Dekstran Sülfat Sodyum (DSS) kullanarak murin Kolit Modelleme

Farelere dört gün boyunca libido içinde %3 DSS verilir. Ağırlık, ishal varlığı ve dışkıda kan günlük olarak kaydedilirken, dördüncü günden sonra TSS otoklavlanmış su ile değiştirilir. Suyla geçen üç günün ardından fareler sakrifiye edilir ve kolonları çıkarılır.

Kolonlar ölçülür ve tartılır. Ardından kolonlar, ya İsviçre rulosu (Swiss roll) ya da sosis şeklinde düzenlenir ve mikroskop altında incelenir. Bu video makale, bir kolit fare modelinde kolonların hasat edilmesini ve işlenmesini gösterecektir.

Bu prosedür, Vanderbilt Üniversitesi Kanser Biyolojisi Bölümü'nden Dr. Christopher Williams'ın laboratuvarında, dekstran sülfat sodyum tedavisine başlamadan önce koliti incelemek için kullanılır. Deney süresince temel ağırlıklar kaydedilir. Fareler tartıldıktan sonra günlük ağırlıklar alınır; su içerisinde hacimce %3 ağırlıkta bir dekstran sülfat sodyum tuzu çözeltisi veya DSS hazırlayın.

Bu modelin etkili olabilmesi için DSS'nin düşük moleküler ağırlıkta olması gerekir; her fare kafesi için bir su şişesini dolduracak kadar DSS çözeltisi hazırlayın ve çözeltiyi 0,45 mikrometre selüloz asetat filtre ile filtreleyin. Fare kafesindeki içme suyu şişesini, %3 DSS çözeltisi içeren bir şişe ile değiştirin. Kurumunuz otomatik bir sulama sistemi kullanıyorsa, farelerin başka herhangi bir su kaynağına erişemediğinden emin olmak için sulama uçlarına dışlama uçları takın.

Dört gün sonra, kolitin sistemik sonuçlarını belirlemek için fareler tekrar tartılır. Ağır yaralanmalarda kilo kaybı yaygındır, ancak aynı gün içinde birkaç gün daha belirginleşmeyebilir. Dördüncü günde, kolon epitelyal dokusunun bir miktar iyileşmesini sağlamak amacıyla DSS solüsyonu üç gün boyunca su ile değiştirilir.

Üç gün sonra, yedinci günde, fareler tekrar tartılır. Ardından kolon, bir sonraki bölümde gösterildiği şekilde ötanazisi yapılmış farelerden toplanabilir. Kolonu toplamak için, abdomen bölgesine engelsiz erişim sağlamak amacıyla ötanazisi yapılmış farenin ventral tarafını açığa çıkarın.

Karın bölgesini %70 etanol ile tamamen ıslatın. Karın orta hattını doku pensetiyle kavrayın ve kaldırın. Böylece ince uçlu makas kullanarak cildi gerdirin.

Karın içeriğini açığa çıkarmak için abdomeni kesin. İnsizyonu orta hatta ksifoid çıkıntının ucuna kadar uzatın ve ardından her iki tarafta kostal kenarların alt kısmı boyunca uzatın. İnce bağırsak, sekum ve kolonu tanımlayın.

Kolonu çevreleyen mezenterden dikkatlice ayırın veya serbest bırakın. Ardından, rektumdan distal kolonu serbest bırakmak için pelvisin derinliğinde kolonu kesin.

Herhangi bir arter veya venin kesilmemesine dikkat edilmelidir. Ayrıca, kolonun kolayca yırtılabileceği unutulmamalıdır. Bu nedenle, kolonu mezenterden nazikçe ayırın.

Proksimal kolonu serbest bırakmak için kolonu Colona sequel sınırından kesin. Kolonu çıkarın ve 20 gauge besleme iğnesi ile 10 mililitrelik şırınga kullanarak, EIT dışkıdan tamamen temizlenene kadar kolonu buz gibi soğuk PBS ile entübe edip yıkayın. Kolonun distal ucunu kendinize en yakın konumda tutarak doğru yönlendirmeyi korumak önemlidir.

İşleme, dijital bir kumpas kullanarak kolon uzunluğunu ölçerek başlayın. Kolon uzunluğu, hasarın şiddetinin bir başka göstergesidir. Kolit, ödemi artırır ve toplam kolon uzunluğunu kısaltır.

Bu aşamada, hasat edilen kolonlar ya makroskobik analiz için sosis şeklinde işlenebilir ya da akut kolitin histolojik analizi için İsviçre rulosu (Swiss roll) haline getirilebilir. Kolonun sosis şeklinde işlenmesi için bu teknikleri sonraki bölümlerde göstereceğiz. Tüm kolonun makroskobik analizi için kolonun doğru yöneliminin korunması önemlidir. Bu nedenle, kolonun distal ucunu kendinize en yakın konumda tutun.

Biri yaklaşık bir inç, diğeri ise iki inç uzunluğunda iki parça emilmeyen sütür kesin. İki inçlik sütür parçasını, iyi bir sızdırmazlık sağlarken kolonun distal ucunu marjine mümkün olduğunca yakın şekilde bağlamak için kullanın. Ardından, kolonun proksimal ucuna beş mililitre %10 tamponlu formalin fosfat içeren 20 gauge bir besleme iğnesi yerleştirin.

Besleme iğnesinin baş kısmının hemen proksimaline kalan sütür parçasını gevşekçe bağlayın. Şimdi kolonu, besleme iğnesinin baş kısmından sıkıca tutun ve kolonun genişlemesini sağlayacak şekilde yeterli miktarda formalin infüze edin. Besleme iğnesini geri çekerken sütürdeki düğümü sıkın; böylece infüze edilmiş genişlemiş kolon içeride kalacaktır.

Sosis şeklinde, 15 mililitrelik konik bir tüpü %10 tamponlu formalin ve fosfat ile doldurun ve tüpü etiketleyin. Kolonu tüpe yerleştirin ve 24 saat boyunca sabitleyin. 24 saat sonra, formalini uygun bir atık kabına boşaltın ve 24 saat daha bekletmek üzere %70 etanol ile değiştirin.

Kolonlar, oda sıcaklığında %70 etanol içinde süresiz olarak saklanabilir. Kolonu analiz etmeye hazır olduğunuzda, konik tüpten çıkarın. Kolona zarar vermemeye dikkat ederek, her iki uçtaki bağları bir skalpel ile kesin.

Distal ucun en uzun ip parçasına sahip olduğunu unutmayın. Kolonu, uzun bir tabaka oluşturacak şekilde distal uçtan proksimal uca doğru boyuna kesin. Kolon artık bir diseksiyon mikroskobu altında incelenebilir.

Kolonu boylamasına kesin ve düz bir tabaka halinde yayın. Kolonun rulo yapılması için iki çift pens ve iki elli bir teknik gereklidir. Distal kolon kenarının her iki lateral kenarını penslerle kavrayın; pensleri döndürüp bırakarak sırasıyla proksimal kenara doğru ilerleyin ve böylece üçüncü boyuta sahip bir spiral veya "Swiss roll" oluşturun.

Kolon watman kağıdına yapışmışsa, formu korumak için kağıdı ve kolonu az miktarda PBS ile ıslatın. Ruloyu pensle sıkıca kavrayın ve 27,5 gauge bir iğne ile enine kesin. İğneyi rulodan çıkarken bükerek ruloyu sabitleyin.

Şimdi, rulo şeklinde hazırlanan örneği etiketli bir doku kasetine yerleştirin ve kaseti %10 tamponlu formalin fosfat içeren bir kavanoza koyun. Dokunun fikse olması için oda sıcaklığında 24 saat bekletin. 24 saat sonra formalini boşaltın ve yerine dört saat daha bekletmek üzere %70 etanol ekleyin.

Kolonlar, oda sıcaklığında %70 etanol içerisinde süresiz olarak saklanabilir. Bu model, araştırmacının kolonları elde etmesine, tespit etmesine ve analiz etmesine olanak tanıyarak kolitin şiddetinin analiz edilmesini sağlar. Tüm kolonun makroskobik analizi için kolon, formalinle infüze edilmiş ve tamamen genişletilmiş bir sosis şeklinde işlenebilir.

Açılmış sosis düz bir şekilde yatırılmalıdır. Sosis yöntemi doğru şekilde uygulandıysa, fikse edilmiş kolon genişlemiş olacak ve tüm mukozal yüzey diseksiyon mikroskobu altında kolayca manipüle edilip görüntülenebilecektir. Histolojik analiz için kolon, Swiss roll (İsviçre rulosu) şeklinde işlenebilir.

Rulo bir iğne ile sabitlenir ve fiksasyon için bir doku kasetine yerleştirilir. Rulo doğru şekilde sarıldıysa, kesilip monte edildiğinde tüm kolonun temsili bir kesitini oluşturmalıdır; kolon hasarının boyutunu belirlemek amacıyla Swiss roll kesitleri hematin ve ASIN ile boyanabilir. Lam üzerindeki rulonun merkezinde kolonun distal ucunun yer aldığı unutulmamalıdır.

Bu örnekte, su ile işlem görmüş kontrole kıyasla DSS ile işlem görmüş kolonda inflamasyon ve kript hasarı belirgindir. Akut kolit murine modelinden kolonların nasıl toplandığını ve işlendiğini göstermiş olduk. Bu prosedürü gerçekleştirirken, sakrifikasyon öncesinde iyi organize olmanız önemlidir.

Örneğin fare çalışmaları için, her fareye ait tüm tüpler ve kasetler etiketlenmiş; tüm araçlar ve reaktifler hazır bulundurulmalıdır. Ek olarak, fare ağırlığı ve kolon uzunluğuna dair ayrıntılı kayıtlar tutun. Son olarak, işlem süreci için yeterli zaman ayırdığınızdan emin olun.

Bu teknik için işlem süresi, deneyimsiz bir kişi için fare başına genellikle 15 dakika, daha deneyimli bir kişi için ise altı ila sekiz dakikadır.