayın.

Dikkatlice inceleyin, eğik çizgiyi çevredeki mezenterden koparmak yapın. Bundan sonra, kolonu transekte edin, pelvisi serbest bırakın. Rektumdan distal kolon.

Hiçbir atardamar veya damarın kesilmemesine dikkat edilmelidir. Ayrıca, kolonun kolayca yırtılabileceğini unutmayın. Bu yüzden kolonu mezenterden nazikçe çıkarın.

Proksimal kolonu serbest bırakmak için kolonu Colona sekel kenarında transekt. 20 gauge besleme iğnesi ve 10 mililitrelik şırınga entübe kullanarak kolonu ve toplamı çıkarın ve EIT dışkıdan tamamen temizlenene kadar kolonu buz gibi soğuk PBS ile yıkayın. Kolonun distal ucunu size en yakın tutarak kolonun doğru yönünü korumak önemlidir.

Dijital kumpas kullanarak kolon uzunluğunu ölçerek başlayın. Kolon uzunluğu, yaralanmanın ciddiyetinin bir başka göstergesidir. Kolit ödemi artırır ve genel kolon uzunluğunu kısaltır.

Bu noktada, hasat edilen kolonlar ya makroskopik analiz için sosis olarak işlenebilir ya da akut kolitin histolojik analizi için İsviçre rulosu haline getirilebilir. Kolonu sosis olarak işlemek için bu teknikleri aşağıdaki bölümlerde göstereceğiz Tüm kolonun makroskopik analizi için, kolonun doğru oryantasyonunu korumak önemlidir. Bu nedenle, kolonun distal ucunu size en yakın tutun.

Biri yaklaşık bir inç uzunluğunda ve diğer iki inç uzunluğunda iki parça emilmeyen sütür kesin. Kolonun distal ucunu kenara mümkün olduğunca yakın bağlamak için iki inçlik sütür parçasını kullanın ve aynı zamanda iyi bir sızdırmazlık sağlayın. Ardından, kolonun proksimal ucuna beş mililitre% 10 tamponlu formalin fosfat içeren 20 gauge bir besleme iğnesi yerleştirin.

Kalan dikiş parçasını besleme iğnesinin ampulünün hemen yakınına gevşek bir şekilde bağlayın. Şimdi kolonu besleme iğnesinin ampulünden sıkıca kavrayın ve kolonun genişlemesini sağlamak için yeterli miktarda formalin verin. Besleme iğnesini çekerken dikişteki düğümü sıkın, böylece demlenmiş genişlemiş kolonu bırakın.

Bir sosis olarak, 15 mililitrelik konik bir tüpü %10 tamponlu, formal ve fosfat ile doldurun ve tüpü etiketleyin. Kolonu tüpe yerleştirin ve 24 saat sabitleyin. 24 saat sonra, formu uygun bir atık kabına dökün ve 24 saat daha% 70 etanol ile değiştirin.

Kolonlar, oda sıcaklığında süresiz olarak% 70 etanol içinde saklanabilir. Kolonu analiz etmeye hazır olduğunuzda, konik tüpten çıkarın. Her iki uçtaki ipleri bir neşterle kesin, kolona zarar vermemeye dikkat edin.

Distal ucun en uzun ip parçasına sahip olduğunu unutmayın. Kolonu distalden proksimal uca uzunlamasına kesin, böylece uzun bir tabaka oluşturur. Kolon artık diseksiyon mikroskobu altında görüntülenebilir.

Kolonu uzunlamasına kesin ve kolonu düz bir tabaka olarak yerleştirin. Kolonu yuvarlamak iki çift forseps ve iki el tekniği gerektirir. Distal kolon kenarının her iki yan kenarını forseps ile kavrayın, proksimal kenara doğru ilerleyen forsepsleri döndürerek ve serbest bırakarak kolonu sırayla yuvarlamaya devam edin, böylece üçüncü bir boyut veya İsviçre rulosu ile bir spiral oluşturun.

Kolon watman kağıdına yapışırsa, formu korumak için kağıdı ve koloniyi az miktarda PBS ile ıslatın. Ruloyu forseps ile sıkıca kavrayın ve 27 buçuk gauge iğne ile kesin. Rulodan çıkarken iğneyi bükerek ruloyu sabitleyin.

Şimdi, ruloyu etiketli bir doku kasetine yerleştirin ve kaseti %10 tamponlu formalin fosfat içeren bir kavanoza yerleştirin. Dokuyu sabitlemek için 24 saat oda sıcaklığında bırakın. 24 saat sonra, formalini dökün ve dört saate kadar %70 etanol ile değiştirin.

Kolonlar, oda sıcaklığında süresiz olarak% 70 etanol içinde saklanabilir. Bu model, araştırmacının kolonları elde etmesine, düzeltmesine ve analiz etmesine olanak tanır, böylece kolitin şiddetinin analizine izin verir. Tüm kolonun makroskopik analizi için, kolon formalin ile infüze edilmiş ve tamamen genişletilmiş bir sosis olarak işlenebilir.

Açık sosis düz durmalıdır. Sosis yöntemi doğru bir şekilde uygulanmışsa, sabit kolon genişleyecek ve tüm mukozal yüzey diseksiyon mikroskobu altında kolayca manipüle edilebilir ve görüntülenebilir. Histolojik analiz için, kolon bir İsviçre rulosu olarak işlenebilir.

Rulo bir iğne ile sabitlenir ve sabitleme için bir doku kasetine yerleştirilir. Rulo kesildiğinde ve monte edildiğinde, düzgün bir şekilde yuvarlanırsa tüm kolonun temsili bir dilimini oluşturmalıdır, İsviçre rulosunun bölümleri, kolon hasarının derecesini belirlemek için hematin ve ASIN ile boyanabilir. Kolonun distal ucunu hatırlamak, slayttaki rulonun merkezindedir.

Bu örnekte, DSS ile tedavi edilen kolonda su ile muamele edilmiş bir kontrole kıyasla iltihaplanma ve kript hasarı belirgindir. Az önce size bir murin akut kolit modelinden kolonların nasıl toplanacağını ve işleneceğini gösterdik. Bu prosedürü gerçekleştirirken, fedakarlık yapmadan önce iyi organize olmanız önemlidir.

Örneğin fareler, her fare için etiketlenmiş tüm tüplere ve kasetlere ve tüm aletlere ve reaktiflere sahiptir. Ek olarak, fare ağırlığı ve iki nokta üst üste uzunluğunun ayrıntılı kayıtlarını tutun. Son olarak, işlem için yeterli zaman ayırdığınızdan emin olun.

Bir acemi için genellikle fare başına 15 dakika ve bu teknikte daha deneyimli biri için altı ila sekiz dakika sürer.